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Tesis de Posgrado

Las poliaminas y su acción sobre laLas poliaminas y su acción sobre lasíntesis de proteínassíntesis de proteínas

Echandi Meza, Guillermo G.

1975

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Echandi Meza, Guillermo G.. (1975). Las poliaminas y su acción sobre la síntesis de proteínas.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1477_EchandiMeza.pdf

Cita tipo Chicago:Echandi Meza, Guillermo G.. "Las poliaminas y su acción sobre la síntesis de proteínas". Tesis deDoctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1975.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1477_EchandiMeza.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

\FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

LAS PDLIAMINAS

V SU ACCION SOBRE LA SINTESIS DE PRDTEINAS

AUTOR: Lic; Guillermo G. Echandi Meza

DIRECTOR: Dr. Israel D. Algranati

LUGARDE TRABAJO: Instituto de Investigaciones Bioquímicas

"Fundación Campomar"

o?q\

\‘ 15515 PRESENTADA PARA UPTAR AL TITULO DE 00mmb

‘Q' ,ÜRIENTACIUNQUIMICA emmamn

Ü \ 1. 9 7 5

AGRADECIMIEPTDS

Al Dr. Israel D. nlgranati, por su Constante apoyo y dirección en

lc realización dc este trabaja, y sobre todo por 103 conocimientos que a

través de él. he adquirido cn estos tres años de labor a su lado.

A los Dres. Luis F. Laloir y Carlos E. Cardiní por haberme permitida

rcalizar este trabajo en el Instituto dc Investigaciones Bioquímicas.

laboratorio, Nélida González, Sara Goldcnberg,

Carcía-Patronc, Francisco Üarallc y Hanzur Azzam,par

su colaanración y afectuoso estimulo.

A tado; las ¿Lcmhrss del Instituto de InvestigaciOncs Bioquímicas,

par Su ccn;cr2;ig' y crítica constructiva.

A mis amígtü Roberta Causa, Gustavo “ale: y ?2(:r Katara, por las

rwmentcs agradables que humo: compartido cuando el trabaja fiarin nos lo

"c-witió.

A Sara S. Dastéfano, cuyo empeño y dedicaciñ' ¿12; ¡:2Lb1: la

:ranscriïcïc' d: a“:w trabajo.

a . I n nA Salada; ¿13272: y hargaríta Mazzardv.ll 'l 'J l' ÍI I ’

l) Í) CJ H ’J3

(J w LJ‘ -l u

ESPADR'HIS

I N D I C E

Pág.INTRODUCCION

Las poliaminas y su acción en la sintesis proteica 1Interacción de las poliaminas con el DNA 6Interacción poliamines y RNA 8Acción de las poliaminas En la sintesis proteica 1hAcción de las poliaminas en 1a activación del RNAdetransferencia 15Interacción de las poliaminns con los ribosomas 18Relación de las poliaminaa con la unión del nminoaciltRNA al ribosoma 27

QEAETLEÜSJÉEJÜEQE 29

HALEB.I!LL_.E_5_...X_HE_TPEQE 31

Medios de cultivo 31Reactivos 33

CrecimiEnto de las bacterias y método de ayuno 3kPreparación de lisadon bacterianos 35Preparación de extractos bacterianon y distinta:Fracciones subcelulares por molienda 36Análisis de la distribución ribosomal 37Análisis del RNAribosnmal 39Disociación de los ribosomas AD

Unión de las poliaminas (espormidina 1ht!) a los ribosomaa h]Sintesis de RNAy proteinas en células enteras #2Transporte de uracilo y loucinn L3Sintesis de poliFenilalanina cen ácido poliuridilico comoRNAmensajero bhFormación de fecilalanil tRNA Q5

Sintesis de proteinas "in vitro" usando ccmomensajeronatural RNAdel fago MS-2

Formación del complejo de iniciación

RESULTADOS

Requerimienta de putrescína para el crecimientonormal de cultivo: de Escherichia c011 MA- 261previamente sometidos a un ayuno de poliaminas

Efecto del agregado de putrescina sobre 1a distribuciónintracelular de las ribosomas

Especificidad del efecto de 1a pollamina sobre ladistribución de ribcsomaa

Disociación de los ribnsomas

Unión de la espermidina al ribosoma y corrección delperfíl ribosomal "in vitro"

Sintesis "in vivo" de RNAy proteinas

Tranïporte de uracilo y leucina

Sintesis "in vitro" de pnlipéptídos

Sintesis "in vitro" de polipéptidos usando RMAmensajeronatural

Sintesis de polifenilalaniwa can subunidades ribusomalespurificadac. Detección de partículas 30-5 anormales

Formación del complejo de iniciación usando comomensajero el trinucleótido AUG

DISCUSION

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

¿5

A7

Lg

53

B7

9h

98

105

109

ABREVIATURAS

AMP

ATP

AUG

EDTA

GTP

PEP

PH

Poli U.:

PPi

RNA

RNAm

DNA

tRNA

fmet-tRNA :

TEA

UDD-ZGDnm

5' adenosina moncfosfatu

5' adenoaina trifcsfato

trinucleósido difcsfatc adenílil-uridil-guanosina

etilen diaminotetraacéticc

5' guanosina trifosfatc

Fosfoenol pirúvico

piruvato quinasa

ácido poliuridilico

pircfosfato inorgánico

ácido ribcnucleico

ácido ribonucleicn mensajero

ácido desoxirríbonucleico

sobrenadante obtenido despues de centrifugar un extractoa 30.000 x g

sobrenadante obtenido después de centrifugar a 150.000 x g

unidades Svedberg de sedimentación

ácido ribonucleico de transferencia

formilmetíonina unida a la especie iniciadora de ácidoribcnucleicc de transferencia

ácido triclnroacéticu

:unidades de absorción medida a 260 nanometros

I N_T_R G.0 U CIC I Ü N

Las poliaminas y su asción gp la sintesis proteica

Las poliaminas son compuestos ampliamente

distribuidos en 1a naturaleza ( 1 - 4 ) que se encuen­

tran presentes en todos los tejidos tanto animales como

vegetales.Aunquesu distribución es universal, exis­

ten diferencias tanto cualitativas cemocuantitativas, quedependende los diferentes tipos celulares de los cuales seaislan. En procariotes predominanla putrescina y la esper­

midina, mientras que en eucariotes, la espermina y la es­

permidina.

Las fórmulas químicas de las poliaminas antes

citadas y la de la cadaverina ( otra poliamina presente en

las células, pero en menorconcentración ) son las siguientes:

Putrescina: NH2- (CH?)4 - NH2

Cadaverina: NH2 - (CH?)5 - NH2

Espermidina: NH2 - (CHZ)3 - NH - (CH2)4 - NH2

Espermina: NH2 - (CH2)3 - NH - (CH2)4-NH-(CH2)3-NH2

Las poliaminas se pueden definir ( 5 ) como

compuestosnitrogenados de carácter no proteico, alifáticosy de bajo P.H.

Se han realizado muchosestudios para deter­

minar las vias metabólicas de su biosintesis ( 6, 8 ) .

Hoyse sabe que las poliaminas se sintetizan a partir de

los siguientes tres aminoácidos: ornitina, arginina y me­tionina. El esquemade biosintesis es el siguiente: ( 6,

7, 8 ).

C02. . ‘7 .Argmma AsmatmaADC

Urea AUH Urea

ODCOrnitina É) Putrescina

(202

AIP C0,

4' f decarboxilación BspermidinaMetíonina ¿-—€>S. Adenosil--—49de la S. Adenosil­

metionina metionina :>

Espermína

ADC I Argiuina decarboxilasa

UDC = Ornitina decarboxilasa

AUh - Agmatina ureohídrolasa

Las poliaminas fueron descriptas por primera

vez en 1676, por Leeuwenhock; pero recién en 1924 ( 9 )

Rosenheimdeterminó la estructura correcta y además sinte­

tizó "in vitro" tanto a la espermidina comoa la espermina

( 2 ).

Aunqueactualmente se conoce que las polia­

minas intervienen en múltiples procesos biológicos, tales

como la sintesis de ácidos nucleicos ( RNA, DNA) y de pro­

teinas, la agregación de subunidades ribosomales, la estabi­

lización de membranas,etc., su efecto biológico primariotodavia no está bien definido.

A continuación detallaremos algunos aspectOs

de las funciones más conocidas de las poliaminas.

Interacción con la pared y membranacelular.

Los estudios para demostrar 1a función e in­

teracción de las poliaminas con las membranasy la pared ce­

lular son bastante complejos, pués las poliaminas presentan

una alta solubilidad que hace casi imposible evitar su redis­tribución al aislar los diferentes componentescelulares (15,18, 19).

En 1955 Mager ( 22 ) trabajando con Pasteurella

tularensis observó que si se hacia crecer dicha bacteria en

un medio hipotónico en presencia de espermidina, se evitaba

la lisis que ocurría normalmente.

Posteriormente Bachrach y Hager ( 23, 25 )

realizaron una serie de experimentos "in vivo" con BacilIUS

subtilis en los que se demostró la presencia de la espermi­

dina tanto en la pared como en 1a membranacelular.

Estos investigadores prepararon protoplastos( 26 ) y trozos de pared ( 27 ) de Bacillus subtilis culti­

vado en un medio que contenía espermidina 14€, o metionina

14€ (precursor de la espermidina). Se observó la presencia

de espermidina radiactiva tanto en los protoplastos comoen

los trozos de pared celular, siendo mayor la concentración

de espermidina 14€ en los trozos de pared celular.

Estudios "in vitro" incubando trozos de pared

celular y protoplastos con espermidina 14€, demostraron nue­

vamente la mayor afinidad de la pared celular por dicha po­liamina.

En experimentos realizados con Escherichia

ggli ( 28 ) se observó que la presencia de espermidina eracapaz de evitar la lisis enzimática con lisozima, obtenién­dose esferoplastos que poseían la particularidad de ser mu­

cho más estables que los obtenidos por otros métodos.

En estos casos la producción de los esferoplas­

tos, no se debia a una inhibición enzimática por la espermi­

dina, sino a una estabilización de 1a membranacelular. En

este proceso la espermidina interactuaba fuertemente con 1a

membranacelular, de manera tal que no se podia eliminar,

mediante lavados sucesivos de los esferoplastos formados.

Interacción de las poliamings con el DNA

Las caracteristicas catiónicas de las polia­minas sugirió la posibilidad de que dentro de 1a célula es­

tas sustancias podrian unirse a los ácidos nucleicos.

Ya en 1957 Hershey ( lO ) habia aislado dos

sustancias que denominó A1 y A2 , que eran inyectadas junto

con el DNAdurante la infección de bacterias por fagos T4.Posteriormente Ames( 11, 12 ) identificó estas sustancias

comoputrescina y espermidina. A raiz de estos hallazgos se

planteó la incógnita sobre 1a función de las poliaminas en

la relación que podrian tener con el DNAdel fago T4. Hoyse sabe, que las poliaminas son capaces de neutralizar el

40%de las cargas negativas del DNAdel fago, permitiendo

el empaquetamientode dicho ácido nucleico dentro de la ca­

beza del virus ( 13 ). Experimentos posteriores, en los cua­

les se trabajó con fago T ( 12 ) y esferoplastos de Esche­4

richia coli ( 15 ) demostraron que la unión de la poliamina

al DNA,se realizaba de una manera inespecifica, y que

Simplemente, como se mencionó anteriormente servia para

neutralizar las cargas de los fosfatos presentes en dichoácido nucleico.

Trabajando con minicélulas de Escherichia coli

5;;3 ( 16 ) que contienen solamente un 3%del DNAtotal de

una bacteria normal, se observó que la concentración de po­liaminas unidas al total de los ácidos nucleicos de esta ce­

pa mutante era aproximadamente igual a la concentración en­

contrada en los ácidos nucleicos de la cepa normal. Estos

experimentos llevaron a 1a conclusión de que las poliaminas

poseen una mayor afinidad por el RNAque por el DNA.

El hecho de que las dobles hélices de los

ácidos nucleicos presenten una absorción a 260 nmmenor

que las de cadenas aisladas, permitió realizar una seriede experiencias ( 20, 21 ) "in vitro", en las cuales se de­

mostró nuevamente1a acción estabilizadora de las poliami­

nas sobre el DNA.Se sabe, que si un ácido nucleico de doble

hélice se somete a un calentamiento paulatino comienza a

desnaturalizarse y sus cadenas se separan. Esto determina

un aumento de la absorción a 260 nm. Se suele llamar tempe­

ratura de fusión (rm) ( 8 ) a la temperatura que provoca

un incremento en 1a absorción equivalente a la mitad del in­cremento total observado cuando la molécula se ha desnatura­

lizado completamente.

Se ha visto ( 17 ) que las poliaminas son capaces de aumen­

tar el Tmalrededor de 10 °C por estabilización de las do­

bles hélices del DNA.Se ha estudiado el mecanismo de esta

estabilización ( 79 ) y de acuerdo a los resultados se pos­

tula que las diaminas ( putrescina y cadaverina ) son capa­

ces de formar puentes entre los fosfatos de una mismacade­

na del DNA6 entre dos cadenas de una misma molécula del

ácido nucleico. La espermidina y la espermina forman puentesinter e intra moleculares.

El grado de estabilidad que las poliaminas

confieren al DNAdepende del número de grupos aminos presen­

tes en la molécula de poliamina. Por esta razón la espermina

es la que produce mayor estabilidad y la espermidina, cada­

verina y putrescina, le siguen en orden decreciente.

Interacción poliaminas y RNA

Comose mencionó anteriormente, las poliaminas

se encuentran unidas preferentemente a1 RNA( 16, 29 ) que

parece presentar un mayor número de sitios de unión que elDNA .

Se ha logrado aislar poliaminas unidas a los

tres diferentes tipos de RNA:de transferencia, mensajero

y ribosomal ( 13, 30, 31, 19 ).

También se ha demostrado tanto en células

animales comoen bacterias una intima relación entre los

niveles presentes de poliaminas y de RNA ( 32, 33, 31 ).

Las poliaminas interactúan de manera diferen­

te de acuerdo al tipo de ácido nucleico con el que reaccio­

nan. Mientras que en la estabilización del DNA,1a confor­

mación de éste no se altera apreciablemente. La interacción

de las poliaminas con el RNAproducen un efecto hipocrómico

( 36 ), lo que llevaria a pensar que existe una relación

poliamina-RNAtal que se producen estructuras tipo doblehélice dentro de la molécula del RNA.

Estudios "in vitro", realizados con la RNA

polimerasa DNAdependiente ( 37 ), demostraron que tanto la

velocidad de sintesis, como la cantidad de RNAproducido en

esta reacción enzimática eran aumentadospor las poliaminas.

Se conoce que la RNApolimerasa puede unirse con DNAo RNA

para formar complejos. Por lo tanto, la producción de RNA

usando el DNAcomo molde puede verse seriamente inhibida por

1a presencia de RNAexógeno. Si se estudia el mecanismo de

esta reacción, que involucra nucleótidos trifosfato, DNA,

metales. 1a enzima y RNAexógeno, se observa que el orden

en que se agregua1los reactivos es critico y determina lacantidad de producto formado.

