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Objetivos:

Evidenciar un mecanismo de silenciamiento traduccional que implica la liberación de una proteína integral ribosomal. Proponiendo así, un modelo en el cual el ribosoma es visto como un depósito de proteínas reguladoras, aparte de su rol como maquinaria de síntesis proteica.

Ceruloplasmina (Cp): proteína de la fase aguda sintetizada en el plasma por los hepatocitos y en zonas

de inflamación por medio de los macrófagos estimulados por citoquinas.

Cada molécula contiene de 6 a 7 átomos de cobre, los cuales le otorgan las funciones oxidativas a la proteína,

como por ejemplo facilitar la captación del hierro por parte de la transferrina. Esto le da un importante rol en la

regulación de la homeostasis del plasma.

La función de la Cp derivada de macrófagos está menos clara. Podría estar involucrada en actividad bactericida, debida posiblemente al daño oxidativo causado por Cp.

Introducción:

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Interferón gamma: induce el ARNm de Cp y su expresión en monocitos de las células U937 (línea celular humana) y en monocitos de la sangre periférica.

Cp está sujeta a un mecanismo de silenciamiento traduccional.

Elemento GAIT: Inhibidor traduccional activado por interferón γ en la región Cp 3´UTR (untraslated region) del ARNm es necesario para el silenciamiento de la traducción de Cp.

Proteína GAIT: Proteína de unión a GAIT, que bloquea el inicio de la traducción.

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Se identificó una proteína citosólica en las células U937 tratadas con interferón gamma que se une específicamente al elemento GAIT: proteína L13.

En base a estos resultados se propone un mecanismo de control traduccional en el cual el ARNm de Cp se circulariza y permite la unión de la proteína GAIT bloqueando la iniciación de la traducción.

Además se observó que el interferón gamma induce la fosforilación de L13a, lo que causa su liberación desde la subunidad grande ribosomal. Uniéndose luego al elemento GAIT en la región Cp3´UTR y dando como resultado el silenciamiento traduccional del ARNm de Cp.

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Resultados:

Identificación de la proteína ribosomal L13a como un candidato a GAIT.

Método de triple híbrido en levadura:

Es una técnica de biología molecular que se usa para detectar interacciones entre ARN y proteína. Muchos factores de transcripción en eucariotas poseen al menos dos dominios funcionales distintos, uno de ellos reconoce UAS (upstream activation sequence) y otro promueve la maquinaria de transcripción.

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Presa

Híbrido de ARN ( ARN

MS2 - ARN

GAIT )

MS2 coat

proteinLos dominios son separados, el dominio de activación (B42) se recombina a la proteína de unión al ARN de interés (presa), mientras que el dominio de unión al ADN (LexA) se recombina a una proteína de unión a ARN (MS2 coat protein).

También se fabrica un Cebo, que es un hibrido de ARN, que contendrá la secuencia GAIT (a la que queremos unir la presa) recombinada con ARN MS2 (al que se unirá la proteína de unión MS2).

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La unión de un hibrido de ARN a cada una de las dos proteínas quiméricas activa la transcripción de un gen reportero in vivo, en este caso el His 3.

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ADNc

Dominio de activacion B42

Proteína quimérica: (presa)

La presa estaba contenida en una librería de ADNc proveniente de celulas U937 monociticas activadas con interferón γ en tendem con el dominio de activacion B42.

ADNc- A partir de todo el pool ARNm

3`UTR- Cp

MS2

Híbrido de ARN: (cebo)

3`UTR- Cp

MS2

Híbrido de ARN: (cebo)

Como cebo se utiliza un hibrido de ARN de la extension Cp 3` - UTR recombinado con ARN de MS2.

Las levaduras fueron cotransfectadas con los siguientes plasmidos:

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MS2 coat protein

Lex A

UAS (Upstream activating sequence)

His 3 (Gen reportero)

Proteína quimérica:

Factor de transcripción

UAS (Upstream activating sequence)

His 3 (Gen reportero)

Factor de transcripción

La proteina MS2 coat protein corresponde a una proteina de cubierta de virus que se une al ARN. Lex A es la proteína de reconocimeinto al ADN.

El Gen reportero HIS3 codifica la enzima necesaria para la levadura auxótrofa de histidina y le permite reproducirse en un medio desprovisto de histidina.

Cepas AUXOTROFAS - Requieren Factores de Crecimiento ej: un aminoácido

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Selección de Cepas recombinantes

106 clones de levadura

103 clones tuvieron crecimiento en este medio

Medio deficiente en Histidina.

