Laboratorio 4 - Determinación Glucosa

Universidad Catlica de Temuco Escuela de Ciencias de la Salud

Manual Actividades Practicas Bioqumica General TEM1143

Laboratorio N 4: Determinacin cuantitativa deglcidos

Introduccin

La determinacin de glcidos es una de las tcnicas de mayor demanda a nivel delaboratorios de bioqumica clnica y analtica, siendo glucosa el analitomayormente analizado. Sin embargo, otros azucares simples tambin tienenimportancia clnica, como por ejemplo la fructosa, la cual juega un rol importanteen la funcin espermtica, por lo que su determinacin se utiliza de manerarutinaria dentro de los anlisis bioqumicos de lquido seminal, sobre todo en casosdonde existe sospecha de infertilidad masculina.Si bien las determinaciones de disacridos como sacarosa y lactosa tienenimportancia especialmente a nivel de laboratorios de anlisis de alimentos, lamayora de las tcnicas utilizadas para determinarlos se basan en la escisinenzimtica de los disacridos en sus porciones monomricas, cuantificando laglucosa liberada de esta reaccin.Para el diagnstico de anormalidades en el almacenamiento de glucgeno, serealiza la determinacin de este polisacrido principalmente en tejido heptico ymuscular y al igual que las determinaciones de disacridos, se basan en laobtencin de molculas de glucosa por ruptura qumica o enzimtica del enlaceglucosdico. SI bien existen mtodos de determinacin directa de glucgeno quepueden resultar ms exactos, suelen ser ms engorrosos, adems de contar conpoca cantidad de fabricantes que ofrecen estas tcnicas en forma de kitscomerciales. Por esta razn, las determinaciones de glucgeno generalmente noson consideradas de rutina en el laboratorio clnico, siendo mayormenteutilizadas en laboratorios de investigacin.

Importancia clnica de la determinacin de glucosaLa concentracin de glucosa en sangre se mantiene normalmente dentro delmites relativamente estrechos en diferentes situaciones metablicas (estadopostprandial, ayuno o ejercicio intenso), gracias a hormonas reguladoras como lainsulina, el glucagn o la epinefrina.Adems de la simple cuantificacin de glucosa plasmtica en estado de ayuno, ladeterminacin de este analito tambin se realiza conjuntamente con otras pruebasasociadas, como el test de tolerancia a glucosa oral, la glicemia postprandial, etc.Estos estudios tienen un gran valor en el diagnstico, seguimiento y tratamientode la Diabetes Mellitus, el desorden del metabolismo de los carbohidratossanguneos ms frecuentemente diagnosticado.Una hiperglicemia superior a 300 mg/dL (16,5 mmol/L) puede conducir a unacetoacidosis o un coma hiperosmolar. Por otra parte, cualquier hipoglicemia



duradera, inferior a 30 mg/dL (1,7 mmol/L), es susceptible de conllevar lesionescerebrales graves e irreversibles.Cuando la glucosa sangunea alcanza valores relativamente altos (como en laDiabetes Mellitus), el rin ejerce un efecto regulador. La glucosa es filtradacontinuamente por los glomrulos, siendo habitualmente reintegradacompletamente a la sangre por el sistema de resorcin de los tbulos renales. Lacapacidad del sistema tubular para absorber glucosa est limitada a una tasaaproximada de 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangresobrepasa la que puede ser reabsorbida, el exceso pasa a la orina producindoseglucosuria.

Determinacin cuantitativa de glucosa: fundamentos

Mtodos QumicosLos primeros mtodos utilizados para la cuantificacin de glucosa fueron mtodosqumicos, como el del ferricianuro o el de la orto-toluidina (o-toluidina). Este ltimose basa en la condensacin de la o-toluidina con el grupo aldehdo de la glucosa,formando una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiffcorrespondiente. Las reacciones que tienen lugar despus de la condensacinoriginal producen una mezcla de cromgenos verdes los cuales se midenespectrofotomtricamente a 630 nm. Si bien este mtodo fue ampliamenteutilizado, su uso rutinario fue cambiando a favor de los mtodos enzimticos, mssimples y rpidos de utilizar, con menos variables de error y que no utilizansolventes nocivos (tolueno o derivados del cianuro).

