Inmunología Molecularwww.elsevier.com/locate/molimm

Reseña

Propiedades moleculares de las subclases de IgG humanas y sus implicaciones en el

diseño de anticuerpos monoclonales terapéuticos contra enfermedades infecciosas

Vashti Irania, Andrew J. Guy, Dean Andrew, James G. Beeson, Paul A. Ramsland, Jack S.

Resumen

Anticuerpos monoclonales están siendo desarrollados como terapéuticos para complementar drogas y

vacunas, o para llenar el vacío donde ninguna droga o vacuna existe. Estos anticuerpos terapéuticos

(ThAb) pueden ser especialmente importantes para enfermedades infecciosas en las cuales hay

resistencia antibiótica, patogénesis mediada por toxinas, o patógenos emergentes. La estructura única

de los anticuerpos determina la naturaleza específica de sus efectos o funciones, por lo que al

desarrollar ThAb, los efectos o funciones deseados necesitan ser considerados e integrados en los

procesos de diseño y desarrollo para asegurar la máxima eficacia y seguridad. Es crítico tener en

consideración la subclase de los anticuerpos, y es notable que casi todo ThAb que está licenciado o

actualmente en desarrollo, utiliza una IgG1 como cimiento. Esta reseña describe las principales

propiedades estructurales que varían entre cada subclase, cómo es que estas propiedades afectan la

inmunidad funcional, y discute los diferentes acercamientos usados para estudiar la respuesta de las

diferentes subclases a enfermedades infecciosas. También analizamos los factores asociados a la

selección de las subclases de anticuerpos durante el diseño de las ThAb y subrayamos circunstancias

donde las diferentes propiedades de las subclases pueden ser beneficiosas al ser aplicadas contra

enfermedades infecciosas específicas. Estos enfoques son críticos para el futuro diseño de ThAb y para

el estudio de la inmunidad naturalmente adquirida y la inducida por vacunas.

1. Introducción

El descubrimiento de Emili von Behring de las antitoxinas para

la difteria, tétano y ántrax en 1901, llevó eventualmente al

descubrimiento de los anticuerpos. Un siglo después, el uso

de anticuerpos terapéuticos (ThAb) se ha vuelto una de las

áreas de mayor crecimiento de la industria farmacéutica; aun

así, irónicamente, el desarrollo de ThAb monoclonales contra

enfermedades infecciosas ha sido lento, comparado con la

mayoría de otros campos. Queda todavía un considerable

vacío de conocimiento en la identificación de los roles de

ThAb contra enfermedades infecciosas específicas, así como

las propiedades moleculares exactas requeridas para

asegurar que los ThAb induzcan las funciones deseadas,

evitando reacciones adversas. Es bien sabido que los

principales isotipos de inmunoglobulinas humanas tienen

funciones estructurales únicas que les permiten realizar

funciones inmunológicas específicas (Fig. 1). En esta reseña,

nos concentramos en IgG y sus subclases y resaltamos la

compleja relación estructura-función, que es crítica para

desarrollar ThAb monoclonales más seguros y efectivos

(TablaS1). Situamos este conocimiento en el contexto de

enfermedades infecciosas y resaltamos cómo los estudios

deberían evaluar ahora las mejores subclases de IgG o las

propiedades moleculares

requeridas para tratamientos efectivos de enfermedades infecciosas específicas.

Actualmente, un amplio repertorio de ThAb monoclonales

están licenciados, con cientos más en desarrollo preclínico y

clínico. Estos ThAb son administrados para un amplio rango

de enfermedades, aunque la gran mayoría son usados para

tratar cáncer, desórdenes autoinmunes y trasplantes (Fig. 2A y

tabla S2). Es interesante notar que a pesar del claro papel que

los anticuerpos desempeñan contra muchas infecciones, sólo

hay dos ThAb monoclonales licenciados que tienen como

objetivo agentes infecciosos (Palivizumab contra el virus

sincitial respiratorio humano y Raxibacumab contra Bacillus

anthracis) (Tabla 1). La mayoría de ThAb licenciados son de

tamaño completo en vez de fragmentos Fab (Fig. 2B). Los

beneficios de usar ThAb de tamaño completo incluyen mayor

vida media en suero como resultado de la interacción con

FcRn, efecto o función mejorados mediante el acoplamiento

con receptores Fc y, en algunos casos, una neutralización

más efectiva comparada con el fragmento Fab

correspondiente. La mayoría de los ThAb aprobados

anticuerpos IgG humanizados o completamente humanos.

Anticuerpos quiméricos o basados en murinae (ratas)

conllevan un riesgo incrementado de reacciones anti murinicas

en los pacientes., y ha habido un movimiento general hacia el

uso de un andamio humano en el desarrollo de potenciales

ThAb.

Mientras el uso de IgG intacta permite la selección de subclases de IgG para desempeñar funciones efectoras específicas, esto no es reflejado en el rango actual de anticuerpos licenciados en los que la mayoría son IgG1 (Fig. 2D y Tabla S2).

Probablemente, esto es porque la IgG muestra funciones efectoras potentes, siendo la más predominante de las subclases de suero, y fue el cimiento usado en los primeros ThAb aprobados. Interesantemente, no existen ThAb de IgG3 aprobadas, con posibilidad de que esto sea debido a (i) una afinidad aumentada a proteólisis debido a una extensa región bisagra, (ii) los muchos alotipos de IgG3 entre diferentes poblaciones, (iii) que las IgG3 no puedan ser purificadas con proteína A, o (iv) la reducida vida media en suero de la IgG3 comparada con otras subclases (Tabla S1). En este análisis, proveemos una visión concisa del efector conocido de la IgG humana y propiedades de subclases (Sección 2) y discutimos cómo está información puede ser usada en el diseño de ThAb para enfermedades infecciosas (Sección 3).

