l:ONSERVAl:ION DE LA MUESTRADE MATERIA FEl:AL EN PAPEL SEl:ANTE

ESTUDIO COMPARATIVO CON LA SIEMBRADE HECES DIARREICAS FRESCAS *

Por

Hernando Rocha Posada ~.,~y

Yolanda V illaní ~.,~~.

INTRODUCCION

Las enfermedades diarreicas han cons-tituido y constituyen en la actualidaduna de las principales causas de mor-talidad en el mundo, y especialmenteen los países latinoamericanos. EnMéxico, Guatemala, Colombia, Vene-zuela, Brasil, Uruguay y Nicaragua,representan la causa principal de de-función en la primera infancia. Aunen países como la Argentina, en dondela tasa es relativamente baja, la mor-talidad es de 7 a 10 veces superior a lade los países como los Estados Unidosy Canadá. Por ello está plenamentejustificada la prioridad para su estudioy tratamiento dentro de los programasde salud pública de una nación.

* Trabaja llevada a cabo en la Unidad deBiopatología del Departamento de Me-dicina Interna. Universidad Nacional.Hospital San Juan de Dios. Bogot6.Instructor de Medicina. Director de laUnidad de Biopatología.Licenciada en Bacteriología.***

En los últimos años, con el extraor-dinario avance de las técnicas bacte-riológicas, mucho se ha progresado enel conocimiento de los gérmenes entero-patógenos, y nadie discute el papel queellos desempeñan, no sólo en las infec-ciones enterales propiamente dichas,sino en las infecciones del tracto uri-nario, septicemias, séptico-piohemias,etc. Paralelamente se han introducidométodos que simplifican y facilitan eltransporte de las muestras de un lugara otro, se han mejorado los procedi-mientos para su recolección, ideadomedios de enriquecimiento, de conser-vación, etc.

El presente trabajo tiene por prin-cipal objeto poner en conocimiento, ennuestro medio, el .método de conserva-ción de la muestra de heces fecales enpapel secante, con el cual el médico ymuchos pacientes, residentes en zonasapartadas de los centros de investiga-ción, tendrán la posibilidad de bene-

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ficiarse con un estudio bacteriológico,del cual, en la mayoría de los casos,depende el tratamiento de las enferme-dades diarréicas, de tan elevada mor-talidad entre nuestra población infan-til.

CLASIFICACION

DE LAS ENTEROBACTERIACEAS

La familia Enterobacteriácea ha si-do definida por Breed Murray y Hit-chens (cit. 3) de la siguiente manera:"Son bastonetes gram negativos, mó-viles o no, con flagelos perí tricos, quecrecen bien en los medios artificiales.Todas las especies fermentan la gluco-sa formando ácido, o ácido y gas vi-sible. Característicamente los nitratosson transformados en nitritos (con laexcepción de Erwinia), y su composi-ción es un mosaico, el cual resulta dela interrelación de muchos géneros, aunextendiéndose a otras familias. Fre-cuentemente actúan corno saprófitos,causando la descomposición de lasplantas y de materiales que contienencarbohidratos".

Edwards y Ewing (3) agregan a laanterior definición: los micro-organis-mos pertenecientes a la familia Entero-bacteriaceae no producen citocromo-oxidasa, lo cual elimina del grupo aun buen número de bacterias con fla-gelos polares, incluyendo Aeromonas,cultivos los cuales a menudo se con-funden con entero-bacterias, particu-larmente del tipo Aerobácter. T am-bién quedan eliminados algunos gruposcorno Pseudomonas, Alcalígenes y Vi-brio. Tampoco las enterobacterias li-cúan el medio de Pectinato de sodio, ycon ello se elimina el grupo Pectobac-terium, clasificado dentro del grupoErwinia, el cual al menos incluye dostipos de organismos: a) Bacterias pa-tógenas para las plantas llamadas "ver-daderos Erwinia", que no reducen losnitratos a nitritos y disminuyen porlo tanto un poco la semejanza con las

enterobacterias en sus caracteres cul-turales y en sus propiedades bioquími-cas. b) Bacterias igualmente patóge-nas para las plantas que generalmentereducen los nitratos a nitritos y se pa-recen al género Aerobácter, pero quetienen la propiedad de licuar el Pecti-nato de sodio, y se ha dicho que no espropio de las enterobacterias. Por talrazón es aconsejable su exclusión hastaque el grupo Erwinia no sea satisfac-toria y completamente estudiado.

Durante muchos años, variados testsbioquímicos se han utilizado para lo-grar una clasificación taxonómica. Enla actualidad, de su simplificación hanresultado métodos para la determina-ción de las propiedades fisiológicas delas bacterias. De particular interés hansido los métodos para la determinaciónde la decarboxilación y desaminaciónde ciertos aminoácidos, ayudando así ala distinción de grupos y sub-gruposde enterobacterias, clarificando con elloconceptos de taxonomía.