Se rastrearon 106 clones de levadura en un medio deficiente en Histidina de los cuales en primer lugar solo 103 fueron clones tuvieron crecimiento en este medio, mostrando expresion del gen reportero.

5- fluoroorotic acid (5- FOA)

15 clones

Secuenciación

Para asegurar que la transcripción de His 3 es dependiente de la presencia del elemento GAIT (Cp 3´- UTR) se hace una segunda selección con 5–FOA, el cual causa el rechazo al plásmido que contiene el cebo. Entonces los clones que dependan de la presencia del cebo de ARN no podrán crecer en un medio deficiente en Histidina con 5-FOA.

La secuenciación de estos clones identificó 15 sensibles a 5-FOA que contienen ORFs en Fase con el dominio de activación de B42.

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15 clones

Medio que contiene uracilo

Estos clones fueron replicados en un medio rico en uracilo para sacar los plásmidos que contienen el cebo y URA3, con el fin de expresar la presa de unión a ARN en su forma libre.

Expresión de la presa en forma libre

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Se observa una banda de menor intensidad correspondiente al clon ORF2, esto corresponde a una menor cantidad de producto de traducción (Luc).

Concluyendo que solo el clon ORF2 inhibe la traducción del transcripto reportero quimérico (Luc-Cp 3` UTR) pero no altera la traducción del transcripto control.

Objetivo: Ensayar el silenciamiento de la actividad traduccional, habilidad de lisados de inhibir traducción.

cARN (Luc-Cp 3` UTR) sujeto a traducción in vitro conteniendo 35S metionina en presencia de extractos citosólicos de los clones seleccionados. Alícuotas de la reacción de traducción fueron sujetas a SDS PAGE y autoradiografía. Como control se usa T7 gen 10 cRNA que no posee elemento GAIT.

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La presencia de banda en el carril 2 sugiere la formación del complejo ARN- Proteína entre la

sonda y el ORF2.

La ausencia de banda en el carril 3 muestra que la proteína ORF2 tiene especificidad de unión a

elementos GAIT. Se une a la sonda pero también se une al elemento GAIT competidor,

por esto se visualiza una menor intensidad de banda.

En el carril 4, se observa formación del

complejo, indicando que ORF2 tiene especificidad de unión para la sonda y no para un

mutante de esta.

Objetivos: Mostrar interacción de ORF2 con Cp 3´-UTR.

Lisado del clon ORF2 sujeto a un EMSA usando como sonda Cp 3´UTR radio marcada.

Para los experimentos de competición los lisados fueron preencubados con un exceso de elemento GAIT o con un mutante de Cp 3´UTR .

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Objetivo: Verificar que los resultados obtenidos se deban al plásmido presente en ORF2, y no a una alteración secundaria o a una mutación en el clon de la levadura.

Recuperación del plásmido de ORF2 y retransformación en levaduras con el cebo (bailt).

Las levaduras transfectadas con los vectores conteniendo ORF2 y Cp3’UTR (50-150)

crecieron en un medio sin histidina. Mientras que aquellas que carecian del cebo o de la presa, no crecieron en un medio sin histidina (figura del medio).

Todas las levaduras transformantes crecieron en un medio con histidina (figura de la derecha).

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Secuenciación del ADN plasmídico de ORF2 (Fig. D): codifica para la proteína ribosomal humana L13a, proteína integral de la subunidad ribosomal grande, de 23 KDa con 202 aminoácidos.

Dos motivos consenso han sido descriptos en L13a (Fig. E): el “leucine zipper” y el “dominio básico del leucine zipper”.

Parecería ser que L13a no tiene un rol directo en la formación de las proteínas nacientes desde el ribosoma.

El L13a se une a Cp 3´-UTR en las células y es requerido para el silenciamiento de la actividad

traduccional.

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Células U937 fueron tratadas con INF-γ por 8 y 24 horas. Extractos citosólicos resultantes del tratamiento con INF- γ fueron incubados con radio marcadores del elemento GAIT.

Para confirmar la presencia de la proteína L13a extractos tratados por 24hrs. fueron pre incubados con anticuerpo anti-L13a polyclonal o con suero pre inmune.

Se realiza un Ensayo EMSA supershif ARN para comprobar que la proteína L13a se encuentra enlazada al elemento GAIT.

El ensayo EMSA demuestra que una proteína enlazada al elemento GAIT (marcado) forma complejo ARN-Proteína sólo luego de 24hrs de tratamiento con INF-γ. El “supershift” con el anticuerpo anti-L13a confirma que la proteína es la L13a.

