MICROBIOLOGIA SANITARIA ILAB N2-USO DEL MICROSCOPIO- COLORACION DE BACTERIAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERAFACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

LABORATORIO N 2:USO DEL MICROSCOPIO COLORACION DE BACTERIACURSO:MICROBIOLOGA SANITARIA IPROFESOR:ING. JORGE GILBERTO TELLO CEBREROSALUMNO:LUIS AARON CABELLO CANDELA

2015

1) OBJETIVOS

Conocer y aprender a utilizar el microscopio compuesto Saber de los cuidados que se debe tener al manejar el microscopio Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica. Identificar el tipo de bacterias mediante el mtodo de tincin de Gram Describir las caractersticas de las diferentes formas observadas

2) FUNDAMENTO TERICO

MICROSCOPIO Los microbilogos utilizan diversos microscopios pticos en su trabajo; de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia son los tipos de microscopios ms empleados.

Es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento ptico que contiene dos o ms lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa.

Los microscopios pertenecen a dos clases, el de luz (ptico) y el electrnico, segn el principio en que se base la amplificacin. El microscopio mediante el cual la amplificacin se obtiene por un sistema de lentes pticos (microscopios de luz) abarca los siguientes tipos: Microscopio de campo claro o luminoso. Microscopio de campo oscuro o ultramicroscopio. Microscopio de luz ultravioleta. Microscopio de fluorescencia. Microscopio de contraste de fases.El microscopio electrnico, como su nombre lo indica, se basa en un haz de electrones en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen amplificada. Los estudiantes hacen casi la totalidad de sus exmenes, acaso todos, con el microscopio de campo luminoso, el instrumento de uso ms comn para el trabajo diario. Los otros tipos de microscopia se usan para propsitos especiales o trabajos de investigacin. Sin embargo, los

estudiantes conocen sus aplicaciones porque cada uno tiene propiedades convenientes para demostrar estructuras morfolgicas especficas.MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO Un microscopio ptico es un instrumento que consiste bsicamente en un tubo con lentes de aumento en ambos extremos. El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las lentes del microscopio y as se amplifica la imagen. Permite visualizar estructuras pequeas, cuyas dimensiones son inferiores al lmite del poder de resolucin del ojo humano. Un microscopio ptico tiene dos caractersticas fundamentales: 1. la amplificacin (aumento) 2. el poder de resolucin, que a su vez depende de: a. la calidad de las lentes b. la longitud de onda de la luz que ilumina Poder de resolucin es la capacidad de separar dos puntos muy prximos y dar de ellos imgenes claras y definidas. El del ojo humano es de 100m y el de un microscopio ptico es de 0.24m. En los microscopios pticos el material biolgico a examinar se observa por transparencia, significa que la luz debe atravesar los tejidos para formar imgenes. La consecuencia de esto es que se hace necesario estudiar: - clulas aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente delgados como para ser atravesados por radiacin luminosa. La gran mayora de los componentes celulares no tienen color debido al gran contenido de agua. Esto plantea la necesidad del uso de colorantes selectivos, los cuales presentan a la vez la dificultad de matar a las clulas, ya que previamente los tejidos deben ser fijados, deshidratados, incluidos en un material endurecible y cortados. Un microscopio ptico consta de una parte mecnica, una parte ptica y un sistema de iluminacin: 1) PARTES MECANICA DEL MICROSCOPIO OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. TUBO PTICO se puede acercar o alejar de la preparacin mediante un TORNILLO MACROMTRICO o de grandes movimientos que sirve para realizar un primer enfoque. REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. La esfera se suele llamar CABEZAL Y contiene los sistemas de lentes oculares (monoculares o binoculares (2 lentes)). BRAZO: Es una pieza metlica de forma curvada que puede girar; sostiene por su extremo superior al Tubo ptico y en el inferior lleva varias piezas importantes. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. PINZAS DE SUJECION: Parte mecnica que sirve para sujetar la preparacin. La mayora de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparacin. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. El condensador de la parte de abajo tambin se llama FOCO y es el que dirige los rayos luminosos hacia el condensador. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. BASE: Sujecin de todo el microscopio.