2. Propiedades moleculares de las subclases de IgG relevantes para anticuerpos terapéuticos

Las IgG consisten de dos cadenas pesadas y dos cadenas

ligeras con las principales características moleculares

descritas en la Fig. 1B. En la IgG, la región del fragmento de

unión al antígeno (Fab) contiene al paratope, y puede ejercer

diferentes efectos, haciendo posible las interacciones con el

antígeno (por ejemplo, bloqueando una proteína de

reconocimiento del hospedero o inhibiendo una toxina/enzima

de un patógeno). Mientras tanto, la región de fragmento

cristalizable (Fc) interactúa con una variedad de moléculas

accesorias para mediar funciones efectoras indirectas, tales

como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

(ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos

(ADCP) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC)

(Fig. 3A y B). Las funciones efector mediadas por Fc son

especialmente importantes contra enfermedades infecciosas

donde respuestas celulares y de

complemento son importantes para la eliminación eficiente del patógeno.

Las propiedades estructurales y funcionales de las subclases

de IgG varían, así como su respuesta se perfila contra

diferentes enfermedades infecciosas, y estas diferencias

pueden ser utilizadas en el desarrollo de ThAb efectivos. A

pesar de que las cadenas pesadas comparten más del 90%

de identidad en sus secuencias entre las subclases de IgG,

hay diferencias en los residuos expuestos en la superficie en

los dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), así como una

variación sustancial en la región bisagra [hinge region] (Fig.

3C, D y Tabla S1). Es la estructura de bisagra la que confiere

muchas de las propiedades únicas para cada subclase de IgG,

como estabilidad, flexibilidad y distancias abarcadas por las

dos Fab y la Fc acomodadora. Considerablemente, algunas

áreas del Fc y de la bisagra que difieren entre subclases de

IgG, claramente se sobreponen con residuos que se sabe

estan involucrados con unirse con receptores activadores e

inhibidores Fcγ (FcγR), el receptor neonatal para IgG (FcRn) y

el componente complemento C1q (Fig. 3A and B). La

ocurrencia de diferencias en aminoácidos clave en los sitios

de unión de estas moléculas efectoras, ayuda a explicar las

diferencias observadas en las propiedades efectoras de las

subclases de IgG (Tabla S1). Esta información estructural y

molecular es importante al escoger una subclase como base

para un anticuerpo terapéutico o para introducir cambios en

aminoácidos clave para adaptar anticuerpos para un propósito

específico.

2.1. Sitio de unión en GgG-Fc para FcyRs activadoras e inhibidoras

La región de fragmento cristalizable (Fc) de las IgG interactúa con diversos FcγRs para estimular y regular el flujo de mecanismos efectores. Hay cinco receptores activadores, llamados FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIc (CD32c), FcγRIIIa (CD16a) y FcγRIIIb (CD16b),y un receptor inhibidor, FcRγIIb (CD32b). Las subclases de IgG varían en su habilidad de unirse a FcγR, y esta diferencia en la unión determina su habilidad para desencadenar un gran rango de respuestas funcionales.

Fig. 1. Estructura de un anticuerpo y nomenclatura. (A) Los potenciales isotipos, subclases y alotipos de inmunoglobulinas en humanos. Tanto la letra como el código son provistos para cada alotipo.

(B) Esquema ilustrando la estructura básica de un anticuerpo y su nomenclatura asociada. La cadena ligera (en marrón) consiste de un dominio variable (VL) y uno constante (CL), mientras que la cadena pesada (en gris) consiste de un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2, CH3). Uniones de disulfuro intercatenarias en el rango de la región bisagra estabilizan el total de la estructura del anticuerpo. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR, rayas cruzadas) determinan especificad antigénica. Los patrones de glicosilación pueden también afectar la función (en verde).

Fig. 2 Estructura y dianas de anticuerpos terapéuticos licenciados. La lista actual (2014) de anticuerpos terapéuticos que han sido licenciados para su uso en EE.UU. y la UE los clasifica en (A) enfermedad para la que fueron aprobados inicialmente, (B) estructura del anticuerpo (tamaño completo o fragmentos Fab), (C) tipo de especie del anticuerpo (e.j. murina, quimérica, humanisada, totalmente humana), y (D) subclase de anticuerpo. Estas figuras fueron hechas con datos de la Sociedad de Anticuerpos (2014) y la tabla de datos usada para preparar estas cifras está provista en los materiales suplementarios (Tabla suplementaria S2). *Panel A: “otras” indicaciones incluyen prevención de coágulos de sangre, pérdida de masa ósea, asma, degeneración macular, hemoglobinuria nocturna paroxística y síndrome de Mackle-Wells.

Fig. 3 Entendimiento estructural para las interacciones Fc y las diferencias entre subclases de IgG. (A) Un esquema generalizado de un anticuerpo con sitios de adherencia mayores [receptores Fcγ (magenta), C1q (cian) y FcRn(morado)] superpuestos. (B) Estructura dristalina de la región Fc de la IgG1 (PDB: 1FC1) (Deisenhofer, 1981) con todas las diferencias de aminoácidos entre subclases resaltadas. Los residuos que difieren de la IgG1 están en negrita. Los allotipos (alelos de un anticuerpo) usados fueron IgG1 (G1m,17), IgG2 (G2m..) y IgG3 (G3m5*). (D) Alineación de los residuos de bisagra entre las cuatro subclases. Los residuos están numerados usando el esquema de numeración de la UE; este esquema está basado en secuencias de IgG1 y por ende no asigna números para la mayor parte de la secuencia bisagra de IgG3 (por ser muy larga). Las figuras B y C fueron construidas usando Accrelys Discovery studio visualizer (versión 3.5).