Numerosas clasificaciones de entero-bacterias han aparecido, pero las másatractivas y que por lo tanto merecenatención son las de Breed, Murrayy Smith (4) Y la de Kauffmann (cit.3 ). Breed y col. las clasifican con ba-se a la fermentación de la lactosa; perohan colocado juntos a grupos que tie-nen distintas características y separadoa grupos con interrelaciones bioquími-cas y serológicas. El establecimientode un género simple corno el Paracolo-bactum, en base a la tardía fermenta-ción de la lactosa, no se justifica, yaque un Paracolobactum puede cambiara una típica Escbericbia coli, simple-mente por selección de componentesque la fermentan rápidamente.

La clasificación de Kauffmann, aun-que difiere en nomenclatura, es taxo-nómicamente muy cercana a la pro-puesta por Edwing y Edwards en 1960.El investigador mencionado usa cornotest primario para su división el de laDecarboxilasa del ácido glutámico, por

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cierto de aplicación difícil en el labo-ratorio. Establece 14 grupos (19):Salmonella, Shigella, Arizona, Escbe-ricbia, Citrobácter, Klebsiella, Hafnia,Erzvinia, Serratia, Proteus, MorganeUa,Rett gerclla y Providencia.

Sin embargo, no hay acuerdo encuanto a la conveniencia de mantenerles grupos Proteus, Morganella, Rett-gerclla y Providencia tal como lo pro-puso Kauffmann. Muchos investigado-res, siguiendo la clasificación propues-ta por Rustigian y Stuart (20), in-cluyen como tipos de los del grupoProtcus, a Morganella y Rett gerella,con igual jerarquía que Proteus mira-bilis y uulgaris, reconociendo por lotanto dos grupos: Protcus, que incluyeProteus uulgaris y Protcus mirabilis, yMorganella, que incluye a M. Morgag-ni, M. Rettgeri y M. Inconstants (Pro-videncia) .

El grupo Citrobácter, más ligadobioquímicamente al complejo Salmo-nella atizona, comprende los gérme-nes designados previamente como Es-cherichia [reundi y Bethesda; estaunión es justificada, ya que desde elpunto de vista serológico como bio-químico están estrechamente vincula-dos y sólo la fermentación de la lactosapositiva en los primeros y negativa otardía en los segundos los distingue.En cuanto a los grupos Klebsiella yCloacae, que han sido redefinidos en elúltimo informe del Subcomité de lasEnterobacteriaceae (22), Hormaeche yMunilla (23) han establecido clara-mente su diferenciación bioquímica.

El Aerobácter aerógenes ha desapa-recido como especie, ya que las cepasinmóviles han pasado al grupo Kleb-siella y las móviles al Cloacae, génerointroducido por Castellani y Chalmers(24). Edwards y Ewing (25), refi-riéndose al grupo Klebsiella-Aerobác-ter, han encontrado que muchas cepasinmóviles, aisladas de heces y de laorina, no pueden diferenciarse por lasdistintas pruebas de que se dispone en

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la actualidad, de las aisladas del tractorespiratorio, y que han sido clasifica-das como Klebsiella. Ante tal hecho,proponen que mientras no se puedandemostrar como diferentes las cepasaisladas de las heces y orina, de las deorigen respiratorio, sean agrupadosconjuntamente. Por lo tanto, la Kleb-siclla p neumoniae y el Aerobácter ae-rógencs deben ser considerados comomiembros de un solo grupo y designa-dos como Klebsiella-Aerobácter (25-26) .

Los grupos Serratia y Hafnía tie-nen poco significado médico, ya queson bacterias componentes de la floranormal del suelo y del agua y se con-sideran no patógenas para el hombre.Sin embargo, las primeras se aislancon frecuencia de procesos patológicosy a veces como único germen presente,lo que induce a pensar que su viru-lencia para el hombre es mayor de laque se le asigna. De todos modos, elaislamiento de cualesquiera de los gér-menes mencionados crea problemas dediagnóstico.

El grupo Eru.inio está constituí dopor bacterias patógenas para los vege-tales y excepcionalmente se le halla enel hombre. El Alkalecens-dispar se haeliminado como grupo independiente yunido a Escbericbia por sus vincula-ciones bioquímicas y serológicas.

La clasificación propuesta por Ed-wards y Ewing en 1961 es la que nosha parecido más didáctica y más acor-de con el estado actual de los conoci-mientos sobre enterobacterias. Nosotrosla hemos seguido en nuestro estudiopara la clasificación final de las cepasaisladas.

