El poder de la leche materna:

Lactoferrina en recién nacidos

Dra. Theresa Ochoa

Profesor Auxiliar de Pediatria

Instituto de Medicina Tropical

8.1 millones de muertes

anuales en < 5 años

Huicho, et al. 2006

CAUSAS DE MORTALIDAD EN MENORES DE 5 AÑOS EN EL PERU

Lactancia Materna

La lactancia materna ha

sido identificada como la

intervencion más efectiva

para la protección de niños

menores de 5 años contra

diarrea y todas las causas

de mortalidad.

Jones et al. Lancet, 2003

Factores protectores de la leche materna

Previenen la adquisición de infección y

enfermedad:

• Alteran el mecanismo de adherencia de

los enteropatógenos.

• Regulan la respuesta inflamatoria contra

al patógeno.

• Estimulan la maduración del tracto

gastrointestinal y del sistema inmune del

infante.

Morrow & Range, 2004

Factores protectores - leche materna

• Inmunológicos:

– IgA secretoria (sIgA)

– Citokinas

• No-inmunológicos:

– Oligosacaridos

– Glicoconjugados

– MucinasMorrow & Rangel. Sem Pediatr Infect Dis, 2004

Anticuerpos protectores en leche materna

• Anticuerpos (IgA) contra proteínas del

sistema secretor tipo III de:

– Salmonella

– Shigella

– E. coli enteropatogénica (EPEC)

• 76 muestras de calostro de madres del

Hospital Nacional Cayetano Heredia

• Presencia de anticuerpos en 40-98% de

muestrasDurand D, 2010. En prensa

Lactoferrina

• Proteina ligadora de fierro

• Presente en:

– Secreciones mucosas

(leche, lágrimas, saliva)

– Neutrófilos

• Actividad: antibacteriana,

antiviral, anti-inflamatoria,

inmunomoduladora, etc.

Farnaud & Evans. Molec Inmunol, 2003

Lactoferrina - efecto antibacteriano

Efecto en bacterias Gram-negativas:

1. Quela fierro, esencial para el crecimiento de las bacterias.

2. Se une al Lípido A del lipopolisacaridos (LPS) en la superficie de la bacteria y altera la membrana celular.

LACTOFERRINA

Estudios Básicos

Shigella - SalmonellaEPEC - STECEAEC - ETEC

Estudios Clínicos

Piloto lactoferrinPrevención de diarreaPrevención de sepsis

ESTUDIOS PREVIOS

Lactoferrina - EPEC

Control (DMEM/HEPES) Lactoferrina

Disminuye la polimerización de activa

inducida por EPEC en células HEp2

Ochoa et al, IAI 2003

1

A B C

LF 0.01 mg/mL Control

Lactoferrina – EAEC

Ochoa et al. BCB, 2006

Inhibe la adherencia de EAEC a células HEp-2

Inhibe la formación de biofilms

Gomez et al, 2001 y 2002

Lactoferrina – Shigella

Control Lactoferrina

Proteje contra inflamación intestinal por S.

flexneri en conejos

Disminuye la invasión de S. flexneri en tejidos

celulares (HeLa)

Efecto de lactoferrina en infección por Salmonella typhimurium en ratonesSusan Mosquito, Tesis Bachiller Biologia UPCH - 2009

17.0

17.5

18.0

18.5

19.0

19.5

20.0

20.5

21.0

d1 d2 d3 d4 d5 d6 d7

Tiempo (días)

Pe

so

s c

orp

ora

les

(g

)

Control

Lactoferrina

c,dc,d

dd d,e

a,b

aP<0.05 vs. d1; bP<0.05 vs. d2; cP<0.05 vs. d3; dP<0.05 vs. d4; eP<0.05 vs. d5.

Lactoferrina Control

Efecto de lactoferrina en Salmonella

Higado - Lactoferrina Higado - Control

Colon - Lactoferrina Colon - Control

.05

.1.1

5.2

Weig

ht / le

ng

ht (g

/cm

)

1 2 3

**

CT LF PBS(n=6) (n=6) (n=2) **p<0.01

Xth International Conference on Lactoferrin Structure, Function & Applications

May 8-12 th , Mazatlán Sin., México

Bovine lactoferrin decreases cholera-toxin-induced

intestinal fluid accumulation in miceFulton P. Rivera1, Sandra Bezada2, Anicia M. Medina1, María Bernal3,

