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Laboratorio de Microbiología farmacéutica UPIBI-IPN 1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA MANUAL DE MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA ELABORARON: Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ Q.B.P. MARTHA MORALES MARTÍNEZ SEGUNDA EDICIÓN ENERO 2012

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1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA ELABORARON: Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ Q.B.P. MARTHA MORALES MARTÍNEZ SEGUNDA EDICIÓN

ENERO 2012

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PRÓLOGO

El presente manual de laboratorio de Microbiología farmacéutica tiene la finalidad de dar apoyo a la asignatura con el mismo nombre, en este manual tenemos las practicas que se realizarán a lo largo del curso, la cual contiene los fundamentos mínimos, los materiales, el procedimiento y la bibliografía para ampliar los fundamentos.

Se presentan algunas técnicas básicas de microbiología, algunas de ellas basadas en la normatividad de la secretaria de salud para que el alumno poco a poco se vaya adentrando a la legislación sanitaria mexicana.

Uno de los principales objetivos es poner en práctica el método científico para despertar el interés y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.

Como una aportación a las estructuras didácticas de este manual, colocamos una serie de imágenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.

NOMBRE DEL ALUMNO: ___________________________________________

PROFESOR DE TEORÍA: ___________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________

GRUPO: _______________________________________________________

PERIODO LECTIVO: _____________________________________________

CARRERA: _____________________________________________________

ESCUELA: _____________________________________________________

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ÍNDICE

Instrucciones generales ______________________________________________________________3

Practica No. 1 Tinciones y uso del microscopio____________________________________________8

Practica No. 2 Métodos de esterilización y controles _______________________________________20

Practica No. 3 Preparación de medios y cultivo de microorganismos__________________________ 28

Practica No. 4 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios___________________________34

Practica No. 5 Conservación de microorganismos _________________________________________ 51

Practica No. 6 Determinación de organismos coliformes, mesofílicos aerobios, mohos y levaduras en

superficies vivas e inertes ___________________________________________________________ 63

Practica No. 7 Pruebas para identificar bacterias mohos y levaduras (PARTE I)__________________ 71

Practica No. 7 Pruebas para identificar bacterias mohos y levaduras (PARTE II) _________________ 91

Práctica No. 8 Identificación de Salmonella, Pseudomonas aeuruginosa, Staphylococcus aureus y

Escherichia coli en productos farmacéuticos y productos de tocador __________________________91

Practica No. 9 Cinética de crecimiento _________________________________________________111

Practica No. 10 Resistencia microbiana ________________________________________________121

Practica No. 11 Autovacunas_________________________________________________________131

Agares__________________________________________________________________________137

Caldos _________________________________________________________________________144

Medios semisólidos _______________________________________________________________149

Soluciones y reactivos _____________________________________________________________151

Colorantes y decolorantes __________________________________________________________155

Nefelómetro de McFarland__________________________________________________________157

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INSTRUCCIONES GENERALES

I.- EVALUACIÓN

1.- El laboratorio representa el 50 % del curso y cada práctica se evalúa de la siguiente forma:

Trabajo experimental: 50 %

Discusión de la práctica: 25 %

Informe de la práctica: 25 %

a)Objetivos 0.25 puntos

b)Análisis de resultados: 1.0 puntos

c)Discusión: 0.5 puntos

d)Conclusiones: 0.5 puntos

e)Bibliografía: 0.25 puntos

1.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,

aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.

2.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la

práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte

correspondiente.

3.- La calificación final del laboratorio será el promedio de las calificaciones de todas las prácticas.

4.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.

5.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del equipo hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presento tendrá cero en el reporte y para acreditar el laboratorio deberá entregar el 80 % de prácticas

6.- Cuando a un equipo le corresponda esterilizar material y no lo realice tendrá cero en la práctica.

Cada sección deberá traer un candado para su gaveta.

II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

7.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:

Una bata limpia y con botones

Manual de laboratorio

Bitácora

Una fotografía tamaño infantil

Colores y marcador indeleble

Dos asas bacteriológicas

8.- Por equipo deberá traer:

Un rollo de Masking tape

Una caja de portaobjetos

Una tijera de punta recta

Una pinza de punta roma

Una regla graduada

Un metro de franela

Encendedor

Bolsas de plástico grandes

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3 botes de lámina

Una bolsa de cucharas de plástico

Un kg de bolsas de un kilo nuevas

Jabón liquido para trastes

Una fibra. Periódico

Una caja de ligas

9.- Por grupo deberá traer.

Un rollo de gasa hospitalaria

4 jeringas de 10 ml estériles

Una caja de cubreobjetos

Un litro de solución salina estéril

Un barniz de uñas transparentes

Una caja de guantes de latex

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

10.- Se impartirán dos sesiones por semana de 1.5 horas cada una.

11.- Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.

12.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.

13.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos.

14.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del profesor, se considerará que no asistió a la práctica.

15.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.

16.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el

alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada con una

tolerancia de 5 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no se le permitirá la

entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.

17.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que este

cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que alguna fracción este escrita con lápiz, se sugiere

el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de esquemas biológicos lápices de colores.

18.- El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión,

apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo que

vayamos cambiando.

19.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo responsable,

para ello tiene como mínimos una semana, de lo contrario el vale se irá al expediente del alumno.

20.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo

práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.

21.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio, a la persona encargada del

almacén del laboratorio y debe limpiar la mesa antes y después de iniciar o terminar la práctica con

benzal.

22.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.

23.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un

lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.

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24.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará acordada

con el profesor responsable de la práctica, deberá traer bata y si va a continuar con su trabajo

experimental, traerá el material que va a necesitar.

25.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se depositará

en una bolsa de plástico para su desecho.

26.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.

IV REGLAS BÁSICAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio.

2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas.

3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica.

4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se utilice en la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar desinfectar la superficie de trabajo.

5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos.

6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar pipetas automáticas.

7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados.

Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar micropartículas que

pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la

flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad.

8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en los cultivos.

10.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe

realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola

vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.

11.- Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.

12.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El material de

vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.

13.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el laboratorio

14.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio

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Actividades: I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)

A.NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

B.NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías

a.Desinfección del área de trabajo

b.Código de colores (instalaciones de gas)

c.Uso del contenedor para punzocortantes

d.Botiquín

e.Extinguidores

II.- Conocimiento del material básico de laboratorio

a.Material de cristalería

b.Uso del mechero

III.- Equipo de laboratorio

a.Cuarto de incubación

b.Cuarto de refrigeración

c.Incubadoras

d.Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica

e.Campana de flujo laminar

f.Campana de extracción

IV.- Material para la gaveta

a.Frasco con benzal

b.Frasco con alcohol

c.Frasco con torundas

d.Frasco con benzal para pipetas

e.Varilla acodada y base de caja de Petri

f.Frasco con benzal para material de desecho

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PRÁCTICA No. 1

TINCIONES Y USO DEL MICROSCOPIO

UNIDAD: II Introducción y técnicas de aplicación en Microbiología

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio compuesto.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas.

1.2.2. El alumno realizará frotis bacterianos para realizar tinciones simples, diferenciales y selectivas.

1.2.3 De las preparaciones realizadas el alumno las observará de manera correcta en el microscopio, utilizando la iluminación de Köhler.

2.- INTRODUCCIÓN

Los microorganismos no teñidos muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico generalmente se

basa en las diferentes afinidades tintoriales de los microorganismos por lo que para poder observarlos

es necesario teñir la célula proceso que resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicas muy

complejas

Algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido

en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.

La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están

formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas

(cromóforos) que están asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos

tienen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo

funcional llamado auxócromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la

célula.

Los colorantes se clasifican en ácidos o básicos, términos que no indican necesariamente sus

reacciones de pH en solución, sino más bien, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica. Desde

el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.

En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación,

tratamiento con colorantes y observación.

Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida

se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de agua.

Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar

la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de

una flama.

Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos

anteriores. Puede ser de varios tipos como simples, diferenciales y específicas.

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Para poder observar estas preparaciones es necesario el uso de un instrumento óptico que amplifica la

imagen de un objeto pequeño, denominado microscopio. Es el instrumento que más se usa en los

laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación

se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de

miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan

tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y

otras mediante instrumentos.

I.- Microscopio óptico

Es un instrumento, que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los

microorganismos. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de

resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar

como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar

la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del

espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución

que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por

un filtro verde y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el

objetivo, pero no puede aumentar la resolución.

El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: Sistema de iluminación; Sistema óptico y

Sistema mecánico.

El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente

la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el

condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)

El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que

permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.

El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el

movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base,

estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y portarevolver.

Función básica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecánico

Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato

Brazo o Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio

Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la

preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con

los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas

numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar

la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.

Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.

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Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.

Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.

Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto

aumento.

Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que

dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos

tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una

diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala

grabada para poder ajustar la distancia; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema

mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo

micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil.

b.- Sistema de iluminación

Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 12 V,

50-100 W.

Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro

de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad

de luz que atraviesa la preparación.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el

objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco

y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.

c. Sistema óptico

Oculares

El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen

final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es

de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.

Tubo

El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, éste puede ser

monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una

cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija

entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio

es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.

Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen

aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los

objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a

detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:

1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1).

2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos.

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3.- El lado superior derecho la apertura numérica.

4.- El lado inferior la distancia mecánica.

5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos.

6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2).

En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que acepta

cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor.

Con el objetivo de 100 X no se debe de utilizar cubreobjetos.

10= No requiere cubreobjetos ó

0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.

Anillo superior

Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

Aumentos totales:

El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número

de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de

aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando.

Distancia mecánica:

Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre la luz por el interior del microscopio desde que

penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular. La distancia mecánica se

mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de

nuestro microscopio es de 160 mm.

Poder de resolución:

El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos

Tabla 1. Correspondencia entre

los aumentos y los anillos de

colores grabados

Aumentos Color anillo

superior

1.0X Negro

2.5 X Pardo

4.0 X Rojo

10 X Amarillo

16 X Verde claro

25 X Verde oscuro

40 X Azul claro

100X Blanco

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en

qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo

Carácter Sustancia

Índice de

refracció

n

Color del anillo

Oil Aceite 1,515 Negro

W Agua 1,333 Blanco

Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado

Metileno Yoduro de

metileno

1,740 Amarillo

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puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µm y el electrónico de

transmisión es de 5 Ángstrom (0,5 nm) y el microscopio electrónico de barrido entre 30 y 200 Ángstrom

Apertura numérica:

Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del

condensador o del objetivo.

II.- Microscopio de contraste de fase

Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una

célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de

refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de

luz que pasaron la muestra, aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de

anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz

de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las

porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos

densas, por lo tanto este microscopio se utiliza para observar células vivas y cortes histológicos teñidos.

La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque

emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más

pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar

autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum

microorganismo causante de la sífilis.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 MATERIAL POR EQUIPO

5 portaobjetos

Asa bacteriológica

Lámpara de alcohol o mechero

Microscopio compuesto

3.2 REACTIVOS

Aceite de inmersión

Reactivos para tinción de Gram

Verde de malaquita

Reactivos para la tinción de Zielh Neelsen

3.3 MATERIAL BIOLÓGICO

Cultivos puro de Staphylococcus sp

Cultivo puro de Escherichia coli

Muestra de lodos

Cultivo puro de Bacillus subtilis

Cultivo puro de S. cerevisiae

Cultivo puro de Micrococcus luteus

3.4 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

Colores Muestra de agua estancada

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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1 Preparación de Frotis:

Método A: Cultivo en tubo en medio sólido inclinado.

4.1.1 Procedimiento

a)Limpiar el portaobjetos con una torunda con alcohol.

b)Colocar la etiqueta sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente

pegada a la izquierda de la preparación, (si es necesario colocar otra del lado derecho), con la siguiente

información: Nombre del microorganismo, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.

c)En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con dos ml de agua, de ahí tomar con el asa

una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.

d)En el mechero, flamear el asa al rojo vivo, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el

asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda

tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo

aproximadamente un cm2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para

esterilizarla.

e)Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

f)Fijar el frotis con calor, pasarlo rápidamente por la flama, luego colocarlo en el dorso de la mano, si

soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operación una vez más. Dejar enfriar el

portaobjetos antes de teñir.

Método B: A partir de una suspensión microbiana

a.Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.

b. Flamear la boca del tuboo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.

c.Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla

d.Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

II.- TINCIONES FIJAS

4.3 Tinción simple

a)Tomar la preparación fija de Saccharomyces cerevisiae y colocarla el colorante según el siguiente cuadro:

Equipo Colorante

1 y 6 Azul de metileno

2 y 7 Safranina

3 y 8 Cristal violeta

4 y 9 Verde de malaquita

5 y 10 Lugol

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b)Tomar el tiempo por 1 minuto

c)Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua

d)Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.

4.4 Tinciones diferenciales

4.4.1 Tinción de Gram:

a)Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de coloración.

b)Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c)Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

d)Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

e)Lavar los frotis con agua de la llave.

f)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos.

g)Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h)Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

i)Lavar los frotis con agua de la llave.

j)Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)

4.5 Tinción de Gram con exceso de decoloración

Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración.

a)Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

b)Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

c)Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.

d)Lavar los frotis con agua de la llave.

e)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.

f)Lavar inmediatamente con agua de la llave.

g)Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

h)Lavar los frotis con agua de la llave.

i)Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio a 100 X.

4.6 Tinción de Gram aplicada a una suspensión de microorganismos:

a)Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

b)Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.

c)Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.

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d)Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante un minuto.

e)Lavar el frotis con agua de la llave.

f)Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos.

g)Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h)Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos

i)Lavar el frotis con agua de la llave.

j)Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite y observar al microscopio con el objetivo de 100 X.

4.7 Tinción de Ziehl-Neelsen.

a)Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración

b)Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe.

c)Enjuagar con agua de la llave.

d)Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.

e)Enjuagar con agua de la llave.

f)Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto

g)Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión

4.8 Tinción específica

4.8.1 Tinción de Shaeffer–Fulton

a)Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.

b)Dejar que el frotis se enfríe y lavar con agua de la llave.

c)Cubrir el frotis con safranina por un minuto.

Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión

Diferentes tipos de posición de las esporas

En la realización de las tinciones podemos tener ciertos errores como son:

Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo de un cultivo joven presenta una pared celular sin

alteración. El mismo microorganismo, si sufre daño en la pared por alguna causa puede teñirse y

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observarse como una bacteria Gram negativa. Esto indica la importancia de la pared para la retención o

salida del colorante.

Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el

alcohol-acetona, entonces la preparación resultará Gram negativa, debido al tiempo prolongado de

exposición con el decolorante.

III.- Observación microscópica

a) Transportar el microscopio en forma vertical tomándolo del brazo con una mano y con la otra, en la

base.

b) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso

de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)

c) Con una brocha de cerdas suaves retirar el polvo de la parte mecánica y con una perillas de la parte

óptica.

d) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una franela húmeda.

e) Limpiar la parte óptica (lentes) del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.

f) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación.

g) Conectar el microscopio a la toma de corriente.

h) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler.

IV.- Técnica de iluminación de Köhler

A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler

propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación comporta dos diafragmas: un

diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma

llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.

Pasos a seguir para la iluminación de Köhler.

1.- Luz amarilla (bajo voltaje).

2.- Ajustar la distancia interpupilar.

3.- Ajustar las dioptrías.

4.- Abrir el diafragma de campo e iris.

5- Subir completamente el condensador con la lente frontal introducida.

6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X o 10X y utilizando los tornillos macro y micrométrico.

7.- Observar y cerrar el diafragma que está en la base del microscopio y observar por el ocular el

hexágono.

8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener máxima nitidez de la imagen del diafragma.

9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual, recurriendo a los dos tornillos el

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condensador.

10.- Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual, centrando con exactitud

y abrirlo hasta que desaparezcas detrás del borde del campo visual.

11.- Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.

12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje.

13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el micrométrico y contrastar con el diafragma del

condensador.

14.- Al utilizar objetivos panorámicos de bajo aumento rebatir la lente frontal del condensador sin alterar

su altura.

V.- Observación de una muestra en fresco

a) A un portaobjetos desengrasarlo, limpiándolo con una torunda de algodón impregnada de alcohol y

dejar secar.

b) Colocar una gota de la muestra de agua estancada.

c) Colocar sobre la muestra un cubreobjetos con mucho cuidado, tratando de no capturar burbujas

d) Observar la preparación a 10 y 40 X

Observaciones de preparaciones fijas

a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X.

b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X.

c) Observar la preparación que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biológico.

d) Ahora mover la preparación para enfocar la preparación con poca cantidad de muestra.

e) Comparar ambas muestra y concluir.

Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:

1)Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de

aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.

2)Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento

de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.

3)Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas.

Algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio son:

a) Espuma de jabón suave: Solo para remover lo sucio de la superficie del instrumento.

b) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos: Para un prelimpiado de la óptica.

c) Solución para limpiar la óptica: Etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión.

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5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 realiza un esquema biológico, indicado lo que observaste en la preparación en fresco.

5.2 Resumen de las tinciones simple.

Equipo/ S. cerevisiae Colorante a utilizar Color adquirido Agrupación

1 y 6 Azul de metileno

2 y7 Safranina

3 y 8 Cristal violeta

4 y 9 Verde de malaquita

5 y 10 Lugol

Resumen de tinciones

Microorganismo Tinción Color Forma Agrupación Resultado

1 Simple (colorante usado)

2. de Gram

3. de Shaeffer y Fulton

4. de Gram decolorado

5 Zielh-Neelsen

5.3 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Tipo de microscopio Aplicaciones

Compuesto

Contraste de fase

Electrónico

Estereoscópico

Fluorescencia

5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:

Parte del microscopio Función

Condensador

Diafragma

Filtro azul

Lámpara

Objetivo

Ocular

Platina

Revolver

Tornillo macrométrico y micrométrico

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5.5 Realiza los esquemas correspondientes anotando de manera correcta el nombre de la cepa, la forma

y agrupación que presenta.

5.6 Que problemas se tienen al realizar una preparación muy gruesa y otra muy delgada?

5.7 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS (tercera sesión)

Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler, el uso del microscopio óptico, la

manera que influye una preparación muy gruesa. Analiza las diferencias de las tinciones utilizadas y sus

aplicaciones.

7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos

y la bibliografía consultada.

8.- BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V. 1991.

139 p.

8.2 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por

la Asociación de Químicos del INN.

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PRÁCTICA No. 2 ESTERILIZACIÓN Y CONTROLES

UNIDAD I: Introducción y técnicas de aplicación en microbiología

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo general

El alumno preparará material de uso común en un laboratorio de microbiología para su esterilización y analizará los diferentes métodos para seleccionar el más adecuado acorde a la naturaleza del material

1.2 Objetivo específicos

1.2.1 Preparará el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor húmedo.

1.2.2 Esterilizará el material e preparado, por calor seco y calor húmedo, haciendo uso de controles de esterilización.

1.2.3 Realizará el proceso de filtración a través de membrana.

2. INTRODUCCIÓN

La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización.

1 Métodos físicos

Calor húmedo:

La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que

no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas, pero no

las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de

presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas,

generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se

encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en

todas las partes del recipiente.

Calor seco:

Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que

circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una

temperatura de 160 –170 °C durante una h.

El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la

célula y fragmentando las membranas celulares.

Flameo:

La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para

esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de

ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar”

diseminándose partículas infectantes.

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A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material

mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización

completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.

Radiaciones ionizante y no ionizante:

La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre

pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos,

las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.

Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.

Filtración a través de Membranas

Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco

pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna

propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de

membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer

las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro

adecuado (diámetro).

Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,

asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como

bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm

2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y propiolactona)

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos

carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la

industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos

electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y

además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 %

de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad

de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C,

cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es

de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno

residual porque es muy tóxico.

La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva

después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más

rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser

cancerígena.

3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).

En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que

manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,

para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y

posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

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Método de la tira de papel

Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan

en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado

(testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca (problema

y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras

se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 °C en caldo de soya y

tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización no fue la

correcta habrá desarrollo en la tira testigo.

Método de la ampolleta:

Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo. La

temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C; dentro del

medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar

la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el

material, después de terminar la esterilización, las ampolletas (sin

abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el enturbamiento y

la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa,

en cambio si el color permanece igual durante varios días de

incubación el equipo está funcionando bien. Debe llevarse el control

constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo,

incubada en las mismas condiciones, debe mostrar desarrollo

bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

Métodos físicos para esterilizar:

A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material

mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización

completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo.

Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las

células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas

en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 EQUIPO

Autoclave a 121° C

Autoclave a 110 ° C

Horno a 170 ° C

Incubadora a 35° C

Baño María a 55°C

Termómetros de 150 y 200 °C

3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección)

Dos botes de lámina

Un cilindro pipetero

Un cilindro para cajas de Petri

Una jeringa de 5 ml

Una pinza de disección

Una tijera de disección

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Dos filtros estériles swinnex con empaque

Tres matraces de 125 ml con 50 ml de

Caldo nutritivo (CN) estéril

Un matraz con 50 ml de suspensión de Escherichia coli (suspensión turbia)

Frasco con benzal

Un contenedor para punzocortantes

Material por equipo

Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm para tapón de tubo

Tres cuadros de papel aluminio de 20X20 cm para envolver pinza o tijera

Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 cm para tapón de matraz

Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm para gorro de matraz

Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm para gorro de matraz

Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm para cubrir un bote de lámina.

Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm para envoltura de pipeta de 10 ml.

Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm para caja de Petri

Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm para envoltura de pinza o tijera.

Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm para tapón de matraz.

Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm para tapón de matraz.

Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophilus

Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón.

Cuatro cajas de Petri limpias

Tres pipetas de 10 ml limpias

Un clip o aguja de disección

Cuatro matraces de 125 ml

Un matraz de 250 ml.