EL COPROCULTIVO

Aunque aparentemente parece noser dificultosa su ejecución, un buenestudio requiere personal adiestrado ymaterial especializado. La técnica a se-guir desde la recolección de la muestra

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hasta la identificación final de las bac-terias entéricas, varía de acuerdo con losdiferentes autores y escuelas. Sin em-bargo, existe un delineamiento para sucorrecto estudio que comprende lastécnicas para la recolección de lasmuestras, la utilización de medios di-ferenciales e inhibido res y de mediosselectivos, etc. Cada uno de estos pro-cedimientos varía de acuerdo con tipode bacterias a investigar y de las posi-bilidades técnicas y materiales de quese disponga en el laboratori«.

a) Recolección de la mucstra=s-v «:riadas técnicas se han empleado parala recolección de los especÍmenes feca-les, todas tendientes a lograr un mayorporcentaje de casos positivos. El cul-tivo puede hacerse a partir de la ma-teria fecal recientemente emitida, porimpregnación de un escobillón intro-ducido directamente en el recto (3),o en el momento de la rectosigmoidos-copia (15). Debido al hecho de queciertas enterobacterias, especialmentel i Sbigella, pueden decrecer en núme-ro rápidamente luégo de que las hecesfecales son evacuadas, se hace necesariocolocar los especí.menes en medios espe-ciales tan pronto como son obtenidos.En la disentería crónica la impregna-ción de un escobillón, directamente delas lesiones intestinales, durante e! actode la proctoscopia, ha resultado seruno de los mejores métodos para elaislarniento de la Sbi gclia. Hardy,Mackel, Frezier y Hamerick (cit. 3)han hallado, en un mismo grupo deindividuos, que el escobilleo rectalsembrado inmediatamente aumenta elnúmero de aislamientos de patógenos,en comparación con la siembra de he-ces evacuadas recientemente. Aún me-jor resultó la práctica de! escobilleodirectamente de las lesiones intestina-les durante el acto de la proctoscopia.Stuart (10) ha demostrado experimen-talmente que e! escobilleo rectal no esinferior a la siembra de las mismasheces en e! aislamiento de patógenos.

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Sin embargo, Shaughessy, Friewer ySnyder (5) consideran su práctica po-co adecuada, aunque de utilidad, espe-cialmente cuando se hacen encuestasen grandes masas de población y pre-fieren la siembra de especí.menes fres-cos cuando se trata de convalecientesy de portadores que eliminan escasacantidad de bacterias. Thomas (6) esde la misma opinión, y sólo emplea e!escobilleo como un paso preliminar aun examen con heces frescas.

Cuando se dispone de especí.menesrecientemente emitidos, es convenienteseleccionar en ellos trozos de epitelioo bien zonas que contengan moco, pusy sangre, lugares estos en donde losenteropatógenos son muy abundantes(15). Esta práctica se reflejará en unaumen to en los aislamientos, especial-mente si se asocia a medios de enrique-cimiento y a soluciones preservativas.

b ) Soluciones j!rcscrvativas.-Se em-plean cuando las heces fecales debenser transportadas o mantenidas por al-gún tiempo antes de ser sembradas.Sachs (cit. 3), en 1939 (7), usaronexitosamente la solución salina glice-rinada, adicionada de solución Buffery de rojo fenol, este último con el ob-jeto de apreciar las modificaciones de!pH, ya que la acidificación es perju-dicial a los bacilos entéricos. Bangxany Eliot (8), en 1940, aconsejan unase lución preservativa con citrato descdio al 1 (Ir, Desoxicolato de sodio al5 'Ir, en solución salina Buffer, con unpH de 8.5, en la cual se preserva muybien la vida bacteriana. Gaub (9) usóuna solución similar y le asignó efectopreservativo, así como de enriqueci-mien too Stuart (10) describió un me-dio semisólido de Tiogliocolato parael transporte y preservación de espec i-menes obtenidos con escobillones tra-tados con carbón.

En general, puede decirse que mu-chas soluciones preservativas han sidol' sadas, y todas ellas con buenos resul-tados, en manos de sus descubridores;

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sin embargo, la solución glicerinadaadicionada de Buffer sigue siendo lamás conocida y usada, aunque no haresultado tan efectiva como la siembradirecta.

c ) Medios de enriquecimiento.-Esrecomendable su uso, particularmenteen el estudio de portadores en quienesel número de organismos es reducido.Su principal ventaja es la de disminuírla flora normal, dejando libre la pató-gena. Es satisfactorio el medio de Se-lenita de Leifson (11), cuyo poderinhibitorio es variable sobre las dife-rentes bacterias. Para algunos investi-gadores supera este medio a los demásen e! aislamiento de los patógenos, es-pecialmente los tíficos y para-tíficos,además de ser de composición simpley económico.