Roberto Valencia1, Rina Meza3, Ryan C. Maves4, Theresa J. Ochoa1,5

ELF-018 ELF-020 ELF-021 ELF-022ELF-019

DOSIS PBS CT1.5µg CT1.5µg CT 1.5µg CT 1.5µg +

LF10mg/ml

CT 1.5µg +

LF10mg/ml

CT 1.5µg +

LF10mg/ml

Peso 0.24 1.51 0.62 0.79 0.26 0.28 0.24Tamaño 3.8 5.0 3.8 4.2 3.7 4.6 3.7Ratio

(g/cm) 0.06 0.30 0.16 0.19 0.07 0.06 0.06

ELF-024ELF-023

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

PBS CT 1.5µg CT 1.5µg CT 1.5µg CT 1.5µg + LF10mg/ml

CT 1.5µg + LF10mg/ml

CT 1.5µg + LF10mg/ml

Flu

id a

ccum

ula

tion

ETEC

infection

(n=4) (n=12) (n=12)

Efecto de la lactoferrina

bovina en la

acumulación de fluidos

causado por toxina

colérica (1.5ug)

Ratones: BALB/c

Edad: 6-7 semanas

Peso: ~21g

Promedio del ratio por

cada grupo

0.06

0.18

0.07

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

PBS CT 1.5µg CT 1.5µg + LF10mg/ml

mean ± SD: 0.06 ± 0.01 0.18 ± 0.06 0.07 ± 0.02

Nº strains MIC PE MIC PE + bLF MIC CRO MIC CRO + bLF

6 8 8 2 2

(4-8) (1-4) (1-4)

28 4 4 2 2

(2-4) (2-4) (2-4)

1 4 2 1 0.25

1 4 1 1 0.5

2 4 0.5 1 1

3 4 0.25 2 2

(0,125-0,25) (0,5-2) (0,5-2)

2 4 0.06 2 2

(0,03-0,06) (1-2) (1-2)

1 4 0.03 1 <0,03

3 4 <0,015 2 2

(1-2) (1-2)

7 2 2 1 1

1 2 2 1 <0,015

1 2 0.5 1 1

1 2 0.5 0.5 <0,015

1 2 0.125 1 0.06

2 2 <0,015 2 2

(1-2) (1-2)

3 2 <0,015 2 <0,015

(1-2)

63 Total Strains

Effect of bovine lactoferrin (bLf) in Streptococcus pneumoniae growth

bLf reduces the MIC values for penicillin and

ceftriaxone in some highly and intermediate

resistant strains (Table 1).

Table 1. MIC values (in mg/mL) of penicillin

(PE) and ceftriaxone (CRO) of the 63 tested

strains in presence and absence of bLf

(10mg/mL)

* MIC reduction because of bLf was definied as reduction in 2

or more folds in MIC value without bLF.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Lf 0 Lf 1 Lf 10

Fig. 1 Growth curves of Streptococcus pneumoniae

with and without bLf (1 and 10mg/mL)

Susan Mosquito, Kelly Farias, Cristian Rios

Acta pediátrica, 2007

Clin Infect Dis, 2008

-0.60

-0.50

-0.40

-0.30

-0.20

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Month of Follow-up

HF

A c

han

ge (

z)

Estudio randomizado de lactoferrina para

prevención de diarrea en niños

• Objetivo 1: Determinar el efecto de la

suplementación nutricional con lactoferrina bovina

en la prevención de diarrea en niños de 12 a 18

meses de edad.

• Objetivo 2: Determinar el efecto de la

suplementación nutricional con lactoferrina en el

crecimiento.

NATIONAL INSTITUTE OF CHILD HEALTH AND HUMAN DEVELOPMENT

Randomized Controlled Trial: NCT00560222

Equipo de trabajo de campo

1 Coordinadora (Enf), 4

supervisoras (Enf), 1 técnica de

enfermería, 10 trabajadoras de

campo, 4 encuestadoras, 1

asistente y 4 médicos pediatras.

Enrolamiento:

Ermitaño Alto

Ermitaño Bajo

Tahuantinsuyo Alto

Independencia

Informed consent

process:

Several home visits to

explain the study to the

mother and to the father.