Algodón suficiente para tapones de matraces

Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin tapón

Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón

Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la práctica)

Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo estéril

Un frasco con alcohol

Cuatro matraces con 50 ml de caldo nutritivo estéril

Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para tapón de tubo

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Caldo nutritivo

3.4 CEPAS MICROBIANAS

Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con esporas.

Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli

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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN

4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental

a)Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el

material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de preferencia

extran.

b)Enjuagar suficientemente con agua de la llave

c)Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.

4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a.Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor

b.Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

4.2.2 CAJAS DE PETRI

a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETAS

a.Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy

compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip

b.Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón

c.Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con

masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo

de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

4.2.4 MATRACES

a.Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las

instrucciones del profesor.

b.Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.

c.En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No

anotar los datos sobre el gorro de papel.

4.2.5 PINZAS Y TIJERAS

a.Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.

b.Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

4.3.1 TUBOS DE ENSAYE

a.Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.

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b.Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.

c.Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.

4.3.2 CAJAS DE PETRI

a.Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición

invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL

CONTAMINADO)

b.Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

4.3.3 PIPETAS

a.Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado.

b.Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón.

c.Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.

d.Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la

tira entre la tapa del cilindro pipetero.

4.3.4 MATRACES

a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.

b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo

con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.

4.3.5 PINZAS Y TIJERAS

a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.

b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR CALOR HUMEDO)

a.En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con la

siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de

Geobacillus stearothermophilus.

b.Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos.

c.Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente

durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la

aparición de turbidez.

4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo

b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.

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c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC 2°C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

Pasos para realizar una buena esterilización:

-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.

-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical

- -Observar que el manómetro registre la presión

-Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.

-Al terminar de esterilizar dejar el autoclave sin agua

4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

a)Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la

temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada.

b)En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de

Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar.

Esterilizar a 170 oC/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.

c)Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro

indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.

d)Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira de

papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de caldo

nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 2oC durante 5 días. Observar diario y anotar cualquier

cambio en cuanto a la aparición de turbidez.

4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO

a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.

b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).

4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA

Sistema de filtración Swinnex marca Millipore

a)Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del

empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.

b)Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro

colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35 2 oC de 48 a 72 h.

c)Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición

de turbidez durante 3 días.

d)El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para

membranas con un diámetro de poro de 0,2 m.

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Esterilización de material de desecho

-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,

nunca se esterilizan por calor seco

-5. CUESTIONARIO

5.1 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?

5.2. ¿Por qué utilizamos el papel Kraft para envolver el material?

5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando si hubo no turbidez en los tubos

Método Tratamiento 110°C/10´10 lb

Calor húmedo

121°C/15´/15lb

Calor seco

170°C/2 h

Filtración a través de membrana

Control

positivo

Control negativo

Resultado

(turbidez)

5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye

5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay

crecimiento después de la incubación.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel

Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.

7. CONCLUSIONES

7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así

como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA

8.1 Enlistar la bibliografía consultada

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PRÁCTICA No. 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

UNIDAD II: Cultivo de microorganismos.

1 OBJETIVOS

1.1 Objetivo general.

Identificará los diferentes medios de cultivo según la NOM-065-SSA-1993, que establece las

especificaciones sanitarias de los medios de cultivo o nuestras necesidades.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y

sintéticos de acuerdo a la NOM – 065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo,

los esterilizará y vaciará para su uso.

2.- INTRODUCCIÓN

Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones

inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas

grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.

La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera

preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas

interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.

Nutrición.

A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo

se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:

a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.

b.- Nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales.

Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras

estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados

directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas

funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes,

dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de

crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se

requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los

micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se

requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en que

un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales

micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.

Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las

rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos

adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos

medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.

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Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo,

formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:

a) Fuente de carbono

b) Fuente de nitrógeno

c) Fuente de azufre

d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que no pueden sintetizar)

e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).

f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o metales pesados.

g) Indicadores de potencial oxido-reducción.

h) Agar como el agente gelificante o soporte.

Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.

Medios selectivos.

Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en

una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.

Medios selectivos de enriquecimiento.

Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la

reproducción de otros.

Medios diferenciales.

Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el

medio o en las características típicas de las colonias.

Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.

Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de

microaerofilia.

Medios de transporte.

Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del

producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.

Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.

Medios para filtración a través de membrana.

Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el

crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.

Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del

medio de la membrana.

Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.

En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que

tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser

más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;

para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se

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llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de

bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.

En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.

Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los

medios de cultivo como son:

a.La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)

b.Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza

c.Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización,

caramelización o pérdida de actividad nutricional.

d.pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante

e.Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación

comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.

Cultivo microbiano.

Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras

ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se

encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un

cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de

microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.

Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo

gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de

estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura

(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.

Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo

proveniente de una placa.

Existen dos variedades de cultivo en tubo:

a)Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia

inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio

por la superficie inclinada del agar.

b)Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada

y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.

La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en

el medio líquido agitando suavemente el asa.

a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos

con agar inclinado

b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un

sedimento, una película superficial, o combinados.

c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo

Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede

hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario.

Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para

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completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la identificación de

microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras

pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.

Agar bacteriológico

El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados, sales

insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.

El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,

particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar

es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como

polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable,

con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El

agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua

hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas,

que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no

cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la

solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.

Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:

a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.

b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.

c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de 65 °C.

d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.

e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.

f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.

Clasificación de medios de cultivo

I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos

a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.

b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.

c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.

II.- Por su uso se clasifican en:

a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos o grupo de microorganismos de interés.

b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún microorganismo.

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c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden la reproducción de otros.

d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.

e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.- Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.

III. Por su composición

a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético como el caldo glucosa sales.

b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo como el agar base sangre.

Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios semisólidos y en placa medios sólidos.

IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).

Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.

Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.

Microorganismo Cepa Resultado

Candida albicans ATCC 10231 Bueno

Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno

Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno

Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:

Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metálico

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes

Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes

Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa pálido.

Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado, además es parte del control de calidad de los medios de cultivo.

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3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO

●Balanza granataria

●Autoclave

●Horno 170° C

Papel Kraf

●Potenciómetro

●Algodón

● Gasa

Refrigerador

Incubadora a 28° C Incubadora a 37° C

3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I)

●Un mechero Fisher

●Un espátula

●Seis matraces de 250 ml

●Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm

●Dos matraces de 125 ml

●Una pipeta de 10 ml

●Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm

●Una probeta de 100 ml

●Un termómetro

Seis cajas Petri

Sesión II

Tres tubos con 3 ml de medio SIM

Tres cajas con agar EMB

Tres tubos con agar PDA

Tres cajas con agar nutritivo

Tres tubos con 3 ml de caldo glucosa sales

Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales

Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo

Tres tubos con agar nutritivo

Tres cajas con un medio enriquecido

Tres tubos de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

●Agar nutritivo (AN)

●Agar eosina azul de metileno (EMB)

●Agar de papa y dextrosa (PDA)

●Medio SIM

●Glucosa

Agar base sangre

●(NH4) 2SO4

●K2HPO4

●MgSO4 7H2O

●MnSO4 4H2O

●Agar bacteriológico

Agar rosa de bengala

3.4 CEPAS MICROBIANAS

Escherichia coli

Bacillus sp.

Penicillum sp.

Aspergillus sp.

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1 Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.

a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su empleo.

b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.

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c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)

d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.

e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la

proyección en el momento de la ebullición.

f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen.

g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que

se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.

h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25° C.

i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.

j)Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de color o de consistencia etc.

k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido tartárico

no puede ser esterilizado una segunda ocasión.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar)

a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.

b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:

Reactivo Cantidad

Glucosa 5.0

(NH4) 2SO4 2.0

KH2PO4 0.05

K2HPO4 0.05

MgSO4 7H2O 0.25

MnSO4 4H2O 0.001

Agua destilada 100 ml

c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer

lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2 si

fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro.

d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, colocarle el

tapón de algodón su gorro de papel Kraf y colocarlo en el autoclave.

e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de lámina

f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la

concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio.

g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente.

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h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de

lámina para su esterilización.

i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave.

j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110° C durante 15 minutos. Una vez que se ha

llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar.

k) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio

en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o

con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.

m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en

refrigeración para su uso.

4.3. MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de

medio indicada por el profesor.

b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.

f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio

en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o

con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.

4.4 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)

a)Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de

medio indicada por el profesor.

b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.

e)Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y

etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote

f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta

y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

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g)Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas y en el refrigerador.

4.5 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.

b)Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.

d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro

e)Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,

taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.

f)Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.

4.6 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.

b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolución completa.

d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.

e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco

f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio

en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o

con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida y en el

refrigerador.

4.7 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)

a)Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de

medio indicada por el profesor.

b)Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c)Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

d)Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

e)Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.

f)Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en

cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g)Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o

con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.

4.8 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)

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a)Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de

medio indicada por el profesor.

b)Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.

c)Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

d)En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.

e)Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y

etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote

f)Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta

y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.

g)Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.

4.9 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)

h)Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.

i)Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.

j)Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.

k)Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.

l)Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.

m)Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será necesario

fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10% estéril por cada

100 ml de medio preparado y homogeneizar.

4.10 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).

a) Pesar la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.

b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.

c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.

d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase

e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.

4.11 MEDIO COMPLEJO Y ENRIQUECIDO (Agar Baird-Parker, medio que se utilizará en aislamiento)

Este medio de cultivo contiene cloruro de litio y telurio para la inhibición de la flora acompañante, en

tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de Estafilococos.

Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de Estafilococos

muestran dos características diagnosticas por la lipólisis y proteolisis, se producen halos y

características y, debido a la reducción del telurio a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción

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con la yema de huevo y la reducción del telurio se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-

positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última.

Formula

Ingredientes

Medio base

Solución de telurito de potasio

Emulsión de yema de huevo

Cantidad

95 ml

1.0 ml

5.0 ml

Preparación

a.- Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.

b.- Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar.

c.- Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.

Preparación del medio base de Baird-Parker

a.- Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1

min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45ºC.

Preparación de la solución de telurito

a.- Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios

meses a temperatura de 0 a 5ºC.

Preparación Emulsión de yema de huevo

a.- Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de

tintura de yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000).

Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril.

b.- En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador

de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90 ml con

solución salina isotónica.

c.- Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para

formar la emulsión y filtrar a través de gasa.

d.- En tanto que el medio de cultivo basal puede aguardarse de 1 a 2 meses a 4 º C, el medio de cultivo

completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparación.

4.12 MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.

b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.

c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.

d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C.

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e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada.

f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.

g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador.

4.13 AGAR ROSA DE BENGALA

a)Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.

b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.

c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.

d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C y vaciar en placas estériles

e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador.

4.14 CONTROL DE ESTERILIDAD

a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e incubarlos a 35 °C durante 3 a 5 días.

b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación.

NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

SESIÓN II

4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon

4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA)

Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.

a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.

b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.

c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.

d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el

esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.

f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.

g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.

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4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA

a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.

b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.

c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el

inóculo.

d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del

mechero y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se

indica en el esquema

f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 h.

g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.

4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)

a)Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que

corresponden una para cada alumno y testigo

b)Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.

c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la

boca del tubo por la flama del mechero.

d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo.

e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.

f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.

g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28° C, de 3 a 5 días.

h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento.

4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA

a) Tomar un hisopo estéril.

b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y

pasar la boca del tubo por la flama del mechero.

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c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión.

d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón.

e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se indica en el esquema

f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 °C/24 h, y

observar el crecimiento.

4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO

a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS

b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la

superficie del medio inclinado de agar nutritivo.

c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en “S” la superficie del

medio inclinado de agar de papa y dextrosa.

d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37° C para bacterias y

a 28° C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente

e)Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.

4.7CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)

a)Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste

“agitándolo” en las paredes del tubo o matraz, evitar la

formación de grumos.

b)Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y

sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas

y micelio para disgregarlo en el medio.

c)Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.

d)Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35° C/24 h, y el matraz con hongos a 28° C/ 5 días en

agitación a 120 rpm

e)Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas.

f)Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación.

4.8CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)

a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.

b)Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo

y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de

que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio).

Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.

c)Incubar los tubos a 37° C/ 24 h.

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d)Observar los cultivos a las 24 h y anotar las características del cultivo.

4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL

Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras

Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:

a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación.

b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:

c.- Elevación: Que puede ser:

d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser:

e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.

f. Aspecto: Húmedo o seco

g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.

Morfología colonial en placa para mohos:

Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de ø y va de 3 a 5 días.

Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.

Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo,

verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 completa el siguiente cuadro.

Medio de cultivo Condiciones de esterilización

Clasificación por su consistencia

Clasificación por su composición

Presentación del medio

Caldo Glucosa sales Ejemplo 110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz

Agar Glucosa sales

Agar Nutritivo

EMB

PDA

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SIM

Agar sangre o ABP

Agar rosa de bengala

5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?

5.3- De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué

tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.

5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?

5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por qué?

5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin agitación.

5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar?

5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de la

morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.

7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la

bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª

Edición. Interamericana. México. 140 p.

8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2

8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los

medios de cultivo. Generalidades.

8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.

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PRÁCTICA No. 4 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS

UNIDAD II: Cultivo de microorganismos

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

El alumno aislará microorganismos para obtener un cultivo puro y cuantificará las bacterias mesofilicas aerobias en un producto farmacéutico.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno aislará microorganismos utilizando diferentes medios de cultivo para describir la morfología colonial.

1.2.2 El alumno cultivara algunos microorganismos previamente aislados.

1.2.3 El alumno realizará el recuento de microorganismos haciendo uso de la NOM 089-SSSA-1994,

Bienes y servicios. Método para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza o de

la Farmacopea de Los Estados Unidos Mexicanos.

2. INTRODUCCIÓN

El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro o axénico se realiza en un medio sólido y líquido. Se inicia por la separación de una sola célula a partir de una población y requiere también que la colonia que surja de esta célula se mantenga separada de otras células o colonias.

El aislamiento en medios líquidos, se realiza siempre que el microorganismo predomine en el material de partida. Se realiza una serie de diluciones con la finalidad de reducir el número de células, que al ser sembradas en placa se pueden separar fácilmente.

En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se establecen interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato común, la técnica utilizada y el tipo de medio seleccionado dependen de la naturaleza de la investigación, en general podemos tener:

a) se puede necesitar tener una cosecha de células;

b) puede ser necesario determinar el número y tipos de microorganismos presentes en una muestra o

c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural.

Siguiendo con una serie de condiciones la siembra en placa de una muestra permitirá producir colonias a un grupo seleccionado de formas, pero hará que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta razón es costumbre sembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de incubación diferentes como sea posible.

El sembrado en placa en un medio sólido nos proporciona células inmóviles o dentro del medio, las cuales estarán separadas y de ahí se pueden transferir a tubo con agar inclinado para su conservación.

Cultivo puro

Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola célula, generalmente se realiza para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas, es decir “caracterizar” una cepa.

a.- Aislamiento por estría simple

Esta técnica se aplica principalmente para muestras que poseen poca carga microbiana

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b.- Aislamiento por estría cruzada

Inocular con el asa la placa y realizar las estrías tal y como se muestra en el siguiente esquema

c.- Aislamiento por extensión con varilla

d.- Aislamiento por la técnica de vaciado en placa

Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribución homogénea del inoculo, las diluciones se

realizarán para que en un ml se obtengan de 25 a 250 UFC (unidades formadoras de colonias) de

bacterias y de 15 a 150 UFC de, mohos y levaduras. Las placas a contar se seleccionan entre estos

límites, según la recomendaciones de la NOM-092-SSA-1994; Método para la cuenta de bacterias

aerobias en placa.

En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que

deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos

productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.

Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibición,

producción de amilasas o producción de hidrólisis.

El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna

característica como hidrólisis o hemólisis.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 EQUIPO

Balanza digita

Autoclave

Cuenta colonias

Incubadora a 37oC y 20 °C

Horno a 170 °C

Bolsas de plástico estériles

3.2 MATERIAL

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Cuatro cajas de Petri estériles

Una gradilla metálica

Un cilindro con pipetas estériles de 10 y2 ml

Una varilla de vidrio acodada

Algodón y gasa

Cinco tubos de 16 X 150 mm con 9 ml de CLM

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Cuatro placas con medio EMB

Cuatro placas con medio ALM o ACS

Cuatro frascos de dilución con 90 ml de CLM

Un matraz con 100 ml de ACS o ALM

Cuatro placas de agar Baird Parker, cetrimida o sangre

3.4 REACTIVOS

Un Frasco con alcohol 50 ml de Tween 80 estéril

3.5 MATERIAL BIOLÓGICO

Muestra de producto (Gel para el pelo, desodorante, crema para la piel, champú, loción para afeitarse, agua de tocador, maquillaje, talco o esmalte)

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

4.1 Cuenta total de hongos, levaduras y mesofílicos aerobios Los equipos pares realizarán la determinación de mohos y levaduras y los nones la cuenta total aerobica.

Toma de muestra (del producto)

a) Analizar la muestra tan pronto como sea posible. Si es necesario almacenar, debe hacerse a la temperatura ambiente.

b) No incube, refrigere o congele las muestras antes o después del análisis.

c) Inspeccionar las muestras cuidadosamente antes de abrirlas y anotar cualquier irregularidad del contenedor de dichas muestras.

d) Desinfectar la superficie del contenedor con un algodón estéril impregnado una solución de etanol al 70% con 4% de yodo o benzal al 0,001%

4.2 Antes de abrir y tomar la muestra o contenido; secar la superficie con gasa estéril.

a)Homogeneizar el producto al tomar la muestra necesaria de acuerdo a su estado físico. Para líquidos,

agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos, mezclar el contenido con una espátula estéril;

para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y tomar una muestra representativa; y para

aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente, expeler apropiadamente la cantidad de

producto previa agitación.

b)Preparación preliminar de las muestras

c)Para las muestras que sean miscibles en CLM y CDS, adicionar 1 g o ml en 90 ml de CLM y 1 g o ml

en 90 ml de CDS en condiciones asépticas.

d)Para las muestras que no sean miscibles en CLM y CDS (ejemplo, cremas, labiales, etc.), en 2 frascos

estériles o bolsas de polietileno estériles debidamente etiquetados; uno para CLM y otro para CDS,

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adicionar 1 g o 1 ml de la muestra y agregar 0,5 ml de tween 80 estéril a cada uno de los frascos o

bolsas previamente marcados y homogeneizar la muestra.

e)En caso de usar los frascos poner en baño maría a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el

tiempo de exposición en el baño no debe exceder de 15 minutos).

f)Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 90 ml de CLM y 90 ml de CDS

respectivamente y agitar perfectamente.

4.3 Procedimiento

a)Incubar a 30ºC ± 2 durante 7 días los medios de cultivo inoculados. Marcar los frascos o bolsas que se

enturbien al agregar la muestra.

b)Confirmar si existe crecimiento a los 2 y 7 días de incubación.

c)Cuando el crecimiento sea evidente o se tenga duda de desarrollo microbiano, hacer una resiembra en

ALM y AEM, inoculando 0,5 ml de cultivo del CLM y CDS respectivamente, empleando el método de

vaciado en placa o de dispersión con codos de vidrio esterilizado.

d)Incubar durante 4 días a 30ºC ± 2.

Interpretación de resultados

Observar si hay crecimiento en los medios inoculados:

Si no hay crecimiento reportar: menos de 10 UFC/ml o g de muestra. Concluyendo el ensayo.

Si se presenta crecimiento, continuar con la prueba definitiva que se describe a continuación.

4.4 Cuenta total de mesofílicos aerobios, hongos y levaduras.

Procedimiento

a)Agregar por separado 10 ml o g de muestra a 90 ml de medio CDS y CLM (Dilución 10-1) cuando las

muestras sean miscibles en éstos.

b)Para las muestras que no son miscibles; en dos frascos o bolsas estériles debidamente etiquetados:

uno para CLM y otro para CDS, adicionar 10 g o ml de muestra y colocar 5 ml de tween 80 estéril a cada

uno de los frascos o bolsas previamente marcados. En caso de usar los frascos poner en baño de agua

a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo de exposición en el baño de agua no debe

exceder de 15 minutos).

c)Posteriormente agregar a cada uno de los frascos o bolsas 85 ml de CLM y 85 ml de CDS

respectivamente y agitar perfectamente. (Dilución 10-1)

d)A partir de la dilución 10-1, realizar diluciones seriadas según el crecimiento esperado de la siguiente

manera:

FRASCO DILUCIÓN VOLUMEN AGREGADO CLM o CDS ml

1 10-2o 1:100 10ml de dilución 10-1 90

2 10-3o 1:1000 10ml de dilución 10-2 90

3 10-4o 1:10 000 10 ml de dilución 10-3 90

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Para la cuenta estándar total, realizar las diluciones en CLM; y para la cuenta de hongos y levaduras,

realizar las diluciones utilizando el CDS. Mezclar hasta homogeneizar. Colocar 1 ml de cada dilución en

cajas de Petri estériles previamente marcadas con la dilución, registro y fecha, agregar de 18 a 20 ml de

medio de cultivo cuidando que la temperatura no sea mayor de 45ºC; para cuenta estándar total, utilizar

ALM; y para cuenta de hongos y levaduras, emplear AEM o PDA. Homogeneizar el inóculo en el medio

de cultivo, rotando la caja sembrada de izquierda a derecha, vertical y horizontalmente 6 veces en cada

ocasión. Dejar solidificar el medio de cultivo en las cajas. Si se emplea el método de dispersión con

codos de vidrio, utilizar 0,5 ml de inóculo por cada dilución y colocarlo en cajas de Petri conteniendo

ALM y AEM para cuenta estándar total y cuenta de hongos y levaduras respectivamente. Dispersar el

inóculo con codos de vidrio estériles. Dejar que se absorba el inóculo. Invertir las cajas e incubar: a 30°C

± 2 durante 48 horas para la cuenta estándar total; a 22ºC durante 5 días para la cuenta de hongos y a

35ºC por 48 horas para la cuenta de levaduras.

