Metodo Lowry

VALORACION DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY

1.- FUNDAMENTO TEÓRICO

El método de Lowry (1951) es un método espectrofotométrico de valoración cuantitativa de proteínas. A la disolución de proteínas se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con ellas, siendo la intensidad de color de la disolución resultante proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer (A= .l.c).

La preparación de las muestras consta de dos etapas:1ª) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas en los átomos

de nitrógeno de los enlaces peptídicos, formando complejos. Estos complejos Cu2+-proteína, de un color azul pálido, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo hacia la superficie a los residuos fenolitos de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

2ª) En la segunda etapa, el cobre actúa como catalizador de la reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por parte de los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los residuos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Metodo LowryReacción entre la proteína y los reactivos de Cu2+ y de Folin

2.- MATERIAL Y REACTIVOS

Materiales.- Tubos de ensayo .- Pipetas y puntas de micropipeta.- Espectrofotómetro.- Cubetas de espectrofotómetro.- Agitadores de tubos.- Timer o cronometro

Reactivos- Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M- Reactivo B: CuSO4 5H2O al 0,5% en tartrato sódico-potásico al 2%- Reactivo C: Se mezcla 50 ml del reactivo A con 1 ml de reactivo B al momento de usar.- Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1:1- Solución patrón de albúmina de suero bovino (11,7 mG/50mL)- Muestra problema huevo o carne

3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Realización de la curva de calibrado:Para poder determinar la concentración de proteínas en la muestra problema hay que contar con una curva patrón o de calibrado que relacione la concentración de albúmina presente en cada tubo con la Absorbancia determinada en el espectrofotómetro. Para realizar la curva patrón se toman diferentes volúmenes de la solución patrón de BSA (11,7 mg/50ml) tal y como se detalla en el cuadro, tubos del 1 al 6. El tubo 0, que no contiene proteína y sí los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del espectrofotómetro cero de absorbancia.Es conveniente procesar simultáneamente los tubos de las muestras con la disolución problema para determinar igualmente su absorbancia.

Pasos a seguir:.- Numerar los tubos de plástico de 10 ml, del 1-6 .- Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina y solución problema de proteínas.

Metodo Lowry

Tubo Muestra

Agua destilada

µg totales

Reactivo C

10’ a Tº amb.

Folin diluido1:1

30’ Tº amb. y oscuro

Abs.750 nm

0 0 600 µl 0 3 ml 300 µl

1 500 µl 100µl 117µg 3 ml 300 µl

1’ 500 µl 100µl 117µg 3 ml 300 µl

2 400 µl 200µl 93.6µg 3 ml 300 µl

2’ 400 µl 200µl 93.6µg 3 ml 300 µl

3 300 µl 300µl 70.2µg 3 ml 300 µl

3’ 300 µl 300µl 70,2µg 3 ml 300 µl

4 200 µl 400µl 46.8µg 3 ml 300 µl

4’ 200 µl 400µl 46.8µg 3 ml 300 µl

5 100 µl 500µl 23.4µg 3 ml 300 µl

5’ 100 µl 500µl 23.4µg 3 ml 300 µl

6 50 µl 550µl 11.7µg 3 ml 300 µl

6’ 50 µl 550µl 11.7µg 3 ml 300 µl

.- A continuación se añade el reactivo de Folin (diluido 1:1) a todos los tubos, mezclando bien. Dejar reposar 30 minutos en oscuridad para que se desarrolle completamente la reacción coloreada.

.- Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 750 nm. Previamente en el aparato se ajusta la absorbancia a cero con el blanco (tubo nº 0); de esa forma sólo se determina la absorbancia producida por las proteínas modificadas, puesto que se resta la absorbancia debida a los reactivos.

4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

4.1.- Curva patrón: Representar, en papel milimetrado, las absorbancia de los tubos frente a la concentración de proteínas de cada tubo, previamente calculadas.

4.2.- Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema, expresando el resultado en mg/ml (tener en cuenta las diluciones realizadas). La concentración de las muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón.

Metodo Lowry

conclusión:

como conclusión las ventajas del método de lowry, son: su alta sensibilidad su fácil operación fácil de manejar en gran número de muestra

y las desventajas son: Dependencia del color con la composición del aminoácido Interfieren un buen número de compuestos Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino La curva estándar no es lineal para altas concentraciones de

proteínas por lo tanto es necesario diluir mucho antes de medir