Otro medio de enriquecimiento muyusado es e! caldo de tetrationate, deMuller (5) modificado por Kauff-mann (tetrationate, verde brillante ybilis); su eficacia aumenta cuando seusa conjuntamente con el agar verdebrillante. Con este medio, Kauffmannaumentó en un 100 'j" el aislamientode! Paratífico B y en un 500% el deetras Salmonellas, en comparación conotros métodos en los cuales el mediode enriquecimiento no fue usado. Gal-ton y Quan (1) confirmaron estosresultados. Por el contrario, Dixon(13) Y Smith opinan que el medio deSe!enlta es superior al tetrationate.

Rappaport y col., y Collard y Un-win (cit. 3), comparando el uso de losmedios de Selenita y de Tetrationatecon un caldo de verde de malaquita ycloruro de magnesio, hallaron a esteúltimo superior a los dos primeros ene! aislamiento de Salmone'las, diferen-tes de S. typhi. Hajna, en 1955, usócen éxito un caldo preservativo y deenriquecimiento que contiene Manitol,Glucosa, Desoxicolato de sodio, Citra-to de sodio y fosfatos. Su uso aumentóe! número de aislamientos de Salmone-llas y Sbigcllas.

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Otros medios de enriquecimiento sehan usado (31) Y algunos modifica-dos por el agregado de antibióticos yquimioterápicos para evitar el creci-miento de ciertas bacterias, especial-mente el Proteus.

d ) Medios diferenciales.-(Inhibi-dores y selectivos). Estos medios, porlo general, inhiben el crecimiento delas bacterias Gram positivas y contie-nen indicadores que distinguen losgérmenes que fermentan la lactosa delos que no lo hacen. Existen mediosdiferenciales altamente selectivos, enles cuales la mayoría de los coliformesy algunas cepas de Proteus son inhibi-des, lo cual es útil para el aislamientode los patógenos.

Siempre es recomendable usar con-juntamente un medio altamente selec-tivo con un foco seleccionado, el cualpermitirá estimar la totalidad de laflora entérica, hecho éste de particularinterés cuando se estudian diarreas in-fantiles, en las cuales en muchas opor-tunidades e! Coli patógeno es el ger-men causal. El uso del medio selectivocubrirá las necesidades para e! aisla-miento de posibles Saimonellas o Sbi:gellas. Los medios de Agar-MacCon-key, Endo-Agar y Agar-eosina-azul demetileno llenan a satisfacción la pri-mera necesidad y los medios de Agars. S., Agar bi-sulfito-bismuto (mediode Wilson Blair), el Agar verde bri-lIante-rojo-fenol de Kristensen y elAgar-citrato-desoxicolato, la segunda.

En general, cuando se trata de in-vestigar Salmonella, y en particularty phi, es recomendable el uso de Agar-bisulfito de bismuto de Wilson Blair,en el cual la Sbigella habitualmenteno crece, y Agar desoxicolato o Agar-verde brillante, cuando se trate de lasdemás Salmonellas. El Agar-eosina-azulde metileno es satisfactorio para el ais-lamiento de las Sbigellas, y el AgarS. S. lo es tanto para Salmonellas comopara Shigellas.

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Edwards y Ewing (3) recomiendanespecialmente e! Agar verde-brillante,asociado al medio de enriquecimientode Kauffmann, cuando se desea aislarSalmone/las diferentes de la typhi. Sise busca Salmonclla ty phi, electiva-mente debe usarse el medio de Wilson-Blair y caldo de Selenita como mediode enriquecimiento, el cual también esde valor en la investigación de Sbige-llas. Vemos así que los medios utiliza-dos varían en cada caso en particulary de las circunstancias de! medio enque se trabaje, admitiendo que un solomedio no es aceptable para todos lospropósitos.

e) Aislamiento e identificación.-Seinicia con la selección de las colonias,las cuales se pasan al medio de Kligler(lactosa y glucosa), o mejor el mediode triple azúcar adicionado de hierro(lactosa, glucosa y sacarosa) (18-34).Recientemente, Taylor (32) ha des-

crito un nuevo medio sólido (D. L. F.M.) para e! aislamiento primario deSbigellas, Salmonellas y Arizona, elcual permite estimar al mismo tiempola fermentación de! Dulcitol (D) Yde la Lactosa (L), la producción deH2S en presencia de una solución deHierro (F) Y la movilidad (M). Coneste nuevo medio se reducen notoria-mente los aislamientos e identificacio-nes necesarias comúnmente.

MATERIALES Y METODOS

Fue estudiado un total de 116niños en el Hospital de la Misericordia,de los cuales 104 estaban hospitaliza-dos en la Sala de Contagiosos con sa-rampión y el resto fue de asistentes dela Consulta Externa. En todos los ca-sos se procedió al coprocul tivo portrastornos diarréicos. Conjuntamentese emplearon experimentalmente, y co-mo control, cepas de Salmonella, Sbi-gella y Coli patógenos, procedentes delCentro de Enterobacterias de! Institu-

to Adolfo Lutz, de Sao Paulo, Brasil,y del Instituto de Salubridad y Enfer-medades Tropicales de México. El totalde muestras procesadas en el laborato-rio ascendió a 942, y el número de ce-pas cultivadas a 39. Cada una de estasúltimas se sembró en ocho oportunida-des, totalizando 312 cultivos de con-trol.