Interpretación de resultados

Cuenta total de hongos y levaduras

Contar el número de hongos y levaduras que se encuentren.

Reportar el número de colonias /ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada.

En el caso de utilizar el método por dispersión de codo de vidrio, el resultado se multiplicará por 2.

Concluyendo la prueba.

Cuenta total de mesofílicos aerobios

Contar las cajas en donde se encuentren de 25 a 250 UFC.

Reportar el número de UFC/ml o g de muestra multiplicando por el inverso de la dilución observada. En

el caso de utilizar el método por dispersión con varilla de vidrio, el resultado obtenido se multiplicará por

2.

4.5 Aislamiento por la técnica de estría cruzada

a)Sembrar por estría cruzada las placas de EMB, Agar nutritivo, Bair Parker o cetrimida con la suspensión proporcionada

b)Obtener la morfología colonial

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Conservación de la cepa

En un tubo de ensaye con agar de soya y tripticaseína inclinado, sembrar cada una de las colonias

aisladas y si es posible realizar una tinción de Gram para conocer la forma, agrupación y pureza.

En un tubo de ensaye con agar de papa y dextrosa inclinado, sembrar cada una de las colonias aisladas

de mohos y levaduras para su identificación.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Anotar los resultados en las tablas siguientes sobre la morfología colonial y microscópica de la bacteria, moho o levadura.

CARACTERÍSTICAS Medio de Cultivo:_________________

Tamaño

Forma

Elevación

Aspecto

Consistencia

Gram

Morfología microscópica

Con los resultados obtenidos por la técnica de vaciado en placa anota los resultados en la siguiente

tabla:

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DILUCIÓN MEDIO DE CULTIVO UFC/ ml

Con los resultados obtenidos por la técnica de extensión con varilla anota lo que se pide en la tabla

siguiente:

DILUCIÓN MEDIO DE CULTIVO UFC/ml

5.3.1 ¿La técnica de estría cruzada permite cuantificar el número de microorganismos presentes en una

muestra?

5.3.2 ¿Para que se hacen las diluciones? ¿Podría sembrarse una muestra en forma directa?

5.3.3 Menciona 3 ventajas y desventajas al efectuar las diluciones:

Con una misma pipeta y usarla para sembrar.

Con una pipeta para cada dilución y utilizar otra para sembrar.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS (Tercera sesión)

6.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas realizadas para el recuento de

microorganismos, así como los resultados obtenidos.

7. CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos

y la bibliografía consultada.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Atlas, R. W. Microbiology. 2ª. Edition. Mc. Millan Public. Co. 1988. 807 p.

8.2 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica

Panamericana. 2001. México. 1432 p.

8.3 Norma oficial mexicana 089-SSA1-1994.Bienes y Servicios. Métodos para la determinación del

contenido microbiano en productos de belleza

8.4 NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

Publicada en el diario oficial de la federación el día 12 de diciembre de 1995.

8.5 NOM-110-SSA1–1994, Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis

microbiológico.

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51

PRÁCTICA No. 5

CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

UNIDAD II: Cultivo de microorganismos.

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

1.1 El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a las características de este.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno conocerá los métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas de interés eligiendo el método más adecuado.

1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana.

2. INTRODUCCIÓN

En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, teniéndose

varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las características del

microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues

sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños como la deshidratación,

cambios genéticos o perdida de la viabilidad.

Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un

laboratorio son:

Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el

proceso de conservación;

Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y

Que estas células permanezcan genéticamente estables.

Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica

microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios

métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados,

que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos

restringidos.

A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.

Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han

muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones

sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los métodos de

conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.

Conservación por congelación.

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a

temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células

de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así

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conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde

todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro

factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la

edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y

empleo de agentes crioprotectores.

Conservación por liofilización.

Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el

agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a

veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de

las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla

mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la

viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores.

Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de

la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la

congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el

almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden

almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil.

Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que

influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la

deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en

nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de

microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de

evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es

conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del

agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como

crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y

actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores,

como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de glucosa con caldo

hígado (sin carne) para bacterias anaerobias.

Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de

conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación

alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.

B.- Métodos alternativos.

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los

equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por

estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que

se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

a).- Conservación por transferencia periódica.

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin

embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir

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activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y

muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el

peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una

alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán

descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus

características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con

esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que

podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los

microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en

tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es

que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo

y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.

b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de

microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender

en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos, en este

caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso de bacterias y

levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de

agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en

agua de mar diluida.

C.- Métodos restringidos.

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a

la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o

la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.

a).- Desecación en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se

deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se

llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación

previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un

vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,

ocasionando la congelación incontrolada de las células.

b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos

productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es

barato y de fácil conservación.

c).- Desecación en bolitas de alginato.

Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del

agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta

que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos

cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC

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debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.

Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.

Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el

porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,

bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1. EQUIPO

Incubadora a 35 ° C

Congelador

Refrigerador

Autoclave

Horno

Balanza digital

3.2. MATERIAL

Cajas de Petri

Portaobjetos

Pipetas de un ml

Gasa y algodón para un tapón

Un tubo eppendorff de dos ml

Una espátula de acero inoxidable

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:

Dos tubos de 13 X 100 con TSA inclinado con tapón de baquelita

Un tubos con 4 g de arena estéril

Un matraz con 80 ml de ACS

Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base sangre con tapón de algodón

Cinco tubos con 9 ml de solución salina

Un matraz con 30 ml de BHI

Un matraz con 30 ml de caldo BHI

Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado en tubos con tapón de baquelita (Cosecha de esporas)

Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado con tapón de baquelita

Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapón de algodón.

Un matraz con 80 ml de PDA

Un tubo de 13 X 100 mm estéril con tapón de baquelita

3.4. REACTIVOS:

Glicerol al 60 % estéril

Acido tartárico

Colorantes para tinción de esporas

Aceite mineral

Colorantes para tinción de Gram

Azul de algodón lactofenol

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3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL

Escherichia coli Agar eosina azul de metileno

Rhizopus sp Agar de papa y dextrosa

Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y dextrosa

Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y dextrosa

Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa

Agar cetrimida

Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente:

Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar

1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae

2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger

3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii

PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DÍA 1

1)Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo

esporulado, realizar la tinción de esporas.

2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del

microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 °C durante toda la noche

en agitación a 150 rpm.

DÍA 2

3)A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a 35

°C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con

tapón de algodón.

4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de

conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.

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DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente

Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente

Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C

Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C

Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te ha tocado

La suspensión es para obtener el número de células / ml

Del matraz realizar lo siguiente:

4)Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.

Conservación en congelación

5)Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene

arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente

6)Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión

microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas

diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos

cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.

En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a

continuación.

Nombre de la cepa

Fecha de siembra del matraz

Fecha de siembra de los tubos

Fecha de conservación

Determinación de viabilidad (1era. vez)

Determinación de viabilidad (2da.da vez)

% de Viabilidad

Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:

Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del

microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha

conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.

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Cepa a conservar Medio de cultivo

Conservación a temperatura ambiente

Conservación a 4 °C

Conservación con aceite mineral y a 4 °C

Escherichia coli EMB

Bacillus subtilis AN

Micrococcus luteus AN

S. aureus ASM

S. cerevisiae ACS

P. aeruginosa Agar cetrimida

L. delbrueckii Medio MRS

Al tubo (eppendorff)

1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina

2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones

3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa

4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas

5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad

Al tubo con arena

1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina

2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones

3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa

4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas

5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad

PARA MOHOS: DÍA 1

1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica).

2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón

3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita

4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita

5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C

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DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente

Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón

Se conservará a temperatura ambiente

Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita

Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C

Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita

Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C

Tubo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita

Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml de solución salina y con la ayuda del asa resuspender para tener la cosecha de esporas y poder obtener el No de células / ml

Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente:

1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo

2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente

etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.

3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene

arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente

4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión

microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas

diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos

cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.

En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a

continuación.

Nombre de la cepa

Fecha de siembra del matraz

Fecha de siembra de los tubos

Fecha de conservación

Determinación de viabilidad (1era. vez)

Determinación de viabilidad (2da.da vez)

% de Viabilidad

Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:

Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.

Cepa a conservar Medio de cultivo

Conservación a temperatura ambiente

Conservación a 4 °C

Conservación con aceite mineral y a 4 °C

Rhizopus sp PDA

Aspergillus niger PDA

Penicillium sp PDA

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Al tubo (eppendorff)

1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina

2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones

3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa

4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C

5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad

Al tubo con arena

1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina

2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones

3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa

4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C

5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación

Método /cepa Temperatura ambiente

Refrigeración Crecimiento +

Refrigeración + Aceite Crecimiento +

Congelación UFC/ml

Arena UFC/g

Escherichia coli

B. subtilis

M. luteus

S. aureus

S. cerevisiae

P. aeruginosa

L. delbrueckii

Rhizopus sp

Aspergillus niger

Penicillium sp

+ Solo indicar si hay abundante o no.

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Después de la conservación

Método /cepa Temperatura ambiente

Refrigeración Crecimiento

Refrigeración + Aceite Crecimiento

Congelación UFC/ml

Arena UFC/g

Escherichia coli

B. subtilis

M. luteus

S. aureus

S. cerevisiae

P. aeruginosa

L. delbrueckii

Rhizopus sp

Aspergillus niger

Penicillium sp

Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM)

5.1 Según el microorganismos que conservaste ¿Cuál es el mejor método para consérvalo?

5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.

5.2 ¿Cual el papel del crioprotector?

5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica

5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio que utilizaste

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación

7. CONCLUSIONES

Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la

bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 10ª. Edición. Prentice-Hall.

España.

8.2 Prescott, H, Microbiología, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p.

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8.3 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª

Edición. Interamericana. México. 140 p.

8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios

que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico

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PRACTICA No. 6

DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES, MESOFÍLICOS AEROBIOS, MOHOS Y LEVADURAS, EN SUPERFICIES VIVAS E INERTES.

UNIDAD III: Ecología de los microorganismos

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

El alumno determinara la presencia de microorganismos indicadores de la calidad sanitaria en una superficie.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno explicará que son los microorganismos indicadores y realizará la determinación de ellos.

1.2.2 Utilizara las normas oficiales mexicanas para el recuento de estos microorganismos y determinará si la superficie esta bien higienizada.

2. INTRODUCCIÓN.

Evitar la contaminación por microorganismos en el lugar donde se preparan medicamentos en diferentes

presentaciones es una de las actividades más importantes para toda empresa farmacéutica, sobre todo

porque al prepararse este tipo de sustancias en el ambiente y suelo pueden existir residuos que hacen la

selección de resistentes a estos medicamentos. La eliminación adecuada de los microorganismos

constituye una fase importante en la higiene de las plantas.

Así ocurre con el agua, la tierra, la fauna, los manipuladores, o el equipo y envase que finalmente

habrán de contenerlos.

Las superficies contaminadas, los utensilios y el equipo mal higienizado, constituyen una fuente

importante de microorganismos patógenos o saprofitos.

Mucho dinero y esfuerzo invertido en una planta para seleccionar materias primas e instalar equipo

costoso puede perderse si la limpieza y desinfección en general, o específicamente en los puntos

críticos, no se realiza o evalúa su eficacia correctamente.

Las bacterias mesofílicas aerobias son las que crecen a 35 ± 2°C, de 24 a 48 ± 2 horas, en agar cuenta

estándar o en agar triptona extracto de levadura, este grupo esta formado por cocos o bacilos Gram

positivos y negativos, así como un amplio grupo de especies como: cromógenos, proteolíticos,

fermentativos, lipolíticos, psicrotróficos, patógenos, saprófitos, etcétera.

En muchos productos, este grupo de microorganismos arroja los máximos recuentos, aunque

dependiendo de la naturaleza de los ingredientes, así como de las condiciones higiénicas en las que se

prepararon y conservaron se puede predecir la vida de anaquel.

También llamadas bacterias indicadoras ya que se utilizan como indicadores de la calidad sanitaria, del

valor nutricional de alimentos perecederos, del agua potable, equipo y otros productos, así como

indicadores de la posible presencia de microorganismos patógenos.

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables, la técnica comúnmente utilizada

es la cuenta por vaciado en placa (NOM 092 SSA y 089-SSA), donde la técnica no pretende poner en

evidencia a todos los microorganismos, pues tenemos una gran variedad de especies y tipos diferentes

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por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc.,

hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y

la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.

El recuento de mohos y levaduras tiene importancia como recurso para apreciar algunos aspectos de la

higiene aplicada durante el procesamiento, para seguir la eficacia de su tratamiento germicida y en

determinadas circunstancias para los riesgos que pueden resultar en la formación de toxinas al

incrementar su número.

En general, simultáneamente con el recuento de mohos puede realizarse el de las levaduras, ya que el

medio de cultivo les proporciona también buenas condiciones para su desarrollo. Sin embargo, cuando

se presenta un desarrollo excesivo de mohos, difícilmente puede efectuarse el recuento de las colonias

de las levaduras.

El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo

específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el

crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos, es decir seguimos el

procedimiento de la NOM-111-SSA.

Al contar las colonias de hongos en las placas hay que cuidar de individualizar cada una debido a la

confluencia ocasional en el desarrollo de colonias cuyo centro no existe o es difícilmente perceptible,

puede haber cierta dificultad en el recuento; ésta se elimina o disminuye cuando éste se realiza en las

primeras 72 horas de incubación.

Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varios microorganismos. Existe

poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico.

La falta de certeza en cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos

recomendados para la detección de coliformes han presentado problemas. El primero, es que

Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen

gas de la lactosa o lo hacen después de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta

técnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está frecuentemente asociada a genes

localizados en plásmidos. Estos determinantes extracromosomales son fácilmente transferidos entre

otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser

recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha demostrado su

efectividad.

El número de organismos presentes en un alimento se establece mediante la cuenta de unidades

formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Método para la cuenta de microorganismos coliformes

totales en placa) o el uso de la técnica del número más probable. Esta última, también llamada técnica

de dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente con

base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el

volumen de muestra inoculado.

Los organismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios

facultativos, que a 35 °C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones de la NOM-

112 –SSA-1994.

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Las placas con medio deshidratado aún cuando no están normalizado en todos los productos elevan la

eficiencia de un laboratorio debido a que disminuyen grandemente el espacio, los medios de cultivo, el

tiempo de preparación, materiales y costos. Contrariamente a los métodos tradicionales están listas para

recibir la muestra y también se pueden utilizar en forma directa para muestras de tipo ambiental. Existen

diversas placas para el recuento de los microorganismos

Las placas están recubiertas con nutrientes gelatinosos e indicadores especiales que colorean la colonia

dándoles contraste para su fácil identificación; en forma general, la placa Petrifilm consta de:

3. MEDIOS DE CULTIVO, MATERIAL, REACTIVOS, EQUIPO Y MUESTRAS POR EQUIPO.

MEDIOS DE CULTIVO

Tres frascos con 100 ml de CLM o agua peptonada

Un matraz con 100 ml de ABRV

Un matraz con 100 ml de ACS

Un matraz con 100 ml de PDA

Dos placas con medio deshidratado para OMA

Dos placas con medio deshidratado para OC

Dos placas con medio deshidratado para Mohos y levaduras

Cuatro placas con agar nutritivo

MATERIAL

Doce cajas Petri

Cuatro pipetas de 2 ml y 4 de 10 ml

Cuatro bolsas de plástico transparente

Dos esponjas estériles

REACTIVOS

Un Frasco con alcohol 1 frasco con 50 ml de ácido tartárico al 10 % estéril

EQUIPO

Autoclave

Incubadora con termómetro

Baño de agua a la temperatura de 45.

Horno para esterilizar de 170 °C.

Potenciómetro

Balanza digital

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SUPERFICIES A MUESTREAR

Manos sucias

Manos limpias

Mesa sucia

Mesa limpia

4.-DESARROLLO EXPERIMENTAL.

A.- Técnica normalizada de vaciado en placa

4.1 SUPERFICIES VIVAS: MANOS SUCIAS

a)Vaciar 100 ml de caldo Letheen modificado o agua peptonada al 0.1 %. En una bolsa de plástico

nueva.

b)Introducir y enjuagar sin frotar bruscamente las manos de la persona en la bolsa que contiene el

diluyente.

c) Regresar el diluyente al frasco de dilución, siendo esta dilución 10-¹ después realizar la dilución 10-² en

un tubo que contiene 9 ml del diluyente utilizado.

d) Sembrar por duplicado la dilución 10-² para organismos mesofílicos aerobios y organismos coliformes

totales, para mohos y levaduras sembrar la dilución 10 -1.

e) Determinar los organismos coliformes, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².

f) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores,

depositando un ml de la dilución.

4.2 SUPERFICIES VIVAS: MANOS LIMPIAS

a)La misma persona ahora se lava las manos con jabón y agua de la llave, después se vuelve a

enjuagar las manos en la bolsa de plástico que contiene 100 ml del diluyente.

b)Regresar el diluyente al frasco, siendo esta la dilución 10-¹.

c)Sembrar por duplicado la dilución 10-¹ para organismos mesofílicos, coliformes totales y mohos y

levaduras.

d)Determinar los organismos coliformes, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².

e) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores,

depositando un ml de la dilución.

4.3 SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES SUCIAS

a)Medir 25 x 25 cm² de la superficie de la mesa.

b) Limpiar con una esponja estéril humedecida con el diluyente.

c)Lavar la esponja dentro de la bolsa que contiene los 100 ml del diluyente y regresar al frasco, esta dilución es 10-¹, si la superficie esta muy sucia realizar la dilución 10-²

d)Sembrar por duplicado la dilución 10-² para organismos mesofílicos y organismos coliformes totales, para mohos y levaduras sembrar la dilución 10 -1.

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e)Determinar organismos coliformes, organismos mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/ cm².

f)Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los microorganismos indicadores, depositando un de la dilución.

4.4 SUPERFICIES INERTES: SUPERFICIES LIMPIAS

a)Limpiar el área seleccionada con benzal o el higienizante que normalmente se utiliza, después limpiar

con una esponja estéril y lavarla dentro de la bolsa que contiene 100ml del diluyente.

b) Regresar el diluyente al frasco siendo esta la dilución 10-1.

c) Sembrar por duplicado la dilución 10-1 para los organismos mesofílicos, coliformes totales y mohos y

levaduras.

d) Determinar los organismos coliformes totales, mesofílicos aerobios y mohos y levaduras en UFC/cm2.

e) Sembrar en placas con medio deshidratado para cada uno de los organismos indicadores,

depositando un ml de la dilución.

4.5.- TÉCNICA DE EXTENSIÓN CON VARILLA

a) Practicar esta técnica de aislamiento y recuento con una de las diluciones para la determinación de

organismos mesofílicos aerobios.

b) En una placa que contenga agar cuenta estándar o agar Letheen modificado, colocar 0.5 ml de la

dilución correspondiente, realizar el sembrado por duplicado.

c) Colocar en una base de una caja de Petri un poco de alcohol (retirado de la flama del mechero) y

humedecer una varilla de vidrio acodada, flamearla en la flama del mechero, realizar esta operación una

vez más y dejar enfriar.

d) Extender con la varilla el inóculo en la superficie de la placa.

e) Incubar las placas a 35 °C por 24 – 48 h.

f) Contar las colonias que crecieron en la placa y realizar los cálculos necesarios para repórtale número

de UFC/ ml, siguiendo las sugerencias de la NOM 092-SSA…

4.6- PLACAS CON MEDIO DESHIDRATADO PARA ORGANISMOS COLIFORMES, HONGOS Y LEVADURAS Y ORGANISMOS MESOFILICOS AEROBIOS

a)La preparación de la muestra se realiza tal y como se indica en la técnica y las diluciones son las que

elija el analista según el tipo de muestra.

b) Para la inoculación levantar la superficie superior con mucho cuidado y con la pipeta inocular 1 ml de

la dilución en el circulo delimitado.

c) Con mucho cuidado dejar caer la superficie superior evitando la formación de burbujas.

d) Con el difusor extender la muestra por toda la superficie delimitada presionando con cuidado.

e) Dejar que la muestra se difunda por un minuto e incubar a 35 2 ºC.

f) Leer las placas con el contador de colonias o en forma visual.

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g) En el caso de muestras ambientales o de superficie, hidratar la placa con un mililitro de solución

salina fisiológica y dejar que se hidrate le medio por tres minutos.

h) Levantar la superficie superior con mucho cuidado y colocar los dedos de la persona a la cual se le

quiere determinar el con la pipeta inocular 1 ml de la dilución en el circulo delimitado.

PLACAS PARA RECUENTO AERÓBICO

Se presentan colonias rojas en la superficie de la placa, en ocasiones el número es mayor de 250 UFC,

en tal caso contar las colonias en 1 cm2 y multiplicar por 20 para obtener el número total, esto es porque

el área total de una placa es de 20 cm2.

PLACAS PARA RECUENTO DE COLIFORMES

El indicador rojo en la placa colorea las colonias, la película superior atrapa el gas producido por los

microorganismos coliformes.

PLACAS PARA RECUENTO DE Escherichia coli

Tiene el indicador β-glucoronidasa para la detección de coliformes.

Las colonias de E. coli producen la enzima glucoronidasa reaccionando con el indicador lo que da como

consecuencia un precipitado azul alrededor de la colonia, muchas colonias producen gas quedando

atrapado en la película. Las colonias que no son E. coli muestran un color rojo.

PLACAS PARA RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS

MOHOS

Colonias más largas

Colonias difusas

El color es variable por los pigmentos

LEVADURAS

Colonias pequeñas

Colonias bien definidas

Colores tenues

En el caso de tener muchas colonias contar un cm2 y multiplicar por 30.