2) Parte ptica: Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador. - Objetivos: Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la funcin de una sola. Este sistema sirve para corregir errores de observacin que derivaran del uso de una sola lente. En los microscopios modernos es comn que los objetivos sean parafocales, es decir, que si se encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revlver y cambiar por otro objetivo, ste resulta prcticamente enfocado, siendo suficiente slo una ligera correccin con el micromtrico para lograr el enfoque perfecto. En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que indican: a. Aumento b. Abertura numrica c. Espesor del cubreobjetos a utilizar, en mm.

a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X, estos dos ltimos se utilizan como objetivos de inmersin). Respecto del aumento hay que diferenciar: 1) Aumento primario: es el dado por el objetivo en s. 2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo. Nos dice cuntas veces est amplificada la imagen que obtenemos del material examinado. 3) Aumento til: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta cantidad condicionada por la abertura numrica del objetivo. Significa que si el aumento total supera el aumento til la imagen obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definicin. En los objetivos de tipo acromtico el mayor aumento til posible es de mil veces la abertura numrica (A.N. * 1.000), mientras que en los objetivos ms perfeccionados, como los apocromticos o los de fluorita, el lmite de aumento til es de 1. 500 veces la abertura numrica (A.N. * 1.500). b. Abertura Numrica (AN): cada objetivo tiene un determinado poder de resolucin que se mide en trminos de abertura numrica del objetivo. Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de l formando un cono que penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ngulo de abertura; y a la mitad de este ngulo de abertura se lo llama ngulo x. El medio en el que el objetivo trabaja (aire, aceite o agua) tiene un ndice de refraccin determinado al que designamos como N. La abertura numrica se determina entonces del siguiente modo:

La abertura numrica determina las siguientes caractersticas pticas: 1. Resolucin: es la capacidad que posee un objetivo para separar dos puntos muy prximos entre s.

2. Lmite de resolucin: es la mnima distancia en que dos puntos prximos se ven como separados. Por lo tanto: a menor lmite de resolucin, mayor poder resolutivo El lmite de resolucin se calcula del siguiente modo:

0.61 = constante = longitud de onda de la luz incidente A.N. = abertura numrica Si se pretende poder observar estructuras muy pequeas se requiere el menor lmite de resolucin posible. Deduciendo de la frmula esto se consigue a mayor abertura numrica y a menor longitud de onda de la luz incidente.

