Laboratorio en alergia inmunología

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Laboratorio en Alergia- Inmunología Dr. Tomás Velarde Domínguez Alergia e Inmunología Clínica Medicina Interna Octubre 2014.

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Page 1: Laboratorio en alergia inmunología

Laboratorio en

Alergia-Inmunología

Dr. Tomás Velarde DomínguezAlergia e Inmunología Clínica

Medicina Interna

Octubre 2014.

Page 2: Laboratorio en alergia inmunología

Los determinantes de la salud

11%

49%

19%

27%

Contribución potencial a la reducción de la

mortalidad

Afectación actual de los gastos para la salud en USA

90%

8%

SISTEMA SANITARIO

ESTILO DE VIDA

AMBIENTE

BIOLOGÍA HUMANA

DEVER GEA An Epidemiological Model for Health Policy Analysis, 1976

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CLAVES DE LA MEDICINA PERSONALIZADA

La persona adecuada

Determinar si una persona puede beneficiarse realmente de una prueba mejora el manejo de la enfermedad y permite reducir los costos asociados al proceso sanitario.

El exámen adecuado

Prescribir un exámen que no va a aportar valor al paciente supone dilatar los tiempos de la enfermedad e inducir a confusión al médico, con el consiguiente incremento de los costos sanitarios.

√ √

La interpretación adecuada

Una correcta y completa información permite sacar el máximo rendimiento al exámen y ayudar al médico con un elemento diagnóstico de gran valor al decidir cual es el tratamiento mejor de la enfermedad.

Page 4: Laboratorio en alergia inmunología

Importancia del laboratorio en el área de Alergia e Inmunología

Papel primordial que se incrementa día a día.

Pacientes hospitalizados y ambulatorios.

Mejor conocimiento de la patogénesis.

Biomarcadores diagnósticos, pronósticos y terapéuticos.

Incrementan procedimientos diagnósticos de rutina.

“Estándares de oro”.

MEDICINA PERSONALIZADA.

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¿EL LABORATORIO ES UN AUXILIAR REAL?

FENOTIPOS ENDOTIPOS

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Conceptos:

SensibilidadEspecificidadValor predictivo

positivoValor predictivo

negativo

Page 7: Laboratorio en alergia inmunología

Pacientes enfermos

Pacientes sanos

Prueba 1

Pacientes enfermos

Pacientes sanos

Sensibilidad alta

Especificidad alta

Prueba 2Pacientes todos enfermos

Falsamenteasignados

Sensibilidad alta

Especificidad baja

Pacientes enfermos

Prueba 3

Pacientes sanos

Sensibilidad bajaFalsamenteasignados Especificidad alta

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Prueba Enfermo Sano

Positiva A B

Negativa C D

Total enfermosA+C

Total sanosB+D

PRESENCIA DE ENFERMEDAD

SENSIBILIDAD = A / A+C

ESPECIFICIDAD= D / B+D

Page 9: Laboratorio en alergia inmunología

Si la prueba es positiva

¿Realmente esta enfermo?

Valor predictivo positivo.- Posibilidad de padecer la enfermedad con un resultado positivo

Valor predictivo negativo.- Posibilidad de estar sano con un resultado negativo

Prueba Enfermo Sano

Positiva A B

Negativa C D

Total enfermosA+C

Total sanosB+D

PRESENCIA DE ENFERMEDAD

VPP = A/ A+B

VPN = D/ C+DLimitante es que dependen de la prevalencia de la enfermedad

Page 10: Laboratorio en alergia inmunología

Biometría hemática

Datos generales Cuenta diferencial

Valores absolutos

8,000 mmc

Valores relativos

> 300 eosinofilia sanguínea >10,000 linfocitosis< 2000 linfopenia

> 6,000 neutrofilia< 1500 neutropenia

Page 11: Laboratorio en alergia inmunología

Recuento leucocitario en la infancia.

Comportamiento a través del tiempo

Gpo. Etario Leucocitos % neutrofilos % Linfocitos

recien nacido 18,000 60 30

1 año 12,000 30 60

2 - 5 años 10,000 40 50

≥ 6 años 8,000 50 40

recien nacido 1 año 2 - 5 años ≥ 6 años0

10

20

30

40

50

60

70

% neutrofilos

% Linfocitos

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Otros estudios auxiliares….