Para obtener una cantidad máximade producto

se debe agregar primero el DNAy la enzima, pues si se

agrega primero el RNA,se produce el complejo RNA-enzima

y se impide la unión de la enzima a su templado,inhibién­dose de esta manera la sintesis de nuevo RNA.

La estimulación de la sintesis de RNApor las

poliaminas ( 37 ) se debe a la interacción de estas sustan­

cias con el complejo RNA-enzima,de manera tal que la polia­

mina es capaz de disociar el complejo, permitiendo por este

mecanismo que exista una mayor cantidad de enzima disponible

para unirse al DNAy producir RNA.Por otra parte se demos­

tró que las poliaminas eran incapaces de disociar el comple­

jo DNA-enzima.

Petersen ( 39 ) demostró que la poliamina ac­

tuaba en la sintesis de RNApor dos mecanismos diferentes:

aumentando el número de sitios en el DNAcapaces de unirse

a la enzima y determinando la mayor polimerización del RNA,

es decir la formación de cadenas más largas del producto.

La relación entre los niveles de espermidina

y los de RNAfueron claramente demostrados en experimentos

realizados con embrión de pollo e higado de rata ( 41 - 43 ).

Si se trabaja con higados en crecimiento acti­vo, ya sea por ser higados inmaduros de ratas recién nacidas

o por estar en periodo de regeneración después de una hepa­

tectomia parcial, se encuentra una relación directa entre

la estimulación de 1a sintesis de RNAy e] aumento de la

sintesis de espermidina ( 44 , 47 ). Si se estudian higa­

dos adultos se observan niveles bajos tanto de espermidinacomo de RNA.

.Se considera que la mayor cantidad de espermi­

dina en higados en regeneración se debe a un aumento en 1a

actividad de la ornitina decarboxilasa ( esquema hoja nQ 2 ).

Se producen entonces niveles altos de putrescina que estimu­

lan a la enzima S-adenosil metionina decarboxilasa provocan­

do una acumulación de espermidina ( 45 ).

Aparentemente el aumento de actividad de la

ornitina decarboxilasa está acompañadopor un incremento de

actividad de la RNApolimerasa ( 46 ).

Raina y Cohen ( 48, 50, 51 ) han tratado de

explicar mejor la relación entre los niveles de RNAy de po­liaminas. Para ello han utilizado mutantes nutricionales de

Escherichia coli, conocidas comomutantes TAU,pues requie­

ren para su crecimiento 1a presencia de timina, uracilo y

arginina en el medio de cultivo. Ademáslas mutantes usadas

eran de dos tipos: "Stringent" y "Relaxed". Se llama cepas

"Stringent" a aquéllas en las cuales al suprimirse del medio

de cultivo un aminoácido esencial para su crecimiento detie­

nen tanto la sintesis proteica, comola sintesis de RNA.

Las cepas "Relaxed" son aquéllas en las cuales la eliminación

de un aminoácidoesencial, solamente detiene la sintesis

proteica, manteniéndose normal la sintesis de RNA.Si se estudian los niveles intracelulares de

espermidina y de RNAen cultivos desarrollados en ausencia

de arginina (aminoácidoesencial para estas bacterias) de

cepas TAU"st" y TAU"rel", se observa que, en las cepas

TAU"rel" (donde la sintesis de RNAcontinúa)tanto los ni­

veles de espermidina como de RNAson a1tos,mientras que en

las cepas TAU"st" (donde no hay sintesis de RNA)los nive­

les intracelulares de espermidina se mantienen muybajos.

Cuando las cepas de Escherichia coli TAU"st"

sometidas a un ayuno de arginina, se cultivan en presencia

de estreptomicina ( 48, 49 ) las bacterias se comportan

como"relaxad'yse observa nuevamente estimulación de la sin­

tesis de RNAque es acompañada por un incremento en los ni­

veles de espermidina. Resultados similares se obtienen cuan­

do se trabaja con cepas TAU"st" ( 48 ) sometidas a ayuno de

arginina, pero desarrollados en presencia de espermidina,en estos casos la presencia de la poliamina en el medio de

cultivo hace que se sintetice nuevamente RNA.Para determinar si los niveles altos de RNA

provocaban acumulación de espermidina, o viceversa, Cohen

utilizó mutantes TAU"rel" cultivadas en ausencia de argi­

nina y de uracilo. En estas condiciones se provoca la inhi­

¡.4 UI

bición de la sintesis de RNAy se encontró que la sintesis

de espermidina no era afectada. Esto hizo pensar que son los

cambios en los niveles de espermidina los que producen alte­raciones de la sintesis de RNA.La conclusión anterior fue

posteriormente ratificada por Cohen, trabajando con mutantes

de Escherichia coli deficientes en potasio ( 34 ).

Estas bacterias en medios ricos en Na‘Fpero

deficientes en K+y purinas ( condición de no crecimiento ),

detienen la sintesis de RNA,pero mantienen inalterada la

Velocidad de sintesis de la espermidina.

Los trabajos efectuados por Raina y Cohen

fueron seriamente criticados por Maasy Srinivasan ( 52 ),

debido a que en las experiencias descriptas por los primeros

los niveles de poliaminas utilizados eran bastante superio­res a las concentraciones fisiológicas.

Maas y Srinivasan trabajaron con cepas mutan­

tes de Escherichia coli auxótropas para putrescina y demos­

traron ( 50 , 51 ) que las poliaminas actuaban en forma in­

directa sobre la sintesis del RNA,posiblemente contrarres­tando el efecto de algunos inhibidores de dicha sintesis ypermitiendo de esta manera una mayor acumulación del RNA.

Acción de las poliaminas en la sintesis proteica

El hecho de que las poliaminas se encuentran

formando complejos con las distintas clases de RNA,tanto

mensajero comode transferencia y ribosomal llevó a pensar

que estas sustancias, podrian desempeñar un papel muy im­

portante en 1a regulación de la sintesis proteica ( 53, 13 ).Experimentosrealizados en varios laboratorios

( 54 - 58 ) demostraron que a concentraciones subóptimas

de Hg*+, las poliaminas eran capaces de aumentar la incor­

poración de aminoácidos marcados, cuando se usaba sistemas

libres de células con RNAmensajeros artificiales.

Otros investigadores trabajando con espermi­

dina y espermina ( 55 ), demostraron que estas sustancias

eran capaces de producir errores de lectura cuando se usaba

poli U como mensajero.

Posteriormente Takeda ( 60 ) demostró nueva­

mente, pero trabajando con mensajeros naturales ( RNAmen­

sajero de MS-2 ) que las poliaminas eran capaces de dismi­

nuir los niveles óptimos de magnesio, para la sintesis dela proteina capsular del virus.

Hurwitz ( 58 - 59 ) demostró que las concentra­

ciones de magnesio intracelulares, eran demasiado bajas con

respecto a los niveles utilizados para la sintesis de pro­

¡.1 U1

teinas'ïn vitro". Por esta razón se postuló que "in vivo"+se usan tanto el Mg+ como las poliaminas ( en especial 1a

espermidina ) en 1a biosintesis proteica.

Acción qe las poliaminas en la activación del RNAggtransferencia

La primera etapa en la sintesis proteica es

la activación de aminoácidos y 1a formación de complejos

aminoacil tRNA( 61 ). Esta etapa sumamenteespecifica de­

termina en gran parte 1a fidelidad de la copia del mensaje

( que depende de una reacción de reconocimiento entre el

codón del RNAmensajero y el anticodón del tRNA ).

La reacción clásica por 1a cual le sintetizael aa-tRNA os la siguiente: ( 62 - 63 )

a) aa + ATP + Enzima.:::3’ Aminoacil —AMP- enz. + PPi

b) Aminoacil - AMP- enzima + tRNA.;_: Aminoacil -tRNArAHP+enz.

Existen una serie de evidencias que apoyan

este mecanismo,en especial el hecho de poder aislar el

complejo aminoacil-AHP-enzima en columnas de sephadex, y

que este complejo asi aislado pueda transferir su aninoácidoal tRNAcorrespondiente.

Allende y cul. ( 63 ) estudiaron esta reacción

y observaron que tanto para la formación del complejo

AA-AMP+ Enzima. como para 1a transferencia del aminoácido

a1 tRNAera necesaria la presencia de niveles altos de Mg++.

Posteriormente, analizando 1a reacción de trans­

ferencia ( b ), ellos demostraron que el Mg++podia ser reem­

plazado por espermidina, sin que se alteraran los nivelesde AA - tRNA formado ( bb - 66 ).

En 1972 Eldret ( 64 ) estudió más a fondo esta

reacción, postulando 5 etapas.

1) aa + ATP + Enzima < Ï’anima —ATP - aaA

2) Enz - ATP - aa <r__i_Ï Enz - aa - AMP+ PPi

3) Enz - aa- AMP+ tanan —aa - AMP- tRNA

4) Enz - aa — AMP - tRNA G___7l:;nz -—aa — LRNA + AMP B

5) Enz — aa - tRNA ‘Ïj’Enz o aa — {RNA

La reacción A ocurre rápidamente, mientras

que 1a reacción B es muchomás lenta y por lo tanto limi­

tante. Por otra parte ya se sabia que la formación del com­

plejo AA- AMP—Enzima podía determinarse indirectamente

por agregado de 32PPi exógeno. De esta manera se detecta

la reacción inversa por formación de ATP(32P), aminoácido

y enzima.

El mecanismopropuesto anteriormente fue seriamente objeta­

do por Loftfield ( 74, 67 ), quién propone un mecanismo con­

certado en el que reaccionan el aminoácido, la enzima, ATP

y el tRNAsimultáneamente sin formación de complejo

AA- AMP- Enzima intermediario.

Igarashi y Pastuzyn ( 72 - 73 ) demostraron

que en presencia de eSpermidina o espermina es posible ob­

tener aminoacil - tRNAen ausencia de MgH y sin la forma­

ción del complejo intermediario. Estos hechos apoyaron la

teoria de Loftfield, quién también refirmó su hipótesis con

el siguiente experimento ( 67 ): si se usa una mezcla de

reacción que contiene complejo ( AA- AMP- enzima ) radiac­

tivo marcado con 14€ en el aminoácido, espermina, ATP,

aminoácido libre marcadocon tritio, y una cantidad limitan­

te de tRNA,1a mayoria del aa- tRNAque se forma proviene

del aminoácido libre o sea de aquél que no está formando

complejo. De esta manera se concluye que en presencia de

poliaminas el mecanismo que predomina es el de tipo concerntado.

Los experimentos de Loftfield son criticados

por otros investigadores ( 68 - 69 - 70 ), quienes argumen­

tan que en las experiencias descriptas en presencia de esper­

mina y ausencia de magnesio, existia contaminación por el

magnesio complejado por el tRNA. Ellos postulan que las

poliaminas actuarian desplazando al magnesio del tRNAy

permitiendo que el magnesio liberado pueda actuar en 1a

reacción de aminoacilación del tRNA.

Otros experimentos ( 71) indicaron que el

EDTAusado para la eliminación total del magnesio de las

preparaciones de tRNAactuaba inhibiendo la enzima encar­

gada de formar el aminoacil tRNA.

Se debe mencionar también que Cohen ( 34 ),

ha demostrado usando bromuro de etidio la presencia en la

molécula de tRNAde sitios de unión limitados y especifi­

cos para las poliaminas.

Todos los hechos mencionados parecen señalar

que las poliaminas están unidas al tRNAy participan ( po­+siblemente junto con el Mqf en la reacción de activación

de aminoácidos.

Interacción de las poliaminas con los ribosomas

Antes de entrar a analizar 1a relación de las

poliaminas con el ribosoma, creo necesario definir dichas

estructuras dondese realiza 1a sintesis proteica.

Los ribosomas son particulas macromoleculares

formadas por RNAy proteinas ( 88 ). Estas particulas seclasifican de acuerdo a su coeficiente de sedimentación:­

en procariotes se aislan ribosomas con coeficiente de se­

dimentación 70 S, que pueden disociarse en dos subunidades

más pequeñas de coeficientes 30 S y SO S.

A partir de organismos eucariotes se aislan

ribosomas 80 S que pueden dar lugar a subunidades 40 S y

60 S.

Si se analiza más a fondo la composición de

las subunidades de bacterias se puede determinar sus compo­

nentes: La subunidad 30 S está compuesta por una molécula

de RNAde coeficiente de sedimentación de 16 S (PM 0.55 x 106)

( 80 - 82 ) y 21 proteinas ( 83 ). Por otra parte de la sub­

unidad SO S, se aislan dos moléculas de RNA, una de S S

( pu a 4 x 104 ) y otra de 23 s, (PM - 1,1 x 106 ) y 34

proteínas ( 84 , 91 ).

Hace algunos años se creía que los ribosomas

desempeñabanun papel pasivo en la sintesis proteica; hoy

se sabe que dichas particulas ademásde servir de soporte

a la sintesis proteica, intervienen en forma activa y direc­ta en 1a regulación de dicha sintesis.

Podemosenumerar las siguientes funciones ri­

bosomales en el proceso de traducción:

I) Reconocimiento y unión del RNAmensajero por la

II

III

IV

V

V

)

V

V

subunidad 30 S ( 89 - 91 ). En esta etapa intervie­

ne un factor proteico llamado IF 3 ( 93, 94 ), que

confiere especificidad a la unión entre la subparti­cula ribosomal y el mensajero.Existencia de dos sitios de unión en el ribosoma

( 84, 92 ), para el aminoacil tRNAy el peptidil

tRNA. Estos sitios se denominan A y P respectivamen­te.Formación de la unión peptidica: Es 1a reacción que

involucra la formación de la unión entre el peptidil

tRNA( unido a1 sitio P ) y el aminoacil tRNA ( unido

a1 sitio A ). En esta reacción el peptidil tRNAcede

el péptido al aminoacil tRNAproduciéndose una cadena

polipeptidica con un aminoácido más y la simultánea

hidrólisis de GTP( 84, 91 ). En 1a formación del

enlace peptidico participa una o más proteinas pre­sentes en la subunidad 50 S, que se conocen con el

nombrede peptidil transferasas ( 96 -97 ).

Control de la fidelidad de lectura del RNAmensajero( 95 ).

Translocación:

Se conoce con este nombre a 1a etapa en la cual el

ribosoma, mediante un cambio conformacional se des­

plaza a lo largo del RNAmensajero. De esta manera que­

da expuesto un nuevo codón en el sitio A del ribosoma

y el peptidil tRNApasa a1 sitio P, con 1a consecuente

liberación del tRNAdeacilado ( 98 ).

Cuandose analizan extractos bacterianos se.encuentran ribosomas en varias formas: unidos a complejos

polisómicos, como monómoros libres o como sununiaades 30 S

y 50 S.