- Oculares: Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo, aumento que est grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X, siendo los ms comnmente usados los de 6X y 10X). - Condensador: Es el tercer elemento de la parte ptica, constituido por una lente que concentra los rayos de luz iluminando la preparacin en la parte enfocada por el objetivo, de modo que el campo visual presente una iluminacin uniforme. Adems proporciona al objetivo un cono de luz adecuado en tamao y naturaleza, para obtener ptimos resultados en la observacin. El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o bajarlo segn las necesidades. Adems presenta un diafragma semejante al de una cmara fotogrfica que deja penetrar slo los rayos tiles y elimina los laterales que generalmente molestan. Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, gradundose a continuacin su abertura segn los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma debe estar ms abierto que con los bajos aumentos. 3) Sistema de iluminacin: Los microscopios ms antiguos presentan como sistema de iluminacin un espejo con una cara plana y la otra cncava. Este espejo recibe los rayos luminosos de una fuente natural o artificial y los enva hacia la parte ptica. Siempre que se use el condensador, el espejo debe enfocarse en su cara plana ya que la cara cncava acenta demasiado la convergencia de los rayos, cosa que ya cumple el condensador. Actualmente los microscopios presentan un sistema de iluminacin incorporada con una bombilla de bajo voltaje y de intensidad regulable con un transformador. Tipos de observacin: Segn la forma de iluminacin una observacin con un sistema ptico de aumento puede ser: a. Por reflexin: se realiza cuando la iluminacin se hace desde arriba del objeto. Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efecta se denomina estereoscpico o lupa. b. Por refraccin o transparencia: se realizan con luz transmitida desde abajo. Para ello los objetos a ver deben ser lo suficientemente transparentes. Este es el caso del microscopio ptico. Por otro lado, una observacin tambin puede ser seca o por inmersin: Observacin seca: se realiza sin colocar lquido alguno entre el cubreobjetos del preparado y el objetivo.Observacin por inmersin: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una gota de aceite de inmersin (con ndice de refraccin de 1.5, que es el del vidrio) que mejora la imagen por aumento de la abertura numrica. De este modo, todos los medios atravesados por la luz tienen un mismo ndice de refraccin. La imagen obtenida es ms luminosa y ms clara. Para hacer inmersin se utiliza el objetivo de mayor aumento (95X o 100X). Tcnica de la inmersin: Consiste en colocar una gota de aceite de inmersin entre el cubreobjetos y la lente frontal del objetivo de mximo aumento. Para ello, teniendo ya enfocado el objeto en un aumento menor, se gira levemente el revlver, se coloca una pequea gota de aceite sobre el cubreobjetos, luego se sigue girando hasta enfocar el objetivo de mayor aumento y se procede al ajuste con tornillo micromtrico. Terminada la observacin se eleva el tubo o se baja la platina y se limpia el objetivo con papel de seda o gnero suave que puede estar humedecido en un detergente especial para lentes. Nunca debe utilizarse para limpiar la lente alcohol ni xilol, ya que stos deterioran el cemento que aglutina las lentes. Dada la reducida distancia de trabajo que existe cuando se utilizan objetivos de 40X a 100X (que llega a ser tan slo 0.12 mm) puede suceder que la lente frontal tome contacto con el cubreobjetos con lo cual dicha lente puede rayarse o desplazarse hacia atrs. Por ello es necesario evitar todo contacto entre el objetivo y el cubreobjetos. Para evitar estos peligros en la actualidad estos objetivos cuentan con un muelle protector situado en el interior del tubo del objetivo. Sin embargo se debe tener precaucin pues los microscopios antiguos no presentan este mecanismo de seguridad.MANEJO DEL MICROSCOPIO Procedimiento 1. Levantar el tubo o bajar la platina. 2. Colocar la preparacin microscpica en la platina. 3. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento). 4. Bajar el tubo (o subir la platina), observando por el costado, (no por el ocular), hasta hacer tope o bien hasta que la lente frontal del objetivo se encuentre ms o menos a 1 mm del cubreobjeto. 5. Regular la iluminacin: a. Colocar la lmpara a unos 25 cm. b. Usar el espejo plano y centrarlo mirando por el tubo hasta que el campo quede uniformemente iluminado. c. Abrir completamente el diafragma. d. Subir del todo el condensador. 6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado. 7. Levantar el tubo con el tornillo macromtrico hasta lograr una observacin lo ms ntida posible, posteriormente ajustar la misma con el tornillo micromtrico. 8. Ajustar la iluminacin: a. bajando levemente el condensador. b. cerrando el diafragma lo necesario. 9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes). 10. Cambiar de objetivo, sin levantar el tubo, hasta obtener el aumento deseado. Tincin o coloracin de bacteriasLos microorganismos excepto las algas, son por lo general incoloros y muy ligeramente refractantes por lo tanto son difciles de estudiar tal como se les encuentra en la naturaleza. Para poder hacerlos visibles es necesario colorarlos o teirlas previamente antes de observarlos al microscopio. La coloracin hace resaltar tambin algunas caractersticas morfolgicas que de otra manera no son visibles por que las distintas partes de una clula tienen afinidad por diferentes colorantes. Los colorantes ms comunes son aquellos derivados de la anilina como la fucsina, violeta de gencia, azul de metileno y otros.La coloracin se usa tambin para diferenciar a los organismos y parte de ellos que de otra manera no son muy semejantes; el proceso se conoce entonces con el nombre de diferenciacin por coloracin. La diferenciacin por coloracin se puede hacer empleando un tinte policromado en cuyo caso algunos organismos o partes de un mismo organismo retienen un color mientras que otro retiene otro color. Sin embargo la diferenciacin de bacterias por coloracin generalmente depende de la habilidad de un organismo o parte de el de retener un colorante especifico despus de que ha sido tratado con un agente decolorante. Los pasos fundamentales para hacer una diferenciacin de bacterias por coloracin son:a. Coloracin.b. Decoloracin.c. Contracoloracin.

