LOS MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS

PERSPECTIVA PARA INMUNOHISTOQUÍMICO EVALUACIONES

La gran mayoría de los diagnósticos histopatológicos se hizo estudio siguiente de hematoxilina manchado secciones de tejido de rutina por un patólogo experimentado . Esto no va a cambiar en un futuro próximo . Sin embargo , de vez en cuando , estas secciones de tejido no proporcionan información suficiente para permitirnos hacer un diagnóstico final seguro. Por ejemplo , algunos neoplasma pobremente diferenciado no puede revelar características que son lo suficientemente específico para determinar si las células se originaron a partir de una célula linfoide neoplásica o de una célula epitelial neoplásico . Sin embargo, esta distinción es muy importante para determinar el pronóstico y la terapia para el paciente adecuado. En casos tales como este , los anticuerpos monoclonales están disponibles , que ayudan al patólogo para distinguir entre estas alternativas . Tenga en cuenta que los anticuerpos monoclonales no determinan que la lesión es neoplásica, lo que ya ha determinado Bedn por el patólogo . El inmunohistologíaes , sin embargo , de vez en cuando de una importancia crucial para la correcta clasificación de la neoplasia . Las biopsias renales también frecuentemente requieren inmunohistología tanto para detectar y al subtipo inmunoglobulinas contenidas dentro de deposiciones complejos inmunes. El tipo particular de presente complejo inmune , así como el patrón de distribución tendrán una importancia considerable para el paciente . En los últimos años , las aplicaciones de las sondas de ácidos nucleicos marcados a la patología de diagnóstico ( hibridación in situ ) ha permitido al técnico de laboratorio para detectar los oncogenes, reordenamientos de genes y secuencias de ADN viral integrado . Advenimiento mar de hibridación sim y otros tipos de análisis de ácidos nucleicos ha mejorado la sensibilidad de diagnóstico , especificidad, y si el tiempo , en algunos casos , a su vez- en torno .

La base para todas las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y de inmunohistoquímica es la especificidad que se puede añadir al proceso de diagnóstico . Sin embargo , el proceso se limita mediante la variación de la sensibilidad y las reacciones cruzadas que pueden ocurrir en ambas técnicas . Para llevar a cabo estos estudios especiales efectivamente , hay que entender los principios básicos de los métodos utilizados para amplificar o para detectar la reacción del anticuerpo monoclonal con su epítopo diana o de la sonda de oligonucleótido con el ácido nucleico en los tejidos . La conjugación de anticuerpos o antígenos con fluorocromos o enzimas nos proporciona con una sonda específica y sensible para detectar el epítopo particular a la que que el anticuerpo reacciona en una variedad de situaciones. En este capítulo , hacemos hincapié en cómo se utilizan esos reactivos para detectar antígenos específicos o secuencias de ácidos nucleicos en muestras de biopsias de pacientes .

ANTIGENO PRESERVACIÓN Y FIJACIÓN DE TEJIDOS

Ya sea que uno está realizando cenciaimmunofluorea o procedimientos inmunoenzimáticos , el éxito dependerá en gran medida de la forma en la que el antígeno se conserva en el tejido. Hay varios factores que son claves para la conservación óptima de los antígenos . El antígeno en sí es una variable importante . Cuando se utilizan técnicas inmunohistológicas , pequeños antígenos que son solubles se pueden perder durante el proceso de incrustación de fijación y .

Afortunadamente , la mayoría de los antígenos que el patólogo debe enfrentar son proteínas con estructuras terciarias relativamente complejas . Con estos antígenos , es importante utilizar la fijación relativamente suave para evitar la alteración significativa de antígeno . Se pensaba que los tejidos tenían que ser instantánea congelada , en sección , y se fijaron con etanol , metanol , o acetona, para proteger el antígeno suficientemente para el estudio inmunohistoquímico . Considerando que es truc que , para la gran malority de antígenos , este enfoque proporciona una conservación óptima de antígeno , para la mayoría de los antígenos que estudiamos en histopatología , fijadores , tales como 10 % de formalina tamponada neutra , son bastante adecuados para preservar suficiente reactividad para antígeno diagnóstico clínico . Los antígenos son sorprendentemente bien conservados en la mayoría de los bloques de tejido .

Incluso descalcificación se puede realizar con una cierta preservación de abundantes antígenos , como las inmunoglobulinas . Si desea realizar inmunohistología sobre los tejidos que deben ser descalcificada , un fijador de cloruro niercunc (véase más adelante en este capítulo) se preferiría seguido de tratamiento con un agente de descalcificación débil, tal como solución salina formol ácido acético al 10 % , para preparar el tejido para seccionamiento . Si la fijación o la descalcificación se prolonga (más de 48 horas) ,antigenicidad del tejido sufrirá en consecuencia.

El fijador más común utilizado en la patología de hoy es el 10% formalina tamponada neutra .Afortunadamente , conserva la anhigenicity de muchas proteínas . Sin embargo, es importante darse cuenta de que la reactividad de los antígenos en los tejidos es el progreso vamente perdido con la duración de la fijación. Una conservación óptima Tigen ocurre generalmente después de 4-6 horas de fijación . Por lo tanto , una muestra que ha empapado durante una semana o más en un frasco que contiene 10 % de formalina tamponada neutra puede dar una reacción negativa por inmunohistología , a pesar de que el antígeno estaba presente . Tenga cuidado con los falsos negativos !

Fijador de Bouin contiene ácido picnc y esto tiene efectos variables en los antígenos en los tejidos .

Aunque se podría suponer que la presencia del ácido dañaría las estructuras de antígeno , de hecho , el fijador de Boom mejora la antigenicidad de algunas hormonas , como la insulina , y de im

inmunoglobulinas . Como con - tamponada neutra para - malin , 4-6 horas de fijación proporciona la mejor preservación de antígenos.

Zenker es un fijador de antiguo que contiene cloruro de mercurio . B5 es un inure reciente fijador cloruro de mercurio que se utiliza para mejorar la tinción nuclear de neoplasmas linforreticulares . Además de proporcionar detalle nuclear preferida para el diagnóstico histopatológico , estos fijadores proporcionan una excelente preservación de antígenos de proteína . A diferencia de formalina neutra tamponada y Bouin , sin embargo, estos tejidos se fijarán foi : período más corto sof tiempo (2-4 horas ) para evitar la destrucción de los antígenos .

Con secciones congeladas de tejidos, tales como el riñón o la piel , etanol y acetona se utilizan comúnmente para preservar Los complejos inmunes . Estos tienden lodistort la histología , pero esto no es por lo general de importancia clave para determinar la localización de complejos inmunes en estos tejidos (véase más adelante ) .

Sólo se requieren unos pocos minutos para la fijación porque uno está tratando con cortes congelados delgadas.

El etanol es particularmente bueno en la preservación de antígenos , lo que explica por qué un método elaborado se empleó una vez el uso de etanol para fijar las muestras antes de la inclusión en parafina . Afortunadamente , uno no necesita recurrir a tales medidas elaboradas para detectar antígenos en los tejidos que no han sido fijados de manera óptima (aunque uno debe tratar de ajustar el tiempo y las técnicas de fijación de las muestras de rutina lo proporcionan resultados óptimos ) .

Última , incluso tejidos fijados en glutaraldehídoy incrustados en metacrilato se pueden utilizar para llevar a cabo la inmunohistología . Sin embargo , la expresión de antígenos por dichos tejidos es deficiente y requiere un esfuerzo especial para lograr sólo resultados marginales. La reactividad de los antígenos en secciones fijas y embebidos en parafina se puede mejorar mediante el uso de técnicas enzimáticas que se han dicho a " desenmascarar " antígenos en los tejidos .Comúnmente , las enzimas tales como la tripsina y proteasa V se han utilizado para mejorar la disponibilidad de los antígenos tanto en inmunofluorescencia y procedimientos inmunoenzimáticos . Digestión con pepsina es útil para desenmascarar la antigenicidad de las inmunoglobulinas , factor VIII , la fibronectina , la desmina , y el antígeno de membrana epitelial ( EMA ) . Desafortunadamente , hay un lado hacia abajo para el uso de enzimas para digerir los tejidos . Algunos antígenos se degradan rápidamente y pueden dar falsos negativos . Por lo tanto , no use la digestión de pepsina en la búsqueda de hormonas peptídicas pequeñas, como la insulina , el glucagón , una fetoprotem , antígeno carcinoembrionario , antígeno común de leucocitos, enolasa neuronal específica , antígeno prostático específico , y la proteína S100 . Otra forma de mejorar las técnicas inmunoenzimáticas es arreglar o REFIX tejidos en zinc sullate - formalina. Este es un precipitante de proteínas superior a la formalina neutra tamponada y preserva antígeno mejor así.

QUE MARCADOR DE USAR - inmunofluorescencia o IMMUNOCNZYINATIC ?

Si se opta por utilizar inmunofluorescenciacencia o técnicas inmunoenzimáticas depende en gran medida de lo que uno está tratando de lograr. Ambos methuds darán información muy específica y

ambos son dependientes de las interacciones anticuerpo-antígeno . Cuando uno requiere una sección permanente para estar disponibles para su revisión , técnicas lnimunoenzymatic son los procedimientos de elección. 1m -

munoperoxidase y otros immunoenzymes utilizan sustratos cromogénicos que permiten una sección relativamente permanente . Además, puesto que las técnicas de inmunoperoxidasa pueden ser evaluados por microscopía de luz , las secciones de tejido se pueden contador manchadas y se pueden distinguir diferentes tipos de células dentro de un tumor ( por

ejemplo). Sin embargo , debido a los pasos adicionales que implican incubación del sustrato y controles para la actividad enzimática endógena , inmunoperoxidasa es algo más caro , engorroso , y difíciles de estandarizar para la intensidad final de la tinción. Nuevos instrumentos automatizados están ahora disponibles thai procesará las secciones de tejido de manera eficiente.