El tiempo de incubación y la temperatura es similar a los métodos convencionales en placa.

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INFORME DE LA PRUEBA

Reportar como: Unidades formadoras de colonias,_________ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas a _________ horas a _______ ° C.

Reportar como: Unidades formadoras de colonias,_________ UFC/g o ml, de organismos coliformes totales en placa en agar de bilis rojo violeta, incubadas a _________ horas a _______ ° C.

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 3-5 días.

Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 ¿Cuando realizo tres diluciones (10-2, 10-3 y 10-4 ) y no hay crecimiento cómo se debe de reportar?

5.2 ¿Cuál es la importancia de determinar organismos coliformes, organismos mesofílicos y mohos y levaduras en superficies vivas y en superficies inertes?

5.3 ¿Qué problemas causan el elevado número de estos indicadores sanitarios?

5.4 ¿Cómo se lleva a cabo la sanitización de equipos, instrumentos, que son requeridos para el procesamiento de medicamentos a nivel industrial?

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En la siguiente tabla anota los resultados obtenidos en el grupo.

Equipo Superficie No. de bacterias mesofílicas aerobias /cm 2

No. de bacterias coliformes totales / cm 2

1 Manos sucias

2 Manos limpias

3 Mesa sucia

4 Mesa limpia

Valor permitido por la NOM 093

Superficies vivas

< 3 000 UFC/cm2 < 10 UFC/cm2

Valor permitido por la NOM 093 .-- Superficies inertes.

< 400 UFC/cm2 < 200 UFC/cm2

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Analiza la presencia o ausencia de organismos mesofílicos aerobios y organismos coliformes totales en

las superficies el método de análisis y la norma utilizada. Busca el intervalo de organismos mesofilicos

aerobios y el de organismos coniformes totales de la misma superficie en otro país y compara los datos.

7.- CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica.

8.- BIBLIOGRAFÍA

8.1 NOM 089- SSA1 – 1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza.

8.2 NOM-092- SSA ---1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

8.3 NOM 093 - SSA1 – 1994, Bienes y servicios. Practicas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos.

8.4 NOM 111- SSA1 – 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

8.5 NOM 113- SSA1 – 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

8.6 Fernández, E. Microbiología e inocuidad alimentaria, Ed. Universidad de Querétaro. 2000. México. 931 p.

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PRACTICA No. 7 PRUEBAS PARA IDENTIFICAR BACTERIAS, MOHOS Y LEVADURAS.

PARTE I

UNIDAD IV: Identificación bacteriana

1. OBJETIVOS:

Objetivo general

El alumno identificará bacterias de interés farmacéutico, a través de su metabolismo microbiano.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono.

1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad enzimática.

1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-reducción.

2. INTRODUCCIÓN

El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de

compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar

reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a

este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según su

origen:

a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).

b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).

c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).

d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y

anaerobios estrictos).

La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias

y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en

género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada

especie.

En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una

serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan

los cambios de pH o la presencia de un subproducto.

Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los

microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y

observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo

en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de

crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y

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saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además en la morfología microscópica permite conocer la forma y

agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)

Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológicos. Las pruebas de

identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y

económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen

enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica aunque la

formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un

momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.

Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie)

son:

Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema

VITEK, Identificación por PCR, etc

En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera

tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el

fundamento.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc lac,

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol,

sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base

CRF.

Fermentación de la glucosa, producción

de ácido sulfhídrico, producción de gas,

en el medio TSI

Descarboxilación de la lisina, en el

medio LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina

y la producción de indo, en el medio MIO

Movilidad, producción H2S, producción de

indol, en el medio SIM

Prueba cuantitativa para la producción

de ácidos. Prueba de Rojo de metilo,

medio RM/VP

Producción de ureasa, en caldo urea

Producción de acetil metil carbinol.

Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

la gelatina), en el medio gelatina

Crecimiento en caldo nutritivo

Utilización de la esculina, medio de bilis

y esculina

Utilización del gluconato (oxidación),

medio caldo gluconato peptona

Requerimientos de oxígeno, condiciones

aerobias y anaerobias

Producción de Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos, en caldo nitrato.

Detección del metabolismo oxidativo

/Fermentativo, en el medio OF con

sacarosa

Utilización del citrato, en citrato de Sodio

Utilización de Malonato, en malonato

PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac, Crecimiento en bilis al 40 %

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manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,

raf, ram, xilosa, etc.)

Fermentación de la glucosa, producción de

ácido sulfhídrico, producción de gas, medio

de TSI

Descarboxilación de la lisina, medio de LIA

Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la

producción de indol, medio de MIO

Movilidad, producción de indol y producción

de ácido sulfhídrico, medio SIM

Producción Catalasa y oxidasa

Reducción de nitratos

Producción de hemólisis, en agar sangre

Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %

Sensibilidad a optoquina y bacitracina

Coagulasa

Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la

gelatina), en el medio gelatina

Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina

Producción de acetil metil carbinol, prueba

Voges – Proskauer, medio VP/RM

Producción de la fosfatasa, medio PDP

Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN

Crecimiento a 10 y 45 ª C

Reducción con azul de metileno en leche

Hidrólisis en caldo hipurato de sodio

Formación de cápsula

Hidrólisis de almidón,

Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin

pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos

realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.

FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS

1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de

almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.

2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL

Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene

rojo de fenol.

3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)

Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar

hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de

la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro

férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de

los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de

glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2

cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su

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superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es

relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de

flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin

de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el

pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego

se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de fenol y un

pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.

4. PRUEBA DE ROJO DE METILO

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es

cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos

láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen

muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos

organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h),

contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes

5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en

diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol

actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp

UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS

6. PRUEBA DE CITRATO

Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de

ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende

una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los

productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce

más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay producción

de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético.

Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del

citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,

un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales

de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de

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citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono

como fuente de carbono.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes

7. PRUEBA DE MALONATO

Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,

con la consiguiente alcalinidad.

El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido

fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso de

inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos de

manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona

un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.

Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la

oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto

ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma

otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como

el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, recurre al ciclo del

ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo.

Indicador de pH: Azul de bromotimol

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis

8. PRUEBA DE UREASA

La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de

amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la

urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco

reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un

aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.

Controles

Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli

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HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:

9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son

detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son

demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a

componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por ciertas

bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El

catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y

posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.

Controles

Prueba Control negativo Control positivo

Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus

10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H2S E INDOL).

El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,

para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la

turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de

sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del

tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).

La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina

putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar

si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para

determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido

triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos

indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en

conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.

Control

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Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae

Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp

Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp

12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)

En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.

La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La

descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas

específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una

diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la

cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido

en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la

alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es

irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.

El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina

cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si

recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se

deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3

cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de

bromocresol.

Controles:

Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO

13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada

para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos

biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.

Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar

nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo -

naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - -

naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los

reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es

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necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn

reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la

presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.

Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus

14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO

DE HUGH Y LEIFSON

Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos

de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de

fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son

sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,

como el medio OF.

Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:

a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.

b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.

c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.

La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden

neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La

concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción

de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se

difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es

también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.

La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden

no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas

pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación

final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se

inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm

desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el

otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o

más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.

Interpretación.

Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto

Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde

Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo

No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde

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Controles

Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp

15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO

Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga KCN.

La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de

la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación

– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo

trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final

de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie

bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo oxidasa a nivel

del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con el O 2 y actúa como aceptor final de electrones,

bloqueando la respiración.

Controles

Prueba Control positivo Control negativo

KCN Klebsiella Escherichia coli

16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena

respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema

citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la

prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son

anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser

enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de

Pseudomonas o Neisseria (positivas).

**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de

electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en

presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.

La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:

1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias

aisladas que se han desarrollado en la placa.

2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,

3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.

En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se

recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la

superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.

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Controles:

Prueba Control positivo Control negativo

Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA

Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias

y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en

peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura

similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del

metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de

hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y

oxígeno en agua.

Controles

Prueba Control positivo Control negativo

Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp

18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.

Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.

aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida

por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una

proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.

19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)

La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran

variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración

final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio

está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El

tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está

asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la hemólisis se asocia con una

hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.

20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %

Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les

denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en

condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal

hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a

diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.

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3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1. EQUIPO

Incubadora a 35 ° C

Microscopio

Autoclave

Horno

3.2. MATERIAL

Portaobjetos

Pipetas Pasteur

Gradilla metálica

Asas bacteriológicas

Colorantes para tinción de esporas

Colorantes para tinción de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:

Pruebas de cada uno para Gram positivos

Tinción de esporas

Hidrólisis de almidón

Hemólisis en agar sangre

Resistencia a polimixina de 300

Prueba de TSI

Prueba de SIM

Prueba de MIO

Licuefacción de la gelatina a 22 °C

Utilización del citrato

Prueba de oxidación –fermentación

Prueba de Voges Proskauer

Prueba de ureasa

Fermentación de glucosa

Fermentación de manitol

Fermentación de arabinosa

Fermentación de Xilosa

Fermentación de lactosa

Crecimiento en NaCl al 6.5 %

Prueba de reducción de nitratos

Prueba de catalasa

Prueba de oxidasa

Prueba de coagulasa

Pruebas de cada uno para Gram negativos

Hidrólisis de almidón.

Crecimiento en MacConkey.

Prueba de TSI.

Prueba de LIA

Prueba de citrato.

Prueba de MIO

Prueba de SIM.

Licuefacción de la gelatina

Prueba de oxidación-

fermentación.

Prueba de ureasa.

Prueba de reducción de nitratos.

Fermentación de glucosa.

Fermentación de lactosa.

Fermentación de sacarosa

Fermentación de manitol.

Fermentación Xilosa.

Rojo de metilo.

Prueba de Vogues Proakauer

Crecimiento en caldo KCN.

Prueba de malonato.

Prueba de catalasa y catalasa

3.4. REACTIVOS:

Solución de rojo de metilo

Solución de alfa-naftol

Solución de KOH

Aceite mineral

Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %

N,N,N,N-tetrametil-p-

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Reactivo de Kovac o Erlich

Solución de ácido sulfanílico

Solución de alfa naftilamina

Plasma de conejo

Tween 80 estéril

Plasma de conejo

fenilendiamina

Reactivos para tinción de Gram

Reactivos para tinción de esporas

Oxidasa

Catalasa

Jeringas de 10 ml

3.5. BACTERIAS:

Escherichia coli

Salmonella typhi

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Shigella sp

Micrococcus luteus

Staphylococcus aureus

Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis

Corynebacterium glutamicum

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

A. Preparación del inoculo

a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la

morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está

es necesario re-aislar.

b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y

homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.

c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)

d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores

Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)

Picadura y estría (TSI, LIA)

Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF )

Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO3 ,KCN..)

e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa

o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad

de inoculo.

f)Colocar una batería de bioquímicas como testigo

g)Incubar los tubos 24 horas y leer

h)La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para

un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.

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B LECTURA DE PRUEBAS

PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

RESULTADO

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

Hidrólisis de almidón

Agregar lugol sobre la estría

+ Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.

- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fermentación de manitol

+Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de lactosa

+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas

- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.

Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla

Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio.

Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio.

Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.

Producción de H2S ( - ): sin coloración.

Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.

Prueba de rojo de metilo

Agregar 2 gotas de rojo de metilo

+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol).

-Negativa: No hay cambio en el color

Prueba de Voges-Proskauer

agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH

+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.

- Negativa: El cultivo no cambia de color

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PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

RESULTADO

UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS

Utilización de citrato de sodio

+ Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul

- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Utilización de malonato de sodio

Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).

Negativa: No hay desarrollo (medio de

Hidrólisis de urea Producción de ureasa

+ Positiva: Color rosa fucsia en el medio.

- Negativa: Sin cambio de color en el medio

HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Licuefacción de la gelatina

Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco

minutos.

+ Positivo: licuefacción de la gelatina.

- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar, descartar la prueba negativa hasta los 14 días.

MIO (movilidad, indol y ornitina)

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.

Descarboxilación de la ornitina:

+ Positiva: Color púrpura del medio.

- Negativa: Color amarillo del medio.

Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de kovacs y se observa:

- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.

- Negativo: No se forma el anillo.

SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo

Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.

Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.

Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

LIA (Desaminación y descarboxilación de aminoácidos)

Desaminación de aminoácidos:

+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.

- Negativa: La superficie no tiene cambios.

Descarboxilación de aminoácidos

+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.

- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.

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PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO

METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de nitratos a nitritos

Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.

+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos

- Negativa: Sin cambio de color.

Prueba del cianuro de potasio

+ Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)

- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)

Prueba de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).

+ Positiva: aparición de un color azul violeta.

- Negativa: No hay cambio de color.

Determinación de metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa (OF)

TUBO SIN SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

TUBO CON SELLO DE ACEITE

Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios

Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

Prueba de la catalasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.

+ Positiva: Presencia de burbujas de oxígeno.

- Negativa: Ausencia de burbujas de oxígeno.

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PRUEBA

LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

RESULTADO

Prueba de la

coagulasa (Solo

para cocos Gram

positivos)

a)-Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo con

0.5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC

durante 24 h.

b)Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus y

S. epidermidis como testigos positivo y negativo.

c)-En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior, 0.2

ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con

solución salina estéril.

d)-Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6

h a intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar

a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de

coágulo.

e)Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se

añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma

reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 s.

f)En caso de utilizar plasma de humano citratado o heparina.

Positiva: Coagulación del plasma.

Negativa: El plasma esta líquido.

Hemólisis en

agar sangre (solo

para cocos Gram

positivos)

a)-En una placa con agar sangre estriar con la cepa presuntiva

de Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el asa en el

medio, para crear un ambiente de microaerofilia.

b)Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de

hemólisis que presenta.

Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.

Positiva: Hemólisis color verde tenue alrededor de la colonia.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.

Crecimiento en

NaCl AL 7.5 %

Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo

registrar la turbidez.

Positiva: Turbidez del medio.

Negativa: Sin cambio de color en el medio.

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5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el

desarrollo de la práctica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.

Nombre del microorganismo: ______________________________________________________

5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las

pruebas de hidrólisis del almidón.

5.2. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se

emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.

5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?

5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál

es su intervalo de sensibilidad?

5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos

microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,

la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de

los microorganismos.

7. CONCLUSIONES

7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la

bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica

Panamericana. 2001. México. 1432 p.

8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.

Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p.

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Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos

Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R

Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +

Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -

Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -

Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +

Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x

Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +

Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -

Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +

O / F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT

Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·

Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·

Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·

Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·

Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·

Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·

Arachnia · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·

Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·

Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·

Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +

Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +

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Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R

Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -

Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* - +

Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +

Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -

Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -

Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +

Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F

Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·

Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·

Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·

Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·

Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·

Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·

Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·

Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·

Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·

Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·

Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·

Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·

Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·

Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +

Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +

Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +

Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +

Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +

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Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.

Significado Símbolo

Tabla No. 1

* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)

También Actinomyces odontolyticus

D Reacciones diferentes en distintas especies del género

d Reacciones diferentes en distintas cepas

F Fermentación

O Oxidación

w Reacción débil

x No se conoce

<> Variantes no esporágenas

Formas típicas

Presentan algunas características comunes

S Cocos

R Bacilos

NT No probada

Tabla No. 2

* Crecimiento en aire + CO2

Crecimiento en oxígeno 5-6%

‡ También Shigela dysenteriae

Forma típica

x No se conoce

Presentan algunas características comunes

NT No probada por métodos comunes

Para ambas tablas

+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)

d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)

- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)

( ) Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío

(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas

(w) Reacción débil y tardía

w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas

D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)

· No se conoce Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University 1974. pp167.

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MÉTODOS RÁPIDOS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA

Recientes avances biotecnológicos son usados para la identificación de microorganismos por medio de pruebas de

identificación bioquímica de manera miniaturizada y automatizada haciéndose la identificación más rápida y

económica.

Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir

específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello se han

desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como el sistema API

El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram

negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.

Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos

deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana

Reactivos complementarios: API OF

Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API 20 E y el

API STAPH.

INSTRUCCIONES

1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un caldo

nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.

2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA,

IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.

3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml

de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar en la lengüeta lateral.

4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación

5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y a una

turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.

6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de una

pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.

7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con aceite de

parafina.

9) Cerrar la cámara de incubación

10)Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+

Lectura de interpretación:

11)Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)

12)Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la cúpula indica

una reacción (+)

13)Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una débil

coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).

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14)Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3, como la

galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que corresponden a las

reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.

15)Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de identificación.

16)En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de Nitratos a

nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de 2 a 5 minutos y una

coloración roja indica una reacción (+)

17)Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli

ONPG ADH LCD ODC

H2s URE TDA IND

GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2

- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -

+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -

Tabla de lectura

Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo

ONPG 2 nitro fenilβD-galactopiranosido

0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil βD galactopiranosido

Incoloro Amarillo (1)

ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)

LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado

ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)

CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l

H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro

URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)

TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo

IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa

VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)

GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro

GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación- fermentación

Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo

MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación-Oxidación

Azul-azul verdoso amarillo

INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación INOsitol

Azul-azul verdoso amarillo

SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación SORbitol

Azul-azul verdoso amarillo

RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación RHAmnosa

Azul-azul verdoso amarillo

SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación SACarosa

Azul-azul verdoso amarillo

MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación MELobiosa

Azul-azul verdoso amarillo

AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación –Oxidación

Azul-azul verdoso amarillo

ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Oxidación

Azul-azul verdoso amarillo

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1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa

3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)

4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula

5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa

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PARTE II

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo general

El alumno identificará mohos filamentosos y levaduras de una muestra.

1.2 Objetivo específicos

1.2.1 El alumno identificará un moho por medio de la técnica Ridell (microcultivo).

2.-INTRODUCCIÓN

Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo

como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.

Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies

causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura. En

la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a

partir del género Penicillium.

En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para

elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos, etc.

Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de

derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.

También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.

MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS

Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos.

Los mohos mi8croscópicos pueden ser:

1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.

2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células.

Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples,

membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular.

Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de

quitina o mananas. Además la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta

esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos.

El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama

hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto

que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas

coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas

pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en:

1) Mohos con micelio cenocítico : son los que carecen de septos o tabicaciones

2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.

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Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones más delgadas o anchas. El diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.

En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:

1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.

2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen estructuras de reproducción.

Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37º C en el cuerpo humano, se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25º C presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.

REPRODUCCIÓN

Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas

para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio

ambiente, sin embargo son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas

fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A

continuación se muestran la clasificación de estas esporas:

Esporas asexuales:

I.- Talosporas:

a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares con doble pared gruesa.

b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.

c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que les confiere gran resistencia.

II.- Conidiosporas.

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Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas, llamadas conidioforos.

a)Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaños, formas y colores. Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.

b)Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La forma de estas estructuras varía, según el género.

III.- Esporangiosporas.

Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.

Esporas sexuales

I.- Cigosporas o Zigosporas:

Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos, desarrollándose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).

II.- Ascosporas.

De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho ascosporas.

III.- Basidiosporas

De la fusión de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.

IV.- Oosporas

Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio (gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.

FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.

Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila

lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general

tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de biosíntesis

los llevan a cabo por las vías más comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones más severas que

otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada,

frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.

El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero también resisten la

falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30º C.

Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0º C

(mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos).

Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o

celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno

inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.

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De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas

cuando poseen con color café oscuro

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL

Pipetas de 1 ml

Bisturí

Mechero

Caja de Petri con Varilla en forma de “V” con porta y cubreobjetos estériles.

Asa micológica

3.2 EQUIPO

Autoclave

Incubadora a 28°C y 35 °C

Horno a 170°C

Microscopio

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Tubos con PDA inclinado

Caja de Petri con PDA (para microcultivo)

Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estéril

Matraz con 50 ml de formaldehído al 10 %

Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de Durham con los azucares siguientes

Glucosa 10 %

Lactosa al 10 %

Maltosa al 10 %

Sacarosa al 10 %

Rafinosa al 10 %

3.4 CEPAS DE MOHOS Placas con cultivo de:

Penicillium sp

Rhizopus sp

Aspergillus n íger

S. cerevisiae

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

4.1 MORFOLOGÍA COLONIAL DE MOHOS

Observar la morfología colonial de los mohos que están en la placa y reportar tamaño, forma, aspecto, además de observar si hay pigmento difusible.

4.2 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (microcultivo)

a)De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 5 mm de espesor con un bisturí estéril.

b)Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).

c)Tomar con el asa el inóculo del moho al cual se quiere identificar.

d)Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.

e)Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.

f)Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %

g)Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 °C.

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h) Realizar observaciones mínimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructíferos.

i)Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de reproducción,

quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.

j)Adicionar 10 ml de formaldehído al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.

k)Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre

un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodón lactofenol, sellar la preparación con barniz de

uñas transparente.

l)Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de azul

de algodón lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos

m)Si re requiere la preparación con barniz

n)Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.

o)Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras

reproductivas e identificar el moho.

4.3 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS

a. De la suspensión proporcionada realizar un frotis, fijarlo con calor y realizar una tinción simple.

b. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X

c. Dibujar la levadura que se observó.

4.4 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR ASIMILACIÓN O FERMENTACIÓN DE AZUCARES.

Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas

bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en sus capacidad de fermentar azucares.

a.De la suspensión a la que se le hizo la tinción simple y si resulto ser una levadura

b.Inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares.

c.Incubar de 24 – 48 h y observar la fermentación o asimilación del carbohidrato y comparar los

resultados que se buscarán en la bibliografía como la siguiente tabla.

d.Identificación de levaduras del género Candida.

Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa C. albicans + + - + - + C. tropicales + - + + - + C. glabrata + - - - - + C. guilliermondi + - + + - + C. parapsilosis + - - + - + C. krusei + - - - - - C. kefyr + - + + + + C. lipolitica + - - - - - C. zeylanoides +* - - - - -

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5 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.