Por ejemplo FcγRIIIa es el mayor receptor involucrado en la

activación de ADCC y la IgG3 seguida inmediatamente de la

IgG1 muestran las afinidades más altas por este receptor,

reflejando su actividad para inducir potencialmente ADCC.

La región de unión de FcγR en la IgG incluye partes de CH2 y

la bisagra, con la unión influenciada por glicosilación en N297.

Residuos específicos que interactúan con FcγR en la IgG han

sido identificados por medio de cristalografía de rayos X de

complejos de IgG1-Fc con los diferentes FcγRs. Muchos de

estos estudios han demostrado que hay residuos conservados

en la IgG involucrados en la unión con todos los

FcyRs. Sin embargo, otros residuos de IgG varían en su

interacción con los diferentes FcyRs y algunos de estos

residuos difieren entre las subclases de IgG, lo que ayuda a

explicar los diferentes perfiles de unión de FcyR en las

subclases de IgG. Esto ha proporcionado una visión específica

de los residuos requeridos para la interaccion de IgG con los

receptores involucrados en ADCC y ADCP. La posibilidad de

usar secuencias específicas de subclases para adaptar la

unión de diferentes FcyRs debe ser considerada cuando se

desarrolle la IgG terapéutica con las funciones efectoras

dependientes de anticuerpos deseados.

2.2 Deposición del complemento y CDC por IgG

En el clásico camino del complemento, IgG se une al antígeno para formar complejos inmunes, que luego interactúan con C1 y desencadenan una jerarquía de interacciones y reacciones enzimáticas que pueden llevar a la formación del complejo de ataque a la membrana y CDC, resultando en la liquidación del patógeno. La deposición de C1q (unión a IgG-Fc), ocurre con IgG1, 2 y 3, con IgG3 siendo la más efectiva; IgG4 no es capaz de interactuar con C1q. Curiosamente, la eficiencia de deposiciones de C1q no se correlacionan con la actividad de CDC, en la que IgG1 es la subclase más potente de IgG. El fundamento estructural para esta diferencia entre la unión de C1q y CDC por las subclases de IgG queda aún irresuelto. Aquí brevemente resumimos lo que es conocido acerca de la interacción de IgG y C1q.

El sitio de unión de IgG1 para C1q ha sido localizado en el

dominio CH2 y los residuos específicos implicados en la

interacción se han estudiado usando mutagénesis de IgG1.

Mostramos la ubicación del sitio de unión C1q en una

representación diagramatica de IgG (Fig 3A) y la estructura

cristalina de IgG1-Fc (Fig 3B). Aunque cada IgG tiene dos

sitios de union para C1q en lados opuestos del Fc, sólo un

sitio necesita ser implicado en la unión de C1q. Mientras la

estructura cristalina de IgG unida a C1q no se ha determinado,

la estructura cristalina de C1q se ha modelado con IgG1 y

sugiere una conformación de C1q e IgG1 que también puede

implicar el fragmento Fab. Un estudio reciente usando

tomografía crio-electrón sugiere que el antígeno unido a IgG1

puede formar una estructura hexamerica que interactúa

eficientemente con el hexámero C1q de una manera

reminiscente a la IgM polimérica.

2.3 La unión de IgG a FcRn determina la vida media y el transporte de la placenta.

La interacción de IgG con FcRn es importante en el contexto

del transporte placentario y la vida media en suero. El FcRn

tiene homología estructural con MHC I y también participa en

la presentación de antígenos. Los residuos responsables

de la unión de IgG a FcRn fueron aclarados utilizando principalmente las estructuras cristalinas de FcRn de rata o de humano, y se indican en una representación de IgG y en la estructura 3D de la estructura de IgG1-Fc (Fig 3B). El sitio de unión FcRn en IgG se produce en la unión entre los dominios CH2 y CH3, un área rica en residuos de histidina, en la cual H310 y H435 se considera actúan como sensor de pH en la unión de IgG.

De las subclases de IgG, IgG3 tiene la vida media más corta

con aproximadamente 7 días, lo cual es debido en gran parte

a una arginina en la posición 435 que sustituye a la histidina

presente en todas las otras subclases de IgG. Después de su

absorción por endosomas recicladores, la unión de IgG3 a

FcRn está competitivamente inhibida por IgG1, que tiene una

mayor afinidad de unión por FcRn; la IgG3 no unida, es

degradada en lugar de ser de vuelta a la circulación, lo que

explica su vida media más corta. Un alotipo de IgG3 (G3m15)

con H435 no tiene una vida media reducida, destacando la

importancia de residuos de histidina en la afinidad de unión en

general para FcRn. En consecuencia, la producción de IgG3

humana con H435 debería conducir a candidatos Thab con

vidas medias largas in vivo similar a otras subclases de IgG.

Es interesante observar que aunque el FcRn también está implicado en el transporte placentario, IgG2 se observa a menudo como el menos eficiente en comparación con otras subclases. La razón del transporte placentario ineficiente de IgG2 no se entiende claramente, pero la proporción de isotipos de cadena ligera (κ o λ) no es un factor. La comprensión de las interacciones de los receptores específicos que modulan el transporte placentario, mas no su vida media en suero, puede ser útil cuando se produce ThAb para uso durante el embarazo.

2.4. La glicosilación de IgG-Fc impacta en la función efectora

Todas las IgG contienen un sitio de glicosilación conservados

en N297 en CH2, contribuyendo a la conformación estructural

de la Fc requerido para la unión a FcγR, FcRn y C1q (Fig 1B).