Tipos de Tincin Tincin Simple: Utiliza un solo colorante. Tincin acidorresistente: Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la carbolficsina, aun cuando intente descolorarlas con una mezcla de alcohol y cido clorhdrico. Las bacterias acidorresistentes se tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de contraste en este caso el verde o azul. Tincin negativa: Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un colorante cido para dejar las clulas incoloras en contraste. Comnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusna. El mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que difcilmente se tien con las tcnicas directas. Tincin de los flagelos: Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensin coloidal inestable de sales de cidos tnico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden poner de manifiesto su presencia y disposicin en las clulas. De esta manera el dimetro aparenta que la estructura aumento de tamao con fuscina bsica los hace visibles en el microscopio ptico. Tincin de la cpsula: La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin negativa o una modificacin de esta. Uno de los mtodos de tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las bacterias con un solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solucin de sulfato de cobre. El sulfato de cobre tambin imparte color al fondo y esto resulta en que la clula y el fondo aparezcan teido en color azul oscuro mientras la cpsula aparece de color azul plido. Tincin del ncleo: Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es especfica para el ADN. Tincin de las esporas: Las esporas se observan de la manera ms simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teir, la parte de las esporas relativamente impermeable, las esporas comnmente se tien con verde de malaquita y carbolfucsina o carbolfucsina Tincin de Giensa: El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias ncleos de las clulas.

Tincin GramTipo de coloracin de las bacterias que constituyen un carcter sistemtico; segn tomen o no color, aplicando este mtodo, se distinguen los grupos Gram positivos y Gram negativos.La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la pared celular. Esta tcnica diferencial es una de las de uso ms comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete a las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal violeta, alcohol y safranina o alguna otra solucin de contraste conveniente.

Causas que alteran la tincin de Gram Edad de la bacteria. Errores del operador. Uso de antibiticos. Bacterias resistentes a la tincin GramLas siguientes bacterias de naturaleza gram positiva, tien como gram negativas: Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente). ULTRAESTRUCTURAS BACTERIANADentro de las bacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relacin a la estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificacin, y basta con un microscopio ptico y unas cuantas soluciones de colorantes.La forma ms sencilla de iniciar una identificacin del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloracin o tincin de Gram. La tincin de Gram es una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de bacterias, la bacteria Gram positivas y Gram Negativas.Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta despus de la coloracin de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado.El tercer grupo de bacterias es el de los bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloracin de Ziehl-Neelsen. La diferencia en la coloracin no se debe en reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura fsica de la mismaMICROORGANISMOS GRAM POSITIVOSLas bacterias Gram positivas son clulas con una gruesa pared celular de petidoglicanoEstas clulas poseen una membrana citoplasmtica con fosfolpidos y protenas. Por fuera de la membrana citoplasmtica se encuentra la pared celular que est compuesta por una ancha capa de peptidoglicano.