A menudo, nos encontramos con que inmunohistología se utiliza para proporcionar una respuesta afirmativa o negativa a una pregunta de diagnóstico. Por ejemplo , si se desea determinar si una proliferación de células plasmáticas es monoclonal o policlonal , es poco probable que se podría mirar a esa sección en particular en una fecha posterior . Es algo análogo a la realización de un nivel de glucosa en suero durante una crisis diabética . El nivel de glucosa será alto o bajo dependiendo de la pizarra de los pacientes. De manera similar , la proliferación de células plasmáticas o bien ser monoclonal o policlonal será . Después de que uno tiene la respuesta, no hay razón para volver a evaluar la muestra particular .

El suero se descarta y la corredera también se descarta . Si se desea tener un registro permanente , se obtiene fácilmente una microfotografía . La inmunofluorescencia es el procedimiento de elección para detectar pequeños antígenos presentes en los tejidos , tales como los complejos inmunes . La mayoría de nephropathologists ,dermopatólogos y imunopaLhologists prefieren fdetectinginmunofluorescencia complejos inmunes en el riñón , la piel o biopsias intestinales.

Además , preferimos immunoflìarescence para detectar declaraciones sutiles, como Thase visto cuando pequeñas cantidades de PROTAN monoclonales reaccionan con biopsias de nervio sural (Véase más adelante en ts capítulo) .

Curiosamente , algunos mitos TLT que ser disipado envolvente [ l uso de técnicas de fluorescencia . Por ejemplo , hay una impresión general de que la fluorescencia fadts rápidamente y que los tejidos deben ser examinados withii , unas pocas horas afterstaining para ser útil. Esto es incorrecto. Es cierto que el fluorocromo perderá su intensidad con el tiempo , sin embargo , simplemente manteniendo las diapositivas fluorescentes en la iwfrigerator a 4 ° C , que se pueden ver durante semanas o meses con poco deterioro en la intensidad . Algunas de las microfotografías de este texto fueron hechos de láminas de vidrio que eran 6 meses de edad .

Otra desventaja de inmunofluorescencia es que uno requiere el uso de un microscopio especial para hacer la evaluación. Sin embargo , la mayoría de los laboratorios de patología clínica tendrán un microscopio tales disponible . El uso de este microscopio se discute más adelante en este capítulo. La mayor desventaja de inmunofluorescencia que hemos encontrado es que cuando uno utiliza una fuente de luz intensa ( bombilla de vapor de mercurio) , un rápido desvanecimiento del fluorocromo ocurre que no se pueden restaurar . Esto limita el tiempo que uno puede pasar el examen de una sección de tejido o la enseñanza de un colega.

INMUNOFLUORESCENCIA Y DIAGNÓSTICO DE TEJIDOS

En 1942 , Albert Coons comenzó el uso de anticuerpos fluorocromo - labcled mediante la demostración de neumococos - en secciones de tejido . La técnica no se popularizó hasta los años 1960 . Desde entonces , la aplicación de immunohiatology se ha convertido en una parte integral de la diagnosis de la función renal , dermatologie , y las condiciones inflamatorias de los nervios , así como de neoplasma en todo el cuerpo . El desarrollo de la tecnología de anticuerpo monoclonal en los últimos años ha ampliado en gran medida el número de reactivos disponibles para el sondeo estos tejidos .

Normalización de inmunofluorescencia es de gran importancia en la comparación de los resultados de un laboratorio a otro . Hay varios factores que son importantes en este . Para mejorar la correlación entre laboratorios , se formó un SUBCOMITÉ Organización Mundial de la Salud sobre la normalización de inmunofluorescencia que proporciona muestras de referencia que pueden utilizarse para estandarizar los ensayos en laboratorios individuales. Estos estándares se prepararon en el reconocimiento del hecho de que es prácticamente imposible para especificar una técnica estándar que se utiliza en todos los laboratorios que realizan ensayos específicos . Esto refleja la variabilidad en equipo, capacitación .y reactivos disponibles . Sin embargo , tener un reactivo estándar, que una agencia fiable determina que tienen reactividad apropiada , es una gran ayuda para acercarse a la normalización de los resultados . Para las pruebas , como el ANA ( véase el capítulo 9 ) reactivos positivos estándar con rango de títulos aceptables pueden ser proporcionados por los Centros para el Control de Enfermedades en Atlanta , GA . Mediante el uso de estas normas en el laboratorio , uno va a determinar rápidamente cómo realizar ensayos en comparación con un estándar aceptado .

PRINCIPIOS DE FLUORESCENCIA

El término fluorescencia describe el fenómeno que se produce cuando una sustancia ( unfluorocromo ) absorbe la energía de la luz, y en un breve penod de tiempo a partir de entonces , emite una parte de

esta energía como una segunda longitud de onda , más larga . La cantidad de energía en una forma de onda eleitromagnetic es inversamente proporcional a la longitud de onda . Durante la fluorescencia, la luz emitida tiene una longitud de onda más larga que la luz absorbida . Esto indica que algo de energía se pierde en el proceso .Thisis porque la transferencia de energía por la molécula no es completamente eficaz . El cambio de

longitud de onda usada para excitar el fluorocromo a la longitud de onda emitida desde que se llama un Stoke

cambiar . Cada fluorocromo tiene una longitud de onda óptima que se traducirá en la reconfi molecular

guracióneventuating en la producción de fluorescencia. El ( emocionante ) de longitud de onda más corta entre en la molécula y ( en este ejemplo) hace que los electrones para ser excitados a un nivel de energía ( exterior ) más alto ( Fig.19.1 ) . Sin embargo , esta nueva configuración molecular es inestable y , en un plazo muy breve período de tiempo ( 10 segundos -e ) , los retornos de electrones a su estado más estable. La energía liberada en la restauración al nivel de energía más baja es menor que la utilizada para la excitación como parte de la energía LHE

se utilizó en el proceso de excitación . Los fluorocromos comunes utilizados en nuestro laboratorio son fluoresceína y rodamina fluo (Tabla 19.1 ) .

Otro mito relativo inmunofluorescenciacencia es que hay que utilizar un ámbito micro ultravioleta para visualizar el resultado . La luz ultravioleta es más corta que 400 nm de longitud de onda. Como se ve en

Tabla 19.1 , los fluorocromos comunes son todos excitado por la luz con una longitud superior a 400 nm . Esta es la luz visible, no ultravioleta. La fluoresceína , por ejemplo , el fluorocromo más comúnmente utilizado ,

es excitado por la luz azul visible a una longitud de onda media excitador de 490 nm y emite luz visible verde a 520 nm. Rodamina , otra commonfluorochrorne menudo utilizado con fluoresceína para doble tinción en secciones de tejido , tiene una longitud de onda media de excitación de 540 Jim y emite un Redlight en una longitud de onda media de 570 nm .

La impresión errónea de que la fluorescencia requiere una fuente de luz ultravioleta puede remontarse a la utilización de bombillas de vapor de mercurio que producen una considerable luz ultravioleta y que han sido una parte estándar de microscopios equipados para microscopía de fluorescencia durante muchos años . Estos bulbos producen varios arcos intensas de iluminación en diferentes longitudes de onda. Dos arcos particularmente fuertes ocurren en el visible (aunque cerca de ultravioleta) longitudes de onda de 407 um y 435 mn . Al aunque estos no se encuentran en la longitud de onda óptima de excitación media de fluoresceína ( 490nm ) , su intensidad les permite excitar la molécula de fluoresceína . Otra característica exagerada de microscopía de fluorescencia es el peligro de la lámpara de vapor de mercurio , Es cierto que esta bombilla emite arcos soute en el espectro ultravioleta que dañaría la retina si se ven directamente . Debido a esto , el bulbo debe ser mantenida en su alojamiento y filtros debe ser en su lugar cuando el examen de especímenes . Al cambiar una bombilla , siempre tienen bulbo mar de nuevo en su vivienda o seguir las instrucciones del fabricante cuidadosamente para evitar mirar a la bombilla directamente . Si todo esto suena demasiado intimidante , recuerde que cuando uno sale a la calle , no hay que mirar al sol , que emite incluso redundará radiación ultravioleta potente ! Básicamente , siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando el sentido común , uno no puede estar en peligro mediante el uso de microscopía de fluorescencia con una bombilla de vapor de mercurio.

Uno no necesita usar una bombilla de vapor de mercurio para la visualización de algunos inmunofluorescencia re acciones. De hecho , uno paga un precio considerable para la intensa fluorescencia que se obtiene mediante el uso de la bombilla de vapor de mercurio . Los tejidos contienen muchas sustancias que son capaces de absorber las longitudes de onda , de alta energía más cortos que son producidos por las bombillas de vapor de mercurio . Cuando estas sustancias absorben la luz de alta energía ( UV cercano ) , que emiten una autofluorescencia que puede ser aire de fusión , aunque la microscopista experimentado en cuenta que es casi siempre de un color diferente que la producida por los fluorocromos usados comúnmente . Sin embargo , como la autofluorescencia puede hacer interpretación de inmunofluorescencia difícil. Otra desventaja de la excitación intensa proporcionada por las bombillas de vapor de mercurio es el hecho de que la intensa luz UV cercano puede alterar permanentemente la estructura de un fluorocromo que resulta en un proceso llamado desvanecimiento . El

desvanecimiento es un cambio permanente en el fluorocromo tal que ya no puede ser excitado . Cuando se mira en un campo bajo de alta potencia con una bombilla de vapor de mercurio y luego pasar a campo anadjacent , se observará que la intensidad de la fluorescencia en el primer campo se ha desvanecido . Aunque esto no suele afectar negativamente a la interpretación , que hace que sea difícil de enseñar a sus colegas cómo interpretar patrones de fluorescencia . Photomicroaphsaie una solución a este problema . Sin embargo , otra buena solución es utilizar una forma de luz menos intensa cuando uno está buscando en brillantes ¡ magos no requiere tal en la excitación de tensión para la detección.