Los N-glicanos en Fc son estructuras complejas

principalmente di-antenarios con núcleo de 1-6 fucosilación

del residuo N-acetil glucosamina (GlcNAc) unido a N297, pero

una gran variedad de glicoformas se han descrito en IgG

normal y recombinante. Estos patrones diferentes de

glicosilación imparten cambios estructurales en la región Fc,

que a su vez afecta a la función efectora de anticuerpos.

Aunque hay evidencia de que los patrones de glicosilación

pueden diferir entre subclases, el impacto en las funciones

efectoras de IgG no ha sido bien caracterizado. La

glicosilación de IgG también se ve afectada por un número de

factores incluyendo la edad, el embarazo, enfermedad

inflamatoria e infección. Les referimos a los lectores que

busquen revisiones detalladas en la glicosilación de

inmunoglobulina para más información.

2.5. Alotipos de subclases de IgG

La variación alotípica (polimorfismos) en cadenas pesadas de

IgG (Gm) tiene el potencial de influir en las respuestas de IgG

inducidas tanto naturalmente o por vacunas. El número de

alotipos para cada subclase IgG varía: IgG1 tiene 4, IgG2

tiene 2, IgG3 tiene 13 e IgG4 no tiene ninguno (Fig 1A). Estos

alotipos de IgG han sido en ocasiones asociados a una mayor

protección contra ciertas enfermedades. Es importante

destacar que se ha sugerido que el alotipo de un ThAb puede

contribuir a la resistencia a la terapia asociada a respuestas

inmunes anti-Thab. Hasta la fecha, sólo unos pocos estudios

han investigado claramente los efectos del desajuste del

alotipo en el desarrollo de respuestas anti-Thab. En estos

estudios, no hubo asociación significativa entre el alotipo de

IgG y la aparición de respuestas de anticuerpos anti-

monoclonales. Sin embargo, se necesita más investigación

para concluír de forma segura que un alotipo no influye en las

respuestas anti-Thab, sobre todo porque relativamente pocos

alotipos se han probado en la clínica.

2.6. La subclase IgG y la ingeniería de Fc

La ingeniería de Fc ha sido importante para el desarrollo de

anticuerpos terapéuticos con actividad potente y específica,

así reduciendo tanto la dosificación y los efectos secundarios

potenciales. La comprensión de las diferencias entre las

subclases de IgG se ha utilizado en la producción de Fc y los

estudios han demostrado que la introducción de residuos

específicos de una subclase a otra puede transformar ciertas

funciones efectoras, mientras que conserva las demás. Los

ejemplos incluyen la producción de IgG2 con residuos de IgG4

para la extripación de las funciones efectoras o la producción

de IgG3 con residuos procedentes de otras subclases para

aumentar su vida media. Este enfoque se complementa con

otros métodos tales como la evaluación de los mutantes de

alanina, métodos de cribado de alto rendimiento

computacionales o la resolución de la estructura de los

dominios Fc mutados. Estos enfoques de ingeniería Fc son

pertinentes en el contexto de las enfermedades infecciosas,

como la función efectora de anticuerpos específicos es a

menudo crítica en la eliminación eficiente del patógeno. Los

anticuerpos de Fc también se han modificado para eliminar los

sitios de proteólisis bacteriana, que se cree es un modo de

evasión inmune de ciertos patógenos. El amplio alcance y las

posibilidades de la ingeniería de Fc han sido revisados en

detalle en otra parte.

3. Anticuerpos terapéuticos para enfermedades infecciosas

El uso de ThAb para enfermedades infecciosas puede implicar la transferencia pasiva de anticuerpos para la profilaxis pre/pos exposición o para el tratamiento. El ThAb puede derivarse de suero humano agrupado o anticuerpos monoclonales recombinantes. En esta revisión, nos centramos en el uso de anticuerpos monoclonales, pero brevemente discutimos terapias séricas y preparaciones de anticuerpos policlonales ya que se han utilizado para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Discutimos la relevancia de las subclases de IgG en el contexto de las enfermedades infecciosas y destacamos la adherencia actual de ThAb monoclonal a los antígenos de organismos infecciosos.

3. Anticuerpos terapéuticos para enfermedades infecciosas

Preparaciones Thab policlonales usados comúnmente consisten en fracciones de inmunoglobulinas purificadas de cientos a miles de donantes y se entregan por vía intravenosa (IGIV), intramuscular (IMIG) o subcutánea (SCIG). Nos centramos en el uso de IgG agrupado para condiciones infecciosas específicas, aunque también se ha utilizado como una transfusión para pacientes con enfermedades de inmunodeficiencia primaria o enfermedades inflamatorias o autoinmunes. Las principales enfermedades infecciosas que se utiliza IgG combinada son el tétanos, la hepatitis A, la hepatitis B, el sarampión, la rubéola, la rabia, la varicela, el virus respiratorio sincitial y el citomegalovirus. Productos específicos a la enfermedad a veces se enriquecieron mediante la agregación de anticuerpos de individuos con títulos altos a estos antígenos de enfermedad.