Mtodos EnzimticosSi bien existen otros mtodos enzimticos de gran desempeo, como el de laglucosa hexoquinasa, el mtodo enzimtico ms utilizado en la actualidad es el deGlucosa Oxidasa Peroxidasa (GOD-PAP), el cual se basa en la especificidad dela enzima glucosa oxidasa (GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza laoxidacin de la glucosa por oxgeno molecular dando D-gluconato y perxido dehidrgeno (H2O2). Para detectar y cuantificar esta oxidacin se ocupa una reaccinacoplada. El perxido de hidrogeno formado, reacciona bajo la influencia deperxidasa (POD) con fenol y 4-aminoantipirina para formar un complejo rojo-violeta de quinona que se cuantifica midiendo la absorbancia a 500 o 546 nm,dependiendo del tipo de lmpara.

D glucosa + 02 + H2O GOD cido Glucornico + H2O2

2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol POD Quinineimina + 4 H2O



Valores de Referencia de Glucosa

[glucosa]normal en sangre (ayuno )70 110 mg/dL ( 3,9 6,1 mmol/L).[glucosa]normal en orina 1 15 mg/dL ( 0,06 0,8 mmol/L).

Trabajo experimental

Objetivos:- Determinar el rango de linearidad del mtodo de GOD-PAP para la

determinacin de glucosa.- Determinar la concentracin de glucosa en muestras problema de

concentracin desconocida.

Materiales- Matraces aforados de 25 mL- Pipetas parciales 5 o 10 mL- Micropipetas p100 y/o p10- Espectrofotmetro- Vrtex- Tubos Khan- Reactivo de GOD-PAP- Solucin patrn de glucosa (Material de referencia) concentracin ______

Procedimiento

1. Preparacin de la curva de calibracinNOTA: La curva de calibracin se preparar de forma colectiva, entre todos losmiembros del grupo (6 integrantes caga grupo). Recuerde encender losespectrofotmetros al menos 15 minutos antes de realizar cualquier lectura.

1.1 A partir de una solucin de 10 g/L de glucosa (Material de ReferenciaConcentrado), prepare una solucin de una concentracin asignada durante elinicio del laboratorio. Cada alumno tendr una de las siguientes concentracionesasignadas: 30, 70, 100, 150, 300 y 500 mg/dL, la cual deber preparar en unmatraz aforado de _____ mL y agua destilada como solvente.



1.2 Prepare una batera de 5 tubos y siga el procedimiento descrito en el protocolodel reactivo (ver hoja anexa), utilizando el micromtodo.

- Coloque 1 mL de reactivo GOD-PAP en cada tubo de ensayo.

- A los tres primeros tubos agregue 10 L de su solucin correspondientede glucosa diluida.

2. Preparacin de las muestras problema2.1 En el tubo 4, coloque 10 L de la muestra 1 (suero).2.2 En el tubo 5 coloque 10 L de la muestra 2 (orina).

3. Determinacin espectrofotomtrica de glucosa3.1 Utilize Parafilm para tapar sus tubos y mezcle con vrtex.3.2 Deje incubar sus 5 tubos a temperatura ambiente por 10 minutos3.3 Realice las lecturas espectrofotomtricas a 546 nm, utilizando el modo ATC, yconfigurando el carril de cubetas para que lea 6 tubos. Adicionalmente se lesuministrar un blanco de reactivo el cual debe colocar en la posicin B del carril.3.4 Calcule sus valores de Absorbancia corregida para cada tubo, restando laAbsorbancia del blanco a del resto de sus tubos.3.5 Complete la siguiente tabla

ConcentracinGlucosamg/dL

VolumenMRC

AbsorbanciaR1

AbsorbanciaR2

AbsorbanciaR3

3070

100150300500

Absorbancia del blanco:

3.6 Grafique la curva de calibracin y obtenga el factor de calibracin para elmtodo.3.7 Calcule la concentracin de glucosa en las muestras problema utilizando suabsorbancia y el factor de calibracin.

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