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Se intentó comprobar si la actividad traduccional del transcripto de ARN reportero que contiene al elemento GAIT, Luc-Cp 3’-UTR (50-150)-poly(A),es silenciada o no por la proteína L13a.

Para ello, extractos citosólicos de células U937 se trataron con INF- γ por 8 y 24hrs. Los extractos de 24hrs se sometieron a una Inmunosupresión para remover la proteína L13a con el anticuerpo anti-L13a o suero pre inmune como control. Se adicionó también como control de especificidad un transcripto de ARN diferente, el T7 gen 10, que no tiene el elemento GAIT.

Se testea la habilidad de la proteína L13a en la activación o inhibición dela traducción de un transcripto reportero .

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•En los primeros dos carriles con y sin tratamiento de INF-γ durante 8 hrs hay actividad traduccional. •En el primer carril de extractos tratados por 24hrs con INF-γ no hay actividad, sugiriendo que el L13a se unió al elemento GAIT incluido en transcripto reportero silenciando la actividad traduccional.•En el siguiente carril, con el agregado del anticuerpo anti-L13a, se procedió a la inmunosupresión sacando el L13a “del camino” por lo que se detectó actividad traduccional.•En el último carril con suero pre-inmune, sin anticuerpo, no se observa marcado sugiriendo el silenciado de la actividad traduccional.

Como resultado del ensayo de actividad traduccional in vitro podemos observar que:

La remoción de L13a por inmuno-supresión demostró la habilidad de la proteína para silenciar la actividad traduccional de las células U937 tratadas

por 24hrs con INF-γ.

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Se investigó la interacción in vivo entre L13a y ARNm Cp en células U937

Células U937 fueron tratadas con INF-γ por 8 y 24hrs, de los extractos citosólicos la proteína L13a fue inmuno-precipitada (IP) con anticuerpo anti-L13a y el producto obtenido fue amplificado por PCR-RT. El objetivo de este ensayo es demostrar la existencia de un enlace intracelular de L13a con el Cp ARNm de éstas células.

Estos resultados demuestran que L13a es enlazada específicamente, y en forma retrasada, al Cp 3’UTR de células U937 tratadas con INF-γ.

El L13a recombinante tiene actividad silenciadora de la traducción.

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La expresión de L13a recombinante(rL13a) en E.Coli y en células de insectos fue testeada por análisis de

inmunoblot.La rL13a fue testeada en células E.Coli y células de insectos infectadas con baculovirus y parcialmente purificadas por cromatografía en gel filtración. Como vector control (C) se usa ORF de L13a humano clonado en un vector pET-17b.

Ambos sistemas expresaron cantidades sustanciales de proteína recombinante pero las proteína derivadas de células de insectos tuvieron una movilidad retardada levemente comparadas con las células de E. Coli sugiriendo una posible modificación post-traduccional para las células de insectos.

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La habilidad de rL13a es testeada también por traducción in vitro en células U937, E. Coli y células de insectos.

•En células E. Coli se detectó un marcado sustancial en ambos carriles (C y L13a) sugiriendo que L13a de dichas células no afecta la traducción del transcripto reportero quimero Luc.

•En células de insectos se detecta banda en el vector C pero no en el vector con L13a sugiriendo que L13a derivado de dichas células inhiben la traducción del transcripto reportero . De igual

manera sucede con en extractos de células U937 tratadas por 24hrs con INF-γ.•La actividad silenciada de rL13a fue específica y no bloqueó la traducción sobre el transcripto

control T7 gen 10.

Como control de especificidad se utilizó el gen T7 gen 10.

Como control positivo del silenciado de actividad traduccional se utilizaron lisados citosólicos de células U937 tratadas con INF-γ por 24hrs.

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EL INF-γ causa la fosforilación retardada del L13a en células U937

Método de Nothern Blot:Es un método análogo al Southern

Blot, para estudiar la expresión de genes por detección de uno o mas ARNm específicos en una muestra total de ARN.

El ARN es desnaturalizado, separado por tamaño por electroforesis y transferido a una membrana de nylon donde es hibridizado y detectado con una sonda marcada de ADN o ARN complementaria.

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Objetivo: examinar efecto del interferón γ en la expresión de L13a

ARN fue separado de células U937 incubadas con interferón γ 0, 8 y 24hs.

Sujeto a Nothern Blot usando ADNc de L13a humana como sonda.

Conclusión:El interferón γ no altera el nivel de ARN de L13a durante el período de tratamiento.

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Método de Westernblot: (Protein inmuno Blot)

Es una técnica analítica usada para detectar proteínas especificas en un extracto.

Se usa una electroforesis en gel para separar las proteínas. Estas son transferidas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF donde son detectadas usando anticuerpos específicos para la proteína objetivo.