La naturaleza policlonal de IgG combinada permite la

focalización de múltiples epítopos (determinante antigénico), lo

que es ventajoso en el tratamiento de ciertas enfermedades

infecciosas. Sin embargo, esto crea desafíos con

estandarización a través de lotes, aumento de costos,

potencial de contaminación y la falta de eficacia debido a la

dilución de anticuerpos funcionales. Un enfoque alternativo es

usar anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos relevantes

y que estén diseñados con los cimientos de subclases, que

median la respuesta efectora deseada. Los anticuerpos

monoclonales tienen la ventaja adicional de estar

estandarizados, pueden ser producidos en masa y tienen un

bajo riesgo de contaminación. Los anticuerpos monoclonales

terapéuticos pueden ser particularmente útiles para

aplicaciones tales como la fiebre del dengue, en los que

actualmente no hay medicamentos o vacunas antivirales

autorizadas o licenciadas, y el tratamiento es principalmente

de apoyo. Los anticuerpos monoclonales serían favorables, ya

que podrían ser seleccionados para dirigir la neutralización de

epítopos comunes en los cuatro serotipos del virus del

dengue. Mas aún, la preocupación por el aumento de la

patogénesis impulsado por la mejora dependiente de

anticuerpos (mediado por las interacciones Fc:FcR) podrían

ser superados por los anticuerpos monoclonales con cimientos

de IgG4 o mutaciones para eliminar la unión a FcRs.

3.2 Relevancia de las subclases de IgG en enfermedades infecciosas

Las interacciones diferenciales de las cuatro subclases de IgG

con diversas moléculas efectoras inmunes sugiere roles

específicos para cada subclase durante una infección natural.

Esto es reflejado en las características de perfiles de

subclases observados en individuos después de la exposición

a agentes infecciosos. En este contexto, las respuestas de las

subclases pueden diferir de acuerdo con el patógeno, el

antígeno, o incluso el epítopo (discutido en la Sección 4.1). La

importancia de las subclases de IgG en las enfermedades

infecciosas es apoyada también por el estudio en individuos

con ciertas deficiencias en estas subclases de IgG. Las

deficiencias selectivas en subclases están entre las cuatro

deficiencias inmunitarias más comunes en pediatría. Los

síndromes más comunes observados clínicamente han sido

aquellos en las que la deficiencia de IgG2 se asocia con un

mayor riesgo de infecciones, causadas por bacterias

encapsuladas; y la deficiencia de IgG3 se asocia con

infecciones respiratorias recurrentes. Sin embargo, estos

estudios describen la asociación y no necesariamente

causalidad, y pueden ser confundidos con ciertas deficiencias

de subclases de IgG que se producen en combinación con

otras inmunodeficiencias. En consecuencia, las respuestas de

las subclases de IgG pueden afectar la inmunidad a

patógenos y esto debe ser investigado más a fondo para

avanzar en el desarrollo de ThAb especialmente en

enfermedades infecciosas.

3.3 ThAb monoclonal en las enfermedades infecciosas en desarrollo

Actualmente, sólo hay dos ThAb monoclonales autorizados para su uso contra las enfermedades infecciosas, con aproximadamente 36 etapas preclínicas y clínicas de desarrollo. Estos ThAb tienen como objetivo aproximadamente a 14 especies diferentes de virus y bacterias, mientras solo 2 tienen como objetivo hongos y ningúno a organismos parasitarios. Los que están en desarrollo tienen como objetivo organismos similares a los de los productos IgG humano agrupados existentes, reflejando el paso de productos a base de sangre hacia anticuerpos monoclonales recombinantes. Además, las combinaciones de anticuerpos monoclonales para el mismo organismo están siendo evaluados para aumentar su eficacia y para prevenir el escape de organismos mutados que pueden causar resistencia (Tabla S3). Curiosamente, casi todos los ThAb en desarrollo se basan en el cimiento de IgG1 humano con una la ausencia de la mayoría de las otras subclases de IgG (Tabla 1).

El uso de ThAb monoclonal se pueden aplicar a una amplia

gama de patógenos y marcos clínicos (Tabla 2). Esto incluye:

(1) la configuración de un organismo específico para tener esporas, toxinas o biopeliculas como objetivo (ecosistema microbiano);

Tabla 2Situaciones en las que ThAb sería útil contra enfermedades infecciosas.

Situación Ejemplo

Organismo especifico Bacillus anthracisPatogénesis a través de esporas

Escherichia coli (toxina Shiga)Patogénesis a través de la toxinaPseudomonas aeruginosaFormación de biopelículas

Entorno clínico

Ajustes nosocomiales / iatrogénicas Clostridium difficileResistencia a las drogas Staphylococcus aureus (VRSA)Epidemia / brotes pandémicos Virus del ÉbolaBioterrorismo Bacillus anthracisEnfermedades emergentes Nipah o virus HendraEn niños pequeños Virus sincitial respiratorioEn individuos inmunocomprometidos Retinitis por citomegalovirus enLas infecciones en los bebés prematuros Pacientes con VIH

Staphylococcus aureusProfilaxis en personas de alto riesgoVirus de la gripeLas infecciones en pacientes con

trasplante Hepatitis CEn la transmisión maternoinfantil de un Virus VIHenfermedad Plasmodium falciparumTerapia adjunta para el tratamiento deenfermedad grave

La falta de otros tratamientos Virus Marburg

Bacillus anthracisVacunas / medicamento no está disponibleAumente la ventana terapéutica de virus de la rabiaantibióticosPublique profilaxis de exposición

(2) entornos clínicos en los que puede haber brotes

nosocomiales / iatrogénicos, resistencia a los medicamentos,

brotes pandémicos, ataques bioterroristas, enfermedades

infecciosas emergentes, y uso en grupos de alto riesgo o en

enfermos graves; (3) cuando hay una falta de opciones de

tratamiento disponibles; y (4) como terapias adjuntas que

tienen funciones anti-inflamatorias o inmunomoduladoras.

(Esto podría incluir ThAb contra TNF y otros mediadores

inmunológicos en humanos y no se analiza en esta revisión).