Signature of the consent

form by both parents

Las trabajadoras de campo visitan a los niños 2 veces al día para dar suplemento

Evaluación médica control

mensual por pediatra

Control de peso y talla mensual

Permanent training of field workers:

Diarrhea

Nutrition

Health promotion

Research ethics

Multiplex Real Time PCR

Diarrheagenic E. coli

Mac Conkey plate 5 Lac+ colonies selected

Stool studies:- Routine stool culture: Shigella, Salmonella, Campylobacter and Vibrio- Fecal leukocytes- Ova & Parasites- PCR for E. coli- ELISA: rotavirus- IC: adenovirus- PCR for norovirus

EAEC

EPEC

ETEC

STEC

EIEC

DAEC

Temperature, Celsius

Guion, C. et al., 2008

0

2

4

6

8

10

12

14

Campylobacter EPEC ETEC EAEC Shigella Giardia Rotavirus Adenovirus

Diarrhea No-diarrhea

Patógenos aislados en muestras de diarrea y control en niños <24m en el Cono Norte –Lima (2008-2010)

Diarrhea (n=1,056)

No-diarrhea (n=2,055)

28

4049

32

10

30 26

40 4350

4334

27 23 19

30 34 3238

43 43 39

58

3830

35

106116

60 57 55 5343 41

27

0

20

40

60

80

100

120

140

Muestras analizadas* Rotavirus positivo

Frencuencia de rotavirus en muestras de diarrea en la comunidad

en niños de 12 a 24 meses de edad en el Cono Norte de Lima

(2008-2011)

• Total de muestras de diarrea analizadas: 1,471

• Frecuencia de rotavirus: 4.89%

• Estacionalidad: pico en los meses de Mayo-Junio-Julio

Nro. casa visitadas:

40,214

Nro. niños de 12-18m: 4,317

•Con lactancia materna: 3,344

(77.5%)

•Con criterio de exclusión: 210

Nro. niños elegibles:

763

Nro. niños enrolados

430 (31 Abr)

Terminaron: 277 Seguimiento actual: 101

• Retirados: 52 (12.1%)

•No aceptan participar: 244

(32%)

•Pendiente respuesta: 37

•Firman CI y no regresan: 52

Estudio randomizado, controlado de lactoferrina bovina para la prevención de diarrea en niños -

Flowchart (31 Abr 2010)

Resumen de

avances a

Abril del 2010

33

Mortalidad Neonatal Es un importante problema de salud pública

global.

Si no se trabaja en las causas de mortalidad

neonatal no se logrará la meta 4 del milenio:

reducir la moratlidad en dos tercios para el 2015.

(Lawn, 2005, 2008; Qazi, 2009)

“Estudio piloto: lactoferrina para prevención

de sepsis neonatal”

• Aprox. 10 millones de niños menores de 5 años

mueren anualmente en países en vías de

desarrollo; 40% debido a causas neonatales

(Bryce, 2005).

• En el Perú, el 62% de las muertes infantiles

ocurren en el primer mes de vida (ENDES 2005-

2007).

• Se estima que esta mortalidad neonatal es

mayor en las áreas rurales de los Andes y de la

selva Peruana.

4 millones de muertes neonatales

Estudio piloto: lactoferrina para la

prevención de sepsis neonatal

Investigadores:

UPCH: Drs. Ochoa, Chea, Hiucho,

Carcamo

Cayetano: Drs. Zegarra, Bellomo,

Guillen, Rospigliosi

Almenara: Dr. Llanos

Sabogal: Dr. Cam

Fincanciamiento:

Grand Challenges Explorations

Efecto de la lactoferrina en sepsis neonatal

Estudio Italiano (Manzoni, 2009)

al azar a 472 neonatos

lactoferrina

bovina (LF)

LF más el probiótico

Lactobacillus rhamnosus

GG (LF+LGG)

placebo 30 días

incidencia

de sepsis5.9% 4.6% 17.3%

muerte

por sepsis0% 0.7% 4.8%

redujo

significativamente

la NEC

redujo el umbral para

la retinopatía de

prematuridad

No se reportó ningún efecto adverso

Conclusión: Los suplementos con LF, ya sean solos o con LGG, reducen la incidencia de sepsis tardía

en neonatos con bajo peso al nacer.

Efecto de la lactoferrina en sepsis neonatal

• 472 neonatos < 1500 g reciberon vía oral por 30 días:

– lactoferrina bovina (LF)

– LF + Lactobacillus rhamnosus GG (LF+LGG)

– ó placebo

• La incidencia de sepsis fue significativamente más baja

en los grupos LF y LF + LGG comparado con el grupo

que recibió placebo (5.9% y 4.6% vs. 17.3%).

• La muerte por sepsis también se redujo en ambos

tratamientos en los dos grupos comparados con los del

placebo (0% y 0.7% vs. 4.8%).

Manzoni, 2009

Objetivos e hipótesis del estudio

• Objetivo 1. Evaluaremos la hipótesis de que la

suplementación oral de lactoferrina bovina

previene el primer episodio de sepsis tardía en el

primer mes de vida.