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Objetivo: examinar la regulación post-transcripcional

Extractos de células U937 tratadas con interferón γ sujetos a SDS-Page

Realización de Inmunoblot con anticuerpos anti-L13a

Conclusión:El tratamiento con interferón γ no altera significativamente el nivel de expresión de L13a. Sin embargo si modifica su movilidad, que es marcadamente disminuida luego del tratamiento por 24 hs, sugiriendo una modificacion post – traduccional.

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Immunoprecipitación (IP): Es una técnica de precipitación de proteína usando un anticuerpo. Este proceso puede

ser usado para separar o concentrar una proteína particular de una muestra. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se una a un sustrato solido en algún punto del procedimiento.

El principio de la IP es muy simple, un anticuerpo mono o polyclonal contra un objetivo especifico forma un complejo inmune con la proteína objetivo en una muestra como un lisado. El complejo se une a un soporte solido donde una proteína A o G están inmovilizadas y hacen al complejo insoluble que por tanto precipita.

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Objetivo: examinar la posibilidad de que la fosforilación de L13a cause el retardo en la movilidad electroforética.

Marcado metabólico con puso de 6hs de 32P-ortofostato

Realización de Inmunoprecipitación con anticuerpos anti-L13a

Separación por SDS-PAGE Auto radiografía

Conclusión:El L13a fue fosforilado en un curso de tiempo consistente con el retardo de la movilidad.

Proteína L13a Fosforilada

Suero pre-inmune

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Objetivo: Determinar el rol de la fosforilación, efecto del tratamiento con fosfatasa en la actividad de L13a.

Células U937 tratadas con interferón γ fueron incubadas en fosfatasa alcalina.

Realización de Inmunoblot con anticuerpos anti-L13a

Conclusión:Muestra que la fosfatasa alcalina restaura la movilidad electroforética del L13a, indicando que el retardo era debido a la fosforilación y mostrando también la efectividad del tratamiento.

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Traducción in vitro del reportero Luc-Cp 3´UTR-polyA en lisados de reticulocito de ratón tratados con interferón γ.

Conclusión:El lisado con fosforilasa no inhibe la traducción in vitro del reportero indicando el rol critico de la fosforilación de L13a en el silenciamiento de la traducción.

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Objetivo: Confirmar rol de L13a en la actividad de silenciamiento traduccional fue debido a fosforilación diferencial, se usan proteínas recombinantes de L13a de 2 fuentes.

Marcado metabólico con 32P-ortofostato Realización de Inmunoprecipitación con

anticuerpos anti-L13a Separación por SDS-PAGE Auto radiografía

Conclusión:El L13 derivado de células de insectos fue fosforilado y era activo, mientras que el L13 de E.coli estaba sin modificar y era inactivo.

Proteína L13a Fosforilada

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L13a recombinante construida por células de insectos infectadas con baculovirus son tratadas con fosfatasa alcalina en presencia o ausencia de inhibidorL13 a es adicionado a la mezcla de traducción Traducción in vitro del reportero Luc-Cp 3´UTR-polyA en lisados de reticulocito de ratón tratados con interferón γ.

Conclusión:El tratamiento con L13a derivado de células de insecto con fosfatasa alcalina bloquea la actividad silenciadora.

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Conclusión General:

Los resultados muestran que TODO el pool de L13a de las células U937 es fosforilado luego de un tratamiento prolongado con interferón γ y esa modificacion es requerida para el silenciamiento de la traducción.

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El INF-γ induce la liberación del L13a de la subunidad ribosomal 60S

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Objetivo: Buscar cual es la forma en la que L13a se encuentra al enlazar al transcripto, ribosomal (unida a la subunidad ribosomal 60S) o citosólica (no ribosomal)

A y B -Lisados de células U937 tratados con INF-γ fueron fraccionados sobre un “cojín” de azúcar para separar la fracción ribosomal del citosol libre de ribosomas. -Ambas fracciones fueron sujetadas a SDS-PAGE y análisis de inmunoblot con anticuerpos anti-L13a y anti-L28 para A y B respectivamente.

Conclusión de A y BL13a se enlaza al transcripto encontrándose en su forma citosólica

C- De las fracciones ribosómicas y citosólicas se extrajo el ARN y se visualizó con bromuro de Etidio sobre un gel de agarosa-formaldehído.

Conclusión de C La ausencia de ARN ribosomal 28S y 18S verifica que en los procedimientos A y B se removieron eficientemente todas las subunidades ribosómicas intactas.