Se emplearon sobres de carta des-provistos de pegante en la tapa, den-tro de los cuales se colocó un trozo depapel de filtro debidamente doblado.Luégo se esterilizaron en e! autoclavea 15 libras de presión durante 15 mi-nutos. El medio de enriquecimientoutiliz ido en la siembra de las hecesdiarréicas fue e! caldo de tetrationatede Lcifson, modificado por Kauff-mmn, envasado en tubos estériles, elcual, antes de ser usado, se calentó le-vemente a la llama y se le adicionaron2 o 3 gotas de solución de yodo.

El procedimiento para cada caso enestudio fue el siguiente: un aplicadoro escobillón estéril fue introducido cui-dadosamente en el recto e impregnadodebidamente, mediante suaves movi-mientos de rotación; luégo se procedióa impregnar e! trozo de pape! de filtrocontenido en sobres, a sellarlos y a ro-tular su fecha de siembra. El mismoescobillón se colocó en el medio deenriquecimiento y sin incubar se pro-cedió a su siembra en Agar-sangre,Agar-MacConkey y medio de Chap-mann (para aislamiento de Estafilococopatógeno). Al tubo que contenía elcaldo de enriquecimiento y e! escobi-llón se le agregó una cantidad igual demedio y se incubó por un período de18-24 horas, al cabo de las cuales sesembró en Agar-sangre, Agar-MacCon-key o Endo y Agar S. S., cultivos és-tos que se incubaron a 37 grados porun período de tiempo semejante.

Los sobres fueron abiertos cuidado-samente cerca del mechero y los pa-peles impregnados extraídos con unapinza de disección flameada a la lla-

CONSERVACION DE LA MUESTRA DE MATERIA FECAL

ma: con una tijera estéril se cortó laporción impregnada, la cual se intro-dujo en caldo nutritivo o en tetratio-nate y se incubó por 18-24 horas, paraluégo pasarse a los medios sólidos an-tes mencionados. El número de sobresempleados varió, y así en 14 niños seimpregnaron en cada uno 4 papelesque se sembraron a los 2-4-6-8 días;23 tuvieron seis sobres para sembrarsea los 2-4-6-8-12-16 días; por último,a 79 niños se les impregnaron 9 pape-les que se sembraron a los 2-4-6-8-12-16-24 Y 3O días.El aislamiento primario a partir de

los medios sólidos se hizo en medio delKligler, el cual se incubó por 18-24horas a 37oC. Como nuestro interésprincipal fue conocer la sobrevida delas bacterias intestinales desecadas, noseguimos el esquema propuesto porEdwards y Ewing para el aislamientode los enteropatógenos, sino que se pro-cedió a prac ticar a todas las bac teriasuna prueba bioquímica en base a losmedios de Sim, Urea, Citrato de Si-mons, Gelatina, Glucosa, Lactosa, Sa-carosa y Manito!. Las cepas sospecho-sas de Salmonella o Sbigell a fueron so-metidas a estudio serológico.

El medio de Cha pmann (28 ) loutilizamos una vez tomada la muestracon el escobillón y luégo de su incu-bación, con el objeto de buscar elEstafilococo, el cual vira el color delmedio de cultivo del morado al ama-rillo cuando es patógeno (fermenta-ción de la Manita). Las cepas de Esta-filococos aisladas de las siembras delos sobres fueron igualmente sometidosa fermentación de la Manita por unperíodo de 48 horas.

Las cepas de Sbigcllas, Salmonellasy Coli patógeno utilizadas como con-trol se sembraron en caldo de tetratio-nate y se incubaron a 37°C por 18-24horas. Con escobillón se procedió aimpregnar papeles de filtro contenidosen sobres estériles y a sembrarlos pe-riódicamente en Tetrationate, en for-

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111asimilar a como se procedió para lasmuestras de materia feca!. Luégo dela incubación correspondiente se hizola siembra en Agar S. S., y finalmenteen medio de Kligler, para comprobar lapureza del cultivo.

RESULTADOS OBTENIDOS

Los resultados que a continuaciónse transcriben son el resumen del ex-tenso material procesado; el estudiode cada caso en particular puede exa-minarse en los cuadros 1-2-3-4.

El cuadro número 1 comprende a13 pacientes cuyas heces fueron con-servadas hasta por un período de 8días, al término de los cuales la mayo-ría de los gérmenes aislados en Agar-sangre, Agar-MacConkey o Agar S. S.(a partir de siembra directa), se recu-peraron en uno o más de los mediosmencionados luégo de su desecación.Los gérmenes que mejor se conserva-ron fueron en orden decreciente:Klcbsieila aerobácter, Streptococcus[ccalis, Proteus y Pseudomonas aeru-ginosa.