Debido a las mejoras considerables en la óptica de los microscopios utilizados para iminunofluorescence en los últimos 20 años , ahora se pussil.le de utilizar una fuente de luz más suave para excitar la fluorescencia. Tanto la producción de mejores lentes del objetivo con aperturas numéricas altas ( 1,3-1 0.4 ), junto con la disponibilidad de la óptica Ploem (discutidos más adelante en este capítulo ) y filtros de interferencia permiten que se debe usar una sencilla lámpara de cuarzo halógeno para excitar la fluorescencia durante la mayor clínica muestras . Bombillas halógenas de cuarzo emiten luz sólo en el wavelegth visible. Ellos son mucho menos intensas que las bombillas de vapor de mercurio y tienen una vida útil mucho más larga . Se excita la fluorescencia de fluoresceína y rodamina . Debido a que son menos intensos , desvanecimiento se reduce dramáticamente y esto facilita la enseñanza.

TIPOS DE MICROSCOPIOS UTILIZADOS PARA INMUNOFLUORESCENCIA

El lo fundamental lograr la microscopía de fluorescencia óptima es maximizar el contraste entre las longitudes de onda emitidas emocionantes y de la luz. Dos enfoques se han utilizado para lograr este fin : microscopía de campo oscuro y de epifluorescencia ( iluminación Ploem ) . En microscopía de campo oscuro , la luz de la fuente pasa a través de un filtro primario , que selecciona la longitud de onda apropiada para la excitación del fluorocromo . Después de esto, la luz entra en un condensador de campo oscuro en el que se dirige a través de la muestra en un ángulo agudo ( fig. 19.2 ) . 1f no hay ningún objeto en la diapositiva , ninguna luz se dirige a través de la lente del objetivo y uno sólo verá un campo oscuro a través de la lente ocular.

Sin embargo, si un fluorocromo específico se encuentra en la placa de vidrio , la luz golpeará esta molécula y la luz emitida será enviada mn muchas direcciones, incluso a través de la lente del objetivo . Este objeto fluorescente se ve contra un campo oscuro , que optimiza el contraste. Hay dos tipos de condensadores que están disponibles para la microscopía de campo oscuro . El mejor tipo de condensador es uno que requiere la colocación de aceite entre el condensador y la parte inferior de la diapositiva que contiene la muestra de tejido . Esto da lugar a una transferencia más eficiente de la luz desde el condensador a través de la muestra .Desafortunadamente , el aceite es un poco desordenado si no se limpiaba a diario y muchos laboratorios prefieren usar la "seca" condensador de campo oscuro . Esto da una imagen decididamente inferior a la proporcionada por el condensador de aceite . Recomendamos el uso de un condensador de aceite. Por si fuera poco la limpieza diaria ( 1 minuto) y poner una pequeña pieza de un rebeco en él , nos encontramos con que el aceite no se convierta en un problema. La iluminación provista por la "seca" condensador de campo oscuro es inadecuada para el uso clínico .

Con microscopía de campo oscuro , el área de la corredera sistema de iluminación está determinada por el condensador . Por lo tanto , con bajo consumo de energía , todo el campo no puede estar lleno , pero la intensidad será muy fuerte . Como uno aumenta la fuerza de la lente objetivo , la intensidad se reducirá porque gran parte de la zona iluminada queda fuera del campo de visión. Por lo tanto , cuando uno necesita para llevar a cabo la microscopía de alta potencia en busca de una lesión sutil , la intensidad de iaminaciónillu como mínimo por micros de campo oscuro de la copia , a pesar de las observaciones de baja potencia , como en busca de fluorescencia treponemas en el FI'A prueba, por ejemplo, se ve facilitada por la iluminación brillante . Iluminación Ploern( epifluorescencia ) fue de firmado para optimizar la intensidad de fluorescencia para la microscopía de alta potencia . Como se muestra en la figura 19.3 , de epifluorescencia tiene una configuración diferente del microscopio con la fuente de luz en el lado del tubo de microscopio en lugar de debajo de la muestra . La clave para el rendimiento de epifluorescencia es el uso de un tipo especial de filtro de interferencia llama un espejo dicroico , tiene dos funciones . Refleja la luz por debajo de una cierta longitud de onda ( 500nm para decir fluoresceína) y permite la luz por encima de esa longitud de onda de pasar a través de él ( Fig.19.3 ) . En el caso de la fluorescencia de la fluoresceína , a continuación , la luz azul ( < 500 nm ) se reflejaría hacia abajo a través de la lente del objetivo y se centró en la muestra. La luz emitida emocionados por la molécula de fluoresceína será la luz verde que es

> 500 nm . Por lo tanto , se desplazará a través de la lente del objetivo y pasar a través del espejo dicroico a la lente del objetivo . Cualquiera de la luz azul incidente que puedan ser reflejados por el tubo del microscopio , no se les permitirá pasar a las ocularlens .

Observe que la lente del objetivo está actuando como el condensador en esta situación. Por lo tanto , a baja potencia, la luz se difunde ampliamente y sólo los resultados de fluorescencia débiles. Como resultado, cuando se desea analizar se desliza debajo de baja potencia para micobacterias o treponemas ,epifluorescencia dará sólo una imagen débil. Sin embargo , a alta potencia , LHE luz se enfoca intensamente sólo en el campo de interés y se consigue una iluminación brillante .

USO DE FILTROS EN microscopía de fluorescencia

Ambos filtros de vidrio de color y filtros de interferencia se utilizan hoy en día. Filtros de vidrio de colores , como FC12 son un tipo más antiguo de filtro. Ya no se recomienda para los microscopios de fluorescencia , aunque la literatura mostrará muchas referencias a su uso. Cuenta con un pase relativamente amplia mano que es ineficiente para microscopía fluorescenec . Ha sido prácticamente sustituido en nuevos microscopios de filtros de interferencia , que tienen un área más estrecha en la que permiten que la luz pase . Son ideales para la selección de las longitudes de onda de los estudios de inmunofluorescencia .

En el desempeño de inmunofluorescencia , la luz inicial producida ya sea por la lámpara de cuarzo halógeno o la bombilla de vapor de mercurio, debe pasar por un (excitación ) del filtro primario . Este filtro seleccionará la luz adecuada para excitar el fluorocromo utilizado mancha tri el tejido , si el tejido tiene el fluorocromo adecuado , emite la longitud de onda fluorescente más larga , que se reunió por la lente del objetivo . La longitud de onda de excitación inicial también será proyectada en la lente del objetivo .

Sin embargo , el proceso de la fluorescencia es muy ineficiente y sólo una pequeña cantidad de luz fluorescente está presente en relación con la cantidad de la longitud de onda más corta excitante . Por lo tanto , un observador ve la diapositiva a través del lente ocular sólo vería la excitante luz azul para la fluorescencia de fluoresceína , no la pequeña cantidad de luz verde del fluorocromo en el tejido. Una analogía sería como tratar de detectar una bombilla celebrada con el sol como fondo. Por lo tanto , un sistema de fibra secundaria debe ser utilizado para bloquear la luz de longitud de onda más corta permitiendo al mismo tiempo la longitud de onda fluorescente para pasar a través . Esto se llama el filtro secundario o de barrera ( figs. 19.2 y 19.3 ) . Una variedad de filtros secundarios están disponibles para permitir que solamente las longitudes de onda fluorescentes que se desean .

Métodos de tinción INMUNOFLUORESCENT DIRECTA E INDIRECTA

Hay dos técnicas que se utilizan comúnmente para teñir antígenos en el tejido sections.For ambas técnicas .es importante para controlar la concentración de los reactivos de anticuerpo utilizado y para controlar la fuerza iónica y pH del tampón . Si el pH no es óptima , se producirá quciiching de la fluorescencia . En los casos en los que se utilizó tampón correctos , el enfriamiento puede ser mejorado mediante la incubación del tejido en el tampón adecuado y la sustitución de la cubreobjetos sobre el portaobjetos . Colocación de los tejidos a la diapositiva es de importancia crítica en este procedimiento. Si se utilizan los tejidos congelados , por lo general hay un pequeño problema con los tejidos adherirse a los procedimientos completos de tinción y lavado . Sin embargo , si se utilizan tejidos fijados , embebidos en parafina , no es un problema considerable en la retención de los tejidos a través de la desparafinación , la digestión de la enzima , tinción , y los procedimientos de lavado . Dos métodos sencillos son recomendados para mantener los tejidos en las diapositivas. El más simple implica el uso de cualquiera de SOBO (mon de Sb ) pegamento o pegamento de Elmer en el agua. Mezclar una parte de pegamento SOBO con cuatro partes de agua . Aplicar esto a las diapositivas que se van a utilizar para recoger las muestras. Después de secar el pegamento , las diapositivas tal vez se almacenaron a temperatura ambiente y se utilizan en cualquier momento. Nos parece que esta técnica sea muy satisfactorio y prefieren el pegamento SOBO (que es demasiado barato para ser vendidos en los catálogos de suministros médicos; ir a una tienda local de la manía de comprar el suministro de un año por alrededor de $ 5,00) . Un método para el pegamento de Elmer en involucra poniendo 10 ml en un baño de agua con aproximadamente 2 litros de agua destilada . El agua se calienta a 43 ° C y las secciones de parafina se flotaba en el baño , por rutina , y son recogidos en la diapositiva . Las secciones deben ser calentados en un horno a 37 ° C durante la noche o a 60 ° C durante 15 minutos . Un newermethod implica diapositivas de recubrimiento con poli-L - lisina para mantener los tejidos adherentes .