Los monómerospueden ser de tres tipos: de

terminación, que se forman por asociación de las subunida­

des libres, los monosomasde iniciación y los que se produ­

cen por la ruptura de los polisomas, y por lo tanto tienen

unidos trozos de RNAmensajero y peptidil tRNA.

La distribución de los diferentes tipos ribo­

somales aislados depende del método de extracción ( 99, 100,

105 ) y de la etapa de crecimiento en que se encuentre elcultivo bacteriano ( 101 ).

Los ribosomas participan durante la sintesis

de proteinas de un ciclo que se puede esquematizar de la

siguiente manera ( 101 - 104 ).

I‘J PJ

CICLO RIBUSDMAL

0AA |./ fi (RNA¿5,3 MM” 305\Q\

o lo 505Yte};\éRIVA-n

P - Proteina

DF = Factor de disociación

AF = Factnr de asociación

F1 Factor de iniciación

f2 ; Factor de iniciación

Los monómerosribosomales representan entre

el 15 y el 20 1 del total de la fracción ribosomal y se

encuentran en un equilibrio dinámico con las subunidades.

Este equilibrio está fuertemente desplazado hacia los mo­

nómeros. El papel fisiológico de estas particulas es muy

discutido; algunos autores las consideran una reserva que

la célula puede utilizar cuando se requiere una mayor sin­tesis proteica.

Se ha aislado un nuevo factor a partir de

Bacillus stegígthermophiluï ( 85 - 87 ) que posee 1a capa­cidad de desplazar el equilibrio 70 52::subunidades ribo­

sómicas hacia el monómero.Este factor,que también ha sido

encontrado en células animales ( 134) podria intervenir

activamente en el ciclo ribosomal y se ha demostrado que

contiene poliaminas ( 86 ).Estas sustancias confieren estabilidad a los

ribosomas y aumentan 1a relación monómeros/ subunidades.

En 1960 Cohen ( 30 ) demostró la presencia

de putrescina y espermidina en la fracción ribosomal de

lisados de Escherichia coli. Aproximadamenteel 15%del

total de la poliamina endógena estaba unida al ribosoma,y esta localización no se debia a una redistribución delas sustancias posterior a la lisis celular.

Cohen ( 30 ) también comprobó que cuando los

extractos bacterianos se preparaban en medio acuoso los

monómerosribosomales desaparecian y solamente se encon­

traban las subunidades de bajo coeficiente de sedimenta­ción. Cuandolos extractos se obtenían en medios acuosos

pero en presencia de magnesio o de espermidina nuevamente

reaparecian los monómeros.

Stevens ( 106 , 108 ) demostró que contraria­

mente a los resultados de Cohen, debia existir un gran in­

tercambio entre las poliaminas unidas al ribosoma y el me­

dio de extracción. Este intercambio dependía de las carac­

teristicas iónicas del medio y aumentaba a mayor fuerzaiónica.

Los estudios de Stevens ( 107 ) con Bacillus

stearothermoghilus cultivados a 45 - 55 y 65 oC indicaron

que la mayor cantidad de poliamina unida a ribosomas pro­

venia de los cultivos desarrollados a 65 0C, aún cuando a

esa temperatura la concentración total de poliamina intra­celular era la menor. Ademásse encontró que los ribosomas

aislados de los cultivos a 65 oC ( que solamente se diferen­

ciaban de los aislados a 45 y 55 oC en la concentración de

poliaminas ) eran muyestables a la desnaturalización tér­mica.

Cuando los ribosomas aislados de Bacillus

stearothermophilus se dializaban contra soluciones de

naran)a de acridina ( que sv une a los ácidos nuclelcos ),

este colorante se unia a los ribosomas aunque no era capaz

de desplazar la espermidina presente en los mismos. Por

otra parte, si un experimento similar se realizaba con RNA

ribosomal al cual se le habia unido espermidina, el colo­

rante era capaz de desplazar a la poliamina. De esta manera

se puede concluir que posiblemente las poliaminas unidas al

ribosoma están protegidas, evitándose su desplazamiento.

Hiess y col. ( 110 - 113 ) estudiaron más a fondo la rela­

ción entre los niveles de magnesio y espermidina en los

ribosomas de Escherichia coli. Estos investigadores demos­

traron por medio de diálisis que la espermidina es capaz

de desplazar al magnesio del ribosoma sin alterar la carga

neta de la particula. Cuando la eSpermidina reemplaza más

* en el ribosoma, estas particulas pierdendel 70% del "9*

su capacidad de sintetizar polifenil alanina en sistemas" in vitro ". Por lo tanto parece requerirse un minimodel

30%de magnesio para mantener las caracteristicas estruc­

turales y funcionales del ribosoma. Por desplazamiento de

más del 70%del MgH en las particulas ribosomales, eÉtas

pierden proteinas, sufren alteraciones del coeficiente desedimentación y se vuelven más sensibles a 1a RNAsa.

Se ha postulado ( 114 ) la presencia de dos

sitios hábiles para la unión de cationes a los ribosomas

de higado de rata, y de tres sitios para los de Escherichia

fl< 111-113).El sitio 1 en los ribosomas de Escherichia

ggli, estaria ocupado únicamente por el ión Hg++y corres­

pondería a1 catión necesario para mantener las caracteris­

ticas funcionales y estructurales del ribosoma; en el caso

especifico de los ribosomas de Escherichia coli, el magne­

sio presente en el sitio I podria ser reemplazado por HnÏ+

Esto no ocurre en los ribosomas aislados de higado derata ( 114 ).

El sitio II podria unir los cationes diva­lentes y las poliaminas. El sitio III estaria ocupadopor

cationes monovalentes como el Na+, NH+ y sobre todo por4

el potasio ( K+ ). Aunqueeste sitio también podria ser

* y las poliaminas, se considera queocupado por el Hg‘

seria necesario un nivel minimo de iones monovalentes y

en especial de K‘ , para que los ribosomas puedan funcio­

nar activamente en 1a sintesis proteica ( 115 - 116 ) .

Medianteel estudio de cultivos de Bacillus thuringiensis,Igarashi ( 117 ) ha realizado las siguientes observaciones:

1) Los ribosonas de Bacillus thuringiensis en desarro­llo logaritmico son muchomás activos en sintesis

proteica "in vitro" que las particulas ribosomalesde bacterias en fase estacionaria.

II) La carga catiónica neta de los ribosomas obteni­

dos de bacterias en crecimiento logaritimico es

mayorque la carga de las particulas de célulasen fase estacionaria.

III) El incremento de la carga neta catiónica de

ribosomas, durante la fase logaritmica de cre­cimiento bacteriana se debe a un aumento de la

concentración de poliaminas. En cambio el nivel

de magnesio varia muypoco durante las distintas

etapas del crecimiento. Estos hechos y la posibi­

lidad de reemplazar aunque sea parcialmente al

magnesio, indican la importancia de las poliami­

nas presentes en los ribosomas y el papel funda­

mental que estas sustancias desempeñanen la sin­

tesis proteica.

Relacién de la; pgliaminas con la unión del aminoaciltRNA al ribosoma

Takeda y col. encontraron que existe una

intima relación entre los niveles de magnesio y poliaminasy la unión del aminoacil tRNAal ribosoma ( 75 ) . Es

bien conocido que la unión del aninoacil tRNAal ribosoma

requiere niveles altos de magnesio ( 76 —77 ).

El hecho de que las poliaminas ( 75 ) sean

capaces de diSminuir los niveles óptimos de magnesio para

esta reacción de unión al ribosoma, conjuntamente con las

observaciones de Hurwitz ( 58 ),de que los niveles intrace­

lulares de magnesio no son suficientes para obtener una ca­

pacidad máximade unión, hacen suponer que "in vivo" las

poliaminas puedensustituir parcialmente al magnesio en estareacción.

Tanner demostró trabajando con levaduras ( 78

que en este caso las poliaminas, ademásde estimular esta

reacción de unión a concentraciones subóptimas de magnesio,

eran un requerimiento indiSpensable para qUe dicha reacciónse llevara a cabo.

?9

Objetivos del trabajo

Él aislamiento de mutantes bacterianas en

la sintesis de putrescina ( SO- 51 ) ha permitido esth

diar mejor las funciones que las poliaminas desempeñanen 1a célula.

Nosotros trabajamos con una cepa dobye mu­

tante de Escherichia coli K-12 auxótropa para poliaminas,

por lo cual necesita 1a presencia de espermidina o putres­

cina en el medio de cultivo para crecer normalmente.

Esta cepa tiene dañadas las enzimas orniti­

na decarboxilasa y agmatina ureohidrolasa, por lo cual los

dos caminos metabólicos para la sintesis de putrescina se

encuentran bloqueados ( esquema página 3 ). La actividad

de 1a enzima ornitina decarboxilasa presente en 1a mutante

es aproximadamente un 2 1 de 1a actividad de 1a enzima de

bacterias normales. Por otra parte, la agmatina ureohidro­

lasa tiene sólo 4 %de la actividad correspondiente a laenzima normal.

El hecho de que esta mutante necesite la pre­

sencia de poliamina en el medio de cultivo para crecer nor­

malmente, y ia caracteristica de las poliaminas de actuar enpequeñas concentraciones determina.que esta cepa deba sometersea un proceso de ayuno para disminuir los niVeIes intracelu­

30

.lares de poliaminas; solamente después del ayuno las bac­

terias requieren poliaminas para su crecimiento.En estas condiciones es posible estudiar el

rol fisiológico de estas sustancias y analizar su partici­pación en distintos procesos metabólicos.

El objeto de este trabajo consiste en rela­cionar la capacidad de las poliaminas para asociar subuni­

dades ribosomales y su posible intervención, tanto en la

biosintesis y ensamblado de los ribosomas, comoen las di­

ferentes etapas de la "traducción".

MATERIALES Y METODOS

31

Materiales x métodos

En todos nuestros experimentos se trabajó

con Escherichia coli HA-261que es auxótrofa para Treonina,

Leucina, Serina y Tiamina Esta cepa es además una doble

mutante que tiene dañadas las enzimas Agmatina Ureo-hidrolasa

(AUH‘)y la Ornitina decarboxilasa constitutiva (ODC-), lo

que determina un requerimiento exógeno de putrescina para

crecer normal-ente ( S. Cunninghan, H. Haas. En prensa ).

Medios de cultivo

A) Medio sólido:

Bacto nutrient broth 0,8 g

Na C1 0,5 g

Agar 2 g

Se mezcla,posteriormente se disuelve en 100 m1 de aguadestilada.

B) Medio liquido MMO:Contiene por litro los siguientes

componentes:

Sol. b = 40 m1

Glucosa 20% a 24 m1

Tiamina 0.5 mg / nl = 8 m1

Biotina 0.5 mg / m1 = 20 m1

Sol. de aminoácidos 2,5 mg / m1 a 40 m1

Ornitina 2.5 mg/ml = 40 m1

Sol. a ( sales) z HK2 PO4 = 87,5 g

H2 Kpo4 a 37,5 g

3H2 0 Na3 Citrato a 6,24 g

Se disuelve en 500 m1 de agua destilada

Sol. b ( sales ): Mg (SOA 7H20 1,25 g

(NH4)2 (so)4 12,5 g

Se disuelve en Soo m1 de agua destilada

Sol. de aminoácidos:

Leucina, Treonina, Serina, Hetionina.

Glicina en una concentración de 2,5 mg/ml de c/uno.

C) Medio liquido MMA:Posee los mismos componentes que el

medio MMOexcepto que se le agrega 40 ml de Arginina

( Smg/ml)por litro de medio cultivo en lugar de orni­tina.

33

D) Egdio liguido MHOP:

Contiene los mismos componentes que

el medio líquido MMOcon el agregado de 40 m1 de putrescina

( 2,5 mg/ml ) por litro de medio cultivo ( putrescina diclo­hidrato ).

Reactivos:

Los reactivos utilizados en los di­

ferentes experimentos son los siguientes: sacarosa (libre de

ribonucleasa) adquirida en Schwarz-Mann;putrescina diclor­

hidrato de Schwarz-Mann;espermidina triclorhidrato y esper­

mina tetraclorhidrato de Sigma; cloranfenicol de Parke Davis;

rifampicina de Lepetit; ácido poliuridllico y RNAdel fago

MS-2de Miles; RNAde transferencia de Escherichia coli de

General Biochemicals; las sustancias radiactivas leucina

14€, fenilalanina 14C, uracilo 14C, espermidina 14€, valina1 144C, metionina C y metionina 3H se obtuvieron en New

England Nuclear Corporation.

Crecimiento de las bacterias y método de axuno

A partir de una estria de Escherichia coli

HA-261desarrollada en medio A se inoculó medio liquido

MMO(B) y se dejó crecer. Luego se mantuvo el cultivo en

frio a 0 DC( hielo picado ) durante varias horas, proce­

dimiento que produce la eliminación de putrescina de la

célula a1 medio,favoreciéndose de esta manera el ayuno. El

cultivo se diluyó posteriormente 50 veces con medio MMA(C)

y se dejó crecer a 37 9C durante la noche; el crecimiento

en este medio liquido produce un aumento considerable de

la población bacteriana. Nuevamentese realizó una dilución

1 : lO del cultivo anterior con medio fresco MMOdejándose

crecer hasta obtener una población bacteriana de 2 a 3 x lO8células /m1. Este cultivo se utilizó mediante dilución 1 : 3

en MMOy MMOP(D) para preparar los cultivos finales. En

esta etapa y en el medio MMOse puede observar que el nivel

intracelular de poliaminas ha disminuido en forma tal que

la bacteria requiere el agregado exógeno de poliaminas para

crecer normalmente. Se sabe que mediante este método de a­

yuno los niveles de putrescina intracelulares disminuyen

100 veces, mientras que los de espermidina se reducen apro­ximadamente a la mitad (5o -51).

Todos los cultivos se efectuaron a 37 QCdu­

rante 1a noche, con buena aereación. El crecimiento bacte­

riano se determinó espectrofotométricamente a una longitudde onda de 550 nm.

Pregaración de 1159995bacterianos

Los lisados bacterianos, se prepararon a

partir de cultivos en crecimiento logaritmico. Las célulasse cosecharon después de un enfriamiento lento, ( 15 minu­

tos a temperatura ambiente y 15 minutos en hielo picado )

de manera tal que se completa 1a sintesis proteica, acumu­

lándose de esta forma los monómerosde terminación, e im­

pidiéndose una nueva reiniciación por 1a baja temperatura.

Las bacterias se sedimentaron por centrifu­

gación a 3.500 xg durante 10 minutos y se resuspendieron

en 0,2 m1 de sacarosa 25% en buffer Tris-HCI IOmMpH 7,8

óOmHKCl ( la sacarosa usada es libre de ribonucleasa).