5.1 Dibujar la levadura observada al microscopio

5.2 Dibujar las estructuras de reproducción del moho

5.5 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________

5.6 Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar rosa de bengala

5.7 Porqué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?

5.8 Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?

5.9 Cómo identificarías un moho contaminante en un producto biotecnológico?

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la naturaleza.

7 CONCLUSIONES

7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada.

8. BIBLIOGRAFÍA

8.1Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana 1991.

8.2Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993

Esquemas de mohos y levaduras

RPS

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PRÁCTICA No. 8

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Y PRODUCTOS DE TOCADOR.

UNIDAD IV: El alumno identificará los principales grupos bacterianos por medio de pruebas bioquímicas.

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

El alumno identificará las bacterias patógenas que puedan estar presentes en un producto farmacéutico.

1.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno realizará la técnica de estría cruzada para aislar a microorganismos

1.2.2 El alumno conocerá microorganismos objetables (patógenos) presentes en productos de belleza, que determina si el producto es apto para el uso humano.

1.2.3 El alumno realizará pruebas bioquímicas de identificación de estas especies.

1.2.4 El alumno interpretará las pruebas de identificación de estas especies utilizando la NOM 089-SSSA-1995, Bienes y servicios. Método para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza.

2. INTRODUCCIÓN

Salmonella es una bacteria Gram negativa, anaeróbica facultativa, en forma de bacilo, que no forma

endosporas, suele ser móvil y fermenta la glucosa produciendo ácido y gas, es un microorganismo

patógeno perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, su hábitat normal es el tracto intestinal del

hombre y de animales, todas las salmonelas se consideran patógenas en algún grado, siendo causa de

salmonelosis o gastroenteritis en el hombre.

S. aureus es una bacteria Gram positiva, en forma de coco, inmóvil, aerobia facultativa, crece con

facilidad en diferentes medios de cultivo, desde el punto de vista metabólico fermentan carbohidratos y

producen pigmentos, hemolizan la sangre, coagula el plasma y produce diversas enzimas y toxinas

extracelulares. Un tipo común de intoxicación alimentaria es ocasionado por una enterotoxina

estafilocóccica termoestable.

La presencia de S. aureus se interpreta en forma general como indicador de contaminación a partir de:

piel, boca, fosas nasales y heridas de los manipuladores. Es conveniente señalar que el material y

equipos sucios, así como la materia prima de origen animal pueden ser la fuente de contaminación.

La elevada incidencia de las intoxicaciones estafilocóccicas y la ubicuidad del microorganismo

comprometen a todo laboratorio de análisis microbiológico a contar con técnicas validadas para el

recuento y aislamiento de S. aureus coagulasa y termonucleasa positivos.

El género Pseudomonas es el más importante, contiene bacilos rectos ligeramente curvados, de una

longitud de 0,5 a 1,0 µm por 1,5 a 5.0 µm, que se desplazan mediante uno o varios flagelos polares.

Estas bacterias quimioheterótrofas son aerobias y llevan a cabo un metabolismo respiratorio, utilizando

O2 y a veces nitrato como aceptor final de electrones.

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3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1. EQUIPO

Estufa a 28 y 35 ± 2ºC

Refrigerador

Balanzas analítica y granataria

Potenciómetro

Autoclave

Pinzas y tijeras

Microscopio

Espátula

Autoclave

Baño Maria

Horno para esterilizar

Cuentacolonias

3.2 MATERIAL

Mechero Fisher

Cajas de Petri

Portaobjetos

Pipetas de 10 ml, 5 y 1 ml

Pipetas Pasteur

Tubos de 13 X 100 mm

Frasco de dilución de 100 ml con tapón de rosca

Varillas de vidrio

Termómetros graduación de -10 a 200ºC

Portaobjetos

1 frasco con alcohol

Campanas de Durham

Cilindro de acero inoxidable para cajas Petri

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Agar cetrimida

Agar citrato de Simmons

Agar DNA azul-toluidina

Agar eosina azul de metileno

Agar extracto de malta

Agar hierro y lisina

Agar hierro y triple azúcar

Agar Letthen modificado

Agar MacConkey

Agar pseudomona F

Caldo urea

Medio basal O/F (oxidativo-fermentativo)

Medio indol ornitina

Agar sal-manitol

Agar sulfito de bismuto

Agar verde brillante

Agar Vogel-Johnson

Agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD)

Base de caldo tetrationato

Caldo cistina selenito

Caldo infusión de cerebro corazón

Caldo lisina descarboxilasa

Medio indol nitrito

Medio rojo de metilo Voges Proskauer

Medio SIM

Tiras API para pruebas bioquímicas

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Agar pseudomona P

3.4 REACTIVOS

Solución de rojo de metilo

Solución de alfa-naftol

Solución de KOH

Aceite mineral

Solución indicadora rojo de metilo

Reactivo de Kovacs y Ehrlich

Solución de etanol 80% y HCl al 1% v/v

Solución de tween 80%

Solución de telurito de potasio al 1% p/v

Solución de agua oxigenada al 3% v/v

Reactivos para la tinción de Gram

3.5 BACTERIAS: control para bioquímicas

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella typhi

Staphylococcus aureus

3.6 MATERIAL BIOLÓGICO

Muestra de producto (Gel para el pelo, desodorante, crema para la piel, champú, loción para afeitarse,

agua de tocador, maquillaje, talco o esmalte)

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:

a) Toma de muestra y transportarla a el laboratorio, desinfectar el envase con un desinfectante y secar

con una gasa estéril.

b) Homogeneizar el producto al tomar la muestra necesaria de acuerdo a su estado físico. Para líquidos,

agitar el contenido del envase; para semisólidos y polvos, mezclar el contenido con una espátula estéril;

para sólidos, raspar el producto con espátula estéril y tomar una muestra representativa; y para

aerosoles, después de limpiar asépticamente el recipiente, expeler apropiadamente la cantidad de

producto previa agitación.

Preparación preliminar de las muestras

c) Para las muestras que sean miscibles en Caldo Letthen Modicado (CLM), adicionar 1 g o ml en 90 ml

en condiciones asépticas.

d) Para las muestras que no sean miscibles en CLM (ejemplo, cremas, labiales, etc.), en un frasco estéril

o bolsas de polietileno estéril debidamente etiquetados, adicionar 1 g o 1 ml de la muestra y agregar 0,5

ml de tween 80 estéril y homogeneizar la muestra.

e) En caso de usar frasco poner en baño maría a 45ºC hasta formar una emulsión homogénea (el tiempo

de exposición en el baño no debe exceder de 15 minutos) y posteriormente agregar 90 ml de Caldo

Letheen Modificado.

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Procedimiento

f)Incubar a 30ºC ± 2 durante siete días y marcar si se enturbien al agregar la muestra. Confirmar si

existe crecimiento a los dos y siete días de incubación.

g) Cuando el crecimiento sea evidente o se tenga duda de desarrollo microbiano, hacer una resiembra

en Agar Letheen Modificado, inoculando 0,5 ml de cultivo del Caldo Letheen Modificado, empleando el

método de vaciado en placa o de dispersión con codos de vidrio esterilizado e incubar durante cuatro

días a 30ºC ± 2.

Interpretación de resultados

h)Observar si hay crecimiento en el medio inoculado y si no hay crecimiento reportar: menos de 10

UFC/ml o g de muestra y el análisis de da por terminado.

i)Si se presenta crecimiento, continuar con la identificación.

Procedimiento para identificación de patógenos

j)A partir del frasco inoculado sembrar una asada en los siguientes medios de cultivo diferenciales: agar

cetrimida, EMB (eosina azul de metileno), Agar Mac Conkey (AMC) y Agar Vogel Johnson (AVJ).

k) Incubar de 33 a 37ºC durante 24 horas los medios de EMB y AMC, y 48 horas el agar cetrimida y

AVJ.

l)Observar las cajas inoculadas para búsqueda de E. coli, S. typhi, S. aureus y Ps. sp. en los medios

respectivos (ver Tabla 1).

Tabla No. 1

Medio de cultivo Microorganismo Carácteristicas coloniales

Agar eosina azul de metileno

E. coli Colonias pequeñas azul negro en la parte central con brillo metálico verdoso a la luz reflejada

Salmonella sp Transparentes, color ámbar

Staphylococcus coagulasa (+) Colonias incoloras, en punta de alfiler

Agar MacConkey

Salmonella sp, Shigella sp y otros

Incoloros, transparentes

E. coli Grandes, rojas, que pueden estar rodeadas de una zona de precipitación de bilis

Enterobacter sp, Klebsiella sp Grandes, rosadas, mucosas

Enterococos, Staphylococcus Diminutas, de crecimiento y otros aislado, opacas

Agar cetrimida Pseudomonas sp Colonias grandes blancas o verdes cremosas

E. coli Crece poco, sin pigmento

Staphylococcus aureus No crece

Agar Vogel Johnson

Staphylococcus aureus Colonias pequeñas, negras, con halo amarillo

Staphylococcus epidermidis Pequeñas, negro-grisáceas, sin halo

E. coli No crece

Pseudomonas aeruginosa No crece

Realizar una tinción de Gram, si se observan colonias sospechosas de los microorganismos antes mencionados, de acuerdo a la Tabla No. 1, para identificar morfología microscópica.

Interpretación de resultados

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Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

Las bacterias Gram positivas, se observan teñidas de color azul violáceo intenso.

Las Gram negativas se observan de color rojo.

Identificación de S. aureus

En caso de encontrar cocos en racimo Gram positivos, continuar con las siguientes pruebas para búsqueda de S. aureus.

Prueba de catalasa

a)Aislar la colonia sospechosa en Agar Letten Modificado, incubar a 33-37ºC durante 18-24 horas. Si se

observa crecimiento, realizar la prueba de catalasa como se indica a continuación: en un portaobjetos

adicionar una gota de solución de agua oxigenada al 3% y dispersar una porción de la colonia

sospechosa. La reacción es positiva si se observan burbujas efervescentes del oxígeno desprendido,

utilizar controles positivos y negativos.

b)Aislar en agar de sal y manitol o Agar Vogel Johnson, incubando a 33-37ºC durante 24-48 horas.

Observar si hay colonias fermentadoras de manitol. Resembrar en medio de oxidación-fermentación con

dextrosa, incubar a 33-37ºC durante 18-24 horas, y observar si hay desarrollo microbiano.

c)Sembrar las colonias sospechosas en dos tubos con BHI, uno destinado para la técnica de coagulasa

y otro para la técnica de termonucleasa, incubar a 35ºC de 18-24 horas. Reportar de acuerdo a la Tabla

No. 2

Prueba de coagulasa

Procedimiento

a)Adicionar a cada tubo 0,5 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Transferir cada colonia

sospechosa de las cajas en las que se desarrollaron al caldo con ayuda de una asa. Hacer lo mismo con

el control positivo. Incubar 24 horas a 35ºC. Posteriormente adicionar a cada tubo 0,5 ml de plasma.

Incubar 3 horas en baño de agua, entre 35-37ºC sin movimiento.

b)Interpretación de resultados

c)La presencia de un coágulo dará la prueba positiva, de lo contrario se procederá a continuar la

incubación hasta 24 horas.

d)Si al transcurrir el tiempo no se observa coágulo, la prueba se considera negativa.

NOTA: No todos los tipos de S. aureus son coagulasa positiva.

CARACTERISTICAS DIFERENCIALES DE S. aureus

Determinación S.aureus S.epidermidis Micrococcus sp.

Prueba de catalasa + - -

Fermentación de manitol + - -

Crecimiento en O/F Fermentativo

Prueba de coagulasa + - -

Termonucleasa +

Vogel Proskauer + -

Oxidasa - -

Reducción de nitratos + d

d= variable

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Realizar las siguientes pruebas bioquímicas: oxidasa, TSI, LIA, OF, citrato de Simmons, Caldo urea, MR-VP, indol en SIM, MIO y caldo lisina descarboxilasa (ver apéndice)

Identificación de bacterias Gram negativas

Pruebas para identificación de Pseudomonas sp.

Procedimiento

a)En caso de que en el medio agar cetrimida se encuentren colonias sospechosas de Pseudomonas sp.,

realizar la prueba de oxidasa y una tinción de Gram (Tabla No. 3).

b)Observar con luz ultravioleta las colonias desarrolladas y comparar la morfología colonial conforme a

la Tabla No. 3.

Tabla No. 3

CARACTERISTICAS DE Pseudomonas sp.

Medio de cultivo Morfología colonial Tinción de

Gram

Prueba de

oxidasa

Agar cetrimida a

37ºC o 42 °C

Colonias grandes blancas o

verdes cremosas

Bacilos - +

Agar

Pseudomonas F

para obtención de

fluoresceína

Colonias incoloras o.

amarillentas, con luz

ultravioleta se observan de

color amarillento.

Bacilos - +

Agar

Pseudomonas para

detección de

piocianina

Colonias verde azulosas. Con

luz ultravioleta se observan de

color azul

Bacilos - +

La presencia de Pseudomonas sp. puede confirmarse, si es necesario, con pruebas bioquímicas y comparar con la Tabla No.4.

Tabla No. 4 Pseudomonas sp.

+= Positivo

-= Negativo

d= Variable

Prueba bioquímica Resultado Prueba

bioquímica

Resultado

H2S (formación) - Citrato +

Movilidad + Manitol d

Indol - Glucosa (gas) d

Urea d Sorbitol -

Lisina

descarboixilasa

- Inositol -

Lactosa - OF/f -

VP d OF/O +

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Pruebas para identificación de Salmonella sp.

En caso de que en los medios de agar eosina azul de metileno o Agar MacConkey se encuentren

colonias sospechosas de Salmonella sp (cuadro No. 1), sembrarlas en medio caldo cistina-selenito y

caldo tetrationato, incubar durante 12-24 horas a 37ºC o 43ºC.

Pruebas selectivas para Salmonella sp.

Si se presenta crecimiento en cualquiera de los medios de enriquecimiento, tomar una azada y aislar por

estría cruzada en los siguientes medios: agar verde brillante, agar Xilosa Lisina Descarboxilasa (XLD) y

agar sulfito de bismuto.

Si son bacilos Gram negativos, correspondiendo a la morfología de Salmonella sp., sembrar por estría y

punción en el medio agar triple azúcar-hierro e incubar de 18 a 24 horas a 35ºC.

Observar las morfologías coloniales y microscópicas y compararlas con las descritas en la Tabla No.5.

Tabla No. 5

CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE Salmonella sp.

Medio de cultivo Características morfológicas Tinción de

Gram

Agar verde brillante Colonias pequeñas transparentes, incoloras,

rosas o blancas opacas, frecuentemente

rodeadas de una zona rosa o roja

Bacilos -

Agar xilosa-lisina

desoxicolato

Colonias rojas con o sin centro negro. Bacilos -

Agar sulfito de bismuto Colonias negras o verdes Bacilos -

Agar hierro triple azúcar Superficie alcalina (roja) punción ácida

(amarilla), con o sin producción de ácido

sulfhídrico (negro)

Bacilos -

Para confirmación de Salmonella realizar las pruebas bioquímicas mencionadas en los puntos anteriores y comparar con la Tabla No. 6.

Tabla No. 6 almonella typhi K= Alcalino

A= Acido

+= Positivo

-= Negativo

d= Variable

Pruebas bioquimicas Resultado Prueba bioquimica Resultado

TSI Superficie K VP -

punción A Citrato -

Gas - Manitol +

H2S + Glucosa (gas) -

LIA Superficie K Sorbitol +

Punción K Ornitina descarboxilasa -

Gas - Dulcitol d

H2S + (-) Inositol -

MIO Movilidad + (-) Triolosa +

Indol - Arabinosa -

Ornitina - Ramnosa -

Urea - Celobiosa d

Lisina descarboxilasa + Eritritol -

Malonato - Acetato de sodio -

Lactosa - mucato -

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Pruebas selectivas para Escherichia coli.

Procedimiento

En caso de que encuentren colonias sospechosas de E. coli (Tabla No. 1), sembrar por estría cruzada

en los medios AMC y agar Levine-eosina azul de metileno e incubar a 35°C. Observar el crecimiento y si

ninguna colonia corresponde a la morfología descrita en la Tabla No.1, la muestra cumple los requisitos

de ausencia de E. coli.

Confirmar la presencia utilizando las pruebas bioquímicas mencionadas anteriormente y comparar con la

Tabla No. 7.

Tabla No. 7 Escherichia coli

K= Alcalino

A= Acido

+= Positivo

-= Negativo

d= Variable

Pruebas

bioquimicas

Resultado Prueba bioquimica Resultado

TSI Superficie A VP -

punción A Citrato -

Gas + Manitol +

H2S - Glucosa (gas) A

LIA Superficie K Sorbitol +

Punción A Ornitina

descarboxilasa

d

Gas + Dulcitol d

H2S - Inositol -

MIO Movilidad +(-) Triolosa +

Indol + Arabinosa +

Urea - Ramnosa d

Lisina

descarboxilasa

+ Eritritol -

Malonato - OF/F y OF/O +

Lactosa + mucato +

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RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Realizar un cuadro en el cual se indiquen las pruebas bioquímicas realizadas e indicar si existe la presencia de patógenos en la muestra.

5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de unos microorganismos patógenos.

5.2. Explicar que daño producen los patógenos al producto y a los consumidores del producto.

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1. Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el buen aislamiento de los microorganismos, la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de los microorganismos.

7. CONCLUSIONES

7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición. Médica Panamericana. 2003, 850. p.

8.2 NOM 089-SSSA-1995, Bienes y servicios. Método para la determinación del contenido microbiano en productos de belleza.

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PRACTICA No. 9

CRECIMIENTO MICROBIANO

UNIDAD V: Crecimiento Microbiano

5.2 Crecimiento microbiano, factores que lo afectan y productos de interés farmacéutico.

5.3 Curva de crecimiento

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivo General

El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.

1.2 Objetivos Específicos

1.2.1 El alumno realizará un cultivo de Escherichia coli por lote en caldo glucosa sales al 5 %, para determinar la fase lag y log.

1.2.2 El alumno realizara dos métodos indirectos para la cuantificación de microorganismos, que son la turbidimetría con un espectrofotómetro y el conteo directo en cámara de Neubauer.

1.2.3 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables por medio de la técnica normalizada de vaciado en placa, auxiliándose del conteo directo en cámara de Neubauer.

1.2.3 El alumno graficará los resultados obtenidos para identificar por lo menos dos fases de crecimiento y obtendrá la tasa especifica de crecimiento para este sustrato y el tiempo de generación de E. coli.

Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones de miles de millones.

Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.

Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.

El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas.

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.

Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.

Los métodos recomendados para medir la población son:

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Recuento en placa

Siembra por vaciado en placa.

Filtración

Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).

Diluciones seriadas.

Siembra por extensión con varilla

Método del número más probable

Hay otros 3 métodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetría. 2.- Actividad metabólica. 3.- Peso seco.

Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de conteo celular, por ejemplo la cámara de Neubauer, y un microscopio.

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana.

Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares.

Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a producir algunos metabolitos.

Fase del crecimiento

En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.

Parámetros de la curva de crecimiento

Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.

La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = Xmax

- X0

La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X

0 y X

t en los tiempos t

0 y t, en la fase de crecimiento

exponencial según

Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.

Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y por

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116

turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL

Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril (matraz semilla)

Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria estéril y/o caldo glucosa sales

Dos celdas y un portaceldas

• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles

Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta estándar (para el vaciado en placa)

120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución salina (para las diluciones)

40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa)

Una pizeta con benzal

3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

NaCI ó peptona

Caldo Luria

Agar cuenta estándar

Caldo glucosa sales al 5 %

3.3.- EQUIPO

Espectrofotómetro

• Autoclave

• Horno

• Incubadora a 37° C

• Contador de colonias

• Cámaras de Neubauer

3.4.- CEPAS:

Suspensión de Escherichia coli Suspensión de Saccharomyces cerevisiae

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL

ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN)

4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad

De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el espectrofotómetro.

a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz

b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540 nm) y la región visible

c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco

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117

d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer

e)Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.

f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer, previamente limpiada con papel sanitario.

g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura.

h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar la celda dos o tres veces con benzal.

i) Una vez leída la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda.

Nota: Las celdas nunca se lavan con escobillón, no se colocan en una gradilla, para ello se entregaran en un vaso

4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER

a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.

b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.

c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada le corresponde a un mm2. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 µl.

d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X

e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.

f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de células/ml.

4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA

a)La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en un

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tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución 10-1

. Mezclar el tubo según las recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina para

obtener la dilución 10-2

y así sucesivamente.

b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría o en

el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x106

, entonces realiza hasta las diluciones 10-6

y 10-7

. Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de conteo

4.4 CUENTA VIABLE

a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.

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119

SESIÓN II

Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes consideraciones

Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D

Equipos 1,2 y dos alumnos del equipo 5

Equipos 3 y 4 y un alumno del equipo 5

Equipos 6,7 y dos alumnos del equipo 10

Equipos 8 y 9 y un alumno del equipo 10

150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%

Volumen del inóculo Si la As es de 0.8-0.9

10 ml 10 ml 10ml

4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor) a)Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5 ml de una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.

b)Incubar a 35° C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.

4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)

Trabajo para el profesor

a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética

b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza.

4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA

Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura).

2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t0)

3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en este orden:

a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las

diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la NOM

110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las

recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.

Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero

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b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda

en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que

realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)

d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al

compañero que va a realizar el conteo en el microscopio.

e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y

desechar la pipeta en el benzal.

f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra

g.- Incubar las placar a 35°/ 24 h y realizar el conteo

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5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________

Tiempo Tiempo real en min

Absorbencia 540 nm

Cuenta directa

UFC / ml

To

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

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5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.

Tiempo Conteo Promedio Resultado

To Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T1 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T2 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T3 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T4 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T5 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T6 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T7 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

T8 Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

Dilución 10 Placa 1 =

Placa 2 =

5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas? 5.3.4 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de crecimiento.