El método de tinción más fácil es la inmunofluorescencia directa (Fig. 19.4) . Para esta técnica , una sección de tejido se incuba con un anticuerpo para el antígeno particular de interés . Dilución del anticuerpo debe ser determinado mediante el uso de diluciones en serie en una diapositiva que contiene un antígeno positivo conocido . La mayor dilución que da la reactividad fuerte ( 4 + en la escala arbitraria 0-4 menudo utilizado para la intensidad de la

fluorescencia de grado ) se debe utilizar para el procedimiento . Si se utilizan mayores concentraciones de anticuerpos , que aumentará las posibilidades de tener tinción no específica de antígenos no relacionados o parcialmente relacionados en el tejido. Anticuerpos a sí mismos tienden a ser " pegajosa ", de tal manera que cuando se utiliza en muy alta concentración , que no específica se adhieren a los tejidos . Además, los reactivos tienden a ser caros y el uso de una concentración demasiado alta sería un desperdicio . Un factor crítico en todas las reacciones de tinción inmunológica ( fluorescentes o peroxidasa ) es mantener la moist.Drying tejido en cualquier momento, mientras que el reactivo se encuentra en los tejidos produce artefactos que a menudo son difíciles de leer alrededor. Para mantener los tejidos húmedo durante el procedimiento , se utiliza una cámara de humedad . Esto puede ser simplemente una caja de plástico con un papel de filtro en la parte inferior . El papel de filtro se empapa con agua y los portaobjetos se colocan en aplicadores utilizados para mantener las diapositivas en el papel ( que podría actuar como una mecha para el reactivo si las diapositivas no estaban elevados ) . Las secciones de tejido deben estar cubiertas completamente con el reactivo y la tapa de la caja cerrada durante el periodo de incubación para retener la humedad . Si no se cubre completamente el tejido es una fuente de tinción falso negativo .

Después de la incubación de la muestra durante 20-30 minutos a temperatura ambiente , las secciones se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, pH 7.2 a 7.4 . El lavado es de importancia crítica . Si se encuentra que los tejidos tienen demasiado fluorescencia de fondo , intente aumentar el número de lavados , la cantidad de agitación , o la disminución de la concentración de anticuerpo reactivo utilizado . Cualquiera o todos estos pasos puede que de importancia . El número de lavados con tampón moie es importante que la duración de cada lavado .

Los tejidos se montaron con un cubreobjetos y IE Ther de dos soluciones . Para diapositivas temporales , o diapositivas que se puede desear restam con otro reactivo , s 09:01 mezcla de PBS con glicerol servirá muy bien . Los productos comerciales de este también están disponibles . Cuando quisimos mantener diapositivas "permanentes" , se utilizó el esmalte de uñas para pintar los bordes de las láminas. Sin embargo , cuando llegué a ser demasiado embargos

acosados comprar el esmalte de uñas en la farmacia , me enteré de la técnica Elvanol para formar secciones fijas . Elvanol es una solución de montaje permanente para inmunofluorescencia que exige que , después de la última etapa de lavado , los portaobjetos se secaron completamente (se utiliza un secador de pelo ) .

La inmunofluorescencia indirecta implica un procedimiento de doble tinción (Fig. 19.5 ) . Es el ensayo más común usado cuando las pruebas de autoanticuerpos en el suero . Sin embargo, también es una técnica útil para buscar antígenos específicos en las secciones de tejido bajo una variedad de circunstancias .

Cuando los anticuerpos se conjugan con fluoresceína ( operoxidasa ) , pierden algo de su actividad de unión al antígeno . Además, si sólo hay unos pocos determinantes antigénicos en la sección de tejido , sólo un número limitado de moléculas de anticuerpos podrán adjuntar al antígeno. Mediante el uso de inmunofluorescenciaindirecta , se puede aumentar el número de anticuerpos marcados que se unen al tejido aumentando de este modo la señal específica para

ser observado . Con inmunofluorescenciaindirecta , el primer anticuerpo ( por ejemplo , conejo antihumano de IgA ) aplicada a la sección de tejido tiene especificidad para el antígeno de interés , pero no está conjugado con fluoresceína . Después de un 20 - . De incubación a 30 minutos seguido de un lavado con PBS ( como se discutió anteriormente con inmunofluorescencia directa ) , el tejido se trata con los anticuerpos de gripe orescein - conjugado contra el primer anticuerpo ( tal vez un immunoglobulirilanticonejo de cabra Como se muestra en la Figura 19.5 , esto tendrá el efecto de aumentar la señal mientras que muestra la misma ieactivity específica que la del anticuerpo primario Después de otro 20 - . de incubación de 30 minutos con este anticuerpo secundario , las secciones se lavaron de nuevo y montado con un covership , como se describió previamente . Hay algunas desventajas con inmunofluorescenciaindirecta .en primer lugar, la técnica requiere más tiempo para realizar que la fluorescencia directa debido a la etapa de tinción adicional. en segundo lugar, es más difícil de controlar que la técnica directa . Una valoración de tablero de ajedrez debe configurarse cuando nuevos lotes de antisueros son recibidos .las diluciones de los antisueros tanto primaria y secundaria deben analizarse en portaobjetos que contienen el antígeno de interés . en tercer lugar, debido a la sueros anti adicional , las posibilidades de tener reactividad cruzada no específica se incrementan . Por último, es difícil llevar a cabo reacciones de doble tinción (utilizando dos fluorocromos -ver más adelante en este capítulo) cuando se utiliza la inmunofluorescencia indirecta technique . No obstante , la fluorescencia indirecta puede ser de gran importancia cuando se manche los tejidos que tienen sólo pequeñas cantidades de antígeno o que han tenido el antígeno alterado. Por ejemplo , en un estudio que estábamos realizando en el colon metacrilato embebido , hemos querido teñir las células plasmáticas IgA - que contienen . Sólo después de fluorescencia indirecta fuimos capaces de visualizar estas células.

APROXIMACIÓN A microscopía de fluorescencia

En la resolución de problemas de las técnicas de fluorescencia , hay varias cosas sencillas para comprobar la hora de estudiar una muestra de tejido . Cuando se utiliza de campo oscuro de fluorescencia , se puede alinear la muestra usando baja potencia , por mucho que se puede hacer con la microscopía de campo claro . Sin embargo , con la iluminación Ploem , puede haber suficiente luz en ese magnificación para ver delicada de fluorescencia , por lo tanto , un nivel medio ( 20 X ) o incluso de alta potencia ( 40 X ) objetivo puede ser usado para alinear la muestra para examen . 1f la imagen es demasiado oscura, compruebe si el condensador está enfocada (por campo oscuro ) , y compruebe si los filtros adecuados estén en su lugar ( muchos microscopios tienen múltiples filtros que puede que se utilizan para la fluorescencia ) . Sólo se deben utilizar filtros de interferencia de fluorescencia óptimas cencia , si se han utilizado los filtros de vidrio BG12 mayores, cambiarlos ! Aligiiment de la bombilla y del espejo que refleja también son de importancia crucial en la obtención de fluorescencia adecuado. 1f uno no está seguro acerca de este procedimiento, un representante de la empresa microscopio puede demostrar el procedimiento para que el microscopio. Por último , no perder de vista el tiempo que cada bombilla de vapor de mercurio está en uso. Contamos con

un temporizador automático que se enciende cuando la lámpara está encendida. Un libro de registro se podría mantener , pero cuando hay varios usuarios del ámbito , como en nuestro caso , no podía estar seguro de que todo el mundo conectado y fuera precisa. Cuando lleguemos a 100 horas , cambiamos la bombilla. Esto evita el deterioro de la clasificación fluorescente como las edades de bulbo.

Las aplicaciones clínicas de microscopía de fluorescencia de secciones de tejido

Las aplicaciones más comunes incluyen el examen de las biopsias renales y de la piel para detectar la presencia de depósito de complejos inmunes o de reacciones de anticuerpos específicos.

En el examen de las biopsias renales , los resultados deben ser correlacionados con la microscopía óptica, microscopía electrónica , y el cuadro clínico . Dado que estamos buscando depósitos de complejos inmunes en los glomérulos o anticuerpos contra la membrana basal glornerular con esta técnica, una muestra se considera inadecuada para el estudio si no contiene glomenili . En aquellas ocasiones en que la muestra de tejido que había sido congelado para el estudio carecía de glomérulos , hemos sido capaces de obtener satisfactoria (aunque no óptima ) resultados mediante el uso de las muestras de tejidos embebidos en parafina fijado en formol para estudio. Estos hicieron necesario digerir los tejidos con una proteasa .

Cuando se examina el riñón , que tiñe los tejidos con anticuerpos IgG , IgA, 1 g , C3 , C4,

factor de properdina B , fibrinógeno , y la albúmina . El anticuerpo para albúmina nos da una indicación de la cantidad de tinción de fondo que puede observarse en los glomérulos ; Flote que, en muchos pacientes , los gránulos de reabsorción dentro de los túbulos contorneados proximales mancharán con esta re

agente . El glomérulo se examina para la presencia de complejos inmunes , la ubicación de los complejos inmunes , y el tipo particular de antisueros que reacciona con ellos . La ubicación de complejos inmunes puede ser mesangial , capilar glomerular , ambos, o que rodea a los túbulos . Los complejos pueden ser finamente granular u ordinario . El tipo específico de anticuerpo depositado variará dependiendo de la enfermedad .Curiosamente , aunque ahora se sabe que es una de las inmunoglobulinas más comunes que de depósito , la IgA se pensaba que era poco común hasta los últimos años . Los controles positivos para cada reactivo deben ejecutarse cada vez que se ejecuta una muestra desconocida .