Algunas de estas aplicaciones se ilustran mediante el uso

autorizado de ThAb contra la toxina de B. anthracis. La B.

anthracis es una bacteria gram positiva, forma esporas,

productora de toxinas, que representa una amenaza

bioterrorista. Los ThAb contra la B. anthracis

podrían ser particularmente útiles, porque un ThAb tiene una

vida media más larga que los antibióticos y los antibióticos

sólo se dirigen a las bacterias, mas no a la toxina, y requieren

un tratamiento de 60 días que plantea retos importantes para

su cumplimiento. Además, la vacunación requiere dosis

repetidas por aproximadamente 4 semanas para inducir un

anticuerpo eficaz.

Claramente, ThAb no tienen aplicación para todas las

enfermedades infecciosas. En los casos donde hay un

beneficio terapéutico potencial, las ventajas y desventajas

relativas de ThAb deben ser consideradas y sopesadas contra

opciones terapéuticas alterativas (Tabla 3).En muchos casos,

los factores que son más probables de limitar

aplicaciones para las ThAb incluyen: (1) la caracterización específica de Ab monoclonal con respecto a objetivos de los epítopos y las respuestas efectoras funcionales; (2) los costos de desarrollo y producción; (3) la necesidad de la administración parenteral; y (4) la capacidad de ofrecer un nivel suficiente de ThAb de máxima efectividad. La selección de las subclases de IgG en el desarrollo de ThAb es a menudo infravalorado, pero puede tener implicaciones importantes para asegurar que se obtengan respuestas funcionales, los efectos adversos se minimicen, y la vida media del anticuerpo se optimice.

4. Selección de subclases de IgG para las ThAb contra enfermedades infecciosas.

4.1 Subclases y respuestas natural inmune

La exposición a la mayoría de los microorganismos conlleva a

la inducción de una respuesta por anticuerpos, muchas de las

cuales mediarán protección clínica, pero otras son no

funcionales y simplemente reflejan la exposición. En ambos

casos, estas respuestas adquiridas naturalmente van a ser,

con frecuencia, altamente sesgadas con respecto al isotipo y

Tabla 3

la subclase. Entender las características de esta respuesta

adquirida naturalmente es el primer paso en la selección de la

subclase apropiada para un efectivo ThAb. El sesgo en la

subclase IgG que ocurre para diferentes microorganismos ha

sido demostrado por la respuesta de la IgG a polisacáridos

bacterianos, lo que indica una predominancia de IgG2, con

reducidas cantidades de IgG1 e IgG3 (Chudwin et al., 1987;

Islam et al., 1995). En contraste, la respuesta de anticuerpos

contra VIH, el virus del ébola, Coxiella burnetii (fiebre Q) y

plasmodium falciparum (malaria), han demostrado contener

principalmente IgG1 e IgG3 (Camacho et al., 1995; Leroy et

al., 2001; Raux et al., 2000; Richards et al., 2010), mientas que

las respuestas a Schistosoma mansoni son

predominantemente de IgG4 (Boctor and Peter, 1990).

Además, se ha observado diferencias en las respuestas de las

subclases según la edad y el género (Perez-Perez et al., 2010;

Simon et al., 2013), que pueden diferir para diferentes

antígenos del mismo patógeno o diferente dominio del mismo

antígeno (Richards et al., 2010; Stanisic et al., 2009).

Este conocimiento de las respuestas de subclases adquiridas naturalmente puede, entonces, ser utilizado en ensayos funcionales para determinar su posible significancia en la inducción de la inmunidad protectora.

Ventajas y desventajas de desarrollar ThAb contra enfermedades infecciosasa

Ventajas Desventajas Alta especificidad Requiere conocimiento detallado de la No afecta la flora normal patogénesis de los microorganismos, epítopos Poca toxicidad protectores y respuesta inmune efectiva Funciones biológicas dirigidas que pueden incluir Puede no reconocer mutantes virales de escapeb u

neutralización, ADCC, ADCP o CDC organismos con antígenos polifórmicos. Variedades de isotipos y subclases opcionales para Costo de producción, almacenamiento y

desarrollar ThAb con las funciones deseadas despacho; además del riesgo de contaminación. Actúa sinérgicamente con antimicrobianos Requiere administración sistemática (parenteral, Provisión rápida de inmunidad pasiva comparada subcutánea, IV o intramuscular)

con los largos periodos requeridos para las Requerimiento para administrar cantidadesrespuestas inducidas por vacunas terapéuticas de ThAb

Conjugar toxinas o moléculas terapéuticas con El ThAb debe ser administrado tempranamenteThAb para dirigir estas respuestas de manera más durante la infección para una máxima eficacia.precisa

ADCC: citotoxina celular dependiente de anticuerpos; ADCP: fagocitosis celular dependiente de anticuerpos; CDC: citotoxicidad dependiente de complemento

. a Tabla resumida usando lecturas de Casadevall et al. (2004).

. b Los combinados con diferentes monoclonales pueden compensar esto.

4.2. Valoración funcional de las subclases aisladas de la respuesta inmune natural:

Discriminar entre anticuerpos que reflejan exposición y

aquellos que median la protección funcional puede ser

desafiante, pero el uso de ensayos funcionales patógeno-

específicos in vitro puede ser informativo. Muchos campos

que estudian microorganismos dependen solo de un puñado

de ensayos funcionales aceptados. (por ejemplo, ensayo de

neutralización para influenza o ensayo de inhibición de

crecimiento para malaria), y se necesitan más ensayos

funcionales para usar en valoraciones sistemáticas de las

funciones de los anticuerpos. Estos ensayos serán luego

comparados con los resultados clínicos para determinar si las

respuestas medidas mediaron protección in vivo. Los ensayos

funcionales bien validados pueden ser usados posteriormente

para valorar la significancia de la subclase IgG al purificar los

anticuerpos específicos de esa subclase.