Se agregó posteriormente 50 pl de una mezcla ( 1 : 1 ) de

lisozima ( Sigma 10 mg/ml en buffer 0,25 mHTris-HCl

pH7,8) y_8mMEDTA.dejándose a 0 QC durante S minutos; se

agregó lueqo Spl de acetato de magnesio 1My se congeló y

descongeló dos veces en nieve carbónica-acetona. Después

de dejar descongelar en agua fria se agregó 25p1 de deoxi­

colato de sodio ( 25 mg/nl ) en buffer lOmHTris HCI pH7.2,

manteniendo por 10 minutos a 0 QC, y luego se añadió QPI

de DlAsa t 2,5 mg/mi ) . Después de 5 minutos a 0 QC, se

agregó 0,2 mi de buffer 20 mHTris HCl pH 7,8 , lOmHaceta­

to de magnesio, SOmHKCl y se centrifugó a 7.000 xg.

Se tomaron alícuotas de los sobrenadantes a los que se le:

midió la concentración ribosomal por espectrofotometria deabsorción a 260 nm.

Pregaración gg extractos bacterianos y distintggifraccionggsubcelulares Eor molienda.

Cultivos bacterianas en crecimiento logarit­mico se cosecharon por enfriamiento lento; las células se

sedimentaron por centrifugación a 3,500 xg y se lavaron

una vez con buffer lOmMTris-HCI pH7,8-,60mM NH4C1, 5mm

acetato de magnesio*y6mMmercaptoetanol ( buffer de molie!da). Todas las operaciones se realizaron a 0-4 QC. La

ruptura celular se hizo mecánicamente, moliendo las bac­

terias durante 5 periodos de 1 minuto cada uno con el

doble de su peso de alúmina, y resuspendiendo 1a mezcla

con buffer de molienda ( 3 a 4 m1/grano de peso húmedo

de bacterias ). Luego se centrifugó a 20.00039 durante

15 minutos, recogiendo el sobrenadante a1 que se le agregó

DNAsa( 3pg/m1 ), dejando en reposo por 5 minutos. Se cen­

trifugó nuevamente a 30.000xg durante 20 minutos con lo quese obtuvo 1a fracción sobrenadante llamada ( 5-30 ). El

sobrenadante ( 8-30 ) se sometió a una diálisis durante

5 horas contra 1000 volúmenes de buffer de molienda.

Los sobrenadantes ( 5-150 ) se obtuvieron

a partir de los ( 8-30 ) dializados sometiéndolos a una

centrifugación a 150.000xg durante 240 minutos. El sobre­

nadante se recogió en dos fracciones: una correspondiente

a los 2/3 superiores y la otra al 1/3 inferior. El sedimen­

to que contiene los ribosomas se resuspendió cuidadosamente

en 0,2 m1 de buffer de molienda.

Las fracciones 8-30, 5-150 y los ribosomas

resuspendidos se conservaron congelados a -709C. De esta

manera se mantienen activos durante por lo menos variassemanas.

Análisis de 1a distribución ribosomal

Gradientes analíticos

Los extractos celulares obtenidos por los

métodos de lisis o de molienda, se analizaron por ultra­

centrifugación en gradientes lineales de sacarosa de 15

a 40% ( P/V ) en buffer Tris HCl, pH 7,8, 20 mM, acetato

de magnesio lOmM, KCl SOmH.Se sembraron aproximadamente

0,6 UDO260nmen un volumen total de 0,2ml de los extrac­

tos celulares sobre los gradientes de 4,6 m1y se centri­

fugó durante 90 minutos a 45.000rpm en un rotor Spinco

SH65. Los gradientes se analizaron por absorción a 2S4nm

en un espectofotómetro ultravioleta con celda de flujo con­

tinuo ( ISCO);el cantenido de los tubos de centrífuga se

hace pasar por la celda inyectando sacarosa al 50%en el

fondo del gradiente.Para distinguir monómerosde terminación de

los monosomasse usaron gradientes de sacarosa de 15 a 40%

en una solución buffer de igual composición que la descrip­

ta anteriormente pero que contenía SOmMde NaCl en lugar

de KCl.

Gradientes preparativos

79

Para obtener cantidades relativamente grandes

de subunidades se utilizó gradientessacarosa de 10 a 30% ( sacarosa Mann

"buffer" similar a] de molienda pero

de magnesio. Se sembró 0,2 m1 de una

lineales de 12 ml de

libre de RNAsa) en un

con 0,1 mMde acetato

muestra que contenía

aproximadamente 40 UDO260nm de una suspensión de ribosomas

previamente dializados durante 4 horas contra 1000 volúmenes

de "buffer" de molienda con 0,1 mMde acetato de magnesio para

lograr la disociación completa, y se centrifugó los gradien­tes a 35.000xg durante 360 minutos en un rotor sw-40 Spinco.

Posteriormente los gradientes se fraccionaron por aspiración

desde el fondo usándose para esto una bomba Desaga. Se re­

cogieron fracciones de aproximadamente 0,3 m1que se anali­zaron midiendo su absorción a 260 nm.

Las fracciones correspondientes a cada subuni­

dad se juntaron y se dializaron contra 1.000 volúmenes de

"buffer" de molienda durante 24 horas y luego se guardaron a

Todas las diálisis se efectuaron a 4

Análisis del RNAribosomal.

Subunidades purificadas obtenidas de

9C.

cultivos

C'J

bacterianas desarrollados en medios MMOy HHOP ( 0,3 UDO

260nm de particulas SOSo 0,2 UDO260nm de 308 ) se trata­

ron con sodio dodecil sulfato ( SDS) a concentración final

de 2% y EDTA15 nn, durante 3 minutos a 37 9C;de esta ma­

nera se puede liberar el RNAribosomal ( 125 ). Las mues­

tras se sembraron luego sobre gradientes lineales de saca­

rosa 15 a 40%en buffer Tris lmH, acetato de magnesio lun

y se centrifugaron 240 minutos a 45.000rpm en un rotor

SW50-1. Los gradientes se analizaron midiendo la absor­

ción a 254 nmpor pasaje a través de una celda de flujo

continuo comoya se ha descripto.

Disociación de los ribosomas

Para estudiar el estado de los ribosomas adiferentes condiciones iónicas se analizaron los extractos

celulares por ultracentrifugación en gradientes de sacarosay se calculó el porcentaje de disociación en base a la re­lación de alturas o áreas de los picos correSpondientes alas particulas SOSy 703.

14Union de las poliaminas ( espermidina C)a los ribosomas

En estos experimentos se utilizó la técnica

de equilibrio de diálisis, trabajando con tubos de diálisisVisking previamente lavados ( 120 ).

Muestras de 0,4ml que contenían 4 a 5 UDO260nm

de ribosomas en buffer 10 mn Tris-Hcl pH 7,8, 50m! KCl SmH

acetato de magnesio y2mHmercaptoetanol se dializaron duran­

te 24 horas a 4 OCcontra 30m1 del mismo buffer al que se1habia agregado espermidina 4C ( 0,5 pCi ) 1mm. La unión

14€ a1 ribosoma se determinó tomandode la espermidina

muestras de SOpl de 1a solución externa y del interior de

la bolsa de diálisis ( por triplicado ), las que se conta­ron en un espadrómetro de centelleo liquido,previo agregado de

agua(0,2m1)y 3 ml de solución de Bray.

La cantidad de poliamina unida se determinó

a partir de la diferencia entre la radiactividad dentro yfuera de la bolsa de diálisis considerando que una unidad

de densidad óptica a 260nmde ribosoma 705 equivale a

Z3 picomoles ( 1?? )

La determinación del RNAse hizo por el

método del OrcinOI ( 123) y la de proteinas por el de

Lowry ( 124 ).

Sintesis de RNAy proteinas en células enteras

Un cultivo de Escherichia coli HA-261

previamente sometido a un ayuno de putrescina se cen­

trifugó a 3.000xg durante 10 minutos a 15 QC.

El sedimento de células se resuspendió en

medio MMOlibre de leucina y se reinició el crecimientobacteriano hasta alcanzar una concentración de 108 célu­

las por m1 .

Se tomaron alícuotas de 10m1que fueron

incubadas en presencia o ausencia de putrescina, con el

agregado correspondiente de precursores radiactivos.Para los estudios de cinética de síntesis

de RNAse añadiá uracilo 14C ( 14PM,O,1 pci/m1 ) y leucina

5 pM. Después de diferentes periodos de tiempo se tomaron

muestras de lml y se precipitaron con ácido tricloroacéticoal 6% ( concentración final ) frio, dejando a 0 QCdurante

30 minutos. El material insoluble se recuperó por filtra­ción en nillipore, lavándose varias veces con TCAfrio a1

5%. Los filtros millipore se secaron y se determinó 1a

radiactividad en un contador de centelleo liquido ( Previo

agregado de una mezcla centelladora que tiene 1a siguiente

composición: 4g de omnifluor en un litro de tolueno ).

h?

En 1a cinética de sintesis proteica se

14€ ( 5 pH, 0,1 pCi/ml ) y se procedióagregó Leucina

camoen el caso anterior, pero calentando durante lS

minutos a 90 QCdespués de la precipitación con TCA,

con el fin de producir la hidrólisis de los aminoaciltRNA.

Transporte de uracilo y leucina

Cultivos bacterianas que fueron sometidos

a un ayuno de poliaminas se incubaron en medio MMOo en

medio HHOPque contenían ZOQPg/mlde rifanpicina y

u4uH, 0,1 PCi/nl ) de uracilo 14€ para medir el transportede uracilo.

Cultivos paralelos de estas bacterias tam­bién previamente ayunados se incubaron en medio HHOo en

medio MHOPlibres de leucina. con cloranfenicol ( 200 pg/ml

y leucina 14€ ( S PM, 0,1 Pci/nl) para medir el transportedel aminoácido radiactivo. En todos los casos los precurso­

res marcados se agregaron después de preincubar los culti­

vos durante S minutos a 37 QCcon los correspondientesantibióticos.

lol;

Posteriormente se tomaron alícuotas de 1 m1

1adistintos tiempos y se filtraron inmediatamente por

millipore, lavándose luego con 5 m1de medio de cultivo

a temperatura ambiente. Se secaron los filtros y se de­terminó la incorporación a las células totales en un con­

tador de centelleo liquido.

Sintesis de polifenilalanina con ácido oiiuridilico,__.__, _ .7 _________JL___________

como RNAmensajero.

Para los experimentos en que se determinó

la sintesis de polifenilalanina se utilizó una mezcla dereacción de 0,1 ml con la siguiente composición: buffer

Tris-HCI pH 7,8 so mM, ATP lmM, GTP 0.02mM psp SmM,

piruvato quinasa 3 Pg, cloruro de amonio 70m", 40 lPg deRNAde transferencia, 0,05 pCi de fenilalanina 14€,

0.01mM, 50 Pg de poli U, acetato de magnesio y S-30 enlas cantidades indicadas para cada experiencia. El 5-30

en algunos experimentos fue sustituido por ribosomas y

5-150. En todos los casos antes de agregar el poli U,

se preincubaron las mezclas de reacción a 37 QCdurante

3 minutos. Después del agregado del RNAmsintético se con­

tinuó la incubación a 37 QCdurante los tiempos indicados

para cada experimento. La reacción se detuvo por el agre­

gado de TCA( concentración final 6% ) frio, luego se ca­

lentó durante 15 minutos a 90 QC, se filtró a través de

millipore y se lavó tres veces con TCAa1 5%frlq,y 1aradiactividad insoluble se determinó en un contador de

centelleo liquido.

Formación de fenilaignil tRNA

Para medir la formación de fenilalanil tRNA,

se usó una mezcla de reacción similar a 1a descripta ante­

riormente en la cual se omitió el poli U., determinándose1a radiactividad insoluble en TCAa1 6%frio.

Sintesis de Egoteinas "in vitro" usando cono mensajeronatural RNAdel fago MS-2

La sintesis proteica con mensajero natural

se realizó en una mezcla de reacción de 50 pl con lasiguiente composición: buffer Tris HCl 50 mM,pH 7,8,

UI

cloruro de amonio 60 mH, PEP SMN, ATP ImM, GTP 0,02 mn

piruvato quinasa 30 pg/ml 19 aminoácidos ( 0,025 mH )

de cada uno, 0,5 pCi de valina 14€ ( 0,061 mn J,

0,25 UDO 260 nm de RNA del fago MS-Z y 1 UDO 260 nm

de sobrenadante S-3O previamente preincubado como sedescribe a continuación.

La preinCubación se realizó de 1a siguientemanera: 100 UDO260 nm de fracción 5-30 de cultivos bac­

terianas ayunados y desarrollados en medio MMOo HMOPse

incubaron a 34 QCdurante 7 minutos con 0,02 volúmenes

de Tris-HCI 2M, pH 7,8 y 0,1 volumen deuna mezcla de ener­

gia que contenía PEP SOmM,piruvatoquinasa 300 Pg/ml,ATP 10 mMy GTP 0,2 mn. Después de esta preincubación

se agregó 0,5 volúmenes oe sobrenadante 5-150 proveniente

de un cultivo bacteriano desarrollado en presencia de po­liamina. Las concentraciones de acetato de magnesio usa­

das fueron las indicadas para cada experimento. La reac«

ción de sintesis proteica se detuvo por el agregado de

TCAal 6%en frio, luego se calentó durante 15 minutos

a 90 QC, y se filtró a través de millipore lavándose 3veces con TCAa1 5%frio. La radiactividad insoluble se

determinó en un contador de centelleo líquido.

Formación del complejo de iniciación

La formación del complejo de iniciación se

realizó en dos etapas; en 1a primera de ellas, cuya fina­3H tRNA se usóíidad es la formación del formilmetionil

una mezcla de reacción de 50 P1 cuya composición es 1a

siguiente: Tris-acetato lOOmM, pH 7,2, ATP 3mm, acetato

de magnesio lOmM, KCl 10 mM, tRNA de Escherichia coli 0,16 mg,

leucovorina 5 pg, sobrenadante 5-150 ( obtenido de cultiá

vos en medio MMOP) equivalente a 0,26 mg de proteina y

4 PM de metjonina 3H ( 2 PCi ) . Esta mezcla se incubó

a 37 QCdurante 20 minutos, luego se enfrió a.09 y se

agregó una mezcla de 50 y] que contenía 1 UDO260 nm de

sobrenadante 5-30 ( proveniente de cultivos bacterianos

ayunados y desarrollados en medio MMOo MMOP) preincubado

comose describió para 1a sintesis proteica con mensajero

natural, cloruro de amonio 100 mM,acetato de magnesio

8 mM, GTP 0,2 mM y 0,1 UDO260 nm del trinucleótido

AUG.

Después de incubar a 25 9C durante 20 minu­

tos, se detuvo 1a reacción por el agregado en frio de 3 m1 de

buffer Tris-acetato lOOmM,pH 7,2, acetato de amonio 50 mMy

acetato de magnesio 20 mM. Posteriormente se filtró a

través de millipore, se lavó tres veces con el buffer an­

terior y se determinó la radiactividad fijada a1 milliporeen un contador de centelleo liquido.

Formaciégqgeiugomglgig_deiniciación a partir de fornil14metionil C tRNApurificado.