La gran mayoría de glomerulonefritis se asocia con la deposición de complejos inmunes .

El tipo y la ubicación de estos son útiles en la clasificación de la enfermedad . Cuando los depósitos se encuentran en el marco de apoyo de los glomérulos ( elmesangio ) , que son generalmente gruesas y han derivado de los complejos preformados en la circulación . Cuando los depósitos se encuentran en la membrana basal glomerular GB , que pueden haberse formado in situ o pueden derivar de la circulación .

Estos depósitos pueden ser finamente granular u ordinario dependiendo de qué enfermedad se trata y en qué etapa de la enfermedad está siendo muestreado. Alrededor del 5% de los

casos de glomerulonefritis se asocia con un patrón lineal de la fluorescencia a lo largo de la pared capilar glomerular . Esto es debido a la presencia de anticuerpos dirigidos a determinantes en la membrana basal glomerular ( ver de Good - pastos enfermedad - Capítulo 8 ) . Por desgracia , a menudo se puede encontrar gran deposición de inmunoglobulinas inespecíficas en enfermedades como la diabetes mellitus o cuando uno tiene glomérulos escleróticos . Como se dijo anteriormente , sin embargo , una interpretación nunca debe ser basedsolely en los hallazgos de los estudios de inmunofluorescencia , pero debe tener en cuenta las conclusiones de luz microscópicos, pruebas de microscopía electrónica , y el cuadro clínico. En las biopsias de piel , uno está también preocupado por el depósito de complejos inmunes y con la reactividad de anticuerpos a los antígenos específicos en la sección de tejido . Los anticuerpos específicos de interés involucrar a las personas en contra de los puentes intercelulares en pacientes con vulgarispeniphigus .Aquí ,IgG reacciona con la sustancia intercelular de la epidermis . También ,Clq , C3 , y C4 se pueden encontrar en las lesiones . Esto está en marcado contraste con los resultados en los pacientes que tienen huilonspenfigoide( véase el capítulo 8 ) . En esta última condición , el depósito lineal de IgG se encuentra en la unión dermo-epidérmica . UNCEM ìssonly , 1GM e IgAantihodies a la membrana basal también se han encontrado en pacientes con penfigoide ampollar . Deposición de C3 se encuentra siempre en estas lesiones , haciendo hincapié en el papel que juega la activación del complemento en este proceso. Clq , C4 y properdina factor B también están a menudo presentes en la zona de la membrana basal de los pacientes con penfigoide ampollar . Un patrón diferente de fluorescencia se ve con los pacientes que sufren de dermatitis herpetiforme . Estos individuos muestran una deposición globular de IgA en la punta de la papila dérmica . [ . ESS comúnmente , se ve complemento . Aquí , C3 puede estar presente en la piel que es adyacente a vesículas , pero , a diferencia de penfigoide , dermatitis herpetiforme en , Clq deposición es poco común . En los pacientes con herpes gestacional , sólo C3 se encuentra a lo largo de la unión dermo -epidérmica de una manera lineal . La prueba de banda de lupus se ha convertido en uno de los procedimientos más útiles para diagnosticar el lupus eritematoso . Para ello, una biopsia de la piel no lesionada se encuentra que tiene un depósito lineal de IgG , C3 a menudo , en la unión dermo-epidérmica . Inimunofluorescence también es útil para detectar otras anomalías . En los últimos años , se ha encontrado que los pacientes con neuropatías periféricas o centrales pueden tener anticuerpos monoclonales a la glicoproteína asociada a la mielina . Estos pueden ser detectados en el suero mediante el uso de alta resolución de electro foresis y inmunofijación , pero pueden ser ignorados por los 5 - banda mayores técnicas electroforéticas . Una biopsia de nervio sural mostrará la deposición de la immunogbobulin monoclonal a lo largo de las porciones mielinizadas de algunas fibras nerviosas . Utilizamos una técnica de doble tinción para asegurar la dad específica de la reacción observada . Para ello, se tiñe el tejido primero con la cadena K anti-humana conjugada con fluoresceína , lavar el tejido con PBS, y luego mancharlo con la cadena K anti-humano conjugado con rodamina . Cuando se examina el tejido , buscamos deposición de color rojo o verde en las áreas de mielina . 1f encontramos tanto la deposición de color rojo y verde , no podemos estar seguros de si hay un proceso policlonal específico que reacciona con nervio o si simplemente estamos viendo la tinción inespecífica . Ya que hemos visto tinción débil con los dos reactivos en casi todas las muestras. sólo interpretamos los queridos con tinción discreta de un tipo de cadena ligera como definitivo para la deposición de inmunoglobulinas. Cuando se examinan otras secciones que

han sido teñidas con los de la cadena de iso- tipos pesados , por lo general revelan la presencia de 1 g . De vez en cuando , hemos visto IgG deposición. Cuando se observa este patrón, se recomienda siempre realizar una evaluación de suero para la gammapatía monoclonal s . Doble tinción con fluoresceína anti- K y rodamina anti- K también es útil para documentar una proliferación linfoplasmacítico monoclonal en tejidos . Desde biopsias de tejido están bañadas en el suero que contiene altas concentraciones de immuneglobulins , células muertas o células de tejido pobremente procesados pueden contener considerables inmunoglobulina . Si la sección de tejido se tiñe de un solo tipo de inmunoglobulina, uno no puede estar seguro de si la inmunoglobulina es en la celda porque se hizo allí o porque se difunde en la célula muerta o muriendo durante el procesamiento del tejido. Sin embargo , si sólo un isotipo está presente , es mucho más probable que nos encontramos ante un producto de esa célula. Tenga en cuenta que mientras que podemos determinar si las lesiones son monoclonal o policlonal , no podemos predecir su comportamiento biológico . El concepto de una gammapatía monoclonal de significado incierto , es importante recordar ( véase el Capítulo 12 ) , cuando en terpreting estas lesiones.

Cuantificar el número de células plasmáticas en el tracto gastrointestinal también puede proporcionar información útil. Los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal crónica activa suelen tener tanto la inflamación aguda, así como un mayor número de células plasmáticas en la lámina propia comparación con el control de colon. Sin embargo , los pacientes con colitis autolimitada aguda a menudo tienen una imagen similar de la inflamación escudo , pero carecen de los antecedentes de células inflamatorias crónicas y de plasma . Mediante la realización de inmunohistología por tejidos fijados - mutilar, embebidos en parafina para determinar el número de células de inmunoglobulina que contiene , se puede proporcionar evidencia a favor de una de estas alternativas.

Inmunofluorescencia también es útil para detectar microorganismos en secciones de tejido . La mayoría de estos procedimientos involucran el uso de antisueros para un microorganismo específico y la incubación con la sección de tejido para un resultado específico . De vez en cuando , el patrón de reactividad puede ser útil para confirmar un diagnóstico . Por ejemplo , en el raro trastorno sistémica conocida como enfermedad de Whipple , la lámina propia del intestino se llena con mac

rophages y otras células que contienen numerosos microorganismos en forma de varilla . Estas bacterias Liase

no ha crecido con éxito en el cultivo de tejidos y no tiene, por lo tanto , completamente caracterizado . Sin embargo, dos características son generalmente aceptados como defirniig el mic !OorganisiÏ . En primer lugar, tiene mediciones distintivos por microscopía electrónica , que son únicos para estas bacterias .

En segundo lugar, contiene un patrón de reactividad de antígeno que se ha encontrado para ser constante a partir de un caso a otro . Por lo tanto , si usted tenía un caso en el que se sospecha el diagnóstico de la enfermedad de Whipple , pero el tejido fresco no estaba disponible para la microscopía electrónica, la inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti- sueros a los antígenos que suelen encontrarse en esta bacteria podría realizarse rápidamente.

MÉTODOS inmunoenzimático

Técnicas de inmunoperoxidasa se han convertido en un pilar para proporcionar diapositivas permanentes que pueden ser vistos por microscopía de luz para hacer un diagnóstico de tejido. Una clara ventaja de este tipo de prepa ración es que la mayoría morfólogos sienten más cómodos mirando a la microscopía de campo claro de st microscopía de campo oscuro . Es más fácil para orientar a un área particular de la corredera con microscopía de campo brillante . Los tejidos pueden ser de contraste con reactivos conocidos Vanous , tales como hematoxilina , proporcionando de este modo una visión más familiarizado . Desde las diapositivas producidas son " pennanente , " que puedan ser enviados a sus colegas para una segunda opinión ; además , se pueden realizar estudios retrospectivos mediante técnicas de inmunohistoquímica . Hay muchas formas diferentes de métodos de tinción inmunoenzimáticos que vamos a describir. Sin embargo , la base en general es la misma . A través de algún mecanismo , que emplean entre antígeno-anticuerpo

320 .... (y un poco de literatura actual! ) erróneamente se afirma que los métodos inmunoenzimáticos son la única manera de manchar , tejidos embebidos en parafina fijado en formol . Realmente refleja el efecto potenciador dramático de la técnica de PAP . La única DIS principal ventaja de esta técnica es que requiere un tiempo considerable para realizar y que el número de manipulaciones implicadas aumenta la probabilidad de error técnico .