Por ejemplo, en un estudio reciente se comparó una subclase

purificada de anticuerpos en un ensayo de neutralización del

virus del Herpes Simplex, y se determinó que IgG3 e IgG4

tienen la mayor capacidad de neutralizar el virus incluso

cuando no fueron la subclase predominante (Mathiesen et al.,

1988). Estudios similares para el VIH purificaron IgG1 e IgG3 y

compararon la habilidad de los anticuerpos para neutralizar el

virus aislados de muestras individuales o en conjunto con

múltiples individuos (Cavacini et al., 2003; Scharf et al., 2001).

Curiosamente, IgG3 demostró ser más efectivo que IgG1 en la

neutralización del VIH-1 cuando se usaron muestras

conjugadas, pero esto no se evidenció en muestras

individuales, indicando que la especificidad del epítopo

también juega un papel importante en la neutralización. Un

estudio adicional sobre las respuestas contra el enterovirus 71

humano usó fracciones específicas de subclases purificadas

de IgG a partir de inmunoglobulinas agrupadas y

encontró que las fracciones de IgG1 e IgG2 son más efectivas

en la neutralización, y que IgG3 conllevaba a una infección

aumentada (Cao et al., 2013). Estos estudios resaltaron el

valor potencial de la purificación de subclases específicas del

suero de individuos infectados naturalmente y el estudio de

estos anticuerpos en ensayos funcionales para entender mejor

su contribución a la protección clínica o a la patogenia de la

enfermedad. Estudios como estos también necesitan ser

complementados con experimentos en donde variantes en el

cambio de subclases son generadas y valoradas en ensayos

funcionales.

4.3 Variantes en el cambio de subclases:

Las “variantes en el cambio de subclases” usan los mismos

dominios variables, pero son expresadas en los cimientos de

cadenas pesadas de las diferentes subclases. Entonces, las

variantes en el cambio de subclases son anticuerpos monoclonales

que se unen al mismo epitopo, permitiendo la contribución de las

diferentes subclases evaluadas en ensayos funcionales patógeno-

específicos in vitro y, en modelos in vivo, para determinar las

diferencias en su función efectora.

Las “variantes en el cambio de subclases” han sido evaluadas usando tanto subclases humanas como murinae para: (1) virus incluyendo VIH (Cavacini et al., 1995; Kunert et al., 2000; Liu et al., 2003; Miranda et al., 2007), virus de la fiebre amarilla (Schlesinger and Chapman, 1995; Schlesinger et al., 1993), virus del Nilo Occidental (Mehlhop et al., 2007), y virus de Varicela Zoster (Lloyd-Evans and Gilmour, 2000);

(2) bacterias incluyendo Staphylococcus aureus (Brown et al., 2009; Kelly-Quintos et al., 2006; Varshney et al., 2014), Streptococcus de grupo A(Cooper et al., 1991, 1993), B. anthracis (Abboud et al., 2010; Hovenden et al., 2013), Pseudomonas aeruginosa (Pollack et al., 1995; Schreiber et al., 1993), y Escherichia coli (Akiyoshi et al., 2010; Oishi et al., 1992; Pelkonen and Pluschke, 1989); (3) hongos incluyendo Cryptococcus neoformans (Sanford et al., 1990; Yuan et al., 1995); y (4) parásitos como P. falciparum

(Lazarou et al., 2009). Estos estudios de “variantes en el

cambio de subclases” han utilizado anticuerpos humanos, de

ratones y ratas; un resumen de las “variantes en el cambio de

subclases” humanas se muestra en la tabla 4. En ciertas

instancias, estos estudios han indicado claras diferencias

entre subclases en la mediación de la neutralización del VIH

(Cavacini et al., 1995; Miranda et al., 2007), fagocitosis por

opsonización de S. Aureus (Kelly-Quintos et al., 2006), y en

estudios funcionales con P. aeruginosa (Eichler et al., 1989;

Schreiber et al., 1993), E. coli (Oishi et al., 1992), virus de la

fiebre amarilla (Schlesinger et al., 1993), virus de varicela

zoster (Lloyd-Evans and Gilmour, 2000) y Cryptococcus (Yuan

et al., 1995, 1998). En otras, el cambio de subclases no

demostró tener mayor efecto en el resultado de los estudios

funcionales (Bachmann et al., 1997; Brown et al., 2009;

Cavacini et al., 1995; Kelly-Quintos et al., 2006; Kunert et al.,

2000; Liu et al., 2003; Sanford et al., 1990). Esto sugiere que

la subclase de ThAb no es siempre crucial y que otros

factores, como los niveles de anticuerpos, también pueden ser

importantes. (Bachmann et al., 1997). Un inconveniente en la

valoración de las “variantes en el cambio de subclases” es que

las subclases de ratones y otros animales no son equivalentes

directos de las humanos debido a la diversificación de IgG en

subclases después de la especiación (Butler, 2006). Por lo

tanto, las diferencias observadas en las funciones de las

subclases especificas obtenidas de modelos animales no

pueden ser inferidas directamente en humanos (Mestas and

Hughes, 2004. Por ejemplo, la IgG de murinae es una

respuesta prominente para muchos patógenos, y la mayoría

de anticuerpos monoclonales murinos son IgG1, pero el IgG1

murino no se involucra con FcyRs activantes o el complemento en ratones. Sin embargo, interacciones y mecanismos efectores determinados para las subclases de IgG humanos y sus sistemas efectores (FcyRs, FcRn y C1q humanos) son relevantes en el desarrollo de ThAb para tratar enfermedades infecciosas