Para 1a formación del complejo de iniciación

a partir de fornil netionil 14C tRNApurificada se uti­

lizó una mezcla de reacción de 0,1 m1 que contenía los

siguientes reactivos: acetato de magnesio6nH, buffer

Tris-HCl 40mH, pH 7,2, cloruro de amonio SO mn, GTP 0,2mM,

AUG0.1 uno 260 nm, 2.200 cpm de 14c formil metionil

tRNA( SScpm/p.mol)y ribosomas en las cantidades indica­

das para ceda experimento. Se incubó a 24 QCpor 20 minu­

tos y 1a reacción se detuvo por el agregado en frio de

lml de buffer Tris-HCI 0,1 H pH 7,2, acetato de magnesio

ZOHH,KCl 50 mn, procediéndose luego como en el caso an­

terior.

ULTADÜS

Requerimientos de putrescina para el crecimiento normal

de cultivos de Escherichia coli MA-261previamente some­

tidos a un ayuno de poliaminas.

Varios investigadores han demostrado,

trabajando con diferentes cepas auxótrofas para poliami­

nas, que en las bacterias sometidas a un ayuno de estas

sustancias los niveles intracelulares de putrescina seencontraban disminuidos 100 veces, mientras que los de es­

permidina se reducian a la mitad ( 119 ). En estas con­

diciones las bacterias dependen de] agregado exógeno de

poliaminas para crecer normalmente. La cap: MA-261de

Escherichia coli posee un comportamiento similar y por

lo tanto el agregado de putrescina a1 medio de cultivo

provoca, después de un periodo de 60 minutos, un incre­mento en 1a velocidad de crecimiento de dicha bacteria.

Fig. l.El tiempo de generación en varios experi­

mentos fué de 180 a 300 minutos en cultivos en ausencia

de putrescina ( MMO), mientras que en presencia de estasustancia fué de 60 a 90 minutos.

Cuando los cultivos de esta misma cepa bac­

teriana previamente sometidos a un ayuno de poliaminas se

desarrollaron en el medio HHOsuplementado con putrescina

( HHOP), espermidina, espernina o Hg, se obtuvieron las

curvas de crecimiento que muestra la Fig. 2. Se puede

observar que el tiempo de generación minimo se obtiene

con putrescina y le siguen en orden creciente los corres­pondientes a medios de cultivo con espermidina, espermina,

y magnesio.

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Figura 1.- Efectn "n la adición degutrescina son a el crecimiento qLïscr;.zric:i:asii .“A “51-:- Las :Ï'zlulzs sometidas al ayuno de pal-laminas: st-‘eincubaran c 3'71”3ÏÏ'T-ciio’fiïïfl. Después de l hora se separó una alícuota del cultivo que 21.- :1..­-; '.:1:'ïtar.'accn putrescina.( 100 g/rnl.) y ambas fraccicnes se íncubarcn nueva­:'=t2. Abscrción óptica a 550 nm en medio HHO,o , y gn medio HHÜP,o

0,5 ­

0,4 r

(L1 '

(208 ­

4550nm

9s N‘va

0A95 '

F

4 ,6

hora: H3. zFig. 2.- Efecto del agregado de varias poliaminaa o Mg++sobre el crecimientode E.coli MA-261. Células sometidas a un ayuno de poliamina, ae incobaron a 370 Cen presencia de 8 mM(concentración final) de MgH o 0,8 mM(concentración final)de la poliamina indicada en cada caso.a Medio MMO+ putreacina, tiempo de dupli­cación 9O minutos; o Medio MMO+ eapermidina, tiempo de duplicación 132 minutos;

a Medio MMO+ espermina, tiempo de duplicación 150 minutos; A» Medio MMO+ Mg++,

tiempo de duplicación 2h5 minutos: O Phdio MMO,tiempo de duplicación 250 minutos.El crecimiento bacteriano ae midió por absorción óptica a 550 nm.

b

ha

Efecto del agregado de putrescina Segre la distribución

intracelular gs los ribosomas

Se ha demostrado que las poliaminas desem­

peñan funciones muyimportantes en el metabolismo celular

( 5 - 19). En experimientos ¡in vitro " se encontró la

propiedad de estas sustancias de disminuir los niveles

óptimos de magnesio para la sintesis de proteinas ( 59 ),

que en algunos casos era netamente estimulada ( 126 ).

Las poliaminas son capaces de producir"in vitro" 1a asociación de las subunidades ribosomales

( 105 ). Por otra parte se sabe que se encuentran for­

mandoparte del factor de asociación aislado en Bacillus

stearothermoghilus ( 86 ).Estos descubrimientos nos llevaron a estu­

diar el efecto sobre la distribución intracelular de los

monómeros70 S y las subunidades ribosomales del agregado

de putrescina a cultivos previamente ayunados. En estasexperiencias los cultivos bacterianoa ayunadosse desarro­

llaron durante varias horas en medio HBO;luego se tomó

una alícuota que corresponde a la mitad del cultivo ori­ginal y se la suplemento con putrescina; amboscultivos

".'

se continuaron incubando durante 30 minutos. Posterior­

mente las células se cosecharon enfriando lentamente y

los lisados bacterianos obtenidos se analizaron por cen­

trifugación en gradientes de sacarosa; la Fig.3A muestra

el perfil ribosomal de los cultivos desarrollados en au­sencia de putrescina ( MMO); en estos casos se observa

un desplazamiento del equilibrio ríbosomal a favor de las

subunidades, con una disminución apreciable del pico co­

rrespondiente al monómero70 S y un aumento del pico co­

rreSpondiente a la subunidad SOS. El pico de particulas

30 S aparece ligeramente disminuido y algo difuso, lo cual

puede indicar que durante el ayuno de putrescina los me­

canismos de sintesis y/o ensamblado de la subunidad peque­

ña están dañados. La Fig. 3 B corresponde a un cultivo

sometido a un ayuno y luego desarrollado durante 30 minutos

en presencia de putrescina.En este caso se produce un rápido cambio en

la distribución ribosomal, desplazandoel equilibrio afavor del monómero,con la consiguiente disminución de

los picos de subunidades. Ademásse normaliza el perfil

correspondiente al pico de la subunidad pequeña.

Si tomamos como parámetro el área de los

picos 50 s y 70 S, 1a relación 70 S/ SO S en la Pig_3A(medio

MMO) es de 1,54,mientras que en la Fig. 38(medio HMOP)es

de ¿,89. El contenido total de ribosonas observado en los

gradientes correspondientes a células ayunadas ( MMO), es

menor que para células cultivadas en medio HMOP,pero se

compensa por una mayor absorción a 260 nn del sobrenadante

( dato no mostrado en las figuras ) .Cuandodos cultivos desarrollados en 1a

misma forma que los descriptos para los experimentos an­

teriores, se cosecharon por enfriamiento rápido en presen­

cia de cloranfenicol,tratamiento que provoca 1a detenciónde la sintesis proteica con 1a conservación de los poli­

ribosonas, se encontró un número mayor de polisonas en

lisados celulares provenientes de cultivos desarrolladosen presencia de putreacina ( MHOP), manteniéndose una

relación nonómero/subunidades semejante a 1a observada

en 1a(Fig. 3); (Fig. 4A y B).

Los perfiles obtenidos en 1a Fig. 3 indi­

can un efecto directo de las poliaminas sobre 1a distri­bución "in vivo" de las diferentes particulas ribosomales.Estas diferencias observadas en los perfiles de la Fig. 3podrian deberse a alguno de los siguientes artificios:

A. 795- 505 4395 “3. i705 505. 3'05í . ' . '

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o; ! .s x 1 LJ ! { I J4 3 2 1 __ 4 3 2 1

ml des e el memsco 1273.3Figur 3,- Efectn de la: palíaminas sabre el gggfil ribosomal.­a

Cc pués de cnsechar las bacteria: se lisaron según se ha descripto an mate­las y métcdcs. Las extractas cnlulares se analizaron por centrífugacíón

¿‘ “arrecppndiente a unen gradientes de sacarosa. A, cs el perfíl ribosomlisado preparado a parti: de bacterias cultivadas en medio MMOyhg,-corres­pnnde a células que han crecido en medio MMOal que se agregó pútrescina

’1

(Ad- '­

durante 1an_últ1mos,30 minutos de la incubación.

A 705 50 30 B 705 50 30l li I i;03'

4254nm

5) Na

4 3 2 1 4 J 2 1

ml desde el menisco 1+Fig. h.- Efecto_gg¿_egregadode putrescina sobre 1a distribución intragglglgrde Eolisomas. Después de cosechar las células por enfriamiEnto rápido en pre­sencia de cloranfenicol, las células bacterianas se lisaron según se ha descriptoen materiales y métodos. Los extractos celulares oe analizaron por ultracentrifu­gación en gradientes de sacarosa. fi es el perfil ribosomal correspondiente a unlioado preparado a partir de bacterias cultivadas en medio MMO;g_correcponde acélulas ayunadaa que se han desarrollado en medio MMCPdurante 3 horas.

I)

VII

III)

La sensibilidad de las bacterias cultivadas en me­

dios MMOo HHOPfrente al método de lisis puede ser

muydistinta, determinando una diferencia de extrac­ción tanto de los monómeroscomo de las subunidades

ribosonales en ambostipos de bacterias.

Tanto los nonómeros de terminación como los monoso­

mas aparecen en el mismopico del perfil ribosomal.

Si el contenido de ambostipos de particulas fuera

diferente en los lisados provenientes de cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de putrescina,esto podria explicar las distintas distribucionesde ribosonas en ambosextractos.

La dimerización de las subunidades 30 S da lugar a

particulas con coeficiente de sedimentación de 50 S.Por lo tanto los diferentes perfiles en los extrac­tos de los cultivos en presencia o ausencia de pu­

trescina se pueden deber a una distinta dimerización

de las subunidades 30 S en ambos lisados, que produ­

ciría contaminaciones de distinto grado en los picoscorrespondientes a particulas 50 S.

Para descartar la primera posibilidadse realizaron estudios cuantitativos del RNAtotal extrai­

do de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de

poliamina. Se encontró que en ambos casos se podia extraer

entre un 80 a 90 1 del RNAtotal. Dado que la mayoria del

RNAcelular corresponde al RNAribosomal, la diferencia

observada en 1a Fig. 3 no puede ser atribuida a una extrac­ción selectiva de las subunidades o monómerosribosomales.

El antibiótico trimetoprim inhibe lasintesis proteica a nivel de la iniciación ( 121 ) pro­duciendo 1a acumulación de monómerosde terminación. Cuan­

do los cultivos bacterianas desarrollados en presencia o

ausencia de putrescina se cosechan luego de estar en con­

tacto con trimetOprim durante 15 minutos, se observa que

los perfiles ribosomales de células asi tratadas, no sediferencian de los correspondientes a extractos bacteria­nos cosechados por el método de enfriamiento lento ( Fig.3 );

este hecho nos indicaria que la mayoria de los monómeros

encontrados en amboscasos corresponden a particulas de

terminación. Se ha demostrado que es posible distinguirlos monómeros de terminación de.bs monosomascuando se

üusan gradientes de sacarosa en los cuales el K sc susti­

tuye por Na * ( 127 ). A1 realizar los análisis en

gradientes de Na* ( Fig. 5 ) se encontró que el porcen­

taje de los ribosomas de terminación en el pico de 70 S

era de un 82 1 para los lisados provenientes de cultivos

ayunados y de 87 % para los que se habian desarrollado

en presencia de putrescina. Estos hechos apoyan la idea

de que 1a diferencia de perfiles de la Fig. 3 no se

debe a diferentes tipos de monómeros70 S.

El análisis de las subunidades purifi­cadas a partir de extractos bacterianas procedentes decultivos desarrollados en presencia o ausencia de polia­

mina nos permitió estudiar detalladamente una posible con­taminación de la subunidad ribosomal 50 S con dimeros de

30 S. Se realizó un análisis de estas subunidades puri­

ficadas en gradientes de sacarosa y se encontró que en

amboscasos ( células cultivadas con o sin putrescina )

las subunidades 50 S poseían un 95 % de pureza, aún después

de ser incubadas a 55 QC durante 5 minutos en presencia

de 2 mnditiotreitol que es un tratamiento que produce

la disociación de los dimeros de 30 S. ( M. Garcia Patrone,

dato no publicado ). Para confirmar estos resultados se

sometieron ambos tipos de subunidades SOS a un tratamien­

to con SUSal 2 % de concentración fina1,con lo que se

produce la liberación del RNAcorrespondiente a cada par­

tícula; posteriormente se analizaron por centrifugaciónen gradientes los RNAobtenidos y se encontró que en am­

bos casos la subunidad 50 S presentaba un pico de RNAde

23 S acompañado por otro más pequeño de 16 S.

La aparición de este pico de RNAde 16 S

se podria explicar por la actividad de endonucleasa pre­sente en la subunidad 50 S ( 128 ). Por otro lado aun­

que este pico de RNAde 16 S tenga su origen en una con­

taminación por dfneros de 30 S, el hecho de que ambos ti­

pos de subunidades 50 S(provenientes de cultivos ayunados

o no) posean la misma cantidad de RNA16 S sugiere que

aún en el caso de una contaminación por dineros, ésta no

alteraria el perfil ribosomal que se observa en 1a F19. 3AyB.

Á254nm

oa­’­._ .'r.

‘ ¿flan Qor ceng;ifugg:ión_eñ oracionteg_ge_5pgpg__.L[T "­

á 1¿-ÜCOG

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A 705 505 305 B 705 505 305

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desc“ el . ­¡n!

- Efecto del qggechc :g_3g¿¿am;gg_ggtre_

:élul s bacteriana: se lisaron y se analizaron

.n nnen medio L.u.

luego cultivocv: por 30 minutos en medioBcorresponde

métodos. fi: :orresponde o un perfil rí:3:emlos perfila: obteïír

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62

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el de cultivos :::::::­a.35 L). E célula; ¿yo­

:2 ha descripto e: m:­

CT

Especificidad del efecto de la poliamina sobre la distri­bución de ribosomas.

Se investigó si los perfiles ribosoma­les de los cultivos desarrollados en medio MMOeran ca­

racterísticos de la falta de polianina o podrian obtener­se por el ayuno de otras sustancias tales comoglucosa o

fuentes de nitrógeno.

En estos experimentos los cultivos de­

sarrollados en presencia de putrescina se lavaron varias

veces con medio HMOPsin glucosa, y luego se volvieron a

incubar a 37 QCdurante 30 ninutos en medio HHOPsin glu­

cosa. Los lisados obtenidos a partir de estas células pre­sentaban un perfil similar al de los correspondientes almedio HMOPcompleto ( Fig. 68 y 6C ) .Un cultivo paralelo

desarrollado en ausencia de poliamina ( MMO), dió unadistribución ribosomal caracteristica de la ausencia de

esta sustancia ( Fig. 6A ). Iguales resultados se obtu­vieron cuando las bacterias se sometieron a un ayuno de

nitrógeno.