La avidina - biotina-peroxidasa de tinción

El siguiente avance importante en inmunohistoquímica fue el reconocimiento de que la fuerte interacción de unión entre el huevo blanco avidina y la biotina vitamina podría ser explotada para mejorar la reacción de inmunoperoxidasa . Cuando avidina es CON conjugada a peroxidasa de rábano picante , IL todavía reacciona fuertemente con biotina conjugado con una inmunoglobulina . Dependiendo de lo que se dispone de reactivos , esta reacción puede realizarse en un directo o un ensayo indirecto . Es decir, el anticuerpo inicial dirigido contra el antígeno se puede conjugar con biotina ( fig. 19.9 ) . Después de la incubación , se añadió avidina conjugada con peroxidasa . Alter nativa , un anticuerpo primario sin conjugar se puede usar seguido por un anticuerpo secundario , que está conjugado con biotina . Entonces , el reactivo conjugado con avidina se puede añadir , seguido , después de un paso de lavado , por el sustrato cromogénico . Al igual que con los métodos indirectos de la peroxidasa , el siguiente paso en la evolución de los métodos de immunoenzyinatic era para formar un complejo de avidina con rábano picante conjugada con peroxidasa biotina ( complejo avidina-biotina o

ABC ) ( fig. 19.10 ) . Esto tiene el efecto de multiplicar en gran medida el número de moléculas de peroxidasa presentes por cada anticuerpo primario unido . La sensibilidad es similar a la de el método de Papanicolau. La única desventaja se refiere a la presencia de biotina en algunos tejidos , lo que puede dar tinción de falsos positivos .

Proteína A peroxidasa de tinción

Recientemente, otras modificaciones de los métodos de detección han utilizado la proteína A ( que se une a la porción Fc de la IgG ) para llevar a la ecule moles peroxidasa ( fig. 19.11 ) . Este método tiene una ventaja sobre el método ABC en que la proteína transportadora de la peroxidasa se une naturalmente a la inmunoglobulina . A pesar de que se une a IgG de varias especies , lo hace con diferentes fortalezas vinculantes. Además, se une poco o nada en absoluto a otros isotipos .

SUSTRATOS

Dos sustratos principales se emplean actualmente para inmunohistoquímica . Todos los reactivos tienen algunas características nocivas . Use guantes . No se conoce ningún riesgo de neoplasia senous cuando los reactivos se utilizan con el sentido común y de acuerdo con las instrucciones del fabricante . De lejos , el mejor sustrato es 3,3 ' cliaminobenzidinetetrahidrocloruro (DAB ) . Su producto crujientes ,dark es permanente y fácil de leer. Además, dado que es estable en disolventes orgánicos , se puede contratinción con una variedad de colorantes .

El otro sustrato comúnmente usado para por - oxidasa es 3 - amino - 9 - etilcarbazol( AEC ) . Un como DAB , AEC es soluble en disolventes orgánicos y , por lo tanto , el color rojo ladrillo se filtrará fuera de los tejidos ; la tasa de la pérdida de color dependiendo del medio usado para LHE cubreobjetos los tejidos . La popularidad de AEC relacionados a la preocupación por la seguridad de DAB , en lugar de a cualquier superioridad de AEC para su uso en este método . No importa la forma en que se lleva a cabo , las reacciones Ing- doble manchas son mucho más torpe para realizar por inmunohistoquímica, que con inmunofluorescencia. Sin embargo , los resultados satisfactorios se pueden obtener con el 4 - cloro - estrategias sub naftol , que da S Color azul . Sin embargo , si se desea de doble tinción , se prefiere usar inmunofluorescencia .

INMUNOPEROXIDASA EN TEJIDO DE DIAGNOSTICO

La inmunohistoquímica se usa más a menudo para distinguir tipos de células en neoplasma .

ONCOFETALES ANTÍGENOS

Antígenos oncofetales se expresan normalmente temprano en el desarrollo fetal, pero desaparecen con el tiempo , al igual que la hemoglobina fetal. La expresión del antígeno Oncofetal puede ser prominente de nuevo en algunos tejidos neoplásicos. Anticuerpo contra el antígeno carcinoem embrionaria (CEA ) fue uno de los primeros utilizados Se pensó originalmente para ser específico para el carcinoma de colon "marcadores tumorales ". , Sin embargo , ahora está claro que los males CEA no es más que una glicoproteína asociada al tumor , lo que también ocurre en de colon humano normal e inflamado. Concentraciones de CEA se incrementan considerablemente en varios tipos de tumores como el de colon , de mama, de pulmón , y tu carcinoma ( medular) roid . CEA se ha usado en combinación con n . EMA (véase más adelante en este capítulo) manchas mesoteliomas mientras que el CEA no lo hace. En contraste, los adenocarcinomas ( risually el principal diferencial para el mesotelioma ) son a menudo CEA positivo. a-fetoproteína ( AFP ) es otro oncofetalcoproteinGly que se encuentra principalmente en el hígado fetal y el endodermo del saco vitelino . AFP ha sido utilizada para manchar los carcinomas hepatocelulares y de las células germinales ( del seno endodérmico o saco vitelino ) tumores .

Gonadotropina coriónica humana (hCG ) es producida en grandes cantidades por la placenta y se mide en las pruebas de embarazo (ver Capítulo 16 ) . Sin embargo , [ ICC está también producido por neoplasma trofoblástica y se examina tanto en el suero y en secciones de tejido de pacientes con carcinoma de chono .

Intermedio Filamento Marcadores Citoqueratinas( queratinas ) están presentes como componentes del citoesqueleto de la mayoría de las células epiteliales ( no sólo el epitelio escamoso ) . Varios anticuerpos monoclonales contra diferentes subclases de queratinas citocinas están disponibles . El uso de algunos de estos anticuerpos monoclonales puede ser particularmente útil en el estudio de los tumores pobremente diferenciados . Por ejemplo , los carcinomas generalmente se mancha positiva para citoqueratina 57-66 kD o una citoqueratina 54 kD reconocida por los anticuerpos monoclonales 34 ® E12 o 35 ) H11 , respectivamente, mientras que neoplasmas linforreticulares y melanomas no lo hacen. Desmjn es un filamento intermedio que está presente tanto en el músculo liso y esquelético . Vi Mentin es un filamento intermedio que está presente en una amplia variedad de células, incluyendo el músculo liso , endotelio , y fibroblastos . En consecuencia ,vimentina no es tan útil para distinguir los tumores diferenciados de la ONU , mientras que la desmina es útil en la identificación de neoplasma del músculo liso y esquelético . La actina es una proteína contráctil que ha sido particularmente útil en la identificación de músculo liso .

LOS MARCADORES ENDOCRINOS

Estos marcadores se pueden dividir en dos clases: los marcadores generales y mercados específicos. Marcadores generales incluyen cromogranina( que tiñe más tumorsi neuroendocrino y enolasa neuronal específica (NSE ) ( que también tiñe neoplasmas neuroendocrinos más pero es menos específica que la cromogranina ) . Cromogranina es más específica para tumores neuroenclocnne porque reacciona con proteínas localizadas dentro de los gránulos secretores de muchas células endocrinas .en contraste , NSE es una isoenzima de la enolasa que se encuentra tanto en las células neuroendocrinas y algunos otros tejidos en

INCLUYENDO muscular

. Marcadores endocrinos específicos se refieren a los productos de hormona específicos de los tumores . Los marcadores endoctine específicos más útiles incluyen la calcitonina (para medullarv carcinoma de la tiroides) , la hCG (por neoplasias trofoblásticas [véase antes en este capítulo ] ) , tiroglobulina ( para el carcinoma de tiroides metastásico) , y otras hormonas polipeptídicas. La calcitonina es particularmente útil en la detección de la fase temprana de la hiperplasia de células C , que se cree que es un precursor del carcinoma medullsry en el síndrome de neoplasia endocrina múltiple . Para los tumores de células de los islotes del páncreas , el tipo de hormona producida puede tener importancia pronóstica. La mayoría de gastrina , glucagón , somatostatina y tumores productores son malignos mientras que la insulina y los tumores de polipéptidos pancreáticos que producen tienden a ser benignos .

LOS MARCADORES HEMATOLÓGICOS

Con el crecimiento de la citometría de flujo como una herramienta de diagnóstico , muchos anticuerpos monoclonales han sido producidos para detectar moléculas en las superficies de los leucocitos , que ayudan a definir su linaje y de la etapa de maduración . Algunos de estos marcadores son útiles en tejidos fijados y embebidos , mientras que muchos de ellos se utilizan solamente en una sola célula suspensiones o en secions congelados debido fijación e inclusión destruye los determinantes antigénicos que detecten . contendría sólo negro o cadena X) fi - orn una proliferación policlonal. Sin embargo , en , tejidos embebidos en parafina fijados con formalina , sólo inmunoglobulina citoplásmica se tiñe de forma fiable en la medida en inmunoglobulina en el suero se adherirá a la superficie de los linfocitos B por lo que es casi im posible detectar monocloriality por este medio . sin embargo . en secciones congeladas , superficie globulina imiituno y otros antígenos se conservan mejor y, en ocasiones , proporcionar información útil. Se utiliza una doble fluoresceína anti- K y rhodainine técnica anti- X para detectar monoclonales proliferaciones de células plasmáticas en los tejidos , incrustadas fijas.