< 4% es positivo en infantes.N.A.R.E.S. (Rinitis no alérgica eosinofílicaB.E.A.R.S. (Rinitis no alérgica con eosinofilia nasal y sanguínea)

Reactante de fase aguda

Inmunodeficiencia humoral más frecuente : IgA ( 1/700 nacimientos)

Elevación > 2 desviaciones estándar IgE sugiere atopia

> 5 UI/ml en dos determinaciones : Deficiencia IgE

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Célula presentadora de antígeno

Linfocito Th 0

TCR

α▬

β

CD 3

CD 4

CD 40 L CD 40 Linfocito

B

yyyyy IgG

IgM

IgE

IgAIgD

IL-13

IL-4

IL-5

Antígeno

CD 20

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Cuadro clínico de Inmunodeficiencia combinada severa

Page 15: Laboratorio en alergia inmunología

TREC’s (Medición cuantitativa de los círculos de

ruptura del receptor de células T)

1 Millón de pruebas

14 casos de SICD

6 casos variantes SICD

40 niños con linfopenia de células T

Biomarcadores en Inmunodeficiencia Combinada Severa

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Inmunodeficiencia común variable

20 – 40 años de edad

6 – 8 años en establecer el diagnóstico

Infecciones recurrentes

Autoinmunidad

Enfermedades pulmonares crónicas

Enfermedad inflamatoria intestinal (CUCI)

Granulomatosis sistémica

Hiperplasia linfoide maligna

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Medición cualitativa de anticuerpos

Respuesta Postvacunación

IgG < 400 mg/dl

IgG < 200 mg/dl = Tratamiento con Inmunoglobulinas IV

PERFIL DE INMUNOGLOBULINAS

Respuesta inmune primaria1-2 semanas post-exposición al antígeno.

Primera fase IgM y después IgG

Respuesta inmune secundaria

Enérgica , inmediata y mediada por IgG

Page 18: Laboratorio en alergia inmunología

El papel del especialista en Alergología, bajo el conocimiento actual, es establecer el riesgo potencial de enfermedad alérgica, situación difícil de determinar, y que requiere un continuo entrenamiento y años de experiencia clínica.

Dr. Tomás Velarde Domínguez.

Tie

mp

o

RIESGO

Severidad de los síntomas (afección en calidad de vida)

Detección precoz de la enfermedad alérgica…

No sensibilizado

IgE normal IgE elevada Sensibilizado

Piel-digestivo-Respiratorio(Marcha Alérgica)

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La marcha alérgica…..

IgE IgE IgE IgE IgE

Eccema

Dermatitis atópica

Trastornos gastrointestinales Sibilancias

Otitis mediaPoliposis nasal

RinitisRespirador oral

Asma

Dermatitis atópica persistenteProblemas respiratorios

mixtos

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Cuantificación de IgE total

Niveles son ng/ml y se expresan en kU/L

UI = 2.4 ng

Estricto control genético

Varían con la edad

Influencias ambientales

Parasitosis

Exposición alérgica, tabaquismo, virosis, exposición a diesel

Elevación cuando están por arriba del percentil 95 para la edad

No significa alergia

Niveles muy elevados indican polisensibilidad o enfermedad alérgica severa

20-30% alérgico tiene IgE total normal

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Marcadores en asma

Periostatina (promueve eosinofilia)

IL-5 IL-13 IgE total IgE específica

Alergeno Componentes Comentarios

Cacahuate Ara h1 Ara h 2 Ara h 3

Responsable de la sensibilización inicial

Ara h 8Ara h 2

Marcador de tolerancia ( aislado) Reducción en los requerimientos del reto oral

Huevo Gal d 1 Resistencia al calor

Gal d 2 OvoalbúminaModelo matemático: IgG/ IgG4 vs Gal d 1 + Gal d 2 = Alergia a huevo

Soya Gly m 4 Predictor de alergia

Carne res Tri a 19 Alta sensibilidad y especificidad

Veneno abeja

Api m 1 Fosfolipasa A 2

Veneno avispa

Ves v 5 Ves v 1 Combinación de ambos eleva la sensibilidad

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1972RAST

(RADIOALERGOABSORBENCIAPRICK TEST

INTRADÈRMICA

RETO DIRECTO

TURBO RASTTecnologías Agilent, Santa Clara,

California

IMMULITESiemens Diagnóstico Médico,

Tarrytown, Nueva York

IMMUNOCAPPhadia, Uppsala, Suecia

PRUEBAS IN VIVO

Page 24: Laboratorio en alergia inmunología

In vivo vs In vitro (???)

No existe prueba estándar de oro para el diagnóstico a alergia por aeroalergenos.

Prueba alergia a alimentos y medicamentos: DOBLE CIEGO PLACEBO CONTROLADO

consume tiempo y riesgo de reacciones severas y graves.