Figura 6.- Eagecificidad dei efecjg_gg puliaminas gpbre le distgibuciónribosomal. Los lisadou de bacterias desarrolladas en distintas condi­ciones se analizaron comose indicó en materiales y métodos. Las bacte­rias Fueron cultivadas en los siguientes medios: fl, en MMO;g, en MMDP;E, en MHÜP,pero las células se levarOn y reincubarun durante 30 minutosEn el mismo medio libre de glUCDSr.

6h

Ghia

/'='70.85053Q“¡3."/051105;30:;C.703

1.1,.J.J.J.J.J0/.-—,_í

A254 nm

0.2—___

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l''g'._.0.)u­

_|

27'1,

N _.

sx

¿x

La

43

¡nl(!CSC:'Cclmcmsco

Disociación de los ribosomas

La sensibilidad a la disociación de los

ribosomas obtenidos a partir de bacterias desarrolladas

en presencia o ausencia de putrescina se estudió a concen­

traciOnes decrecientes de magnesio. En la Fig. 7 se puede

observar que las particulas ribosomales provenientes de

los cultivos en medio MMOestán más disociadas que las

obtenidas de bacterias desarrolladas en medio HMOP. Por

otro lado, las curvas de disociación para ambos tipos de

partícula son paralelas, indicando que los monómeros70 S

obtenidos de cultivos en presencia o ausencia de poliami­

nas poseen igual sensibilidad a la disociación por la dis­minución de los niveles de magnesio.

DlSOC/AC/ON (Vo)(hO

Q

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hL-.,__I| l l l l i i

Fígurñ .- gpiggl}}f"d de 101 rihanomas a_g1Fereñteg_gggpggfifgpiofig_ “e “"’*.Después de aJurtnr 11 canccntrnción de MgH a los niveles indicados, .3: extra:tqs obtenidos a partir de bacterias cultivadas un medio MMO( Q ) o HPC? C O )se analizaron y :e :aiculñ los respectivos porcentajes de dinociaciñ*

Unión de la espermidina al ribosqmg y corrección del

perfil ribosomal " in vitro ".

La unión de espermidina radiactiva a

particulas ribosomales aisladas de cultivos desarrolladosen presencia o ausencia de poliamina se realizó por equi­

librio de diálisis. El númerode moléculas unidas resul­tó sercbl mismoorden ( 920 i 35 moleculas/ ribosoma )

para ambostipos de particulas ribosomales.

Después de una diálisis de 24 horas

contra una solución que contenía espermidina l nn. las

subunidades se asociaron parcialmente, especialmente en

el caso de las provenientes de cultivos en medio MMO.

Deesta manera los perfiles ribosomales de las bacterias

ayunadas o no tienden a igualarse ( Fig. 8 ).

Además, después de la diálisis ambos

tipos de particulas 70 S se vuelven más resistentes a

la disminución de la concentración del magnesio ( Fig. 9 )

Figura 8.- Efecto de diálisis contrisoluciones de esgermidina sobre ladistribfln ribosola_1_.Las muestras se sometieron a equilibrio de diálisiprocediendo como se ha descripto en materiales y métodos. A y _B_son los perfiles de los ribosomas de terminación en gradientes de sacarosa antes dediálisis, y Q y ¡_D_después de diálisis. A y E corresponden a las muestraspreparadas con bacterias cultivadas en medio MMOy g y Q a los extractosde células desarrolladas en medio MMUP.

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A.ms505305a705sosaïs C.705505305D,70553653’03“

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igura 9.- gpjggiljgggL;@L¿pgnyiggggpasdquqgíjgïguéiigig_contra egpa;nídina.aa muestras se sometieron a un equilibrio de diálisis centra espermidina 1mM

luego se ajustó ln cancentrución de Mg++a distintos valores. Después denálisis por centrifugación en gradientes de sacarosa se determinaron los por­entaJea de disociación. Loa simbolos aon loa mismosusados en la Fig. 7.­

70

Sintesis " in vivo " de RNAz proteinas

Se estudió las cinéticas de sintesis

de RNAy proteinas en cultivos bacterianos desarrollados

en medio HHOy IHOP , a los cuales se agregó los precur­

sores radiactivos respectivos ( uracilo o leucina ).

En la rig. 10 A correspondiente a la

cinética de sintesis de RNA,se puede observar un incre­

mento de dicha sintesis para amboscultivos. Aunquela

sintesis del RNAfue mayor a tiempos largos en las bac­

terias desarrolladas en presencia de putrescina, el agre­gado de esta sustancia provocó en los cultivos bacteria­nos un retardo de 1a sintesis de RNAdurante los primeros30 minutos.

En los cultivos desarrollados en HBO

no se observó este efecto.

La cinética de sintesis proteica nues­tra un comportamiento diferente a la del RNA;en estos

casos Pig. lo B ) el agregado de la putrescina produce

un incremento innediato en la sintesis proteica.Estos resultados sugieren un efecto

independiente de las poliaminas sobre el proceso de la

Figura 10.- Efectn___delag;g_ggp_q_gg putrescina sobre la sintesis de RNA!Erotelnas en bacterias ayunadas. E1 procedimiento experimental se ha indi­cada an materiales y métodos. g , cinética de la sintesis de RNA;_B_,cinéticade la sintesis proteica. o y o , incorporaCIOnesEn células cultivadas enmedio MMOy MMÜP,respectivamente.

incorporacion de [MC]Uma/o (CmeÏOG)N On.CxO Q o

IL, obNLOI _

¿L \o¡ __x.)

Co; _gs

(u;tu)L>z,-'w:v_:¡

ov¿a

7’?

traducción. Para confirmar estos resultados se estudiaron

los cinéticas de sintesis de RNAyproteinasen presencia

de rifampicina ( 100 pg/ml ). Este antibiótico produce1a inhibición de la sintesis del RNA. En estas condicio­

nes de trabajo se pudo observar que nientras los niveles

de RNAse encuentran inhibidos en mas de un 90 i para

amboscultivos ( Fiq. ll A ) la sintesis de proteinas dis­

minuye solamente entre 10 a 30 1 ( Pig. ll B ).

Ademas, el agregado de putrescina al

nedio de cultivo provoca el inmediato increnento de la

sintesis proteica. El periodo que transcurre antes de ladetención de 1a sintesis proteica en presencia de rifam­picina es relativamente largo ( 30 minutos ); esto nos

podria indicar una demora de acción de 1a droga o que la

cepa es poco sensible al antibiótico. Aunasi, se debe

señalar que el grado de inhibición de la incorporacióndel uracilo a las células bacterianas producido por elantibiótico, es mayoren los cultivos que fueron suple­

nentados con la putrescina, mientras que en el mismocaso

( HHOP) 1a sintesis proteica es marcadamente superior.

70'3)incorpora cion a’c[MCjU/‘acz’lo (cpm Xxx ' R) (.o

Q O O Qt\\ l . l ‘ 2:.l¿a Í>

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131152.13;- Eicstn. 11.9.1-.033293991219339992.9991042 2.1K» s._de RNA121mm?- en 261.141“ ¿yu-“¿1.8.9.1...en_p_rsss_ns_1.a_ysgéfimpiclm .<._1-“_-"‘___9___u/m1- >.Las:detalles experimentales y los simbolos utilizados son iguales a losindicados en ln F10. 10.­

Transporte de uragilogy leucigg

Las diferencias que observamos en los

experimentos anteriores ( durante la primera hora poste­rior al agregado de la putrescina ) no se deben a un nú­

Iero diferente de bacterias, ya que el aumentode la sin­

tesis del DNAy de la velocidad de crecimiento inducidas

por la polianina comienza después de ese periodo ( Fig. l ).

sin embargo, estas diferencias podrian

atribuirse a una modificación en el transporte de los

precursores radiactivos por la presencia o ausencia de

la polianina. Las Figs. 12 A y B demuestran que el trans­

porte de uracilo y de leucina es similar para los cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de poliamina. Estu­

dios realizados por otros autores indican que la diferen­cia de incorporación del uracilo durante el periodo ini­cial ( Fig. 10 A ) parece deberse a una expansión del

" pool " endógeno de esta sustancia despues del agregado

de la putrescina ( 129 ).

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Firmrn 12.- gfgítg_@_1_9m_cg¿1_dpde pglipflina mpg-cnc} 'ÏTCÏTTPÑFÉLÉE“391.34_‘._c_n.-cinn.El transporte de Ieucina (fi) y de uracilo (.2) se midió segun lo 1.1::cado en materiales y métodos. Los valores correspondientes a los medias :'..".u(O)y MNOP(O ) se expresaron como_la radionctividad incorporada por 108 célglas. '

Sintesis 'in vitro" de Eoligétidos:

Los experimentos de sintesis "in vitro" de

polipetidos, demostraron que el agregado de putrescina a

cultivos previamente sometidos a un ayuno de esta sustancia

produce un efecto independiente a nivel de le traducción.

En estos experimentos se midió la incorporación de fenila­

lanina usando al poli U como¡NAmensajero. Los resultados

indicaron que las fracciones 8-30 provenientes de cultivosdesarrollados en presencia de putrescina presentaban una

actividad 3 a 4 veces mayorque la correspondiente a extrac­tos de bacterias cultivadas en ausencia de esta sustancia

(rig. 13). Esta diferencia de actividad para ambossobrena­

dantes 3-30 no se debe a distintos requerimientos de magne­

sio, ya que en ambos sistemas el óptimo de magnesio oscila

entre 13 y 15 ml (Pig. 14). Cuandose siguió la cinótica

de incorporación de fenilalanina (tig. lS) se pudo ver quelos sobrenadantes 3-30 provenientes de cultivos desarrolla­dos en medio IHOpresentaban una reducida actividad inicial

que luego alcanzaba un valor maximoen tiempos relativamen­te cortos no ocurriendo lo mismocon los sobrenadantes 8-30

aislados de celulas cultivadas en presencia de putrescina.El retardo observadoen la sintesis de polipétidos en extrac­

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O n. I 1 l íS O 0.2 0.4 0.6 0.8

unidades A260 Fíg. 4aF'mura 13.- Incorpcrnqíïïg f'erúlolanina En efiractns de Bacterias ayunadas- "uglemcnto_dz.1_:;Epfjhpnyïflgfi. Las mezclas de reacción contenían las canti­dades indicadas de extr..cto 5-30 y los demás componentes ocscríptos en mate­riales y métodos. La concentración de acetato de '-ï._',»Fu: r1: 15 mMy el tiempode incubación de 30 minutos. Los simbolos O y o corresponden ¡a extractosde bocteriao cultivadas en medios MMOy MMDP,respectivomente.

77

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Mgficoncn. mM) Pía/1‘}Figurn lh.- Elpjgg}p_ggbppllfenllelanlna En amb?gigggïgjgp_gggterlanos aglgg¿¿tas concentraciones de Mg++. Ée usaron D,h unidades de absorción ópticamedida u 260 nmde cada extracto 5-30 y las concentraciones indicadas de acetatode Mg. Los demás detalles experimentales y los símbolos fueron descriptos enmateriales y métodos y en le leyenda de la Flg. 13.

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l l l l l l 1

EÏ O 20 40 60 ó’O

Tiempo(mín) 52‘45Figura 15.- Cinética de incorporación de fenilalanina e" gïjractos de¿a3¿g;¿gg_gïgggggs o suplemeníggp: con putrcggigg. Las mezclas de reacpiónr9 han descripto en materiales y métodos. En todos los casos se utilizaronC,h unidades de absorción óptica medida a 260 nmde los extrattos 5-30 yuna cancentración de Hg*+ de 15 mM. Los tiempos de reacción son los indi­cados en cada caso y lun simbolos los mismos utilizados en la Fig. 13.

79

tos de bacterias desarrolladas en medio MMOparece indicar

que las células con bajos niveles de poliaminas presentan

alguna deficiencia en los procesos de iniciación de la sin­tesis proteica. Por otra parte se ha descartado la potibi­lidad de que la reducida velocidad de sintesis de polifenil­alanina en los extractos de bacterias desarrollados en au­

sencia de putrescina se deba a un menor nivel de activación

de los aminoácidos. En nuestro caso esto no ocurre, pués,

ambossistemas preparados a partir de bacterias cultivadas

en ausencia o presencia de putrescina mostraron similares

cinéticas de activación (Fig. 16).Para estudiar con más detalle el efecto del

ayuno de poliaminas sobre la sintesis "in vitro" de poli­

péptidos,se centrifugaron las fracciones 8-30 provenientesde cultivos desarrollados en presencia o ausencia de putres­cina con el fin de separar ribosomas de los factores solu­

bles presentes en la fracción sobrenadante denominada5-150.

Combinandoluego ribosomas y fracción 5-150 de ambos siste­

maspara realizar la sintesis "in vitro" de polipétidos,se podria detectar cuál de estos componenteses defectuoso

en los extractos de bacterias con bajos niveles de poliami­

nas. Los resultados de la Tabla I muestran que la capacidad

de sintetizar polipétidos depende en la mayoria de los ca­sos, del origen de los ribosomas ( I y III ). En algunos

C; k4

experimentos el sobrenadante 5-150 obtenido de las bacterias

desarrolladas en presencia de poliaminas aumentóla activi­

dad de los ribosomas de células sometidas al ayuno de estassustancias ( II J.

Los resultados anteriores parecen indicar

que el ayuno de putrescina provoca una alteración en alguno

de los componenteso factores ribosomales, que en ciertas

condiciones podrian liberarse parcialmente al sobrenadante.

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(C/Pfiï-A

(I.n¡uo:

J/‘b/H/(IÍ

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C 20 30 40

H8. 46F__.____i-'um 16-- 213_ét1.53_11.0-.ESIEPEAÉK.dpieJ'HpiwL-¿Rí .crirP-__.__ctm de bas»;­¿jgs ayunndgg_9_5gp}ggp3}ppgj_Epg_fly};gpg}na.

).‘3.

Ï’cmpo (mín)

Las mezcla: utilizadas se ha:durcripto pn materiales y métodos. Se usaron 0,4 unidades de nbcorción ópticaa 260 nm de los extractos 5-30 y unn concentración de lan Hg++ de JS mM.Símbolos cnmn en 1a Fig. 13.­

gnk4

-EEL

Síntesis de polifonilalanina con pggpnïaciongg_gs_5}kgggygg_ymigggcigneg

sobrenadantes (5-150) obtenidos de bacterias culgiyagag_enuggpgncia q

Presencia de ngtrescina

Experimento Ribosomas S lSU Síntesis de polipéptidos

MMO MMOP MMO MMOP picomoles de fenilalaniuaincorporada

+ - + - 2396

+ - — + 26,7I

— + + — 46,2

_ + _ + 46,6

+ - + - 25,0

+ - - + 46,4II

- + + - 70,5

— + — + 97,8

+ - + - 48,4

+ - - +III

- + + - 143,5

- + - + 136,0(

Las mezclas de reacción contenían 0,2 unidades ópticas medidas a260 nmde suspensiones de ribosomas y lSlpg de proteínas de sobrenadanteS 150 obtenidos a partir dc extractos de bacterias desarrolladas en losmedios MMOo MMUP. La concentración de Mg++ fué de 14 mMy la de los de­más camponentes como se describió en Materiales y Métodos. El tiempo deincubación fué de 30 minutos. El blanco de la reacción (realizado enausencia de ácido poliuridílico) fué restado en cada caso.