Otro marcador útil que puede ser detectado en tejidos fijados , embebidos de rutina es terminal

transferasadeoxyribonucleotidyl ( TdT ) . Desgraciadamente , la preservación de este antígeno en los tejidos es variable y , por lo tanto , sólo un resultado positivo presenta información útil. Material fijado en el

B5 no sólo proporciona una mejor histología para eva UACIÓN neoplasma hematolinfoide , pero por lo general ofrece la mejor preservación de antígenos de leucocitos . Leu ml se promociona originalmente como un marcador altamente específico para las células de Reed -Sternberg en pacientes con enfermedad de Hodgkin . Este no es el caso . Sin embargo , uno de los mejores usos de este antisuero ha sido distinguir adenocarcinonias ( que se tiñen positivamente ) de mesoteliomas o melanomas ( que no reaccionan con Leu -ML ) .

La mejor manera de determinar la clonalidad de proliferaciones reticulares linfo es examinar reordenamiento de cualquiera de los genes de células T o genes de inmunoglobulina por análisis de transferencia Southern .

MARCADORES TUMORALES GENITOURINARIOS

Los marcadores más útiles son el antígeno prostático específico ( PSA) , la fosfatasa ácida prostática (PAP ) para el cáncer de próstata, y hCG (véase antes en este capítulo ) para coriocarcinoma. PSA y PAP no son específicos para el cáncer de prostste porque están presentes en las glándulas normales y los niveles séricos a menudo son elevados en condiciones benignas e inflamatorias . Sin embargo , la detección inmunohistoquímica de PSA o PAP en los focos metastásicos puede ser muy útil . Además, los niveles séricos de PSA cuantitativos se correlacionan bien con el grado de la enfermedad .

NEUROLOGIE MARCADORES

S100 está presente en numerosas lesiones mesenchyrnal incluyendo iieunlemmoma , coma chondrosar , cordoma , tumor de células granulares , y el melanoma . Anti- S100 inmunotinción se utiliza a menudo cuando el melanoma es parte del diagnóstico diferencial de un tumor indiferenciado. Cuando es positivo , otro anticuerpo monoclonal , HMB45 se utiliza porque es más específico para melanocitos que S100 ( a pesar de que es menos sensible ) . Otro marcador útil para las lesiones Neurologie ha sido proteína fibrillai y ácida glial (GFAP ) . Anti GFAP reaccionará con astrocitos y los tejidos nerviosos periféricos .

INTERPRETACIÓN DE INMUNOHISTOQUÍMICA

La interpretación correcta de la inmunohistoquímica requiere que el observador examinar los controles positivos y negativos apropiados y ser conscientes de los muchos tipos de tinción de los artefactos que se pueden observar en secciones de tejido . Los controles positivos deben ejecutarse cada vez que el antisuero reactivo se utiliza en una diapositiva desconocido y cada vez que se recibe un nuevo lote de reactivo del fabricante. Cuando se usa un nuevo lote de reactivo , la dilución apropiada del reactivo debe ser determinada mediante la reacción de diferentes diluciones del reactivo con los tejidos que contienen el antígeno de interés . Dado que el antígeno de interés es por lo general sólo en las células particulares que pueden ser identificados o complejos inmunes situadas en sitios específicos en las secciones de tejido , el resto de la sección en la misma diapositiva puede servir como un control negativo. Si hay alguna duda acerca de la localización del antígeno de interés a un área en particular de la

diapositiva, se debe utilizar una diapositiva de control negativo aparte. La concentración óptima del reactivo se elige sobre la base de la fuerza de reactividad positiva en las áreas que se sabe contienen theantigen de interés , y sobre la base de la falta de tinción en áreas que se sabe que carecen del antígeno . Contraste entre las áreas positivas y negativas es una característica más importante que la fuerza de la reacción positiva solo. A pesar de que la concentración óptima de los antisueros reactivo ha sido determinada , un control positivo debe ejecutarse cada vez que un desconocido espec - hombres se procesa . Además , el control positivo debería haber sido fijados y procesados en la misma manera que la muestra desconocida . Porque en la postura , si el tejido desconocido se fijó en formalina tamponada neutra , un pañuelo de papel B5- fijo dará un buen control de la libertad de información de la reactividad de los antisueros por el antígeno de interés, pero puede sobrestimar la capacidad de manchar algunos marcadores linfoides , que se conservan mejor en B5 que en formalina.

El uso de un control positivo impide undercalling debido a los errores comunes que incluyen : falta de añadir los antisueros correcta (sin resultado o impar) , la dilución incorrecta de los antisueros añadido ( resultado débil oi fondo pesado dependiendo de la concentración utilizada ) , y la preparación incorrecta de cromógeno (débil o ninguna tinción ) .

Los controles negativos son importantes para dar al observador una idea de la reactividad no específica , que puede ser visto . En las técnicas de inmunofluorescencia , si uno está usando la lámpara de vapor de mercurio , flavonas y otras estructuras de anillo en el tejido dará una autofluorescencia que , aunque producen una tonalidad diferente a la fluoresceína o rhoda - mía, puede confundir a los incautos.

Con inmunoperoxidasa , hay endógeno peroxidasasua que darán tinción en los tejidos no tratados con peróxido de hidrógeno y metanol , como se describe anteriormente . Otro problema con estas técnicas es que la adherencia no específica de reactivos inmunológicos siempre se produce en cierta ex tienda de campaña. Es por esto que es tan importante para determinar la mayor dilución posible que le dará suficiente reactividad a él detectable. A esta dilución , los números mínimos de anticuerpos u otras moléculas de proteína marcadas están disponibles para reaccionar de forma no específica con el tejido . Áreas necróticas , como la necrosis fibnnoid en los vasos de los pacientes con la poliarteritisnodosa , son particularmente aficionados de reaccionar con las inmunoglobulinas. Además, los elementos del tejido conectivo, como el colágeno , son más propensos a reaccionar de forma inespecífica con estos reactivos .

Otra manera de minimizar los efectos no específicos de unión a anticuerpo cuando se utilizan múltiples reactivos , tales como en inmunofluorescencia indirecta o la técnica de PAP , es preincubar el tejido no marcado con suero normal con el tipo de animal utilizado para el segundo anticuerpo . Por ejemplo , en nuestro ejemplo anterior de utilizar conejo antihumano IgA como el anticuerpo primario y fluoresceína conjugaled inmunoglobulina de cabra anticonejo como el anticuerpo - secondai y en immunofluoiescence indirecta , uno preincubar el tejido con normal ( no inmune ) de suero de cabra para bloquear los sitios donde el posteriores Además inmunoglobulina de cabra ( que está conjugado con fluoresceína ( tendría una propensión a unirse ( tales como los receptores de Fc ) . Además, puesto que la unión no específica es debido a las interacciones electrostáticas , la adición de una pequeña cantidad de

heparina se ha sugerido . Idealmente , LHE primera vez que uno utiliza un nuevo antisuero reactivo . NE debe demostrar la especificidad del reactivo mediante la absorción de la reactividad con una preparación de antígeno positivo conocido .por supuesto , esto no es posible en muchas situaciones . sin embargo , IL tiene una neoplasia inusual . decir monoclonal de una proliferación de células plasmáticas de IgE , una prueba absoluta de la tinción inmunológica requiere la absorción con un antígeno apropiado . Si el antígeno apropiado no está disponible en forma purificada , el uso de los portaobjetos de control positivo y negativo es generalmente aceptado . Sin embargo , incluso los anticuerpos monoclonales pueden reaccionar con determinantes antigénicos en antígenos que no pueden estar relacionados con el antígeno de interés , y ciertamente , reactivos policlonales poseer una serie de reactividades no deseados .

Por último, el observador debe estar al tanto de varios artefactos que se pueden ver en las secciones de tejido . Por ejemplo, cuando se utiliza la digestión con tripsina de para , biopsias renales incluidas en parafina fijadas las aguas calientes , la tinción inespecífica se ve a menudo a lo largo de la pared interna del capilar glomerular endotheliom . Esto no debe ser confundido con el patrón de anticuerpos contra la membrana basal glomerular , Caseta observador familiarizado con este artefacto over-the podrá observación. En las biopsias de los nervios , anti 1GM da una relativamente fuerte tinción de la perineunum en casi todas las biopsias de nervio. Carece de importancia conocida. Si el uso de oxidasa immunoper o inmunofluorescencia, tejidos pobremente fijos resultarán en problemas. Por lo general , se verá aumento de la tinción inespecífica en el grito periferia de tejidos fijados mal y no hay manchas en el centro. Si uno está buscando al de una sección de un tumor, este se puede confundir con la verdadera positivily en la periferia. No interprete mal el material fijo.

Las secciones que son demasiado gruesas son más propensos a tomar el suero de forma no específica de las secciones delgadas . Utilice uniforme 4-6 p. secciones .

Finalmente , incluso con tratamiento previo , algunas células , tales como eosinófilos , contendrán alguna actividad peroxidasa endógena residual que puede causar confusión . Asegúrese de que la reactividad visto está en el lugar adecuado y en el tipo celular apropiado. Cuando se descubre un resultado verdaderamente raro , es posible que sea un verdadero unicornio, choza , sería la mejor manera de enviarlo a un "experto" en la zona por su opinión .

HIBRIDACIÓN IN SITU Y DIAGNOSJS TEJIDO

En los últimos años , se ha hecho posible para tomar ventaja de secuencias únicas de ácidos nucleicos en el ADN y ARN para detectar alteraciones clonales y para identificar microorganismos en secciones de tejido . Está más allá del alcance de este texto para revisar la química del ADN en detalle, pero un BNEF sobre vista es útil para entender esta tecnología y sus usos actuales y futuros .