5.3.5 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas).

5.3.6. Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia.

5.3.7 Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.

5.3.8 Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.

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5.3.9 Define el término velocidad específica de crecimiento

5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte

5.3.11 ¿Por qué es importante la cinética microbiana?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados.

6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los resultados obtenidos en esta práctica.

6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de turbidimetría

y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué podrá servir.

7. CONCLUSIONES

Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la

bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.

8. BIBLIOGRÁFIA

8.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág.

8.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pág.

8.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice Hall, España. 956 pág.

8.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs.

8.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de células: cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de 2003.

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PRÁCTICA No. 10

RESISTENCIA MICROBIANA

UNIDAD VI: Resistencia bacteriana a antibióticos

1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

1.1 El alumno determinará la resistencia de bacterias a los antibióticos

1.2 Objetivos específicos

1.2.1. El alumno evaluará la resistencia de bacterias Gram positvas y Gram negativas a diversos antibióticos de alto espectro.

1.2.2 El alumno realizará la técnica de Kirby- Bauer para medir la resistencia a antibióticos.

1.2.3 El alumno realizará a técnica de diluciones seriadas en tubo y determinará la CMI (concentración mínima inhibitoria) y la CMB (concentración mínima bactericida).

2. INTRODUCCIÓN

Actualmente el tratamiento de las enfermedades depende de los agentes quimioterapéuticos, que son productos químicos que destruyen microorganismos patógenos o frenan su crecimiento a concentraciones lo suficientemente bajas para evitar un daño en el huésped. La mayoría de estos agentes son los antibióticos, aunque también se encuentran los antimicóticos, antiprotozoarios y los antivirales. Estos compuestos son muy importantes en medicina clínica, veterinaria y en la agricultura.

Los antibióticos son sustancias químicas producidas por ciertos microorganismos, que en bajas concentraciones tienen la capacidad de inhibir el crecimiento o matar a otros microorganismos, es decir pueden ser bactericidas, que matan al patógeno (su actividad depende de la concentración) o bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento de forma reversible. Son metabolitos secundarios no esenciales que se sintetizan cuando el microorganismo productor se encuentra en la fase estacionaria. La mayoría de los antibióticos son producidos por bacterias que se encuentran en el suelo, por ejemplo los géneros Streptomyces y Bacillus, entre los hongos están los géneros Penicillium, Cephalosporium y Aspergillus.

Los antibióticos son agentes quimioterapéuticos naturales, aunque actualmente existen antibióticos semi-sintéticos que tienen modificaciones en la molécula original y antibióticos sintéticos, obtenidos mediante procedimientos químicos. Los antibióticos se producen a nivel industrial en procesos de fermentación con cepas sobre-productoras mejoradas genéticamente. Por otra parte, la modificación química o por ingeniería genética utilizadas en la búsqueda de nuevos antibióticos más eficaces continúa, debido a que constantemente aparecen cepas de microorganismos con resistencia inherente o adquirida a los antibióticos de uso común en la agricultura, ganadería y medicina, este hecho se debe a la utilización indiscriminada e irresponsable de los antibióticos.

Al conjunto de grupos bacterianos, que un antibiótico en particular afecta, se le conoce como espectro de acción, así tenemos que algunos fármacos sólo son eficaces contra una gama pequeña de patógenos, son antibióticos de espectro reducido, otros son fármacos de amplio espectro y atacan a muchas clases de patógenos. Las bacterias Gram positivas son más sensibles que las Gram negativas, los antibióticos de amplio espectro actúan sobre ambos grupos.

Los antibióticos se clasifican en base a su estructura química y en su mecanismo de acción. Se agrupan en dos categorías principales, los agentes sintéticos y los antibióticos. Los sintéticos son las sulfamidas y las quinolonas.

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SULFAMIDAS: fueron los primeros antimetabolitos empleados con éxito como quimioterapéuticos. La sulfanilamida es un análogo estructural del ácido p-aminobenzoico, cuando la sulfanilamida entra en la célula bacteriana, compite con el acido p-aminobenzoico por el sitio activo de una enzima que participa en la síntesis de fólico y disminuye su concentración, esto es dañino para la bacteria porque el ácido fólico es esencial para la síntesis purinas y pirimidinas. Ejemplos son el sulfametoxazol y el sulfisoxazol. La eficacia de las sulfamidas está limitada por el aumento de la resistencia de muchas bacterias, y tiene efectos secundarios adversos como reacciones alérgicas (fiebre, ronchas y exantemas).

QUINOLONAS: las quinolonas son fármacos sintéticos que contienen el anillo de 4-quinolona, la primera quinolona que se sintetizó fue el ácido nalidíxico, actualmente se utilizan ciprofloxacino y norfloxacino y ofloxacino y se está trabajando en otras. Las quinolonas son eficaces cuando se administran por vía oral. Y pueden causar efectos secundarios adversos, principalmente irritación gastrointestinal. Las quinolonas actúan inhibiendo la DNA girasa bacteriana o topoisomerasa II, probablemente ligándose al complejo DNA girasa, esta inhibición interrumpe la replicación y reparación del DNA, lo que resulta letal para la bacteria. Las quinolonas son fármacos de amplio espectro. Resultan eficaces contra las bacterias entéricas como Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, también son activas contra Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Micobacterium tuberculosis, actualmente se emplean en el tratamiento de infecciones urinarias y de trasmisión sexual causadas por Neisseria y Chlamydia.

Los principales grupos de antibióticos son:

PENICILINAS: la penicilina G o bencilpenicilina, el primer antibiótico empleado ampliamente en medicina, todas son derivadas del ácido 6-aminopenicilánico y difieren en su cadena lateral unida al grupo amino. La característica principal es el anillo β-lactámico, el cual es esencial para su actividad. La penicinilasa, la enzima sintetizada por muchas bacterias resistentes a la penicilina, destruye la actividad de la penicilina hidrolizando un enlace de este anillo. Ejemplos: penicilina G, penicilina V, ampicilina, carbenicilina, meticilina y ticarcilina. La estructura de las penicilinas es similar a la D-alanil-D-alanina terminal que se encuentra en la cadena lateral peptítica del peptidoglucano, y se ha propuesto que la penicilina inhibe la enzima responsable de la reacción de transpeptidación por su similitud estructural, y que bloquea la síntesis de peptidoglicano. Las penicilinas son eficaces contra gonococos, meningococos, y patógenos Gram positivos. Aunque las penicilinas son los antibióticos menos tóxicos, va en aumento el número de personas alérgicas, una persona puede morir de una reacción alérgica violenta.

CEFALOSPORINAS. Las cefalosporinas son una familia de antibióticos cuya estructura es muy similar a las penicilinas en el anillo β-lactámico. Son fármacos de amplio espectro, que se administran a pacientes con alergias a la penicilina. Existen tres grupos o generaciones de estos fármacos, en particular la cefoperazona es resistente a la destrucción por β-lactamasas y resulta eficaz contra muchas bacterias Gram negativas, incluida Pseudomonas aeruginosa, otros ejemplos son cefalotina, cefoxitina y ceftriaxona. Debido a su analogía estructural con las penicilinas, las cefalosporinas inhiben la reacción de transpeptidación durante la síntesis de peptidoglicano, son fármacos de amplio espectro que a menudo se administran a pacientes con alergias a la penicilina.

TETRACICLINA: esta familia de antibióticos tiene una estructura de cuatro anillos a los que están unidas diversas cadenas laterales, la oxitetraciclina y la clortetraciclina son producidas por especies del género Streptomyces, otras son semisintéticas. Es un grupo de amplio espectro, pero de actividad bacteriostática. Estos antibióticos inhiben la síntesis proteica uniéndose a la subunidad 30S del ribosoma e inhibiendo la unión de moléculas de aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma. Son de amplio espectro contra bacterias Gram negativas y Gran positivas, Rickettsias, clamidias y micoplasmas. Las dosis elevadas pueden causar náuseas, diarrea, lesiones hepáticas y renales, dientes amarillos en los niños.

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AMINOGLUCÓSIDOS: aunque sus estructuras son diferentes entre si, todos ellos contienen un anillo ciclohexano y aminoazúcares, son bactericidas y son más activos contra los Gram negativos, entre los más importantes están: la estreptomicina, kanamicina, gentamicina, neomicina y tobramicina. Los aminoglucósidos se unen a la subunidad 30S del ribosoma e interfieren en la síntesis proteica inhibiéndola directamente o también causando error en la lectura del mensaje genético transportado por el m RNA. La utilidad de la estreptomicina ha disminuido por la alta resistencia a ella, aunque sigue siendo eficaz contra la tuberculosis y peste. La gentamicina se emplea para tratar las infecciones por Proteus, Escherichia, Klebsiella y Serratia, los aminoglucósidos son muy tóxicos y pueden causar sordera, daño renal, pérdida del equilibrio, náusea y reacciones alérgicas.

MACRÓLIDOS: contienen grandes anillos de lactona de 12 a 22 átomos de carbono, ligado a uno o más azúcares. El más representativo es la eritromicina, es de amplio espectro eficaz contra Gram positivas, micoplasmas y algunas Gram negativas, es bacteriostática y se une al r RNA 23S de la subunidad 50S del ribosoma para inhibir la elongación de la cadena peptídica durante la síntesis proteica. Se emplea en pacientes alérgicos a la penicilina y en el tratamiento de la tos ferina, la difteria y diarrea causada por Campylobacter, y la neumonía causada por Legionella. Otros ejemplos son la clindamicina, espiramicina y la azitromicina, esta última es eficaz contra Chlamydia trachomatis.

CLORANFENICOL: su estructura consta de un grupo propanol unido a un radical nitrobenceno, aunque fue producido inicialmente a partir de cultivos de Streptomyces venezuelae, en la actualidad se produce por síntesis química, es de amplio espectro, pero muy tóxico, afecta a la médula ósea, que lleva a una anemia y a una disminución de glóbulos blancos. El cloranfenicol solo se emplea en situaciones que amenazan la vida en las que no es adecuado otro fármaco. Este antibiótico se une al rRNA 23S de la subunidad 50S del ribosoma, e inhibe la peptidil transferasa.

En base a su mecanismo de acción tenemos:

INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE LA PARED CELULAR. Inhiben las enzimas de transpeptidación que participan en los enlaces de las cadenas de polisacáridos de la peptidoglicana de la pared celular bacteriana. Ejemplos penicilina, ampicilina, carbenicilina, meticilina cefalosporinas, vancomicina y bacitracina.

INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS PROTEICA: se ligan a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano para inhibir la síntesis proteica y causan errores de la lectura del mRNA, por ejemplo estreptomicina y gentamicina. Otro mecanismo es que se ligan a la subunidad 50S del ribosoma e inhiben la elongación de la cadena peptídica, por ejemplo la eritromicina y clindamicina. Otros antibióticos son el cloranfeniciol, tetraciclinas, el ácido fusídico.

INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Inhiben la DNA girasa bacteriana, por ejemplo el ciprofloxacino y otras quinolonas. Otro mecanismo es bloquear la síntesis de RNA uniéndose e inhibiendo la RNA polimerasa dependiente de DNA, por ejemplo la rifampicina.

ALTERACIÓN DE LA MEMBRANA CELULAR. Se liga a la membrana plasmática y altera su estructura y sus propiedades de permeabilidad. Por ejemplo la polimixina B.

ANTAGONISMO METABÓLICO. Las sulfamidas inhiben la síntesis de ácido fólico, el trimetoprima bloquea la síntesis de tetrahidrofolato por inhibición de la dihidrofolato reductasa.

RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS.

La resistencia a los antibióticos es la capacidad adquirida de un organismo para resistir los efectos del mismo, al que es sensible habitualmente. La mayor parte de la resistencia a los antimicrobianos es debida a genes de resistencia que se transfieren por intercambio genético.

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Los genes de resistencia a los antibióticos están presentes tanto en el cromosoma bacteriano como en plásmidos, pequeñas moléculas de DNA circular que pueden existir independientes del cromosoma o integrarse en él. Las mutaciones espontáneas del cromosoma bacteriano no son muy frecuentes, pero pueden hacer a la bacteria resistente a un antibiótico, estos mutantes pueden ser destruidos por el huésped por sus mecanismos de defensa natural. Sin embargo cuando se trata ampliamente a un paciente con antibióticos, algunos mutantes resistentes pueden sobrevivir y proliferar por su ventaja competitiva sobre los gérmenes no resistentes. Frecuentemente, un patógeno bacteriano es resistente a fármacos porque posee un plásmido portador de uno o más genes de resistencia; estos plásmidos se denominan plásmidos R (plásmidos de resistencia). Los genes de los plásmidos de resistencia, en general, codifican enzimas que destruyen o modifican a los antibióticos, por ejemplo, la hidrólisis de la penicilina o la acetilación del cloranfenicol y los aminoglucósidos. Se han involucrado genes asociados a plásmidos de resistencia a aminoglucósidos, cloranfenicol, penicilinas, cefalosporinas, eritromicina, tetraciclinas, sulfamidas entre otros. Este plásmido R, puede transferirse a otras células a través de los mecanismos de intercambio de material genético, como la conjugación, transducción y la transformación.

El tratamiento prolongado con antibióticos favorece el desarrollo y la propagación de las cepas resistentes, porque el antibiótico destruye las bacterias sensibles normales que competirían en condiciones habituales con las cepas resistentes. El resultado es la aparición de patógenos resistentes a fármacos que llevan a la sobre-infección, por ejemplo Candida albicans produce sobre infecciones cuando la competencia bacteriana es eliminada con antibióticos.

Otro aspecto importante es que muchos pacientes que son tratados con antibióticos interrumpen su tratamiento al sentirse mejor, y dan tiempo a que las cepas resistentes expresen sus genes de resistencia o que muten, estas proliferan al no tener competencia y surgen las cepas resistentes.

En general, el uso indiscriminado de los antibióticos ha generado el aumento de cepas resistentes, las cuales van un paso adelante en comparación con la producción de nuevos antimicrobianos eficaces, la industria farmacéutica trabaja en el diseño de nuevos compuestos o en la modificación de los ya existentes para cubrir las necesidades de antibióticos mas eficaces.

Las bacterias pueden presentan resistencia a un antibiótico debido a:

1.- La estructura blanco (receptor) sobre la que el antibiótico actúa se encuentra modificada o no existe, por lo que el antibiótico no puede unirse e inhibir, por ejemplo las modificaciones del r RNA 23S (de la bacteria) pueden disminuir la afinidad de los ribosomas a los que se unen la eritromicina y el cloranfenicol. Otro ejemplo es la modificación de la proteína receptora de la estreptomicina en los ribosomas bacterianos, lo que impide que la estreptomicina actúe.

2.- Poseen una barrera de permeabilidad al antibiótico (no permite el paso del antibiótico a la célula). Muchas bacterias Gram negativas no resultan afectadas por la bencilpenicilina porque ésta no puede atravesar la membrana externa de la envoltura. Las micobacterias son resistentes a muchos antibióticos por su elevado contenido de lípidos (ácidos micólicos) en la pared celular, lo que la hace impermeable a muchos fármacos.

3.- Modifican enzimáticamente el antibiótico inactivándolo. El ejemplo mejor conocido es la hidrólisis del anillo β-lactámico de muchas penicilinas por la enzima penicilinasa. También son inactivados por la adición de grupos químicos, los microorganismos resistentes pueden fosforilar o acetilar los aminoglucósidos y acetilar el cloranfenicol.

4.- Han desarrollado mutaciones genéticas que alteran la vía metabólica sobre la que actúa el antibiótico. Por ejemplo algunas bacterias son resistentes a las sulfamidas porque emplean el ácido fólico del medio en lugar de sintetizarlo, otras cepas aumentan su producción y contrarrestan la inhibición por sulfamidas.

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5.- Los microorganismos son capaces de bombear hacia el exterior el antibiótico que haya penetrado a la célula. Algunos patógenos poseen translocasas en la membrana plasmática que expulsa a los fármacos. Estas proteínas son inespecíficas, pueden bombear a muchos fármacos diferentes, y se les denomina “bombas de multirresistencia”, utilizan el sistema antiporte fármaco/protón. Este sistema existe en Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium smegmatis y Staphylococcus aureus.

6.- El microorganismo carece de la estructura que inhibe el antibiótico, por ejemplo, algunas bacterias como los micoplasmas carecen de pared celular, por lo que son resistentes a la penicilina.

DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.

Resumiendo, la transferencia genética y la aparición de mutantes en las bacterias han dado lugar a la aparición de cepas resistentes a uno o varios antimicrobianos, tanto en la población en general como en el ámbito hospitalario. Esto ha llevado a la necesidad de conocer el patrón de sensibilidad de cepas aisladas de casos clínicos frente a los microbianos disponibles, teniendo en consideración que tal patrón puede variar dependiendo del género y especie, incluso el lugar de donde es aislado.

La determinación del patrón de sensibilidad de los aislamientos bacteriano hacia agentes antimicrobianos es una de las tareas más importantes en la microbiología clínica y farmacéutica. Hay dos pruebas para mostrar que antibióticos son más eficaces contra un patógeno, estas son:

Pruebas de sensibilidad por dilución.

Estas pruebas se pueden emplear para determinar la CMI (concentración mínima inhibitoria), que es la concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento de un determinado patógeno y la CMB (concentración mínima bactericida) que es la concentración más baja de un fármaco que mata al patógeno. La prueba de dilución en tubo se puede hacer en tubo, en placa o en microplaca. En la de tubo, se prepara una serie de tubos con caldo de cultivo (Mueller-Hinton) que contiene concentraciones de antibióticos entre 0.1 y 128 μg/mL y se inocula con cantidades estándar del microorganismo objeto de la prueba. La concentración mínima de antibiótico a la que no se produce crecimiento del microorganismo tras 20-24 horas de incubación es la CMI, la CMB se puede determinar después de subcultivar los tubos no muestran crecimiento en un medio nuevo sin antibiótico, la concentración más baja del antibiótico a partir de la cual los microorganismos no se recuperan y no crecen cuando son transferidos a un medio nuevo es la CMB. La prueba en placa es muy similar a la de tubo, pero en esta se utilizan placas de agar de Mueller-Hinton. Actualmente se han desarrollado varios sistemas automatizados para realizar pruebas de sensibilidad y determinación de CMI.

Pruebas de sensibilidad por difusión en agar.

Esta prueba se utiliza con bacterias de crecimiento rápido para ahorrar tiempo y medios de cultivo. Se basa en colocar un disco impregnado de un antibiótico sobre una placa de medio de cultivo (Mueller-Hinton) previamente sembrada con la bacteria de prueba, el disco capta humedad y el antibiótico difunde radialmente hacia fuera a través del agar, produciendo un gradiente de concentración de antibiótico, este está presente a una concentración alta cerca del disco y afecta incluso a gérmenes poco sensibles (los microorganismos resistentes crecen hasta en el disco). A medida que aumenta la distancia desde el disco, disminuye la concentración del antibiótico y solo los patógenos más sensibles resultan dañados. Si el antibiótico inhibe el crecimiento bacteriano, en torno al disco se forma un anillo claro y cuanto mas amplio más sensible es el microorganismo. Influye también la concentración inicial del antibiótico, su solubilidad y tasa de difusión a través del agar. En la actualidad, la prueba de difusión en agar más empleada es el método de Kirby-Bauer, que fue desarrollado a principios de 1960 por William Kirby, A.W. Bauer y colaboradores. Este procedimiento es recomendado por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos. Esta técnica permite asignar a un microorganismo en las categorías de sensible, resistente o intermedio y brinda al médico la posibilidad de elegir el antibiótico más apropiado,

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y a la industria farmacéutica hacer un seguimiento y realizar estadísticas en cuanto a la sensibilidad de los antibióticos que esta produciendo.

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.2 EQUIPO

Incubadora a 37oC

3.2 MATERIAL

Pinzas estériles

Hisopos estériles

Tubos de ensaye estériles

Sensidiscos Gram positivos

Sensidiscos Gram negativos

Mechero

Asa microbiológica

Gradilla

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

2 placas de gelosa Mueller-Hinton

11 tubos de 13 x100 con 4.5 ml de caldo Mueller-Hinton

REACTIVOS

Solución salina estéril

3.4 CEPAS MICROBIANAS

Klebsiella pneumoniae

Escherichia coli

Staphylococcus aureus (en gelosa Mueller-Hinton) en “slant”

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL

A) Método de difusión del antibiótico en agar empleando multidisco (método de Kirby-Bauer).

1.- Realizar tinción de Gram a la cepa problema y tomar 2 o 3 asadas de la cepa proporcionada y suspender en 3 ml de solución salina estéril, se ajusta la turbidez de la suspensión hasta tener una densidad comparable con un estándar que corresponde al tubo No. 0.5 del nefelómetro de Mac Farland (equivale a 108 microorganismos/ml). La suspensión ajustada no debe permanecer más de 20 minutos antes de sembrarla.

2.- Introducir un hisopo estéril a la suspensión bacteriana y humedecerlo, quitar el exceso de caldo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo. Se estría masivamente la placa de Mueller-Hinton en tres direcciones sobre la totalidad de la superficie de agar, para obtener un inóculo uniforme, se efectúa el último barrido del hisopo sobre el reborde de la caja de Petri, cuando el inóculo se ha secado (3-5 minutos) se procede a colocar los discos.

3.- Colocar con las pinzas flameadas, un multidisco (Gram + o Gram -) o discos individuales sobre la placa sembrada. Presionar ligeramente cada disco para asegurar un contacto completo con el cultivo.

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4.- Después de haber 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petri e incubar a 35o C. el tiempo de incubación es de 18-24 horas.

5.- Medir los diámetros (en milímetros) de los halos de inhibición con ayuda de una regla.