Este peptidoglicano es una macromolcula gigante formada por cadenas de un dmero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre si mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes peptdicos son caractersticas de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento.El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catlicas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula.La pared celular Gram positiva tambin contiene cidos teicoicos y cidos lipoteicocos. Los cidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas porfosfodiesteres, y estn unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodiester en el oxidrilo del C6- N-acetilmuramico. Los cidos lipoteicos son polmeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmtica y no estn unidos al peptidoglicano.La funcin de estos compuestos seria estructural, pero existen evidencias que indican que tambin participaran en la regulacin de las enzimas hidrolticas que renuevan la pared celular (autolisinas) y que seran sitios de fijacin de fagos. MICROORGANISMOS GRAM NEGATIVOSLas bacterias Gram negativas son clulas con una delgada capa de peptodoglicano y una segunda delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membran externa.Las clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por una bicapa fosfolipica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida para la viabilidad celular covalentemente a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipofilicas.Entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa queda delimitado el espacio periplasmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotnica respecto al citoplasma, isotonidad que es mantenida mediante los oligosacridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalticos de suma importancia.CUADRO DE DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN POSITIVA Y OTRA GRAN NEGATIVA.BACTERIAS GRAM POSITIVASBACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Poseen una pared celular interna y una pared de peptidoglucano.*Peptidoglucano: es un exoesqueleto que da consistencia y forma esencial para replicacin y supervivencia de la bacteria.Poseen una pared celular ms compleja:-pared celular interna-pared de peptidoglucano- bicapa lipdica externa

No tiene membrana externaMembrana externa: forma un saco rgido alrededor de la bacteria, mantiene estructura y es barrera impermeable a macromolculas, ofrece proteccin en condiciones adversas

No tiene espacio periplasmticoEspacio periplasmtico: espacio entre la superficie externa de la membrana citoplasmtica y la interna de la membrana externa.

La red de murena est muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capasLa red de murena presenta una sola capa

La penicilina mata a las gram positivas, ya que bloquea la formacin de enlaces peptdicos entre las diferentes cadenas del peptidoglucanoLa penicilina no mata a las Gram negativas, a causa de la capa de lipopolisacridos situada en la parte externa de la pared celular.

No contiene LPSContiene LPS: estimulador de respuestas inmunes: activa clulas B, liberacin de IL, FNT, IL 6 por macrfagos.

En la tincin de Gram, retienen la tincin azulQuedan decoloradas.

Conservan el complejo yodocolorante

Pierden el complejo yodocolorante

Son esporulantes y no esporulantes, como Streptococcus, Cisteria, Frankia.

Pueden ser anaerobios o aerobios

Poseen otros componentes: cidos teicoicos y lipoteicoicos, y polisacridos complejos.Poseen protenas con concentraciones elevadas.

Caractersticas de la clula bacterianaCOCOProviene del griegokkkos, lo que se traduce como grano, es de forma esfrica. Estas se clasifican en:-Diplococo:Cocos en grupos de dos.-Tetracoco:Cocos en grupos de cuatro.-Estreptococo:Cocos en cadenas.-Estafilococo:Cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.

BACILOProviene del latnbaculus, lo que significa varilla, tienen forma de bastoncillo.

FORMAS HELICOIDALES-Vibrio:ligeramente curvados y en forma de coma, juda o cacahuete. -Espirilo:en forma helicoidal rgida o en forma de tirabuzn.-Espiroqueta:en forma de tirabuzn (helicoidal flexible)

3) PROCEDIMIENTO3.1 Procedimientos utilizados en el microscopio

Debes colocar tus microscopios en una mesa fija, de modo tal que puedas sentarte con comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte. trata que la mesa sea lo suficientemente grande como para colocar sobre ella todo el material que necesites para trabajar. El objeto que se desea examinar debe colocarse en un portaobjetos, que se una lmina de vidrio de 1mm d espesor y a continuacin se cubre con un cubreobjetos, un cuadrado de 2cm de lado o un circulo con esa medida de dimetro. La distancia del microscopio al filo de la mesa no debe ser menor a 15 cm. Adems de limpiar los oculares, objetivos, condensador y espejo para una mejor visualizacin en el microscopio. Practica hasta que tengas la certeza de saber para qu lado debes mover el macrmetro, para hacer subir o bajar las lentes. Para comenzar, seleccione siempre la lente de menor aumento que te permite ver mejor el objeto y encontrar fcilmente la parte que ms te interesa observar. Coloca el portaobjetos sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se encuentre bajo la lente. Utiliza los broches para fijar el portaobjetos en su sitio. Observa desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente .Luego mira a travs del microscopio y sube las lentes girando el micrmetro hasta que el objeto entre en foco y su imagen se vuelva ntida y clara.