El cuadro N'! 2 comprende el estudiode 23 casos en los cuales la muestra fueccnservada desecada hasta 16 días. Aeste grupo se le adicionó el medio deChapmann, para buscar lo más rá-pidamente el Estafilococo patógeno, locual fue posible en 4 ocasiones. Tam-bién se utilizó el medio de MacConkey,el cual es de utilidad semejante al me-dio de Endo, pero diferencia fácilmen-te las cepas de Coli y otros gérmenesfermentadores rápidos de la lactosa.Para este grupo valen las mismas con-sideraciones en cuanto a la supervi-vencia de Escbericbia coli, KlebsiellaAerobácter, S. fecalis, Proteus y Pseu-domonas. Las cepas de Estafilococo pa-tógeno no fue posible recuperarlas entodos los casos por el excesivo creci-miento de las bacterias entéricas. Engeneral, a los 16 días fue posible recu-perar la mayoría de las bacterias ob-

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tenidas p~r el método clásico de co-procultivo.

Por último, el cuadro número 3 to-t iliza 79 casos en los cuales las mues-tras fueron conservadas en su mayoríahasta los 3O días. En algunos casos lassiembras se hicieron hasta pasados los70 días. Los medios utilizados fueronlos mismos, excepto en 25 casos, en losque se suprimieron los medios de En-do, Agar-sangre y Chapmann. Talrazón cbedeció a que éstos fueron ca-sos adicionales y los mencionados me-dios ya habían sido utilizados en unabuena proporción de muestras comopara ser conclusivos. En este grupo seaislaron 7 cepas de Estafilococo pató-geno y la supervivencia de los gérme-nes entéricos fue notoriamente satis-factoria a los 3O días de desecación.

Luégo de este tiempo, el porcentajede casos positivos decreció sin que sepueda anotar una relación entre eltiempo transcurrido y e! número decases negativos (cuadro número 4).

Los resultados obtenidos con las ce-pas procedentes de México y Brasilfueron satisfactorios. Se desecaron has-ta por un período de 45 días, habién-dosc recuperado al término de dichotiempo la totalidad de las cepas ensa-yadas, lo cual es demostrativo de laresistencia a la desecación de los ente-ro-patógenos, al menos cuando se en-cuentran completamente puros (cua-dros números 5-6).

En general, se puede decir que elresultado de! examen bacteriológico delas 115 muestras de materia fecal fres-ca fue sensiblemente igual al de lasmuestras desecadas.

Los resultados podemos calificarlosccmo satisfactorios si observamos e!elevado porcentaje de muestras deseca-das que permanecieron viables luégode los 30 días de su siembra. Aunqueno aislamos ninguno de los llamadosentero-patógenos, es posible que la dia-rrea en algunos de los casos fuese de-bida a cepas de CoE patógeno, Prot eus,

Estafilococo, etc. Tanto los gérmenesGram negativos como los Gram positi-ves sobrevivieron por largos períodosde tiempo soportando la desecación.

COMENTRARIOS y CONCLUSIONES

Ha sido siempre de interés, en eldiagnóstico de las enfermedades dia-rréicas, el buscar un cierto número degéneros probadarnente patógenos degran interés clínico y epidemiológico,pasando por alto a géneros como Es-cbericbia, Sin embargo, en los últimosaños ha crecido el número de afeccio-nes, especialmente entre la poblacióninfantil (14 - 16 - 17 - 27 - 29 - 30-35 - 36 - 37 Y 38), debido a ellos, ra-zón por la cual su aislamiento y estu-dio serológico debe hacerse paralela-mente al de los patógenos comproba-dos. Este grupo de los bacilos Colisobrevive durante meses en el suelo yen el agua a temperatura ambiente ypuede sobrevivir a procesos de pasteu-rización.

En el tubo intestinal se halla unaenorme cantidad de micro-organismos,l i m iycr ia de ellos residentes habitua-les saprofitos y un buen número depatógenos, además de los ingeridos conlos alimentos que no han sido destruí-dos por los jugos digestivos y que seeliminan por la materia fecal. Estosmicro-organismos poseen una cierta re-sistencia a los agentes fí sicos externoscomo frío, calor y desecación.

Según las observaciones Fe!sen (cit.17), las Shigellas pueden permanecercon vida en agua corriente hasta seismeses, en agua de mar de 2 a 5 mesesy en e! hielo por 2 meses; por el con-trario, mueren rápidamente a la tem-peratura de pasteurización y por lacloración. En las heces naturalmenteinfectadas, conservadas alcalinas viveny permanecen activas durante variosdías. En la oscuridad y a la tempera-tura ambiente viven durante lOa 12

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días en la tierra, en la superficie delas frutas y verduras 2 a 7 días, en elpan 20 días y hasta 2 meses, y en laleche cruda de 6 a 12 días. Tambiénpuede conservarse durante varios me-ses a bajas temperaturas, y en la ropasucia de los enfermos por varios días.