Las colonias grandes que aparecen entre la zona clara de inhibición pueden ser variantes resistentes o bien un inoculo mezclado, por lo que se recomienda verificar la pureza de éste.

El swarming que produce Proteus sp se descarta.

Interpretación de resultados

Las cepas se clasificarán en Resistentes (R), Intermedias (I) o Susceptibles (S), dependiendo del diámetro del halo de inhibición (incluyendo los 6 mm del disco), empleando la tabla 1, que relaciona el diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia microbiana. Los valores de la tabla, se han obtenido empleando los valores de CMI y los diámetros de la zona de inhibición de muchas cepas diferentes de microorganismos.

TABLA 1

ANTIBIÓTICO CONCENTRACIÓN Resistente Intermedio Sensible

Amikacina 30 μg < 14 15-16 > 17

AmpicilinaFrente a Enterobacteriaceae 10 μg < 11 12-13 > 14

Ampicilina Frente a Staphylococcus sp 10 μg < 28 > 29

Carbenicilina Frente a Enterobacteriaceae

100 μg < 17 17-22 > 23

Carbenicilina Frente a Pseudomonas sp 100 μg < 13 14-16 > 17

Cefalotina 30 μg < 14 15-17 > 18

Cefotaxima 30 μg < 14 15-17 > 23

Ceftazidima 30 μg < 14 15-17 > 18

Ceftriaxona 30 μg < 13 15-17 > 21

Cefuroxima 30 μg < 14 15-17 > 18

Cloranfenicol 30 μg < 12 13-17 > 18

Dicloxacilina 1 μg < 10 11-12 > 13

Enoxacina 10 μg < 14 15-17 > 18

Eritromicina 15 μg < 13 15-16 > 18

Gentamicina 10 μg < 12 13-14 > 15

Netilmicina 30 μg < 12 13-14 > 15

Nitrofurantoina 300 μg < 14 15-16 > 17

Pefloxacina 5 μg < 14 15-22 > 23

Penicilina Frente a Staphylococcus sp 10 U < 28 > 29

Penicilina Frente a Neisseria gonorrhoeae

10 U < 19 > 20

Penicilina Frente a Enterococos 10 U < 14 > 20

Penicilina Frente a otros estreptococos 10 U < 19 > 28

Tetraciclina 30 μg < 14 15-18 > 19

Trimetroprim-Sulfametoxazol 25 μg < 10 11-15 > 16

La técnica de Kirby-Bauer está diseñada para probar la sensibilidad antimicrobiana para microorganismos aerobios no exigentes y de crecimiento rápido.

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Control de calidad. Las cepas control utilizadas para medir la reproducibilidad de esta técnica son Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) que deberá incluirse en la prueba diaria. La FDA recomienda el uso de la cepa Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) susceptible a Gentamicina y Carbenicilina; deben emplearse siempre en las mismas condiciones que las cepas problema.

B) Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de un antibiótico, por el método de diluciones seriadas en tubo.

1.- Colocar en una gradilla once tubos de ensaye con caldo de Mueller-Hinton y marcar los tubos del 1 al 11.

2.- Tomar 0.5 ml de la solución de ampicilina (10,000 μg/ml) y hacer diluciones en serie 1:9 del tubo 1 al 10, el tubo 11 será testigo de la viabilidad de la cepa, por lo que no lleva antibiótico.

3.- Adicionar a todos los tubos 0.1 ml de la suspensión bacteriana problema que puede ser de Staphylococcus aureus, E. coli ó Klebsiella sp.

4.- Incubar a 37° C durante 24 horas.

5.- Observar el crecimiento como turbidez en los tubos, anotar hasta que concentración hay turbidez, el tubo en donde no exista crecimiento se toma como la CMI y ese es el punto critico.

6.- Del punto crítico tomar dos tubos que muestren turbidez y dos en donde no haya crecimiento.

7.- Tomar una placa de agar Muller Hinton y dividirla en cuatro cuadrantes y sembrar en cada una de ellas por estría simple, anotar la concentración que corresponda.

8.- Observar si existe aparición de crecimiento y si no lo hay, entonces esa concentración corresponde a la CMB.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO

A) Anotar los resultados en las tablas siguientes sobre la morfología colonial y microscópica:

Diámetro del halo de inhibición (mm)

ANTIBIÓTICO Staphylococcus aureus Klebsiella sp Escherichia coli

5.1 ¿Qué utilidad tiene un estudio como éste en la práctica bacteriológica de rutina?

B) Anota en la siguiente tabla la información sobre las diluciones y concentraciones utilizadas en el método de las diluciones seriadas del antibiótico en tubo.

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Prueba de tubo. Antibiótico_______________________ Microorganismo: ________________________________

Tubo Dilución Concentración.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Anota los resultados de crecimiento de S. aureus, obtenidos en los tubos con diferente concentración de antibiótico.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Crecimiento

Anotar el crecimiento con un signo + y en donde hay ausencia con un signo -

¿Cuál fue la concentración mínima inhibitoria (CMI) del antibiótico sobre el microorganismos ?__________μg / ml

¿Con los datos obtenidos, determina cual fue la concentración mínima bactericida (CMB) _________________μg / ml

5.2 Explica las diferencias entre un fármaco, agente quimioterapéutico, antimicrobiano y antibiótico.

5.3 ¿Cuáles son las causas del incremento de resistencia a los antibióticos? (explica)

5.4 ¿Qué técnica utilizarías para hacer un estudio sobre resistencia a antibióticos de una cepa multirresistente aislada de un caso clínico? Explica el porqué.

5.5 ¿Cuáles son los errores más comunes que pueden presentarse al realizar la técnica de Kirby-Bauer?

5.6 De los antibióticos que utilizaste elige dos y llena el siguiente cuadro.

I. Antibiótico y clave de identificación: II. Antibiótico y clave de identificación:

Concentración Concentración

Grupo al que pertenece Grupo al que pertenece

Mecanismo de acción Mecanismo de acción

Diámetro del halo inhibición Diámetro del halo inhibición

Valores de Referencia Valores de Referencia

Interpretación Interpretación

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5.7 ¿Cuáles son las características generales de un antibiótico?

6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

6.1 Discutir los resultados de la práctica.

7. CONCLUSIONES

Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada.

8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA

8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall. España. 956 p.

8.2 Giono Cerezo Silvia: prueba de Bauer-Kirby para sensibilidad a os antimicrobianos. Infectología III (7): 325, 1983.

8.3 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica Panamericana. 2001. México. 1432 p.

8.4 Prescot, H. K. Microbiología. 4ª. Edición. Mc Graw Hill. 1999, 1005 p.

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PRACTICA No. 11

AUTOVACUNAS

UNIDAD VIII: Aspectos básicos en la producción de productos inmunológicos

1. OBJETIVOS

1.1 Objetivos generales

4.9.1El alumno identificará el principio básico de la elaboración de una vacuna.

I.2 Objetivos específicos

1.2.1 El alumno obtendrá muestras biológicas para la elaboración de una vacuna

1.2.2. El alumno preparará una autovacuna a partir de una muestra biológica.

2. INTRODUCCIÓN

Las vacunas, según la definición tradicional son preparaciones inmunogénicas inocuas, obtenidas generalmente a partir de agentes infecciosos o tóxicos que, al ser inoculadas a individuos inmunocompetentes, inducen un estado específico de protección contra los efectos nocivos del agente de donde provienen.

La vacunación consiste en la inducción y producción de la respuesta inmune específica y protectora (humoral y celular) de un individuo sano como consecuencia de la administración de un producto biológico, la vacuna, y se basa en la respuesta del sistema inmune a cualquier elemento extraño (antígeno) y en la memoria inmunológica. Las vacunas, desde su aparición, han sido el primer recurso en la prevención de enfermedades infecciosas y constituyen uno de los avances más importantes de la inmunología y de la medicina preventiva.

La vacunación es el medio más eficaz para prevenir enfermedades infecciosas en humanos y animales, ya que permite evitarlas, controlar el número de infectados e incluso erradicar a los microorganismos patógenos causantes de ellas, como es el caso de la extinción del virus de la viruela, que sin duda fue uno de los agentes infecciosos más peligrosos que se conocieron, en este tiempo, existen también vacunas terapéuticas que evitan el progreso de enfermedades infecciosas crónicas.

Las características ideales de una vacuna son: reproducir una respuesta inmunológica similar a la infección natural; que sea efectiva (más del 90% de protección); que tenga mínimos efectos secundarios y que sea completamente segura; que confiera inmunidad a largo plazo; que sea de dosis única y compatible con otras vacunas; que su administración sea en los primeros meses de vida y de preferencia por vía oral; que sea estable a temperatura ambiente, de fácil producción y económicamente accesible. Obviamente que muchas de ellas no cumplen con todas

La utilización de las vacunas se remonta desde 1798 cuando Edward Jenner, médico inglés inicia la inoculación de personas con material obtenido de lesiones de vaccinia (viruela de las vacas), para proteger las contra la viruela, pronto utilizó lesiones de la viruela humana con lo que se obtuvo una alta eficiencia protectora. Entre 1880 y 1885 Louis Pasteur científico francés logra descubrir varias formas de disminuir la virulencia de la bacteria que causa el cólera de las aves (Pasteruella avisepticum) pero sin perder su capacidad inmunizante, esto se logra también con el microorganismo causante del ántrax o carbunco en ovinos (Bacillus anthracis), siendo capaz de inducir protección contra el ántrax, cuando se inocula en animales sanos. Sin embargo el descubrimiento más famoso de Pasteur, fue obtener un extracto atenuado de tejido nervioso de animales infectados con rabia, que mantenían su capacidad inmunizante, la vacuna de la rabia. En 1908 se empleó el bacilo de Calmette y Guerin, BCG (una cepa atenuada de Mycobacterium ovis), para proteger a la población contra la tuberculosis.

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Actualmente la preparación de vacunas ha sido optimizada, de tal manera que se obtiene una mejor respuesta inmune con un mínimo riesgo para el individuo. La Secretaria de Salud es la que se encarga de la elaboración y distribución de las vacunas, así como de la vacunación de la población en' general. Las vacunas de mayor aplicación son las de poliomielitis (vacuna anti-poliomielitis tipo Sabin), la tuberculosis (vacuna BCG anti-tuberculosis), difteria y tétanos (toxoides diftérico y tetánico), entre otras.

La industria farmacéutica ha elaborado vacunas polivalentes con cepas de referencia que usualmente ocasionan procesos infecciosos en el humano. Por ejemplo la Paspat (inyectable) y Luivac (comprimidos) que contiene una mezcla de antígenos bacterianos de los gérmenes que con mayor frecuencia son responsables de las infecciones de vías respiratorias altas y bajas.

Otras son más específicas y contienen sólo la parte antigénica de la bacteria, por ejemplo la vacuna de Haemophilus influenzae contiene un conjugado de oligosacáridos del antígeno capsular. Lo importante es preparar una forma inocua del microorganismo infeccioso o de sus toxinas los cuales presentan los antígenos responsables de establecer la inmunidad protectora, a la que llamamos vacuna.

PRINCIPIO

Las autovacunas o vacunas autógenas han sido utilizadas desde hace muchos años, su dificultad radica en que la elaboración se hace de manera individual, lo que implica estudios adicionales, tiempo y costo elevado. Sin embargo el hecho de que la vacuna se elabore de las bacterias que están provocando el proceso infeccioso nos da una garantía de efectividad.

Por lo anterior podemos decir que una autovacuna es un producto biológico elaborado con antígenos procedente de un lisado de bacterias aisladas de la lesión del mismo paciente.

Para que se produzca una respuesta inmune efectiva deben ocurrir una serie de complejos procesos celulares. Los tres elementos clave de la respuesta inmunológica son: las células presentadoras de antígenos (CPA), los linfocitos T (Th0, Th1, Th2, Tc) y los linfocitos B. Las células CPA más importantes son las células dendríticas, que se localizan en todos los órganos, pero son más abundantes en el sistema linfoide. En los ganglios linfáticos se concentran en las áreas ricas en células T para facilitar su activación. Otras células presentadoras de antígenos son los macrófagos y las células B. Cuando el antígeno es captado por las células dendríticas circulantes, éstas emigran a los órganos linfáticos o al bazo y después de procesarlo en el citoplasma, lo presentan a los linfocitos CD4, en la hendidura que forman las dos cadenas de HLA (del inglés Human Leukocity Antigens) de clase II, el reconocimiento del antígeno por el linfocito CD4 es totalmente específico, ya que las cadenas a y b del receptor del linfocito T (receptores para antígeno RTC), posee una región variable similar a las inmunoglobulinas.

La respuesta inmune se realiza dentro del tejido linfoide periférico que incluye a los ganglios linfáticos, bazo y tejido que recubre el tracto respiratorio, digestivo y genitourinario.

La autovacuna se aplica por vía intradérmica y es absorbida por el torrente linfático o circulatorio, estos se mantienen en comunicación constante por medio de linfocitos que pasan de la sangre a los ganglios linfáticos y vuelve a la sangre por las principales vías linfáticas como el conducto torácico, esto permite que las células sensibles al antígeno se unan y establezcan en los sitios donde se produce la respuesta inmune.

Por lo tanto su efecto se basa en la estimulación del sistema inmunológico, incrementando la actividad fagocítica, la producción de inmunoglobulinas y la formación de linfocitos de memoria.

En las infecciones de vías respiratorias las vacunas estimulan la síntesis de anticuerpos secretados por la mucosa del tracto respiratorio, elevando significativamente los niveles séricos de inmunoglobulina tipo A (IgA).

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136

CANDIDATOS PARA ELABORAR UNA AUTOVACUNA

Se utiliza principalmente en pacientes a quienes la terapia con antibióticos ha resultado inefectiva, contraindicada o que presenten alta resistencia a los antibióticos, también como auxiliar en el tratamiento de infecciones repetitivas de las vías respiratorias altas y bajas como: faringoamigdalitis, sinusitis, rinitis, otitis y bronquitis, en infecciones de vías urinarias con recidivas causadas principalmente por Escherichia coli y Staphylococcus saprophyticus, en infecciones de la piel (dermatitis por contacto, psoriasis, entre otras) causadas por bacterias principalmente por Staphylococcus aureus coagulasa positiva (infecta los folículos pilosos y glándulas sebáceas por la producción de lipasas), problemas de acné que formen cicatriz queloide donde se aísla comúnmente Staphylococcus epidermidis. En problemas gastrointestinales en que se aísla el género Salmonella principalmente.

3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1. MATERIAL

Abatelenguas

Hisopos

Frascos (varios)

Portaobjetos,

Cubreobjetos

Aplicadores

Asa bacteriológica

Tubos de ensaye de 13 x 100

Cajas Petri

Nefelómetro de Mac Farland

Frasco vial de vidrio (ámbar o transparente)

Frasco gotero

Tapa de butilo

Retapa de aluminio

Pipetas (de 1ml, 5ml)

Matraces (varios)

Vasos de precipitados (varios)

Jeringas

Mechero

Puente de coloración

3.2 REACTIVOS

Equipo de Gram

Peróxido de hidrógeno

Reactivo de Erlich

α-naftol

KOH

Sensidiscos de antibióticos (Gram positivos y Gram negativos)

Sangre de carnero

Rojo de metilo.

Solución salina (comercial)

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Agar base sangre

Agar sal y manitol

EMB

SS

PDA

Caldo de soya tripticasa

Agar Biggy

Medio de TSI

LIA

MIO

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Agar Mûller-Hinto

Caldo V-P

Citrato

Caldo urea

3.4 QUIPO

Microscopio compuesto

Incubadora a 37

Centrifuga

Engargoladota manual

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL. ELABORACIÓN DE LA VACUNA

Obtención de la cepa problema. Se aislará, identificará y seleccionará la cepa problema.

4.1 Tomar una muestra de exudado faríngeo o de orina (de preferencia se tomarán muestras de personas enfermas) y sembrar por estría cruzada o extensión con varilla en los medios de cultivo diferenciales y enriquecidos proporcionados e incubar 24 horas a 37°.

4.2 Seleccionar colonias sospechosas de un agente infeccioso y sembrar en dos tubos con AST.

4.3 Realiza las pruebas bioquímicas correspondientes para identificar el agente.

4.4 Una vez identificada y seleccionada la cepa (bacteria o levadura), sembrarla en 5 ml de caldo de soya y tripticaseína e incuba a 37 ° C por 24 horas.

4.5.-Centrifugar a 300 rpm durante 5 minutos, desechar el sobrenadante y adicionarle 3 ml de solución salina estéril para lavar, de esta manera estamos eliminado los residuos de medio de cultivo. Realizar este procedimiento 2 veces.

4.6.- La suspensión bacteriana se filtra a través de una tela de acetato, para retener impurezas.

4.7.- Para la estandarización de la suspensión utilizar el tuno No. 1 del Nefelómetro de McFarland con aproximadamente 300 millones de bacterias por mililitro

4.8.-Envasar dos frascos viales de vidrio transparente con tapón de butilo y retapa de aluminio.

4.9 Colocar 2 mililitros en cada frasco y etiquetarlo con (300 millones de bacterias por ml).

4.10.- Las vacunas se esterilizan en autoclave, a 121°C por 5 minutos, esta es una modificación del método original en que se debe de efectuar el calentamiento en baño María a 60°C durante 60 minutos.

4.11.- Terminado el tratamiento térmico realizar la prueba de esterilidad, utilizando Caldo Tioglicolato, Caldo Soya Tripticaseína y agar dextrosa saboraud en tubo inclinado.

4.12.- Tomar el frasco vial y desinfectar con una torunda que contenga alcohol, y con una jeringa estéril retirar 0.5 ml.

4.13.- Colocar 0.2 ml en un tubo que contenga 3 ml de caldo de soya y tripticaseína, 0.2 ml en el tubo con caldo tioglicolato y una gota pequeña en la placa de agar dextrosa saboraud para realizar estría cruzada. Incubar a 37°C por 10 días los tubos y a 28 °C la placa.

4.14 Observar si hay presencia de crecimiento mediante la turbidez, para ello realizar revisiones diarias, y si no se obtiene ningún crecimiento la vacuna puede ser aceptada para su aplicación.

APLICACIÓN

La aplicación de la auto vacuna tiene un protocolo establecido que puede variar de acuerdo a la gravedad de la infección, edad del paciente y tipo de respuesta en la aplicación de la prueba, finalmente

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los criterios de administración los hace el médico basándose en la valoración clínica del paciente. La aplicación de las autovacunas debe ser supervisada y valorada únicamente por el médico tratante. El formato de aplicación general de la autovacuna es el siguiente:

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

1.- Anota la morfología colonial y microscópica de la cepa seleccionada.

Medio______________________

Características coloniales:

Tamaño _____________________Bordes_________________

Color _______________________Elevación_______________

Luz transmitida________________Aspecto ________________

Luz reflejada__________________Consistencia _____________

2.- Anota la morfología microscópica

Forma_______________Agrupación ________________GRAM________________

Forma_______________Agrupación ________________GRAM________________

3.- Anota las pruebas bioquímicas realizadas

4.- Anota el o los nombres de los microorganismos aislados del exudado faríngeo y/o urocultivo.

Exudado

faríngeo________________________________________________________________________

Urocultivo__________________________________________________________________________

5.- Anota tus resultados de prueba de esterilidad

Caldo tioglicolato____________________________________

Caldo soya tripticaseina_______________________________

Agar sabouraud _____________________________________

5.1 ¿Que es una vacuna autógena?

5.2 ¿Qué es un antígeno y cuales son sus características?

5.3 ¿Qué es un epitope?

5.4 ¿En que consiste la respuesta inmune?

5.5 ¿Que son las vacunas génicas?

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6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

6.1 Discutir cada uno de los pasos que se realizaron en la elaboración de una vacuna.

6.2 Analizar las ventajas y desventajas de este tipo de vacunas

7. CONCLUSIONES.

7.1 Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los objetivos de la práctica, los resultados y la bibliografía consultada

8. BIBLIOGRAFIA.

8.1 Balcells Gorina A. 1995. La Clínica y el Laboratorio, interpretación de análisis y pruebas funcionales, exploración de los síndromes, cuadro biológico de las enfermedades. Ediciones científicas y técnicas S.A. 16Q Edición.

8.2 Blanco de la Mora E. 1997. Inmunidad y Vacunas. Infectología. Año 17. No. 3. Marzo.

8.3 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall. España. 956 págs.

8.4 Koneman W. E. 1992. Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas. Editorial Médica Panamericana. 3° Edición. Págs. 11-13,150-152,395-397,413-415.

8.5 Lawrence A. K. and Amadeo J. P.1989. Clinical Chemestry, theory, analysis and correlation. 2Qedition. Pages 12-15.

8.6 Mac Faddin J. F. 1980. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Editorial Médica Panamericana.

8.7 Regueiro J.R. y López LC. Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. Editorial Médica Panamericana. 2Q Edición. Págs.100-104, 136-137.

8.8 Roitt I. 1994. Fundamentos de Inmunología. Editorial Médica Panamericana. 7Q Edición.

8.9 Rojas Espinosa. Inmunología (de memoria). Editorial Médica Panamericana. lQ Edición Págs.11-13,181-182.

8.10 Programa de Actualización en Vacunas. Asociación Española de Pediatría, Programa de

actualización de vacunas

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AGARES

1. AGAR BACTERIOLÓGICO

El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y semisólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetración del oxígeno en medios líquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l

2. AGAR NUTRITIVO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Agar 15 g

pH final = 6,8 0,2

Método de preparación:

Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. Calentar a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos.

3. AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de caseína 5 g Extracto de levadura 2.5 g Glucosa 1 g Agar 15 g

pH final = 7,0 0,1

Método de preparación:

Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, vaciar en placas estériles

4. AGAR CITRATO DE SIMMONS

Fórmula en g/l de agua destilada: Fosfato dehidrogenado de amonio 1,0 g Fosfato dipotásico 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Citrato de sodio 2,0 g Sulfato de magnesio 0,2 g Agar 15,0 g Azul bromotimol 0,06 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear también como medio en placas.