Pruebas in vivo son más sensibles.

Pruebas in vitro son más específicas.

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Pruebas in vitro

IgE específica

TEST LIBERACIÒN HISTAMINA

DEGRANULACIÒN ÒPTICA BASÒFILOS

MICROARRAYISOTÒPICAS

ELISA

FLUORESCEINA

QUIMIOLUMINISCENCIA

Page 28: Laboratorio en alergia inmunología

Inmunoensayo marcado-Antígeno- Anticuerpo- Analito

Depende del tipo de marca es la denominación de origen:

FLUROINMUNOENSAYO

RADIOINMUNOENSAYO

ENZIMOINMUNOENSAYO

QUIMIOINMUNOENSAYO

IMMUNOCAP

IMMULITE(ENZIMOQUIMIOINMUNOENSAYO)

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Base del IMMUNOCAP

Unidades de masa arbitraria

Unidades internacionales de kilo de anticuerpos específicos por unidad de volúmen de la muestra (kUa/L)

1 UI = 2.42 mg s-IgE

Sistema de clases I-VI es obsoleto.

No son compatibles las técnicas entre si.

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Der p1Der p 2

Partículas de excremento 5-10 micras

Potente alergeno

Inducen hipersensibilidad

¿Cuáles ALERGENOS probar?

Page 31: Laboratorio en alergia inmunología

RASTTURBO-RASTIMMUNOLITEIMMUNOCAP

Prick testIntradérmicasContactoProvocación

Estigmas típicos

AntecedentesSíntomas

DIAGNÓSTICO DE SENSIBILIZACIÓN ALÉRGICA ESPECÍFICA..

Anamnesis Exploración

Pruebas in vivo Pruebas in vitro

s- IgE = SENSIBILIZACIÓN

Page 32: Laboratorio en alergia inmunología

Características Prick test Immulite Immunocap Liberación mediadores

Sensibilidad ALTA ALTA MUY ALTA BAJA

Especificidad VARIABLE ALTA ALTA BAJA

Costo $ $$ $$$ $$$

Influido por medicamentos

SI NO NO SI

Influido por síntomas SI NO NO NO

Correlación con pruebas de provocación

BUENA BUENA BUENA POBRE

Eficiencia comparativaEnfoques . Laboratorio en Alergia . Dr Carlos D.Crisci 2011

Page 33: Laboratorio en alergia inmunología

S

SS

IgE

Identificar, aislar y purificar múltiples alérgenos.Técnicas de DNA recombinante (Nanotecnología)

Micromatrices ( microarrays)

Ello permite hablar de:

DIAGNÓSTICO MOLECULAR O DIAGNÓSTICO POR COMPONENTES (component-resolved-diagnosis CRD)

Page 34: Laboratorio en alergia inmunología

Interesantes expectativas.

Miniaturización del diagnóstico en Alergia.

Sueño de conocer la especificidad molecular IgE en cada paciente.

Diagnóstico refinado.

Múltiples perfiles de sensibilización.

Predecir reacciones severas y la evolución de las mismas.

Inmunoterapia más precisa

Page 35: Laboratorio en alergia inmunología

Dr. Blakely1893

Prueba cutánea

Von Pirquet1906

Toxina Caballo

Sir Henry DaleHistamina 1910

Dr Leonard Noon1910

Vacunas hiposensibilizantes

1966IgE

Ishizaka / Johansson

1908 Mantoux

1921 primer extracto estandarizado

1924Lewis y Grant

pruebas por punción

1970Pepys modifica la prueba cutánea

1967Pharmacia

1970Phadebast amylase

test

1971Allergon

B

1972Phadeba

st IgE test

1974Phadebast

Rast(IgEs)

1976Pharmacia DiagnosticIgE PRIST

1981Phadezym RAST

1986Wallac OyPhadiatop

1989Immunocap

1990Procordia /

Kaby

1995Fusión con

Upjohn 1995

Immunocap100

AutomáticoPharmacia &

Upjohn Diagnostic

1990Procordia /

Kaby

1997Varelisa Elias

Autoinmunidad Immunocap

2000Micromatices

2009ISAC

2010Phadia 2500 5000

2011

Page 36: Laboratorio en alergia inmunología

Quien tiene mayor posibilidad de alergia a alimentos

< 3 años

3 a 5 años

Adolescentes

Adultos

Ancianos

10% menores de 3 años

La más frecuente es la proteína de leche de vaca.