"U

¿111M 11

bíntesis de polifenilalanina con sistemas rcconstituídos a partir de;subunidades ribosomales purificadas obtenidas dc bacterias cultivadasen presencia o ausencia de putrescina.

subunidades 305 subunidades SOS Síntesis de polipéptidos

de bacterias desarrolladas enmedio de cultivo

“MU HMDP MMO MMO? (cpm)

+ - + - 1724

+ _ — + 1909

Expt. 1- + + - 4817

- + — + 5970

+ - + - 1771

+ - — + 1492Expt. 2

_ + + — 7956

- + - + 7550

La mezcla de reacción contiene 0,05 UDO260 nm de 1a subunidadribosomal 308 y 0,10 UDO260 nm de 1a SOS, que se obtuvieron a partir decultivos desarrollados en presencia o ausencia de putrescina según seindica para cada experimento. El sobrenadante (8-150) equivalente a15pg de proteínas se obtuvo de los cultivos desarrollados en presencia deputreacina. La concentración de Mg++que se u36 para estos experimentosIué de 13 mHy las incubaciones se realizaron a 37° durante 30 minutos.El blanco de la reaccián (incorporación obtenida en ausencia de poli U)fue restado en cada caso.

Todos los otros detalles de la reacción están descriths enMateriales y rEtodos.

Sintesis "in vitro" de poiipétidos usando RNAmensajeronatural

Los resultados obtenidos para la sintesis"in vitro" de polifenilalanina fueron confirmados cuando

se utilizó comomensajero natural el RNAdel fago HS-2.En estos experimentos (Pig. 17), las fracciones 5-30 ais­

ladas de bacterias cultivadas en medio suplementado con

putrescina ( HMOP), mostraron una actividad 4 veces mayor

que 1a correspondiente a 1a de bacterias ayunadas. Se obser­

vó además que para ambos extractos la concentración de mag­

nesio que da máxima actividad es de aproximadamente 9 mH.

BG

Figura 17.- Efecto qggln corcentración del Mg++ sobre la incquoracióngp valina inducida, por el RNAm¿lil Fago M°-_2_g_t_1__gg(g_g_g_ggg_b_ggt_erl_aíai_

dacarrollados en Érggggg¿g_p_gyggf5¿g_gp_ggggggg¿gg. La mezcla dereacción ae ha descripto en materiales y métodos. Símbolos ycorrespOndena los extracto: nbtenidos a partir de cultivos desarrolladosen medio MMOy HHDP. respectivamente.­

063

l..-____|l|co(o .NN

(2...0?x“¡C/3)Dll/[DA[DM]9p¿19390.10chow!

Sintesis de polifenilalgnina con subunidades ribosomales

purificadas. Detección de particulas 30-8 anormales.

Los experimentos descriptos de sintesis

"in vitro" de polipétidos usando RNAmensajeros artificia­

les o naturales y fracciones 8-30 provenientes de bacterias

sometidas o no a un ayuno de putrescina, demostraron que

dicho ayuno provocaba una disminución de la capacidad sin­

tética de polipétidos. Las actividades de los sistemas re­constituidos con ribosomas y fracciones sobrenadantes 5-150

indicaron que la disminución de la actividad dependía fun­

damentalementede las particulas ribosomales. Estos hechos

y la aparición de particulas 30-5 anormales en los perfilesde ribosomas obtenidos por centrifugación en gradientes de

sacarosa de los extractos de bacterias ayunadas ( Fig. 3 ),

sugirió la posibilidad de que la disminución de la activi­dad en los extractos de células cultivadas en ausencia de

putrescina podria deberse a algún daño en 1a subunidad ri­

bosomal mas pequeña.

Para confirmar esta hipótesis, se purifica­ron subunidades ribosomales a partir de extractos obtenidos

de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de pu­trescina ( Fig. 18 ). Posteriormente se realizaron una

505

0,6 P

305

3050

A260nm

0,2 ­

A A A L A 1

10 20 30 10 20 30

H3. 48."u!¿u rrí dp_d_e_:_.I‘_1_b_0¿ï_f.)f_"._21g. ¡.131 tr;._c;gn_t_r¿f¿g ­

numero de fracción

Figura 18.- Purif’ícaqió: f1}?__' ___

nacía};Espgjtjjgshriaypghrprza. Suspe'vqínñcr ¿Enríhnsnma: prnueüurimn 759Lsacterí°s áultívadns rn: medi.“ HMCy Er-ÍMDPrn sametínrorï a una nahtríf‘ugvcíór

en gradiefirm de 'zacarn'ïa 3"“ '21 Fi" c'e uhtcncr Pubuniclade'ï rizos-anales puri­Fícadart (ver detalle on mntrrízles- 2/ métodos). n: ÜGI‘Fílcorres arndierte aa _ i

extractos: de ‘tívcr‘ riennrrallmlnzz e: medir: MMO; perfil de extractos decu­bacterias Cultivarfas e.'. medi-J HHDF.

89

serie de experimentos de sintesis de polifenilalanina en

sistemas reconstituidos mezclandosubunidades purificadasobtenidas de ambosextractos; en todos los casos se utili­

só la mismafracción sobrenadante 5-150 proveniente de bac­

terias desarrolladas en presencia de putrescina. Los datos

de la Tabla II indican claramente que el nivel de actividad

esta dado por el tipo de subparticulas 30-5 utilizado, noocurriendo lo mismocon la subunidad 50-8. Cuando el siste­

ma incluye la subunidad 30-S_preparada de bacterias desarro­

lladas en presencia de putrescina la actividad es 3 a 5

veces mayor que cuando se utiliza partícula 30-5 de células

ayunadas y no depende del tipo de subunidad SO-S usado.

Estos resultados podrian deberse a una dife­

rencia en las concentraciones de poliaminas de los riboso­mas aislados en varias condiciones de cultivo. Para descar­

tar esta posibilidad ae midió la sintesis de polifenilala­nina en los mismossistemas descriptos, utilizando diferen­tes concentraciones de magnesio y en presencia o ausencia

de espermidina. La Fiq. 19 muestra que el agregado "in vitro"

de espermidina no modifica la eficiencia de los ribosomas

obtenidos de bacterias ayunadas o desarrolladas en presen­

cia de putrescina. En ambossistemas la espermidina causa

un desplazamiento similar del óptimo de magnesio, que dis­

minuye hasta aproximadamente 9 a 10 mM.

Los análisis por ultracentrifuqación engradientes de sacarosa de los ribosomas aislados a partir

de bacterias desarrolladas en presencia o ausencia de pu­

trescina, indicaron que 1a subnnidad ribcuzmal más pequeña

de células ayunadas daba picos asimétricos y que dicha

asimetría se acentuaba a medida que disminuia la concen­

tración de magnesio en los gradientes (Fig. 20-A-B-C).

De esta manera aparecía un pico doble correspondiente a

las subunidades 30-8 deficientes cuando el nivel de magne­

sio se hacia 0.1mM.A1 mismo tiempo los perfiles correspon­

dientes a ribOSOmasde bacterias desarrolladas en presencia

de putrescina (F19. 20 D-B-F ) no presentan ningún tipo de

asimetria aún a concentraciones muybajas de maqnesio.

Cuandose analizaron en gradientes de saca­

rosa las subunidades aisladas y purificadas obtenidas de

las bacterias cultivadas en los medios MMOy MHOPse pudo

observar que sólo 1a subunidad 30-5 de las células desarro­

lladas en ausencia de putrescina era anormal, presentando

nuevamente un doble pico (Fig. 21 B). Esta heterogeneidad

de 1a particula 30-S puede deberse a 1a presencia de subuní­

dades defectuosas o de precursores de las particulas madu­ras. Los perfiles correspondientes a todas las otras subuni­

dades fueron perfectamente simétricos ( Fig. 21 A-C-D),

91

Figura 19.- Efecto de lr: concentracion“_d_gl__l'f1uï_y_lg_pdiciónde eegermidirlgEtre la sintesis de polifenijiglggija en 91912231133libres ¿golea obtení­

afirtir de :u_l_tivo:;bocieíííngïpegar;o_1_lpg_g_s;__e_n_¿{931039ausemíade Eutrescina. La mezcla de rencciñn contiene particulas ribosomeles 3D Sy 50 S purificadas, en 113 cantidades. indicador- en materiales y metndor.Sbrenadante 5-150 ( 15 ug .de proteinns) obtenido de cultivos desarrollados:en presencia de putreecina y todos lor: reactivos necesarios para la sintesisde polifenilalanina (Materiales y Métodos). Simbolos: : o y o , correspondena la mezcla de subunidades rihosomleo de bacterias desarrolladas en presenciao ausencia de putrescinn respectivamente A y A corresponden a los mismosSistemes con la adición de 0.5 mMespernidína.

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ñ a ,4 f. ñ a4 J 2 l ‘f 3 2 o a; o 2 i

ml desde. el mcmsco

'í .'_I‘1_Ï_Ü.._-Purf‘ilc: atte-Wide: a diferentes cansantrnsiCr':.-' .2: .3“:nr:3ñr:1dicntcs a :ihnsnnnn aislados n partir de bastaría: charrollccas:n ¡nc-dit) .’-'..".0(,1, 8 y C) o medio F’JZÜP(D, E y F). A y S tu: sttqvícran a

5 nm Hg’*, B y E a 1 mH Mg++ y c y F a 0.1 m: ug*'.

93

- Figura 21-- amiga-12.22.c?.n.t.r_1f.q99céán9_n_ar39_1_ep_t_e_s_.erïáaasuíiaggygynidades rngpgma¿gs_pgg}f}cgggswggtgniggga partir de cultivcg_gggtg­¿LB___y__"°5a unadoig. 22531391355199.sugessnség 515.129.229.612? A v B son103 perfiles correspondientes a las subunidades SDS y 30 S respectivamenteaisladas de cultivos desarrollados en ausencia de putrescina; C y D corres­ponden a los perfiles de las nuburidrdes preparadas a partir de los cultivnñsuplementadns con putrencina.

0.4 ­

¿254nm

.LZ'Í'ÏÏ.)

M

..._L'a

"“"'=-<—O.

(J (r.

m.’ desde el mcmsco

Formación del compieig de iniciación usando comomensajeroel trinucleótido AUC.

Los extractos de bacterias cultivadas en

ausencia de putrescina mostraron la presencia de una sub­

unidad 30-5 deficiente. Ademáslos experimentos de cinética

de sintesis de polifonilalanina con los mismosextractos

indicaron que dicha reaCFión era especialmente lenta en los

primeros minutos ( Fiq. 15 ). Estos hechos nos hicieron

estudiar la iniciación de 1a sintesis proteica en los extrac­tos de ambostipos de bacterias.

Comose observa en 1a Tabla III la formación

del complejo de iniciación fue aproximadamente 3 a 6 veces

mayor con los ribosomas aislados de las bacterias desarro­

lladas en presencia de putrescina. Estos experimentos, juntocon los anteriores, demuestran que los bajos niveles intra­celulares de poliaminas provocan una deficiencia tanto es­tructural comofuncional de 1a subunidad ribosomal 30-5.

TABLA {Li

Formación del complejo de iniciación usando como RNAmel tripleteAUGy extractos o rihosomas bacterianos aislados de cultivosdesarrollados en presencia o ausencia de putrescina.

Medio de cultivo a Cantidad de Formación delpartir del cual se extracto utilizado complejode ini­aislaron las ciación F-metfracciones (uno 260 nm) 3H-tRNA-Rib-AUG

5-30 cpm

b l MMO l 1.300"P mov 1 7.100

Medio de cultivo a Cantidad de Formación del _partir del cual se ribosomas complejo de ini­aislaron los utilizados Ïiación F-ietribOSOmas (UDO 260 nm) C-tRNA-rib-AUG

cpm

[IMD l 312 59

Exp 2

MMO? 1 1052 300

Exp. l: La mezcla de reacción se realizó en dos etapas comose hadescripto en materiales y métodos, y contiene 1 UDO ' de los ex­tractos bacterianos 5-30 preincubados y los demás componentes nece­sarios para la formación del complejo de iniciación. Las incubarciones se realizaron a 34° C y 25° C en la primera y segunda etaparespectivamente. El blanco de la reacción (realizado en ausencia deAUC)fue restado en todos los casos.

Exp. 2: La mezcla de reacción contiene las cantidades indicadas deribosomas obtenidos a pa Sir de cultivos desarrollados en presencia oausencia de putrescina, C formilmetionil-tRNA y los demás componentesya descriptos en materiales y métodos. Las incubaciones se reali­zaron a 24° C durante 20 minutos. El blanco de la reacción (reali­zado en ausencia de AUC)fue restado en todos los casos.

y?)

Las particulas ríbosomales 30-5 de ambostipos de bacterias

desarrolladas en medios MMOy MMOPse sometieron a un tra­

tamiento con SDSpara liberar el RNAribosomal. Los produc­

tos de estas reacciones se analizaron por ultracentrifuga­

ción en gradiente de sacarosa, y se pudo observar que el

RNAcorrespondiente a la subunidad 30-S de bacterias culti­

vadas en ausencia de putrescina presentaba un perfil total­

mente difuso (Fig. 228). Este resultado puede indicar una

alteración de la estructura secundaria o una degradacióndel RNAribosoma].

En el caso de la subunidad 30-5 de bacterias

desarrolladas en medio MMOPno se observa este fenómeno,

apareciendo un pico nítido que corresponde a1 RNAribosomal

16-5 ( Píg. 22 o).

¿19922.22- - Bailey.riel-BE¿A_.r.1.h.o.39mal0.0.rr_e_s_pp.n_d.1_enie_¿lasflpenmyi911212199282_92t?24929 peris}: .de. .c.u_1_'_c._1y.r.1.9__.d.252r.r9315999_33_mesengegausencia gg_pgliam}gag. Subunidadenpurificadaa preparadas de bacteriascultivadas an presencia o ausencia de putreacina, ae trataron con sodiododecil sulfato al 2 % comose ha descripto en materiales y métodos; lasmezclas obtenidas que contiEren el RNAliberada ne analizaron por centri­Fugacion en gradientes de aacarosa. A y B corresponden al RNAobtenidoa partir de nubunidades 50 S y 30 2 respectivamente, de los Cultivosdesarrollados en medio MMO;C y D corresponden al RNAobtenido de subuni­dades 50 S y 3D S respectivamente, de cultivos suplementadoa con putres­cine.

97

4254 nm

A.235165B.235165¿¿34

11lllL

432í432

mldésdcelrncmsco

DISCUSION

98

=Laspoliaminas son sustancias que desempeñan funciones de vital

importancia en el metabolismocelular. Intervienen en múltiples

reacciones que forman parte de los procesos biosintéticos de ma­

cromoléculas tales como DNA,RNAy proteinas, asi como también

en la estabilización de estructuras celulares tales comomembra­

nas, ribosomas, etc. Sin embargo, aún no se conoce si alguna

de estas funciones es primaria y las otras secundarias, derivadas

de ella,o si los efectos mencionadoston independientes entre si.