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5. AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR

Fórmula en g/l de agua destilada: Mezcla de peptonas 20,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Dextrosa 1,0 g Sulfato de amonio férrico 0,2 g Rojo fenol 0,025 g Agar 13,0 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,3 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 118ºC durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm.

6. AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de levadura 3 g Glucosa 1 g L-lisina 10 g Citrato férrico de amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,4 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 13,5 g

pH final = 6,7 0,2

Método de preparación:

Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el punto de ebullición para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.

7. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)

Fórmula en g/l de agua destilada: Digerido pancreático de gelatina 10,0 g Fosfato dibásico de potasio 2,0 g Agar 15,0 g Lactosa 10,0 g Eosina "Y" 0,4 g Azul de metileno (Metiltionina) 0,065 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2

Disolver el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en el agua. Esterilizar, dejar enfriar y antes de utilizar, agregar las siguientes soluciones a cada 100 ml de agar

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líquido: 5 ml de solución 1:5 de lactosa, 2 ml de solución 1:50 de eosina "Y" y 2 ml de solución 1:300 de azul de metileno. Mezclar.

8. AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)

Fórmula en g/l de agua destilada: Infusión de papa (sólidos) 4 g Dextrosa 20 g Agar 15 g

pH final = 5,6 0,1 Método de preparación:

Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

9. AGAR LETHEEN MODIFICADO

Fórmula en g/l de agua destilada: Agar Letheen 32,0 g Peptona de caseína 5,0 g Peptona de carne 10,0 g Extracto de levadura 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Bisulfito de sodio 0,1 g Agar 5,0 g Agua 1 000,0 ml pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Mezclar los componentes y calentar con agitación hasta la disolución completa del agar. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

10. AGAR MACCONKEY

Fórmula en g/l de agua destilada: Digerido pancreático de gelatina 17,0 g Digerido pancreático de caseína 1,5 g Digerido péptico de tejido animal 1,5 g Lactosa 10,0 g Mezcla de sales biliares 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 13,5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal Violeta 0,001 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en 1 000 ml de agua, remojar de 10 a 15 minutos y calentar a ebullición agitando continuamente. Hervir durante un minuto, esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a 45-50ºC y vaciar en cajas Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio.

11. AGAR VOGEL JOHNSON

Fórmula en g/l de agua destilada:

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Digerido pancreático de caseína 10,0 g Extracto de levadura 5,0 g Manitol 10,0 g Fosfato dibásico de potasio 5,0 g Cloruro de litio 5,0 g Glicina 10,0 g Agar 16,0 g Rojo de fenol 0,025 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar, dejar remojar de 5 a 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50ºC y adicionar 20 ml de una solución estéril al 1 % de telurito de potasio. Agitar vigorosamente y distribuir unos 20 ml en cajas de Petri.

12. AGAR DE SAL Y MANITOL

Fórmula en g/l de agua destilada: Digerido pancreático de caseína 5,0 g Digerido péptico de tejido animal 5,0 g Extracto de carne 1,0 g D-manitol 10,0 g Cloruro de sodio 75,0 g Agar 15,0 g Rojo de fenol 0,025 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,4 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y remojar 15 minutos. Mezclar y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Distribuir porciones de 20 ml en cajas Petri de 15x100 mm.

13. AGAR CETRIMIDA

Fórmula en g/l de agua destilada: Digerido pancreático de gelatina 20,0 g Cloruro de magnesio 1,4 g Sulfato de potasio 10,0 g Agar 13,6 g Cetil bromuro de trimetil amonio (cetrimida) 0,3 g Glicerol 10,0 ml Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Disolver en agua los componentes sólidos antes de adicionar el glicerol. Remojar unos 10 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

14. AGAR EXTRACTO DE MALTA

Fórmula en g/l de agua destilada: Extracto de malta 30,0 g

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Agar 20,0 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 5,5 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, homogeneizar y remojar de 10 a 15 minutos, calentar agitando frecuentemente, hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Si el medio se sobrecalienta el agar perderá su capacidad de gelificarse. Enfriar de 47-50°C y ajustar el pH a 3,5 con una solución de ácido tartárico al 10% estéril.

15. AGAR VERDE BRILLANTE.

Fórmula en g/l de agua destilada: Extracto de levadura 3,0 g Mezcla de peptonas 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Rojo de fenol 0,08 g Agar 20,0 g Verde brillante 0,125 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar remojar unos 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos, dejar enfriar a 45-50ºC y distribuir en cajas de Petri estériles.

16. AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (AGAR XLD)

Fórmula en g/l de agua destilada: Xilosa 3,5 g L-Lisina 5,0 g Lactosa 7,5 g Sacarosa 7,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Rojo de fenol 0,08 g Agar 13,5 g Desoxicolato de sodio 2,5 g Tiosulfato de sodio 6,8 g Citrato de hierro y amonio 0,8 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,4 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y dejar que se remoje de 10 a 15 minutos. Calentar con todo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Transfiera al baño de agua, dejar enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri. El medio debe ser transparente y color rojo rubí anaranjado. El calentamiento excesivo o el mantener demasiado tiempo en baño de agua, puede ocasionar que se formen precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamaño y presenten reacciones menos nítidas. Sin embargo el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por filtración con papel filtro.

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17. AGAR PSEUDOMONA F

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de caseína 10,0 g Peptona de carne 10,0 g Sulfato de magnesio 1,5 g Hidrogenofosfato dipotásico 1,5 g Agar-agar 12,0 g Glicerina 10,0 ml Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas.

18. AGAR PSEUDOMONA P

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 20,0 g Cloruro de magnesio 1,4 g Sulfato potásico 10,0 g Agar-agar 12,6 g Glicerina 10,0 ml Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Disolver en agua los componentes sólidos, adicionar la glicerina. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. Dejar solidificar los tubos en posición inclinada o bien verter en placas.

19. AGAR SULFITO Y BISMUTO

Fórmula en g/l de agua destilada: Mezcla de peptonas 10,0 g Extracto de carne 5,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato disódico 4,0 g Sulfato ferroso 0,3 g Indicador de sulfito de bismuto 8,0 g Verde brillante 0,025 g Agar 20,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,5 ± 0,2

Suspender el polvo en un litro de agua, mezclar bien y remojar el medio deshidratado de 10 a 15 minutos para obtener un buen gel. Hervir no más de un minuto agitando continuamente para que se disuelva completamente el agar.

Dejar que el medio se enfríe a 45ºC y sin dejar de agitarlo vacíe en cajas de Petri no menos de 20 ml de medio fluido. Las placas deben permanecer parcialmente descubiertas hasta que se seque la superficie del medio y usarlos el mismo día. Evite el sobrecalentamiento.

20. MEDIO INDOL NITRITO

Fórmula en g/l de agua destilada: (Medio de tripcaseína y nitrato)

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Peptona de caseína 20,0 g Fosfato disódico 2,0 g Dextrosa 1,0 g Nitrato de potasio 1,0 g Agar 1,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,2 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Agregar 2 g de agar en el caso de hacerse movilidad y detección de gas. Calentar agitando continuamente y hervir durante más o menos un minuto hasta disolución total del medio. Envasar en tubos de ensayo hasta la mitad de su altura y esterilizar en autoclave durante 15 minutos. Si se prepara el medio semisólido, dejar que se solidifiquen los tubos en posición vertical.

21. AGAR LISINA HIERRO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Dextrosa 1,0 g L-lisina 10,0 g Citrato férrico-amónico 0,5 g Trisulfato de sodio (anhidro) 0,04 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 15,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,7 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes agitando con frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Distribuir en porciones de 4 ml en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Dejar solidificar en posición inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de agua por evaporación.

22. AGAR DNA AZUL TOLUIDINA

Fórmula en g/l de agua destilada: Acido desoxirribonucleico (DNA) 0,3 g Agar 10,0 g Cloruro de calcio (anhidro) 0,0011 g Cloruro de sodio 10,0 g Azul O toluidina 0,083 g Tris (hidroximetil) aminometano 6,1 g Agua 1 000,0 ml

Disolver el Tris (hidroximetil) aminometano en un litro de agua. Ajustar el pH a 9,0, adicionar los demás ingredientes excepto el azul O toluidina y calentar a ebullición para su disolución. Añadir al medio el color azul O toluidina. Distribuir en cajas Petri o portaobjetos.

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CALDOS

1. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona especial No. 1 7,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato dipotásico 5,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

2. CALDO NUTRITIVO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g

pH final = 6,9 0,2 Método de preparación:

Suspender el almidón en 100 ml de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 ml de agua destilada con calentamiento y agitación continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 °C por 15 minutos en autoclave.

3. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO

Formula en g/l de agua destilada: Extracto de levadura 1 g Sulfato de amonio 2 g Fosfato dipotásico 0,6 g Fosfato monopotásico 0,4 g Cloruro de sodio 2 g Malonato de sodio 3 g Dextrosa 0,25 g Azul de bromotimol 0,025 g

pH final = 6,7 0,2 Método de preparación:

Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos.

4. CALDO DE INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN

Fórmula en g/l de agua destilada: Infusión de cerebro de ternera200 g Infusión de corazón de res 250 g Peptona de gelatina 10 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato disódico 2,5 g Dextrosa 2 g

pH final = 7,4 0,2 Método de preparación:

Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para

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disolverlo.

Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe utilizarse el mismo día de su preparación.

5. CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de caseína 10 g Cloruro de sodio 5 g Rojo de fenol 0,018 g Lactosa 5 g

pH final = 7,4 0,2 Método de preparación:

Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su ebullición y completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15 minutos.

6. CALDO UREA

Fórmula en g/l de agua destilada: Urea20 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato dipotásico 9,5 g Extracto de levadura 0,1 g Rojo de fenol 0,01 g

pH final = 6,8 0,2 Método de preparación:

Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Distribuir en cantidades de 0,1 a 1 ml en tubo estériles. En lugar de esterilizarse por filtración puede esterilizarse en autoclave a 108 °C de 7 a 10 minutos.

7. CALDO NITRATO

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Nitrato de potasio 1 g

pH final = 7,0 0,2 Método de preparación:

Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolución total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

8. CALDO KCN

Fórmula en g/l de agua destilada:

MEDIO BÁSICO

Peptona 3 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato de potasio monobásico (KH2 PO4) 0,225 g Fosfato dibásico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g

pH final = 7,6 0,2

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Método de preparación:

Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es necesario hasta su disolución. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapón de rosca y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

CIANURO DE POTASIO

Preparar un tubo con tapón de rosca, estéril KCN 0.5 g Agua destilada 100 ml

No absorber la solución de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El cianuro es sumamente venenoso y puede causar la muerte.

A los 5 ml del medio básico frió agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y mezclar bien.

9. CALDO LETHEEN MODIFICADO

Fórmula en g/l de agua destilada: Caldo Letheen 26,7 g Peptona de caseína 5,0 g Peptona de carne 10,0 g Extracto de levadura 2,0 g Bisulfito de sodio 0,1 g Agua 1 000,0 ml pH final después de esterilizar 7,2 ± 0,2

Mezclar los componentes hasta la disolución completa y distribuir 95 ml en botellas con tapón de rosca para dilución. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

10. BASE DE CALDO TETRATIONATO

Fórmula en g/l de agua destilada: Mezcla de peptonas 5,0 g Mezcla de sales biliares 1,0 g Carbonato de calcio 10,0 g Tiosulfato de sodio 30,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,0 ± 0,1

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Mezclar bien y calentar a ebullición. Dejar enfriar y envasar en tubos de ensayo estériles, en volúmenes de 10 ml cada uno.

Guardar en refrigeración. No esterilizar en autoclave. Momentos antes de usarlo agregar 0,2 ml (de 3 a 4 gotas) de la solución yodo-yoduro de potasio (6.3.1.7) a cada tubo. Usar el medio el mismo día en que se le agrega la solución de yodo.

11. CALDO DEXTROSA SABOURAUD

Fórmula en g/l de agua destilada: Polipeptona o neopeptona 10,0 g Dextrosa 40,0 g Agua 1 000,0 ml pH después de esterilizar 5,6 ± 0,2

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Suspender el medio deshidratado en un litro de agua. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien hasta obtener una suspensión uniforme. Calentar agitando frecuentemente durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. No sobrecalentar, ya que por su alto contenido en carbohidratos se obscurece y pierde eficacia.

12. CALDO INFUSIÓN DE CEREBRO CORAZÓN

Fórmula en g/l de agua destilada: Infusión de cerebro de ternera 200,0 g Infusión de corazón de res 250,0 g Peptona de gelatina 10,0 g Dextrosa 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato disódico 2,5 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,4 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua y calentar ligeramente si es necesario. Se puede agregar 0,1% de agar si se desea. Envasar y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

13. CALDO CISTINA SELENITO

Fórmula en g/l de agua destilada: Mezcla de peptonas 5,0 g Lactosa 4,0 g Fosfato de sodio 10,0 g Selenito ácido de sodio 4,0 g Cistina 0,01 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,0 ± 0,2

Suspender 23 g del polvo en un litro de agua desionizada. Mezclar bien y calentar ligeramente hasta que el medio se disuelva. Envasar en tubos de ensaye, preferiblemente con tapas de rosca, volúmenes entre 10 y 15 ml por tubo. Esterilizar a vapor fluente durante 15 minutos. No en autoclave. No sobrecalentar. El medio así preparado y herméticamente tapado, puede conservarse en buenas condiciones, hasta 3 meses en refrigeración.

14. MEDIO ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona especial No. 1 7,0 g Dextrosa 5,0 g Fosfato dipotásico 5,0 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,9 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos

15. CALDO UREA

Fórmula en g/l de agua destilada: Urea 20,0 g Fosfato monopotásico 9,1 g Fosfato de sodio 9,5 g

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Extracto de levadura 0,1 g Rojo de fenol 0,01 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,8 ± 0,2

Disolver 38,61 g en 1 000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60ºC como máximo. Esterilizar por filtración o tras distribución a razón de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de vapor durante 5 minutos. No esterilizar en autoclave.

16. CALDO DE LISINA Y DESCARBOXILASA

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Dextrosa 1,0 g L-Lisina 5,0 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,8 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapón de rosca. La tapa debe de estar algo floja para permitir un buen intercambio de gases. Apretarla bien al terminar la esterilización. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

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MEDIOS SEMISÓLIDOS

1. MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)

Fórmula en g/l de agua destilada: Medio SIM Peptona de caseína 20,0 g Peptona de carne 6,1 g Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agar 3,5 g Agua 1000,0 ml pH final 7,3 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10 minutos y hervir a ebullición durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4 cm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2. MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona Caseína 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato dipotásico 0,3 g Azul bromotimol 0,03 g Agar 2,5 g Agua 1 000,0 ml pH final 7,1 ± 0,2

Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia, hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por filtración (o del azúcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido, mezclar y distribuir asépticamente 5 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 118°C durante 10 minutos a fin de evitar la degradación del azúcar. El medio tiene un color verde.

3. MEDIO INDOL ORNITINA (MIO)

Fórmula en g/l de agua destilada: Extracto de levadura 3,0 g Peptona 10,0 g Triptona 10,0 g L-ornitina 5,0 g Dextrosa 1,0 g Agar 2,0 g Bromocresol púrpura 0,02 g Agua 1 000,0 ml pH final 6,5 ± 0,2

Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullición. Distribuir porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

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4. GELATINA NUTRITIVA

Fórmula en g/l de agua destilada: Peptona de gelatina 5 g Extracto de carne de res 3 g Gelatina 120 g

pH final = 6,8 0,2 Método de preparación:

Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir en tubos. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

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SOLUCIONES Y REACTIVOS

1. Aceite mineral

Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

2. Solución de rojo de metilo

Formula: Rojo de metilo 0.1 g Alcohol etílico 300 ml Agua destilada 200 ml

Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.

Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como prueba Negativa.

3. Solución de ácido tartárico al 10% p/v

Formula: Acido tartárico 10,0 g Agua c.b.p. 100,0 ml

Disolver el ácido tartárico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana

4. Solución de -Naftil amina

Fórmula: Dimetil alfa naftil amina 5,0 g Ácido acético 5 N1,0

5. Solución de hidróxido de potasio al 40 %

Fórmula: Hidróxido de potasio 40 g Agua destilada100 ml

6. Solución de alfa naftol

Fórmula: Alfa naftol 5 g Etanol100 ml

7. Reactivo de Griess-Ilosvays

Solución A Acido sulfanílico 8,0 g Acido acético 5N 1 000,0 ml

El ácido acético 5N se prepara agregándole un volumen de ácido acético glacial a 2,5 volúmenes de agua. Mezcle bien, añada luego el ácido sulfanílico y vuelva a mezclar.

Solución B Alfa naftilamina 8,0 g Acido acético 5N 1 000,0 ml

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Mezclar y almacenar en refrigeración (4ºC) cuando no esté en uso. Generalmente ambos reactivos son estables aproximadamente durante 3 meses.

8) Reactivo de Kovacs y Ehrlich

Para-dimetil-amino-benzaldehído 5,0 g Alcohol amílico o butílico 75,0 ml Acido clorhídrico (37%) QP 25,0 ml

Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un baño de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado.

9) Reactivo de O'Meora

Hidróxido de potasio 40,0 g Agua 100,0 ml

Disolver y enfriar. Añadir 0,3 g de creatinina (monohidrato) La solución reactiva, lista para el uso, puede conservarse en refrigeración (4ºC) durante 4 semanas aproximadamente.

10) Prueba de Vogues Proskauer

Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Formula: Alfa naftol 5 g Alcohol etílico absoluto 100 ml

Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.

Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.

11) Reacción de Indol (reactivo de Kovac)

Formula: P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g Alcohol amílico.o alcohol isoamílico750 ml Acido clorhídrico concentrado 25 ml

Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4 ºC.

Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60 ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.

12) Solución de ácido sulfanilico

Formula: Ácido sulfanílico 8,0 g Ácido acético 5N

(Una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua)1,0 L

13) Solución de agua oxigenada 1:10

Preparación:

Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.

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14) Solución de telurito de potasio al 1% p/v

Telurito de potasio 1,0 g Agua c.b.p. 100,0 ml

Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por membrana.

15) Solución de tween 80%

Tween 80% sin diluir

Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

16) Solución salina al 0,85%

Cloruro de sodio 8,5 g Agua c.b.p. 1 000,0 ml

Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1 000 ml, ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 filtrar, envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

17) Solución de etanol 80% y HCl al 1% v/v

Etanol 80,0 ml HCl 1,0 ml Agua c.b.p. 100,0 ml

Mezclar el etanol y el HCl, aforar a 100 ml con agua y envasar.

18) Solución de yodo-yoduro de potasio p/v

Yodo 6,0 g Yoduro de potasio 5,0 g Agua 20,0 ml

Disolver el yoduro de potasio en el agua y en esta solución disolver el yodo. Conservar en envases protegidos de la luz.

19) Solución de agua oxigenada al 3% v/v

Peróxido de Hidrógeno 3,0 ml Agua c.b.p. 100,0 ml

Mezclar el peróxido en agua, aforar a 100 ml y envasar.

20) Solución indicadora rojo de metilo

Rojo de metilo 0,1 g Alcohol al 95% 300,0 ml Agua c.b.p. 500,0 ml

Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml.

21) Solución yodo-yodurada

Yoduro de potasio 2,0 g Yodo 1,0 g Agua 100,0 ml

Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se disuelva el yodo, agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz.

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22) Solución safranina

Safranina "O" 2,5 g Alcohol etílico al 95% 100,0 ml

Disolver la safranina "O" en el alcohol etílico.Tomar 10 ml de esta solución y llevar a 100 ml con agua. Agitar.

23) Solución alcohol-acetona

Partes iguales de acetona y alcohol etílico al 95%.

24) Reactivo de Ehrlich

Fórmula:

Para-dimetil amino benzaldehído2 g Alcohol etílico absoluto 190 ml Ácido clorhídrico concentrado40 ml

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COLORANTES, DECOLORANTES Y MORDENTE

1) Cristal violeta Formulación en g/100 ml: Cristal violeta 2 Agua destilada 80 Etanol al 95% 20 Oxalato de amonio 0,8 Preparación: Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de amonio en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.

2) Yodo (lugol)

Formulación en g/100 ml: Yoduro de potasio 2 Yodo 1 Agua destilada 100 Preparación: Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metálico y disolver. Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar.

3) Alcohol cetona

Formulación en g/100 ml: Acetona 50 Alcohol etílico 100 Preparación: Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco herméticamente cerrado, hasta su uso.

4) Safranina

Formulación en g/100 ml: Agua destilada 100 Safranina 0,5 Preparación: Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua destilada.

5) Fucsina fenicada

Formulación: Solución A Fucsina básica 0,3 Alcohol etílico al 95% 10 Mezclar hasta disolución completa Solución B Cristales de fenol 5 Agua destilada 95 Preparación: Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la

solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.

6)Azul de metileno

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Formulación: Azul de Metileno 1 g Agua destilada 100 ml Preparación: Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.

7)Verde de malaquita

Formulación: Verde de malaquita 10 g Agua destilada 100 ml Preparación:

Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante en frasco ámbar.

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ESTÁNDARES NEFELOMÉTRICOS DE McFARLAND

1.- Preparación de estándares: Sulfato de bario

Reactivos:

BaCl2, solución acuosa al 1 %

H2SO4 QP al 1 %

BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl

2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamaño, mismos diámetro, limpios y enjuagados con agua destilada.

3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a continuación:

Estándares de sulfato de bario

Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0

Densidad aprox. De células (X 108/ml)

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Densidad aprox. de células en millones /ml

300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000

4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células homogéneas de E. coli por ml.

Precauciones:

Si el caldo de cultivo es claro, o si es coloreado.