El ADN es una molécula helicoidal de doble cadena en la que las cadenas complementarias de ácido nucleico se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno entre adenina y timidina y entre citosina y guanina . Cada hebra de ácido nucleico consiste en un esqueleto de azúcar - fosfato a la que purina ( adenina , guanina ) o pirimidina ( timidina , citosina) bases se adjuntan . En el caso de ARN, el uracilo sustituye a la timidina a dúo con la adenina . Las bases de purina y

pirimidina hidrófobos se encuentran en el centro de la molécula , mientras que los grupos azúcar y fosfato se encuentran en el exterior ( fig. 19.12 ) . Cada sola hebra de ADN es exactamente complementaria a su contraparte . Podemos explotar esta complementariedad en el laboratorio clínico mediante el uso de sondas marcadas de ADN con secuencias conocidas para hibridar con las secuencias complementarias en secciones de tejido .

La base de la hibridación in situ es que el ADN normalmente existe como una doble hélice . Sólo durante los breves períodos de la replicación y la transcripción son las zonas con ADN de una sola hebra formados . Podemos crear artificialmente el ADN de una sola cadena mediante el calentamiento de las moléculas. Si bien este proceso rompe las ataduras hidrofóbicas entre las purinas y las pirimidinas , no destruye los enlaces covalentes que tienen cada una sola hebra de ADN juntos (Fig. 19.13 ) . Por lo tanto , en secciones de tejido , después de calentar la muestra a 100 º C , creamos moléculas de cadena sencilla , que se puede examinar utilizando segmentos de ADN con secuencias conocidas ( proporcionada por los fabricantes comerciales) que hayan sido etiquetados con una sonda radioactiva o con una sonda peroxidasa ( tales como los descritos previamente con el procedimiento de inmunoperoxidasa ) . Cuando se enfría la temperatura , se combine.As con las reacciones inmunoquímicas , pueden producirse reactividad cruzada las hebras de ADN y las sondas ( que están presentes en gran exceso ) . Es decir, las secuencias de bases de nucleótidos que son similares , pero no idénticos se combinan ( recocido ) entre sí , aunque la fuerza de la unión se considera hábilmente menos de que cuando se combinan regiones idénticas . Se puede ajustar la cantidad de reactividad cruzada es tolerado por la alteración de la temperatura y la concentración iónica de la solución tampón . Cuando la fuerza iónica es baja , es difícil para los enlaces de hidrógeno para formar entre grupos mal emparejados . Por lo tanto , cuando se requiere una alta rigurosidad de pares hase ( se desea una alta especificidad de la reacción ) , se utilizan soluciones de tampón de baja fuerza iónica . la temperatura es también un factor importante . A continuación, más alta es la temperatura, más difícil es para pares de bases mal emparejadas permanezcan juntos por enlaces de hidrógeno . Por lo tanto , las temperaturas más altas durante la reacción de hibridación también ALE denominan condiciones de alta severidad . El tipo de condiciones que se elija dependerá de lo que uno está tratando de lograr. Si uno está realizando un estudio de cribado con una sonda contra un virus de la familia general de , por ejemplo , virus del papiloma humano , pueden elegirse condiciones de baja rigurosidad para optimizar las posibilidades de detectar el virus en la sección de tejido . Sin embargo , si uno está utilizando sondas contra los subtipos específicos del virus , se elegirán las condiciones de alta rigurosidad para que los grupos de reactividad cruzada de menor importancia , que pueden estar presentes en otros subtipos del virus , no darán tinción de falsos positivos .

Hay varios tipos de sondas que se pueden usar para la hibridación in situ . Todas las sondas se rel segmentos tivamente cortos de ADN que tienen alguna etiqueta ( radiactivos, peroxidasa , biotina - peroxidasa , y otros) adjunto para el reconocimiento de la señal tras la unión . Ácido nucleico viral entero puede ser utilizado como una sonda para el virus en el tejido . Sin embargo , cuando se utilizan tales segmentos largos de ácido nucleico , la sonda puede no penetrar en el tejido así .

Por lo tanto , las secuencias de ácidos nucleicos más cortos son preferidos como sondas .

Una forma de crear grandes cantidades de una sonda es utilizar técnicas de biología molecular para cual el segmento de interés de la molécula de ADN y la inserta en un plásmido. Un plásmido es un fragmento cromosómico extra de ADN que va a crecer dentro de ciertas bacterias y replicarse junto con ellos o incluso a velocidades más rápidas que el microorganismo ( fig.

19,14 ) . Por lo tanto , mediante la colocación de un segmento específico de ADN en un plásmido , a continuación, cada vez mayor el plásmido en un microorganismo como Escherzchta COU , grandes cantidades de ADN de interés se pueden purificar a partir del cultivo , etiquetados , y se utiliza como una sonda específica . Hay muchos detalles a la creación de estas sondas , que se revisan en el texto excelente por Piper y Unger. Recientemente, secuencias de identificación específicas de ADN o ARN se han descrito en la literatura . Esto permite a los fabricantes para sintetizar segmentos cortos específicos de ADN ( oligonucleótidos ) que coinciden con precisión las secuencias descritas . Estas sondas de oligonucleótidos son muy específicos , ya que coinciden exactamente con la secuencia conocida . Debido a que son relativamente corto , por lo general menos de 20 pares de bases de longitud , estos segmentos de ADN penetran mejor en las secciones de tejido que los segmentos clonados más grandes de ADN descritos anteriormente .

Para la hibridación in situ , secciones de tejido se colocan en portaobjetos de vidrio Al igual que con los métodos de inmunohistoquímicatochemical . ADN y ARN son relativamente estable y resisten la fijación y el proceso de incrustación mejor que la mayoría de antigens.As con los métodos inmunohistoquímicos , la digestión de la proteasa pueden mejorar la reactividad de la muestras . La muestra se desnaturalizó por calentamiento o el tratamiento de la muestra con formamidase o solución alcalina para separar las hebras de ADN . La sonda marcada se aplica entonces a la sección de tejido durante 20-30 minutos durante el cual la sonda un neals a la ADN en el tejido . Por supuesto , las otras cadenas de ADN en el tejido también se unirán a ellos mismos, pero ya que la sonda está presente en gran exceso , se favoreció la reacción in situ . 1f se utiliza una sonda radiomarcada , los portaobjetos se cubrieron con emulsión de plata por períodos variables de cal (dependiendo del isótopo utilizado y la cantidad de señal en el tejido ) , y los granos de plata sobre las células específicas se puede ver muy bien por ii oscura microscopía de campo . 1f se utiliza una etiqueta de peroxidasa , se añadió el sustrato chroinogenic apropiado con los mismos controles y tratamientos previos necesarios para técnicas de inmunoperoxidasa descritos anteriormente . Los instrumentos automatizados de tinción se han introducido que puede realizar esta reacción con un mínimo de tiempo de al tecnólogo y cantidades mínimas de los reactivos .

Muchas de las condiciones para que las sondas están disponibles , como el virus del papiloma humano, pueden ser detectados tan fácilmente mediante el uso de métodos de inmunoperoxidasa estándar. Sin embargo , está claro que la hibridación in situ será una técnica poderosa para detectar anomalías y variaciones genéticas más sutiles en los microorganismos que era siempre que sea posible por métodos inmunohistoquímicos . A medida que más sondas estén disponibles, como los avances de automatización , y a medida que aumentamos

nuestro conocimiento de los genomas humanos y microbianos , estos métodos se convertirán en una parte importante de la patología de diagnóstico.

Para la hibridación in situ, Secciones de Tejido sí colocan en portaobjetos De Vidrio Al Igual Que Con Los Metodos de inmunohistoquímicatochemical . ADN y ARN hijo relatively Estable y resisten la Fijación y con El proceso de incrustación Mejor que La Mayoría De antigens.As Con Los Métodos inmunohistoquímicos , la digestión de la proteasa pueden mejorar la reactividad de la muestras . La Muestra sí desnaturalizó porción Calentamiento o el Tratamiento de la Muestra estafa formamidase o Solución alcalina párr Separar las Hebras de ADN . La sonda Marcada SE APLICA entonces a la Sección de Tejido Durante 20-30 Minutos de Durante EL CuAl La Sonda neals de la ONU a la ADN en el Tejido . Supuesto Por, las Otras cadenas de ADN en el Tejido also sí unirán a Ellos Mismos , Pero ya de Me sonda no está Presente en gran Exceso , sí favoreció la Reacción en el lugar. 1f sí utiliza Una sonda radiomarcada , los portaobjetos en sí cubrieron estafa Emulsión de plata porción períodos variables de de cal ( dependiendo del isótopo utilizado y la CANTIDAD de Señal en el Tejido ) , y los Granos de plata Sobre las Células Específicas Se Puede ver muy bien porción ii oscura microscopía de campo . 1f sí utiliza Una Etiqueta de peroxidasa , sí Anadio El sustrato chroinogenic apropiado estafa Los Mismos CONTROLES Y Tratamientos previos necesarios párr Técnicas de inmunoperoxidasa descritos anteriormente . Los Instrumentos Automatizados de tinción en sí de han introducido realizar Que You can this Reacción ONU de la estafa Mínimo de Tiempo de Al Tecnólogo Y Cantidades Mínimas De Los Reactivos .

Muchas de las Condiciones Para Qué las Sondas ESTAN DISPONIBLES , COMO EL virus del papiloma humano , detectados servi pueden tan facilmente MEDIANTE EL USO de Metodos de inmunoperoxidasa Estándar . Sin embargo , no está claro de Me hibridación en sueros situ Técnica Una Poderosa párr DETECTAR anomalías Y Variaciones genéticas MAS sutiles baño del los microorganismos era Que Siempre de Que Posible mar metodos porciones inmunohistoquímicos . À medida que mas Sondas estenDISPONIBLES , Como los Avances de Automatización , ya Medida Que aumentamos nuestro de Conocimiento de los genomas microbianos y Humanos , ESTOS methods sí convertirán en Una instancia de parte Importante de la patología de Diagnóstico .