I. INTRODUCCION

Las bacterias se presentan en tres formas características, como son: bacilos,

espirilos, algunas presentan variaciones morfológicas, debido a la edad del medio

del cultivo (formas pleomorficas o involución) cada genero tiene sus propias

características tanto en forma , tamaño y disposición de la célula.

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los

colorantes básicos se manifiesta si tomamos en cuenta su principal contenido en

ácidosnucleicos. Esta propiedad a sido aprovechada para estudiar mejor los

diferentes tipos morfológicos y estructuras que ayudan a la identificación de una

especie o grupo en particular.

II. OBJETIVOS

- Familiarizar al estudiante con las características morfológicas (tamaño,

forma, disposición), y movimiento, de algunos microrganismos, mediante el

uso del microscopio, en muestra fresca y fijarlas.

- Proporcionar conocimientos sobre los métodos mas comunes de

coloración, como simple y compuesta.

III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

III.1. Examen en fresco

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos

vivos y observar: la movilidad, el tamaño y la forma de agrupación de los

microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; así como gránulos

refráctiles, esporas si teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. Sin

embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite

aumentar el contraste de la preparación por la escasa diferencia entre los

índices de refracción del medio y de los microorganismos; por otra parte, el

movimiento continuo de los microorganismos, así como el causado por las

corrientes de fluido, frecuentemente hacen difícil la observación. Por tanto, su

uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado.

Las preparaciones deben de obtenerse de material clínico fresco o de

cultivos recientes durante 24 horas y realizándoles en medios adecuados.

Es una técnica que apenas se utiliza en el diagnostico microbiológico,

porque ofrece muy poca información en cuanto a la estructura y composición

de las bacterias.

III.2. Método de gota pendiente

Esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión

bacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo

con vaselina o parafina. (actúa como sellador) o parafina; sobre el cubreobjetos

se coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido

gracias a la vaselina. Se invierte la preparación y se observa colocándola en la

platina del microscopio. La ventaja de esta técnica, es que la preparación no se

seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

Fig.1: Método de gota pendiente.

III.3. PREPARACIONES FIJAS

La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un

portaobjetos libre de grasa. Esta preparación debe ser lo suficientemente

delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. El “extendido” o “frote”

se puede hacer de varias maneras:

Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequeña gota de agua

mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos.

Por “impronta”, presionando el porta sobre la muestra.

Colocando una gota de la muestra fluida en el portaobjetos.

Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células

queden adheridas al portaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se

realizan durante la tinción; la preparación se fija con calor moderado, pasando el

portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionando sustancias

deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a

hacer la tinción. Esta puede ser:

Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las

estructuras en estudio; utilizan colorantes.

Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la

silueta incolora de los microorganismos.

III.3.1. COLORANTES

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el

contraste; son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias

les confieren color. Están formados por un grupo cromóforo, que en la parte de

la molécula responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales,

les permite disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes

vitales, que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por

tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son

solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados,

es decir, se encuentren muertos y adheridos al portaobjetos. Para la fijación

por calor, se realiza una fina extensión de una gota de muestra líquida sobre

un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparación

de forma rápida sobre la llama de un mechero; el calor de la llama mata las

células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas

coaguladas unen las células al porta. Cuando se desea fijar especímenes

delicados se utiliza la fijación química, que es menos agresiva que el calor.

Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico,

formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los

microorganismos.

III.3.1.1. Tipos de colorantes

Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.

Colorantes básicos: son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el

ion cargado positivamente (el cromóforo) y se combinan con los

componentes ácidos de la célula como ADN y ARN.

Colorantes ácidos: es el ion cargado negativamente y se combinan con

los componentes básicos de la célula, como el citoplasma; es decir se

combinan con los componentes celulares en función de sus respectivas

cargas; por lo tanto, los factores como fuerza iónica, composición del

medio, temperatura y pH afectan las tinciones.

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en

algunas técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque

aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuando la afinidad

química entre el componente celular y el colorante es baja; también se pueden

utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares

externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser

visualizados de otra forma.

Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte

de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su

superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes

se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de

metileno. Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas

positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con

microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el

rojo Congo.

Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes

celulares tales como el negro de Sudán, que es liposoluble y permite distinguir

los glóbulos de grasa.