1% se presenta en adultos

No existen datos fidedignos en nuestro país ( México)

Page 37: Laboratorio en alergia inmunología

¿Considera dentro de la serología la posibilidad de reacciones cruzadas?

Huevo con leche

Leche con gluten

Plátano con huevo

Leche con plátano

Todas

No existe reacción cruzada

50% de los alérgicos al glúten tiene reacción cruzada con proteínas de leche de vaca (caseína)

Page 38: Laboratorio en alergia inmunología

Nomenclatura de los alérgenos ( Marsh,Lowestein.,Platts-Mills,1980)

Primeras 3 letras del género, primera de la especie y No. de identificación:

Felis domesticus 1: Fel d 1Ambrosia artemisiflora 1: Amb a 1

Isoalergeno: Tamaño, f, y > 67% secuencia a.a. Ejem: Amb a 1. 01

Isoforma: > 97% homología secuencial: Ejem: Amb a 1.01 01, Amb a 1.01 02

Page 39: Laboratorio en alergia inmunología

Epítope 1

Epítope 2

Sitio de corte enzimático

Epítope 1

Epítope 2

Secuenciales Conformacionales

La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.

Page 40: Laboratorio en alergia inmunología

Epítope 1 Epítope 2

La reactividad cruzada requiere al menos un 70% de estructura conformacional.

Page 41: Laboratorio en alergia inmunología

La leche de vaca Centeno   Quinoa                  

alfa y beta-caseína Cebada  Levadura

Casomorfina El trigo de Polonia            Tapioca

Leche Butyrophilin Alforfón Avena

Queso Americano Sorgo Café

Chocolate Mijo Maíz

Sésamo Escanda Arroz

Cáñamo Amaranto Papa

18 alimentos que reaccionan de forma cruzada con el gluten

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Page 43: Laboratorio en alergia inmunología

Tipo I Dependiente IgE:

Anafilaxia y degranulación de

basóflosTipo II

REACCIÓN CITOTÓXICA

TIPOIII

SÍNDROME DE HEINERAnemia por déficit hierroNo crecimientoBroncoespasmoSangrado de tubo digestivo Hemorragia pulmonarHemosiderosisPrecipitinas a Leche

TIPO IV

Atrofia de vellosidades

Page 44: Laboratorio en alergia inmunología

Gal d 4 (lizosima

Gal d 1 Alta estabilidad térmica , difícil desnaturalizar, 11% proteína de la clara

Gal d 2 54% proteína clara. Resistente a la digestión por la pepsina a pH 1.2, lábil al calor y se desnaturaliza a 90 grados

Gal d 3 Ovotransferrina 12% clara, lábil al calor a 95 grados por 15 min.

Gal d 4 3.4% clara termolábil a 80 grados, resistente a pepsinas

Gal d 5 14% proteínas de la yema , relacionado s. ave-huevo, cruza con OVOTRANSFERRINA, termolábil a 90 grados 30 min.

Gal d 6 resiste calor, lábil a pepsina

Gal d 2 Ovoalbúmina

Gal d 1

(ovomucoide)

Gal d 3

Ovotransferrin

a

Gal d 5 alfalivetina

Gal d 6 (Vitelogenina)

Page 45: Laboratorio en alergia inmunología

Alergeno

Literatura experimental

Secuencia Pruebas Immunoblott

Prueba de función

(degranulación basófilos)

Prueba cutánea

Prueba reto conjuntival

Prueba reto

nasal

Prueba reto

bronquial

Reto oral

Datos epidemiología

Monitoreo tiempo real sensibilización IgE

Gal d 1

Gal d 2

Gal d 3

Gal d 4

Gal d 5

Gal d 6

Page 46: Laboratorio en alergia inmunología

Alergeno Literatura experimental

Secuencia Pruebas Immunoblott

Prueba de función

(degranulación basófilos)

Prueba cutánea

Prueba reto

conjuntival

Prueba reto

nasal

Prueba reto bronquial

Reto oral Datos epidemiología

Monitoreo tiempo real sensibilización IgE

Der p 1

Der p 2

Der p 3

Der p 4

Der p 5

Der p 6

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Proteínas leche vaca

Betalactoglobulina.

Alfalactoglobulina.

Caseina-

Seroalbùmina-

Gamaglobulinas.