El aislamiento de mutantes de Escherichia coli que requieren putres­

cine o espermidina para crecer normalmente permite estudiar un

sistema en el cual se puede analizar, tanto "in vivo" como"in

vitro', el efecto del agregado de poliaminas a cultivos previa­

mente sometidos a un ayuno de estas sustancias. De esta manera

hemostratado de localizar el efecto biológico causado por la

deficiencia de poliaminas en las celulas bacterianas.

Los resultados obtenidos "in vivo" (Fig. 10) para la sintesis

de RNAy de proteinas indican que el agregado de putrescina a

cultivos previamente sometidos a un ayuno de esta sustancia, pro­

voca una estimulación inmediata de la sintesis proteica (medida

por la incorporación de leucina radiactiva a polipéptidos), aún

cuando la velocidad de crecimiento se mantiene inalterada duran­

te l a 2 horas. Estos resultados no se observan al analizar la

sintesis de RNA(incorporación de uracilo radiactivo), que se

encuentra disminuida en los primeros 30 minutos posteriores al

agregado de putrescina; después de este periodo sobreviene una

estimulación (Fig. 10). El tiempo de latencia que se observa

antes de un real aumento en la sintesis del RNAprovocado por

el agregado de putrescina al medio de cultivo es de dificil in­

terpretación, ya que para amboscultivos (en ausencia o presen­

cia de putrescina) el transporte del precursor radiactivo es i­

déntico (Fig. 12). Por otra parte. se ha demostrado (129 ) que

el agregado de polisminas a cultivos bacterianas en crecimiento

puede producir un incremento del "pool" endógeno de uracilo; es­

te hecho de expansión del 'pool' podria explicar la disminución

de la incorporación por un fenómenode dilución del precursor

radiactivo. Los resultados mencionadossugieren que el efecto

estimulatorio sobre la sintesis de proteinas producido por el

agregado de putrescina, es independiente de la sintesis del RNA

ya que ésta no parece aumentar en el periodo inmediatamente pos­

terior al agregado de poliaminss. Cuandose realizaron experi­

mentos similares en presencia de rifampicina se observó que el

agregado de putrescina en presencia del antibiótico provocaba

una estimulación inmediata de la sintesis proteica, aún cuando

la sintesis del RNAse habia inhibido más del 90%, confirmandcse

de esta manera que el efecto estimulante que ejercen las polis­

minas sobre la sintesis proteico es independiente de la sintesis

del RNA. Si se analizan detalladamente los experimentos reali­

zados en presencia de rifampicina se observa que la-sintesis

IDO

proteica se detiene después de un periodo relativamente largo

(Fig. ll B). Este hecho podria indicar que existe alguna demo­

ra para que el antibiótico pueda ejercer su acción o bien que

nuestra cepa bacteriana no es del todo sensible a la droga. Aun­

que se considere cualquiera de estas posibilidades los resulta­

dos indican que en los cultivos desarrollados en presencia de

putrescina la rifampicina produce una mayor inhibición de la sin­

tesis del RNAy simultáneamente aparece aumentada la sintesis

proteica.

Los estudios realizados sobre la sintesis de polipéptidos uti­

lizando sistemas libres de células con mensajeros naturales o

artificiales (Figs. 13 yl7) han permitido analizar el proceso

de traducción de una manera completamente independiente de la

transcripción. Asi se pudo demostrar una mayor actividad en

las fracciones (8-30) aisladas de las bacterias cultivadas en

presencia de poliamina. En todos estos experimentos se utili­

zaron iguales cantidades de RNAexógeno para la sintesis poli­

peptidica, y los resultados confirmaron los obtenidos en los

experimentos "in vivo". Cuandose analizaron las cinéticas de

incorporación de Fenilalanina se encontró que ambosextractos

presentaban un comportamiento diferente. En la fracción 5-30

obtenida de bacterias desarrolladas en ausencia de putrescina

la sintesis de polipéptidos se iniciaba con un retraso en los

primeros minutos de 1a reacción y luego se detenia rápidamente.

Amboaefectos no fueron observados en los extractos de bacterias

cultivadas en presencia de poliaminas e indicarian posibles al­

teraciones tanto a nivel de la iniciación comode la elongación

de la sintesis proteica. La diferencia de actividad para ambos

extractos no se debe a un distinto nivel en la activación de los

aminoácidos (Fig 16). Por lo tanto debe reflejar alguna modifi­

cación producida en los ribosomas y/o factores solubles por los

bajos niveles intracelulares de poliaminas. Los valores obteni­

dos para la sintesis de polipéptidos en sistemas reconstituidos

con ribosomas y fracciones sobrenadantes 5-150 demostraron que

la diferencia de actividad provocada por la presencia o ausencia

de poliamina en los medios de cultivos, se debe a algun daño que

se localiza a nivel de las particulas y/o de los factores solu­

bles unidos a ellas (Tabla I). Los valores de sintesis de poli­

fenilalanina en sistemas en los que se utilizaron mezclas de su­

bunidades purificadas que provenían de cultivos bacterianas de­

sarrollados en presencia o ausencia de putrescina, indicaron cla­

ramente que la disminución de la actividad de sintesis proteica

se debia a una diferencia localizada a nivel de la subunidad 30-8

aislada de los cultivos sometidos a un ayuno de poliaminas (Ta­

bla II). Las particulas 50-5 obtenidas de las mismascélulas

tenian una capacidad sintética normal. Estos experimentos y los

de formación del complejo de iniciación ( Fmet- tRNA- ribosoma )

( Tabla III ) demostraron que en ausencia de poliaminas se pro­

102

ducen subunidades 30-5 funcionalmente deficientes. Estas subuni­

dades también presentan anormalidades estructurales que se han

podido detectar por estudios de sedimentación en gradientes de

sacarosa. Cuandolos extractos de bacterias cultivadas en pre­

sencia o ausencia de putrescina se sometieron a ultracentrifuga­

ción en gradientes de sacarosa que contenían diversas concentra­

ciones de magnesio se pudo observar que a bajos niveles de este

cstión divalente la subunidad ribosomal pequeña aislada de las

células desarrolladas en medio MMOaparecia como un pico asimé­

trico o doble en los perfiles ribosomales (Fig. 20). Estos mis­

mosresultados se obtuvieron a1 analizar por centrifugación en

gradientes de sacarosa cada una de las subunidades ribosomales

purificadas (Fig. 21). E1 RNAribosomal de las particulas 30-8

defectuosas también mostró anormalidades al ser analizado en

gradientes de sacarosa. Los perfiles correspondientes eran di­

Fusos, lo que indicaba que el RNA16-5 estaba parcialmente degra­

dado o tenia alterada su estructura secundaria. Estos resultados

no se observaron con los RNAaislados de las subunidades 30-8

puras obtenidas a partir de los cultivos desarrollados en presen­

cia de putrescina. Los estudios descriptos parecen indicar que

las poliaminas intervienen directamente en el ensamblado de las

subunidades ribosomales determinando posiblemente la correcta

interacción del RNAribosomal y las proteinas. Asimismoestabi­

lizarian la estructura secundaria del RNAribosomal, lo que con­

tribuiría a protegerlo de la acción ds las nucleasas.

En muchoslaboratorios se han realizado gran cantidad de experi­

mentos con el fin de lograr el ensamblado ds las subunidades ri­

bosomales a partir de sus componentes estructurales (RNAy pro­

teínas). Nomura y col. ( 130 ) incubaron a LU OCdurante 30

minutos una mezcla de reacción que contenía RNAribosomal 16-5

y las 21 proteínas purificadas de la subunidad 30-5. En estas

condiciones lograron 1a reconstrucción de esta partícula riboso­

mal, que resultó activa en una serie de reacciones tales como

1a síntesis proteica con mensajerosartificiales y naturales,

la unión del aminoacil-tRNA.etc. Hopylov y col. ( 131 )demos­

traron que la estructura secundaria del RNAribosomal cumple una

función decisiva en el ensambladode las partículas ribosomales,

pues de ella depende que se produzca o no la unión de las proteí­

nas al RNA. Nierhaus y col. ( 132 ) lograron reconstruir la

partícula ribosomal 50-5 utilizando para esto las dos especies

del RNA( 23 S y S S ) y las 3h proteínas estructurales: esta

reacción se realizó en dos etapas: durante la primers de ellas

se incuba la mezcla 20 minutos a AUDCy en ls segunda se eleva

la temperatura a 50 DCdurante 90 minutos en presencia de altas

concentraciones de magnesio. Los experimentos realizados por

Hosoksua y col. ( 133 ) en la reconstrucción de la subunidad

50-5 demostraron el papel Fundamental que pueden desempeñar las

poliaminas en el ensamblado de dicha subunidad. A diferEncia

10h

de los experimentos realizados por Nierhaus estos investigadores

lograron el rearmado de la subunidad 50-8 incubando a AUQCen

una sola etapa a partir de una mezcla de reacción que contenía

todos los componentesestructurales y concentraciones óptimas

de cationes inorgánicos. En estas condiciones más cercanas a

las fisiológicas, el agregado de poliaminas producía particulas

ribonucleoproteicas de coeficiente de sedimentación similar s1

de las subunidades 50-5 purificadas; por el contrario la Falta

de poliaminas en este sistema llevó invariablemente a la Forma­

ción de particulas de bajo coeficiente de sedimentación. En to­

dos los estudios mencionados, asi comotambién en los descriptos

en este trabajo se destaca el papel fundamental que desempeña

la estructura secundaria del RNAen el ensamblado de las subuni­

dades ribosomales. Posiblemente en los experimentos "in vitro"

la temperatura elevada permite que el RNAadopte la configuración

adecuada para la reacción del ensamblado de las subunidades, mien­

tras que "in vivo" cumplirisn la mismafunción las concentracio­

nes de cationes inorgánicos y de poliaminas. Por lo tanto el

ayuno de estas sustancias provoca en las bacterias alteraciones

de los mecanismos biosintéticos y/o de ensamblado de 1a subunidad

30-5, de tal manera que se producen particulas ribosomales anor­

males.

En bacterias normales los ribosomas que en un instante dado no

participan de la sinÏÉsis proteica se encuentran en equilibrio

con lao subunidades 30-5 y 50-5 libres. Este equilibrio está

fuertemente desplazado hacia las particulas 70-5 debido posible­

mente a la gran afinidad mutua que poseen las dos subunidades

ribosomales. Cuandolas necesidades fisiológicas determinan un

mayor flujo de subunidades a los agregados poliribosómicos para

aumentar la sintesis proteica, 1a acción del factor disociante

permite la utilización de los monómerosribosomalea desplazando

el equilibrio hacia las subunidades.

Por otra parte alguros estudios realizados en B. stearothermophilus

( ao ) permitieron aislar un factor asociante de subunidades ri­

boaomalea que contiene poliaminas comocomponentes activos. Este

hecho, que confirma las ya conocidas propiedades asociantes de

las poliaminas ( 105), sugirió la posibilidad de que estos catio­

nes orgánicos participen en 1a regulación del equilibrio

'70523081" 505.

Las investigaciones descriptas en este trabajo. utilizando cepas

bacterianas deficientes en la biosintesis de poliaminas permitie­

ron confirmar esta hipótesis. Cuandoestas bacterias son someti­

das a un ayuno de poliaminas, el nivel intracelular de estas sus­

tancias disminuye hasta valores muybajos, y no sólo aparecen

particulas 30 S deficientes, sino que también disminuye notable­

mente la afinidad mutua de las subunidades ribosomales por lo

que el equilibrio entre monómeroay subparticulas se desplaza

hacia la disociación. Cuandose agrega poliaminas a los cultivos

de las bacterias deficientes se provoca un cambio rápido de la

distribución ribosomal ( Fig. 3 ) produciéndose un aumento en

la cantidad de monómeros70 S y una normalización de las par­

ticulas 30 S. El perfil ribosomal de las bacterias deficientes

cuyos cultivos han sido suplementados con putrescina, se vuelve

prácticamente idéntico a la distribución obtenida en la cepa

silvestre de E.coli. Por otra parte cuando los ribosomas obte­

nidos de cultivos desarrollados en ausencia de putrescina se

dializan contra soluciones "buffer" que contienen una concentra­

ción fisiológica de espermidina, parte de las subunidades se

asocian y se observa una distribución de ribosomas similar a la

obtenida de bacterias cultivadas en presencia de polisminas

(Fig. 6). Ademáslos ribosomas sometidos al tratamiento de diá­

lisis se vuelven más resistentes a la disminución de los niveles

de Mg++ (Figs. 7 y 9). La alteración del perfil ribosomal pro­

ducido por el ayuno de putrescina es especifica de esta deficien­

cia, comolo demuestran los experimentos en los que se elimina

de los medios de cultivo la glucosa o la fuente de nitrógeno,

manteniendo en ambos casos la presencia de poliamina.

Enestas condiciones se obtiene los perfiles característicos del

medio MMÜPcompleto ( Fig. 6 ).

Experimentos recientes han demostrado que ambas subunidades ri­

bosomales son capaces de unir espermidina; sin embargo sólo una

pequeña cantidad de la políamina unida a la partícula 3D S es

activa en la asociación de las subunidades (H. Garcia-Patrona

y I. D. Algranati). De acuerdo con estos resultados se ha pos­

tulado la existencia de dos sitios de unión para la espermidina

en la particula 30 5. E1 sitio A correspondería a 1a poliamina

que es activa en la asociación, y el sitio B uniria espermidina

que no interviene en la asociación. La partícula 50 S presenta

sitios de unión del tipo B. Es factible suponer que el agrega­

do de poliaminas a un cultivo de bacterias deficientes,previa­

mente sometidas a un ayuno, aumenta rápidamente los niveles en­

dógenos de estas sustancias, permitiendo un correcto ensamblado

de las particulas ribosomales y la saturación de los sitios es­

pecificos de unión. Esto lleva a la asociación de subunidades

y al restablecimiento de un equilibrio normal entre monómeros

70 S y subparticulas ribosomales.

197

CONCLUSIONES

Se han postulado múltiples funciones biológicas para las polia­

minas. Los resultados aqui presentados demuestran que, además

de las funciones ya conocidas ( 5 ), estas sustancias ejercen

un efecto directo sobre la sintesis proteica, que es indepen­

diente de cualquier otro efecto que pueda ocurrir a nivel de la

transcripción de los RNAmensajeros. La acción de las poliami­

nao en el proceso de traducción está íntimamente vinculado con

el ensambladoy/o biosintesis de las subunidades ribosomales

(en especial 1a partícula 30 S).

En las cepas bacterianas auxótrofas para poliaminas, los bajos

niveles de putrescina y espermidina producen la aparición de

aubunidades 30 S estructural y Funcionalmente anormales, y el

desplazamiento hacia 1a disociación del equilibrio existente en­

tre monómeros70 S y subparticulas ribosómicas.

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