III.3.2. Tipos de tinciones

Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

1. Tinciones simples

En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de

tipo básico como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan

solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el

colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple

mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se

añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se

retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser

observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del

colorante.

2. Tinciones diferenciales

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de

microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas:

una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción

simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se

utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas

por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en

microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol

resistencia, ambas aplicadas a bacterias.

3. Tinción de Gram

Método de identificación de bacterias mediante una tinción específica.

Desarrollado por el médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884.

Esta tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram

negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen

la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas.

Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción de Gram y se

llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los

estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas

son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina;

Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:

En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana

(derivado metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram

(1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por

último se lavan con alcohol etílico, o acetona y unas bacterias retienen el

fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por

completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su

tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante). A veces se

añade una contra tinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias

decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles que tiñe de rosa las

bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las

bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.

El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias

Gram positivas y Gram negativas se debe a las diferencias existentes en

sus superficies externas. Las células Gram negativas poseen una capa de

peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram

positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de

membrana externa.

IV. MATERIALES Y METODOS

IV.1. MATERIALES

- Muestras

Tubos conteniendo cultivos bacteriano (caldo o agar):cultivo de 24

horas de Escherichia coli, y Staphylococcus aureus, Bacillus sp; y

cultivos de 48 horas de Saccharomyces cerevisiae.

Leche coagulada /yogurt / frutas fermentadas, etc.

- Laminas portaobjetos/laminilla cubreobjetos

- Asa de siembra

- Torundas estériles

- Solución salina

- Bacteria Gram:

Cristal violeta

Lugol

Decolorante alcohol: acetona

Colorante de contraste : safranina

- Azul de metileno en solución acuosa.

- Plumón indeleble o lápiz de cera.

- Laminas fijadas

- Microscopio óptico.

IV.2. PROCEDIMIENTO

1. Examen en fresco (observar la morfología y motilidad de las bacteria)

- Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado. Con el as de siembra colocar

una gota de la muestra a observar.

- Colocar una laminilla cubreobjetos, sobre la gota, y observar al microscopio

utilizando primero el objetivo de 10x y luego el de 40x.

2. Preparaciones fijadas: Coloraciones

a) Coloración simple

- Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado.

- Con el asa de siembra tomar un inoculo del cultivo bacteriano (si en

caso es liquido), o colocar una gota de solución salina estéril (en caso

de ser solido) en el portaobjeto, luego tomar un poco de la muestra y

mezclar con la solución salina estéril.

- Hacer una extensión en la lámina (frotis), que no sea ni muy gruesa ni

muy fina.

- Dejar sacar a temperatura ambiente, o pasando por la llama del

mechero al fin de obtener la fijación del frotis.

- Cubrir la preparación con 2 0 3 gotas de colorante de azul de metileno,

dejar que actué por 1minuto.

- Lavar la preparación con agua corriente, y evita que el chorro de agua

le caiga directamente sobre el frotis.

- Secar y observar en el microscopio óptico, usando el lente de inversión

(100x), con aceite de inversión o cedro.

b) Coloración compuesta : Método Gram

- Tomar un inoculo con el asa de siembra y extenderlo sobre la laminilla

portaobjeto limpio y desengrasada. Haciendo el frotis.

- Fijar la preparación del medio ambiente y a la llama del mechero,

controlar sobre el dorso de la mano si el calentamiento es moderado, ya

que si no habrá calcinación

- Cubrir con la solución cristal violeta por un minuto.

- Lavar ligeramente con agua corriente.

- Cubrir la preparación con lugol, dejando actuar el mordiente, por uno o

dos minutos

- Lavar con agua corriente.

- Agregar alcohol-acetona, hasta que este no arrastre colorante (regular

mediante movimientos de balanceo de la preparación).

- Lavar con agua corriente.

- Contrastar con el colorante safranina, por 30 segundos a 1min.

- Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.

- Secar al aire o con ayuda al mechero.

- Observar al microscopio óptico, con el objetivo de inversión (100x).

V. RESULTADOS

Cuadro 1: Observaciones microorganismos.