Discusión:

El INF-γ induce la liberación de L13a desde la subunidad ribosomal

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Entre las 2 y 4 hrs. luego del tratamiento con interferón γ en células U937:

Cp ARNm es inducido y comienza su traducción.

L13a esta en la subunidad ribosomal

60S en su forma no fosforilada.

Entre las 16 y 24 hrs:

L13a esta fosforilada y libre del ribosoma. Esto se puede dar de dos maneras posibles:

L13a se fosforila estando unida al ribosoma, lo que causa su liberación.

L13a se disocia del ribosoma y luego es fosforilada.

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A las 24 hrs:

L13a libre y fosforilada se une al elemento GAIT Cp 3´UTR.

El silenciamiento requiere de la circularización del ARNm,

o más precisamente, de los elementos requeridos para la

terminación de la transcripción: cola de poly(A),

PABP (factor de iniciación de la traducción, proteína de unión a poly(A)), elF4G (proteína de unión-cap).

Se propone que una función de la circularización sería yuxtaponer las

proteínas de unión a 3´UTR con el sitio de iniciación 5´donde se podría

ejercer control de la traducción.

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4 posibilidades pueden ser consideradas para explicar el mecanismo por el cual GAIT bloquea la iniciación de la traducción.

GAIT podría:

i. Inhibir la función del complejo de unión cap, elF4G

ii. Bloquear el reclutamiento del complejo de preiniciación 43S

iii. Prevenir el rastreo del complejo 43S al codón de iniciación

iv. Bloquear la unión de la subunidad ribosomal 60S

La función específica de la fosforilación de L13a no se conoce, pero podría facilitar la unión al elemento GAIT , tanto directamente o por la unión de otras proteínas en un complejo de unión al elemento GAIT.

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El ribosoma como Depósito para Proteínas de Control Traduccional

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La liberación de varias proteínas ribosomales desde el ribosoma influye en la traducción de proteínas específicas (o sobre un grupo de proteínas), sin alterar la síntesis general del resto de proteínas.

L13a actúa de esa forma; las células U937 tratadas con INF-γ por 24 hrs. no inhiben la síntesis global de proteínas.

Estudios con Cristalografía de rayos X de la subunidad ribosomal 50S de Haloarcula marismortui (bacteria) muestran que la mayoría de la masa proteica se encuentra como un dominio globular discreto sobre la superficie del núcleo del ARN, lejos del sitio de catálisis.

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Relación de L13 (proteína globular superficial de la subunidad 50S) con otras proteínas ribosomales y con el ARN.

El ARN está representado como hebras para revelar las proteínas en el interior de la subunidad 50S. No se ve ningún dominio de L13 sumergido, mostrando que se encuentra enteramente en la superficie.

Visualización por Cristalografía de rayos X de la subunidad ribosomal 50S con la proteína L13 de Haloarcula marismortui (bacteria), análoga a la proteína L13a de eucariotas.

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L13 tiene un mínimo contacto con los dominios de la proteínas de superficie L3 y L6.

La remoción de L13 del modelo expone una depresión en la superficie del ARN y muestra que L13 no interactúa con ninguna proteína de las “enterradas”.

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Se piensa que la unión de las proteínas al ARN depende de la topología superficial del ARN y no de la especificidad en las secuencias de ARN.

L13 esta lejos de los sitios de elongación de cadenas y salida de polipéptidos, esto apoya su no influencia en la síntesis de proteínas globales.

La estructura y posición de L13 disminuye las dificultades para su liberación desde el ribosoma.

Se sabe poco acerca de la estructura y función de L13a en la subunidad 60S de eucariotas. Análisis en Saccharomyces cerevisiae (levadura) del ribosoma 80S sugiere que su proteína L16 ribosomal análoga a la L13a de vertebrados, está localizada en la superficie del ribosoma.

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Resumiendo…

Además de funcionar como maquinaría de la síntesis proteica, el ribosoma actúa como un depósito para las proteínas de regulación traduccional.

La función del retrazo en el silenciamiento de la traducción de Cp no es conocida. Una posibilidad es sugerida por el hallazgo de que la actividad bactericida de Cp es efectiva solamente en un escaso margen de concentración. Alternativamente, la acumulación incontrolada de Cp en los sitios de inflamación podría traer consecuencias perjudiciales relacionadas con la habilidad del cobre de Cp para oxidar lipoproteínas.

El mecanismo de silenciamiento de la traducción podría haber evolucionado para terminar o limitar la expresión de Cp por parte de los macrófagos y de otras proteínas inflamatorias.

Varios mecanismos conocidos en la terminación de la inflamación, implican el control traduccional.