Page 48: Laboratorio en alergia inmunología

HUMANA VACAPROTEÌNAS TOTALES 0.89 3.30

CASEÌNA 0.25 2.60PROTEÌNAS DEL SUERO 0.70 0.67ALFALACTOALBUMINA 0.26 0.12BETALACTOGLOBULINA - - - 0.30

LACTOFERRINA 0.17 INDICIOSINMUNOGLOBULINAS 0.105 0.066

PROTEÌNAS DALTON

CASEINA 19,000 - 24,000

BETALACTOGLOBULINA 36,000

ALFALACTOALBUMINA 14,500

LACTOFERRINA 75,000 - 78,000

ALBUMINA SERICA 69,000

IgM 900,000 - 950,500

IgA 420,000

PESO MOLECULAR DE LECHE HUMANA

COMPOSICION PROTEICA

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¿DIAGNOSTICO?

REACCIONES CRUZADAS

Page 52: Laboratorio en alergia inmunología

Alergeno Clase Fuera de rango Unidades de referencia

Clara huevo 2 1.03 kU/L

Leche 1 0.63 kU/L

Trigo 1 0.45 kU/L

Maíz 2 0.95 kU/L

Cacahuate 1 0.51 kU/L

Camarón 2 3.10 kU/L

Tomate 1 0.39 kU/L

Papa 1 0.44 kU/L

Nuez 1 0.48 kU/L

Zanahoria 1 0.63 kU/L

Apio 1 0.35 kU/L

Fresa 1 0.43 kU/L

Manzana 1 0.60 kU/L

Plátano 1 0.72 kU/L

Arroz 1 0.68 kU/L

Naranja 1 0.57 kU/L

Immunocap ® específico IgE total: 5929 UI/ML ( < 100 UI/ml)

Alergeno Clase Fuera de rango

Unidades de referencia

D.Pteronyssinyus 5 75.4 kU/L

D. Farinae 4 25.5 kU/L

Caspa de perro 3 4.12 kU/L

Pasto Bermuda 2 0.75 kU/L

Pasto timoteo 1 0.49 kU/L

Arce 2 1 kU/L

Aliso 1 0.68 kU/L

Cedro 2 1.74 kU/L

Roble blanco 2 0.78 kU/L

Olmo 2 1.06 kU/L

Olivo 1 0.53 kU/L

Lanaria 2 1.02 kU/L

Lengua vaca 1 0.37 kU/L

Page 53: Laboratorio en alergia inmunología

20

• 4 AÑOS 1 MES• 3 AÑOS CON RINITIS/ASMA/ECCEMA• TALLA BAJA (100 cm) PC<5

• 6 meses con ciclosporina (5 mg/Kg/d) se suspende por reducciòn dep.creatinina

• Prednisona 1mg/kg/d• Zafirlukast 20mg/dia• Difenhidramina 5 ml cada 6 hrs• Loratadadina 10 mg/día

• SCORE AD: 89

• TRACK: 20

• Bh 2300 eos/mmc

• IgE: 6956 UI/ml

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·¿¿¿???=$%·

Page 55: Laboratorio en alergia inmunología

PACIENTE SENSIBILIZADO A MÚLTIPLES ALERGENOS, EL MÉDICO TIENE LA OBLIGACIÓN DE CONOCER LAS POSIBLES REACCIONES CRUZADAS…….

Dr. Tomás Velarde D

Page 56: Laboratorio en alergia inmunología

Enfermedad muy severa

Enfermedad poco severa

IgG 4 Caseína

Bos d 8 (caseína)

Extracto completo de Leche

Ara h 2 (cacahuate) *Mayor reacción e incremento en reactividad cruzada clínicamente relevante

Ara h1 Ara h 3 (cacahuate) *Incrementa el riesgo de ANAFILAXIA

Gal d 1 Incrementa riesgo de reacciones

Gal d 2 Gal d 3 menor riesgo al consumo huevo cocido

Page 57: Laboratorio en alergia inmunología

Historia clínica

PielDermatitis

atópica

Gastrico e Intestinal

Respiratorio

IgE Alimentos Leche Huevo Res Oláceas Pescado Soya

IgE Inhalables DPT DPF Perro Gato Pastos Arboles Malezas

> 3 años

< 3 años

Pruebas Immunocap basadas en la edad…………………….

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“LA ALERGOLOGÍA ES UNA CIENCIA QUE SE PRACTICA COMO SI FUERA RELIGIÓN, COMO CIENCIA PUEDES TENER TONELADAS DE EVIDENCIA, SIN EMBARGO DEBES DUDAR DE LO QUE VEZ; Y EN MUCHOS CASOS NO TIENES EVIDENCIA, AÚN ASI CREES LO QUE VEZ.”

Pensamiento modificado de Carl Sagan

¡GRACIAS!

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¡MUCHAS GRACIAS!

¿Algunas preguntas?

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