Nombre del

microorganismo

Forma de la

célula

Tamaño de

la célula

Disposición

celular

Clasificación

Muestra 1

(Agar nutritivo)

Gram (+) y (-)

Muestra 2

(Levadura)

Cocos

1-10 um. De

ancho y 2-3

um. De

longuitud

Independiente

estafilococos

Gram (+)

Muestra 3

(Yogurt) Bacilos

0,2-5 um. Independiente

bacilos

Gram (-)

VI. DISCUSION

La tinción compuesta y la tinción gram que hemos realizado en la práctica no se

obtuvieron resultados, ya que no se observaron el microscopio.

La tinción gram fue para el yogur, pero se realizó una tinción simple para el yogur

lo cual se observo Lactobacillus delbrueckiisubsp. Bulgaricus de coloración azul ,

esto indica que la coloración simple fue útil para el reconocimento de estos

microorganismo.

VII. CONCLUSIONES

- Se conoció las técnicas de coloración como la simple y compuesta.

- Se observó las distintas formas y tamaños de las bacterias

analizadas en el laboratorio.

- La forma de bacteria presente en el yogurt es de forma esférica

conocida también como cocos.

- Se pudo notar en la coloración de tinción simple los estafilococos

coloreado de azul.

- En la tercera muestra no se distinguió muchos detalles pues esto se

debe a que no se obtuvo una buena extensión

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es necesario que se fije la preparación a la llama el

mechero?

La fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del preparado durante la coloración así como también preservar la forma original de los microorganismos.

El procedimiento más común es pasar el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de osmio, ácido pícrico, etc.

2. ¿Debido a que las bacterias Gram (+) se colorean de color

violeta y las Gram (-) de rojo? Explique.

La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial

entre bacterias G(+) y G(-), se deben en la estructura y composición de

la pared celular bacteriana.

La pared de las bacterias Gram (+) está constituida

fundamentalmente por una gruesa capa de peptidoglucano (20-30 nm),

que es un polímero de N- acetil glucosamina y ácido N-acetil murámico.

Las cadenas de peptidoglucano, se unen a través de puentes formados

por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a

otra. En esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos,

formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos

cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos pero se hallan anclados

a la membrana citoplasmática.

En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglucano es mucho más

delgada (3-5 nm) y poseen una membrana externa de estructura

compleja en cuya composición intervienen fosfolípidos, proteínas y

lipopolisacáridos.

3. ¿Ud. Cree que mediante la coloración Gram se puede observar

al Mycobacterium tuberculosis? Explique de acuerdo a su

respuesta. ¿En caso negativo describir el método para

observarlo y como se llama?

No, porque Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las

micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos

micólicos). Es observado mediante el método de: Tinción de ácido-

alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Esta tinción tiene interés desde el

punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos

microorganismos patógenos son ácido-alcohol resistentes, tales como

Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) o M. leprae (lepra).

Procedimiento y descripción:

1. Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus).

2. Fijación.

3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza.

Empapar el papel conFucsina fenicada y pasarlo por encima de la

llama del mechero para que haya emisión devapores. Cuando dejen

de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama,

volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir

hasta 5 minutos.

4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua.

5. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.

6. Lavar con agua

7. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2

minutos.

8. Lavar con agua, secar y observar (100×).

4. Describir el método para colorear esporas bacterianas.

Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller :

Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea

a la espora con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre

nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas las estructuras

celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se verán las

esporas rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro.

La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en

caliente para sensibilizar y colorear a la espora. La decoloración se

realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se

observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul.

5. ¿Cree Ud. que el tamaño de la célula coloreada es natural o no?

¿Explique porque?

6. De acuerdo a sus observaciones en las láminas fijadas

(anteriormente) ¿Qué semejanzas encuentra en las muestras

estudiadas?

IX. REFERNCIA BIBLIOGRAFICA

- Manual de microbiología general de la UNAM: Velásquez, M. O.;

Vierna, G. L. y Luna, M. B.: Manejo y cuidado de los

microorganismos. Pp.25-32

- http://aulavirtual.usal.es/

- http://www.ucbcba.edu.bo/

- MOSSEL D. QUEVEDO F. Control microbiológica de los alimentos.

Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de Farmacia y

Bioquímica. Lima-Perú. 1967.

- NEVOT A. Control Bacteriológica Práctica de los Alimentos de

Origen Animal. Editorial. Flammarion. Paris. 1342.

- MANRIQUE V. VAILENAS R. Manual de Laboratorio de

Microbiologia General. Universidad Agraria La Molina. Lima – Perú.

1980. Pag. 01-20p.