Las Salmoncllas tienen gran resis-tencia: en la manteca pueden vivir du-r rn tc 80 a 108 días (cit. 17), con-servándola a bijas temperaturas; en elsorbete de crema viven por más tiempo,y en las carnes, leches y sus derivados,en los huevos y ciertos vegetales pue-den vivir hasta un mes. La S. Pulloru.mvive tres a cuatro semanas en cul-tivos aun por años, si ellos tienen cier-ta humedad. Se la ha hallado activaen las heces, luégo de 1 a 2 meses, yen el hielo o nieve luégo de 3 meses.Mueren por la exposición a 55°C du-rante una hora y a 60° durante 15minutos.

Sin embargo, estos dos gérmenes sonles más sensibles de todos los del gru-po de cntcrobacterias, especialmente ala acidez, producto del metabolismobac teriano (1 5) .

En general, puede concluírse quetedes estos gérmenes: Sal moncllas, Shi-grUas y Coli, relacionados con losdisturbios gastrointestinales, presentanl111:l gran resistencia al medio ambien-te, tanto en aguas cloacales como enagua corriente, así como en el suelo yen los alimentos.

A pesar de la resistencia referidapara los enteropatógenos, la mayoríade los investigadores aconsejan y pre-fieren procesar la muestra inmediata-mente a su recolección. De esta mane-ra, afirman, el número de aislamientosde interés, especialmente en lo que serefiere a Salm oncllas y Sbigcllas, au-menta considerablemente. Sin embar-go, en el estudio de una diarrea, e! pro-ceso de la muestra no siempre puedehacerse inmediatamente, razón por lacual se recurre a los medios de preser-vación o a métodos que, preservando

la vida bacteriana, faciliten su envío acentros de investigación.

Este último aspecto del estudio delas enterobacterias fue lo que hizoidear el método del desecado de lamuestra fecal en papel secante o defiltro.

Fueron precisamente Dold y Kette-rcr, en 1944, quienes demostraron quelas heces fecales impregnadas en papeld ~ filtro podían ser de utilidad, luégode su transporte de zonas remotas acentros de estudio, cuando el uso delas soluciones preservativas no era con-veniente ni posible. En algunas cir-cunstancias notaron que cuando lospapeles eran guardados en la tempera-tura ambiente y en la oscuridad la su-pervivencia de los patógenos excedíaa la de otros gérmenes existentes en lamuestra.

En 1953, Kirsche y Prevot (2), de!Instituto Pasteur de Ranoi, Indochina,usaron el método con buenos resulta-des, lo mismo que Lie-Kian Joe y col.(1) de la Universidad de Indonesia enDjarta (1954), quienes enviaron mues-tras de materia fecal por vía aérea aHolanda. Precisamente Lie-Kian Joe ycel. han pensado que con la mencio-n ida técnica puede lograrse cierto en-r iquccimienro de la muestra, ya queparece que la mortalidad de las bacte-rias no patógenas es mayor que la delas patógenas. Como se expuso, el prin-cipal obstáculo para la supervivenciade las bacterias es la acidificación delmedio que las contiene (7) (15),aunque presumiblemente no es el úni-co. Sin embargo, el mismo Lie-KianJoe halló datos de interés que hacenpensar que la Salmonclla thyphosapermanece viva por más tiempo en elpapel que los no patógenos, lo mismoque su actividad diastásica se inhibeen el papel, permitiendo de esta ma-nera la supervivencia de gérmenes másdelicados como las Sbigellas y Salmo-ncllas.

60 REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

Más recientemente Varela (1955),del Instituto de Salubridad y Enfer-medades Tropicales de México (33),en un estudio comparativo entre lasiembra de heces diarréicas frescas y lasiembra de muestras impregnadas enpapel, halló resultados significativa-mente iguales sobre 350 espec irnenesexaminados. Los gérmenes aislados fue-ron: Sbigella dyscnteriae, flexneri, boy-dii, Salmonella parathyphi A, así comovarias cepas de Coli patógeno (026-055-0111-0127), que totalizaron unnúmero de 40 cepas cuando se hizo lasiembra de heces frescas, y 38 luégode su impregnación en papel. Talesresultados confirman la utilidad delmétodo en el envío de las muestras allaboratorio.