4.3.1 El uso de modelos murinos para guiar el desarrollo de anticuerpos terapéuticos

A pesar de la dificultad de transferir los descubrimientos de

estudios de variantes de cambio de subclase murinos a

humanos, tales estudios pueden ser útiles en el desarrollo de

ThAb al incrementar el conocimiento de los mecanismos

protectores del sistema inmune y por su aplicación en modelos

animales in vivo. Ejemplos incluyen estudios murinos que han

indicado que ThAb debe incluir una función FcyR para

efectivamente inducir la neutralización de la toxina del anthrax

y que inducir fagocitosis opsonica es más importante que la

actividad mediada por el complemento para protegerse contra

C. neoformans.

4.3.2. Funciones específicas de subclases varían de acuerdo a las características del epítopo

Identificar epítopo objetivos que median la inmunidad funcional

es claramente un componente clave en el desarrollo de una

ThAb. De forma interesante, el impacto de subclases de

anticuerpos en tales epítopos funcionales puede variar

dramáticamente entre epítopos, incluso dentro de los mismos

organismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales IgG3

humanos que tienen por objetivo gp120 han mostrado tener

una habilidad neutralizadora mayor para VIH que sus

contrapartes en IgG1, pero tales diferencias de subclase no

fueron encontradas en anticuerpos monoclonales contra gp41.

La relación entre el objetivo específico de un epítopo y la

subclase de anticuerpos también depende probablemente en

la densidad de los epítopos y la flexibilidad de diferentes

subclases de anticuerpos para interactuar con dichos

epítopos. Por ejemplo, estudios usando variantes de cambio

de subclase contra P. aeruginosa y el grupo A streptococcus

sugiere que la densidad antigénica influencia fuertemente la

habilidad de algunas subclases de anticuerpos para unirse

efectivamente, por tanto resaltando la importancia de

investigar respuestas de subclases usando ensayos que

reflejen la conformación nativa antigénica y su densidad.

Existe también evidencia que el efecto funcional de diferentes

subclases puede variar de acuerdo a la cepa del organismo,

indicando que es importante también investigar una variedad

de cepas cuando se desarrolle ThAb.

4.3.3. Evaluando las respuestas de subclases usando ensayos funcionales in vitro

Como fue mencionado anteriormente, existe necesidad para

un grupo mayor de ensayos funcionales que pueda evaluar

sistemáticamente el rol de subclases de IgG para muchas

enfermedades infecciosas. El uso de tales evaluaciones

funcionales necesitar ser combinado con la validación de

estas evaluación como indicadores de una protección in vivo

real. Estudios en respuestas de subclases murinas contra C.

neoformans han demostrado fuertes discrepancias entre

ensayos funcionales in vitro y modelos in vivo. Caudn

Oposible, ensayos funcionales deben reflejar el mecanismo

probable de la actividad mediada por anticuerpos in vivo. Por

ejemplo, la protección in vivo contra la E. coli es asociada

con la limpieza mediada por el complemento; por tanto ThAb

debería ser evaluada usando ensayos funcionales que reflejen

este mecanismo. Sin embargo, P. aeruginosa es capaz de

resistir la lisis mediada por el complemento, y por tanto, un

ensayo del complemento no predeciría adecuadamente la

protección in vivo. Ensayos funcionales bien-validados pueden

también ser usados para determinar si diferentes subclases de

IgG tienen el potencial de interferir

con acción de otras subclases de IgG, por ejemplo, bloqueando anticuerpos. De forma similar, los ensayos funcionales pueden ser usados para evaluar la habilidad de algunos anticuerpos de tener efectos dañinos al aumentar la infección, como es observado en el virus del dengue, el virus del oeste del Nilo, VIH, y hongos incluyendo Candida albicans y C. neoformans.

Tabla 4: Ejemplos de estudios usando variantes de cambio de subclases humanas de IgG

5. Conclusiones

Existen más de 40 ThAb con licencia pero solo dos que

tienen como objetivos patógenos asociados con

enfermedades infecciosas. Casi todos los ThAb licenciados,

así como aquellos en desarrollo clínico, tienen dominio Fc

IgG1 humano. La diversidad de respuestas de subclase

contra infecciones naturales y la estructura única y funcional

de las 4 subclases de IgG disminuye la importancia de

considerar las propiedades de subclases cuando se

desarrolla y se prueba ThAb, especialmente contra

enfermedades infecciosas. A pesar de que existen

aproximadamente 36 nuevos ThAb contra enfermedades

infecciosas en desarrollo preclínico, la investigación en este

campo ha sido lenta comparada con el desarrollo en cáncer y

autoinmunidad. Existe una multitud de conformaciones

potenciales para la aplicación de ThAb contra enfermedades

infecciosas y los pros y cons deberían ser cuidadosamente

evaluados para cada conformación terapéutica. Conocimiento

de los perfiles de cada subclase contra los patógenos y

antígenos de interés sería

beneficioso. Esta evaluación debería incluir el estudio de las respuestas de anticuerpos naturalmente adquiridas, anticuerpos derivados del suero, y variantes de cambio de subclase en estudios in vitro funcionales relevantes y estudios in vivo donde sea apropiado. Tales estudios han indicado que las subclases de IgG individuales pueden tener efectos funcionales diferentes contra diferentes patógenos, con ninguna subclase siendo singularmente importanteal mediar protección contra enfermedades. Más aún, la naturaleza del epítopo específico es extremadamente importante para respuestas efectivas y funcionales, y la densidad del epítopo o cepa patógena usada en el ensayo puede afectar profundamente los resultados. Por ende es más importante examinar un rango de estos factores. Finalmente, el conocimiento obtenido en los estudios de cambio de subclase, combinado con un entendimiento molecular de las propiedades de las subclases de IgG permitirá la preparación y desarrollo de ThAb monoclonales altamente efectivos específicos para patógenos.