• Objetivo 2. Evaluaremos la hipótesis de que la

suplementación oral de lactoferrina bovina disminuye la

incidencia de sepsis por bacterias Gram-positivas, Gram-

negativas y hongos, así como la incidencia de neumonía,

diarrea y la mortalidad en general, durante el primer mes de

vida.

CRITERIOS DE ELEGIBILIDAD

Criterio de inclusión:

• Neonatos con un peso al nacer entre 500g

y 2500g.

• Neonatos nacidos en, o referidos a las

unidades de cuidados intensivos o

intermedios de los hospitales

participantes, en las primeras 72 horas de

vida.

CRITERIOS DE ELEGIBILIDAD

Criterios de exclusión:

• Neonatos con problemas subyacentes que impidan la vía

oral.

• Neonatos con condiciones subyacentes que afecte

profundamente su crecimiento y desarrollo (anormalidades

cromosomales, anomalías estructurales del cerebro,

anormalidades congénitas severas).

• Neonatos que tienen una historia familiar de alergia a la leche

de vaca.

• Cualquier neonato que de acuerdo a los criterios del

investigador no tiene posibilidad de completar las visitas de

seguimiento del estudio (paciente que antes del mes de edad

regrese a provincia).

• Neonatos cuyos padres no quieran participar.

Intervención

• Lactoferrina bovina (200mg/Kg/día, divido en 3

tomas vía ora). Aunque la lactoferrina humana y

bovina no son idénticas, su actividad biológica es

similar.

• Como placebo se usará un azúcar inerte, la

maltodextrina (200mg/Kg/día, divido en 3 tomas

vía oral).

• La lactoferrina o el placebo se administrará

diariamente (3 veces/día), diluido en leche o

dextrosa (max concentración 25mg/mL) por 1 mes.

Número de pacientes

500 – 2500gr:

330

Exclusión: 51

1.- No VO: 0

2.- Malformaciones/

Anormalidades:13

3.- Hx de Alergias: 0

4.- Dificultad de seguimiento: 9

5.- Rechazo: 29

Número de pacientes

elegibles:

279

Enrolados:

190

Completaron 1 mes de

tratamiento:

152

Actualmente Activos:

18

• Retirados: 11

1.- Falla en cumplimiento: 1

2.- Solicitud de padres: 4

3.- Pérdida de seguimiento: 6

(transferencia)

• Fallecidos: 10

No enrolados (Total: 89)

1.- Madre soltera: 4

2.- Madre adolescente: 1

3.- Falleció antes de 72h: 8

4.- Pasaron más de 72h: 67

5.- Alta antes de 72h: 8

6.- Otros: 1**Madre en CIQ (1)

ESTUDIO PILOTO: LACTOFERRINA PARA LA PREVENCIÓN DE SEPSIS NEONATAL

Flowchart (08 Agosto 2011)

De alta:

10

Hospitalizados:

8

Completaron 3 meses de

seguimiento:

97

TABLA PACIENTES ENROLADOS POR PESO

Peso Cayetano Almenara Sabogal Total Enrolados

500-1000 1 5 12 18

1000-1500 9 23 30 62

1500-2000 15 19 45 79

2000-2500 3 5 23 31

Total 28 52 110 190

Relevancia• Mejorar la salud de los infantes en esta etapa

crítica, al proporcionar una “protección adicional”

con la ingesta de una de las principales proteínas

protectoras de la leche.

Siguiente fase del proyecto: estudio

comunitario de intervención en

zonas rurales de los Andes del

Perú para la prevención de

infecciones neonatales, neumonía

y diarrea en niños, acoplado a

intervenciones comunitarias

maternas y neonatales

Resumen

• Principales causas de mortalidad infantil:

– Enfermedades neonatales

– Neumonía

– Diarrea

– Desnutrición

• Intervenciones de bajo costo pueden

salvar muchas vidas: lactancia materna

• La lactoferrina es una de las proteínas

más importantes en la leche materna.

Agradecimientos

Laboratorio de Enfermedades Entéricas y

Nutrición (LEEN) Instituto de Medicina

Tropical - UPCH

Dra. Ochoa, Dr. Chea, Dr. Baiocchi, Dr.

Campos, Lic. Gladys Valdiviezo, Lic.

Giulinana Ponte, Lic. Yenny León, Lic. Iris

Pecho, Dr. Tom Cleary

DSMB

Equipo coordinación NEOLACTO

Lactoferrin trial research team