Nuestros resultados confirman lohallado por otros investigadores, aunsin que hayamos aislado ningún ente-ropatógeno probado. Creemos de granutilidad el método por su sencillez,bajo costo y comodidad para el trans-porte de la muestra, lo cual facilita

encuestas epidemiológicas sin necesidadde transporte de material delicado, me-dios de enriquecimiento, de conserva-ción, etc. Además, se pueden remitirvarias muestras y con ello mejorar laeficacia del examen.

Su aplicación, por lo tanto, es muygrande en el campo de la Salud Públi-ca, en el diagnóstico, tratamiento yprevención correcta de las enfermeda-des diarréicas bacterianas en lugaresdistantes de los centros de investiga-ción.

Por último, la perfecta conservaciónde los enteropatógenos usados experi-mentalmente demuestra el métodocomo capaz de substitui r eventual-mente al medio de gelosa para la con-servación de las bacterias de un cepa-rio. Además, las cepas aisladas de unespécimen, y sobre las cuales existendudas para su clasificación, puedenenviarse en esta forma a cualquier cen-tro de estudio para una correcta iden-tificación.

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CUADRO NO

CONSERV ACION DE LA MUESTRA DESECADA DURANTE 8 DIAS

Siembra de hecesfecales frescas

y enriquecidas encaldo de tetratio- 2 dfae

Casos nate.4 días 6 días 8 días

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12

13

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Ec-Ka-Pa-Ef-EiE-Elc-Ef

E-Ec-Pa-AcEc-Ka-Pm

Ec-Pm-Pa

E : Estafilococo

Ec : Escherichia colíEi: Escherichia intermedium

EF : Escheríchía freundiPr: Proteus rettgeriPm: Proteus mirabilis

Pmo: Proteus morgagni

Pa: Pseudomonas aeruginosa

Af: AlcaJígenes fecalis.Ka: Klebsiella aerobácterel: Clostridium aerobio

Ef: Streptococcus feca lis

Mt: Micrococcus tetragena

Mo: Monilias

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CONSERV ACION DE LA MUESTRA DE MATERIA FECAL 67

CUADRO No 4

Número de días que seconservó la materia Número (+) % (-) %

fecal desecada de casos

45 5 2 40 3 6050 6 3 50 3 5055 t 5 71,45 2 28,5560 10 4 40 6 6065 8 5 62,50 3 37,507,0 2 2 O75 3 1 33,33 2 66,66

Total 41 22 19

CUADRO N o 5

CEPAS DE MEJICO

N9 cepario Nv de días que se conservaron las cepasNQ cepa patógena Unidad

Biopatología 2d 4d 6d 8d 12d 16d 24d 45d

Coli 026 9 + + + + + + + +Coli 0112 10 + + + + + + + +Co!i()127 11 + + + + + + + +Coli MIl 12 + + + + + + + +Coli 055 13 + + + + + + + +Coli 044 14 + + + + + + + +Coli 0126 15 + + -s- -t- + - + +Coli 0111 16 + + + + + + + +

CEP AS DEL BRASIL

N? cepario NI} de días que Be conservaron las cepasN~Icepa patógena Unidad

Biopatología 2d 4d 6d 8d 12d 16d 24d 45d

Coli 0125 19 + + + + + + + +Coli 086 20 + + + + + + + +Coli 'Ü'127 21 + + + + + + + +Coli 026 22 + + + + + + + +Coli 0119 23 + + + + + + + +Coli 0102 24 + + + + + + + +Coli 0126 25 + + + + + + + +Coli 0124 26 + + + + + + + +Coli 0255 27 + + + + + + + +Coli 0111 28 + + + + + + + +

CUADRO NO 6

Cepas N9 cepario NO de días que se conservó desecadaInstituto Adolfo Lutz Unidad

Brasil Biopatología 2d 4d 6d 8d 12d 16d 24d 45d

Salmonella tomphson 30 + + + + + + + +Salmonella ana tu m 31 + + + + +Salmonella newport b .. 32 + + + + + + + +Salmonel la paratiphi A .. 33 + + -l_ + + + + +Salmonella newport a 34 + + -+- + + + + +Salmonella par at.iph! B. 35 + + + + + + + +Salmonella tiphirnurium. 36 + + + + + + + +Salmonella t.ipbi 37 + + + + + + + +Sa lmonel la dispar 01 38 + + + + + + + +Shigella C-1 39 + + + + + + + +Shigella C-2 .. .. 40 + + + + + + +Shigella D-1 .. .. 41 + + + + + + +Shigella A-1 42 + + + + + + +Alkalescens di~p~;02 43 + + + + + + + +Shigel la A-2 44 + + + + + + + +Shigella hoidÚ' •. 45 + + + + + + +Shigelhi flexneri B3e 46 + + + + + + + +Shigella flexneri B1a 47 + + + + + + + +ShigellQ, flexner-i B2a 48 + + + + + + + +Shigella flexneri B46 49 + + + + + + + +;;higell~ flexner i B5 . 50 + + + + + + +