3.2 Procedimientos utilizados en la coloracin de bacterias.

Usar portaobjetos limpios y pasarla varias veces cortando la llama del mechero. Dejar enfriar el portaobjetos y colocar una gotita de agua destilada con el inoculador esterilizado. Con el inoculador estril, tocar ligeramente el cultivo que ha de ser examinado (cultivos de 18-42 h) y transferir un poco de l sobre la gotita de agua en el portaobjetos. Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo hasta la parte central del portaobjetos, cuidado que se forme una pelcula muy delgada. Fijar el extendido sobre el portaobjeto pasndola sobre la llama del mechero 3 veces. Dejar enfriar. Cubrir la pelcula con el colorante cristal violeta (gram #1) y dejar cubierto por espacio de 1-2 minutos Lavar con agua hasta retirar el exceso. Se aade solucin Lugol (gram #2) y se deja reposar durante 1 minuto. Decolorarla con alcohol-acetona (gram #3) durante 5 a 15 segundos. Lavar la lmina con agua. Se tie con safranina (gran #4) por un espacio de 20-30 segundos. Lavar la lmina con agua durante 2 segundos Dejar secar o secar con papel Aadir una gota de aceite a la lmina para poder examinar con el microscopio utilizando el objetivo de 97x de inmersin.

4) RESULTADOS

COLORACION DE BACTERIASGrupoAmbienteCaractersticas de la ColoniaFormaAgrupacinGram

Forma:

LaboratorioMargen: Rizoide

Grupo 1(Placa N 4)deElevacin: ConvexaBaciloEstreptobaciloPositivo

MicrobiologaCromognesis: Morado violeta

Caracteres pticos: Opaco

CEIA

Forma:

Margen: Ondulante

Grupo 3(Placa N 1)Elevacin: ConvexaCocoEstafilococosPositivo

Cromognesis: Morado

Caracteres pticos: Opaco

IMAGEN VISTA CON EL MICROSCOPIOGRUPO 1PLACA N 4Bacilos esporulados , se observa Gram Positivo

IMAGEN VISTA CON EL MICROSCOPIOGRUPO 3PLACA N1Tincin de Gram. Microscopa ptica. Se observa como cocos Gram positivos dispuestos en racimo.

5) DISCUSIONES Y OBSERVACIONES

Placa N 4 : Laboratorio de Microbiologa (Grupo 1)Con el manejo del microscopio se pudo observar que se encuentran agrupados en estreptobacilos. Esta bacteria se observa de color morado violeta ya que en el proceso de tincin donde se le agrego los diferentes colorantes como cristal violeta, solucin lugol, y safranina, quedaron teidas; aun cuando se les retiro el exceso de colorante con alcohol de 95, tomado este color caracterstico que se le denomina a las bacterias que los presentan Gram positivas.

Placa N 2: Centro de estudiantes (Grupo 3)Para esta muestra se pudo observar que se encuentran agrupados en estafilococos. Esta bacteria se observa de color morado por lo que tambin se afirma que son Gram positivas

6) CONCLUSIONES

Se pudo observar que las bacterias Gram positivas se presentan morfolgicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar tincin de Gram en estas para identificar su grupo taxonmico, las Gram positivas se tien de color violeta-morado. Mediante la tincin de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram negativas gracias al color que tornan luego de ser teidas; en el caso de las bacterias Gram positivas se tien de violeta esto se debe a que gracias a que contienes una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de cidos teicoicos que permiten fijar y retener rpidamente el colorante inicial el cual es, el cristal violeta. La tincin de Gram permite conocer las morfologa celular, el tamao, la forma y su clasificacin taxonmica (Gram positivas o Gram negativas) de acuerdo al color que toman las bacterias despus de la tincin sin embargo no permite conocer la especie o gnero de la bacteria a la cual pertenece. Las colonias de bacterias a las que se realiz tincin de Gram se tomaron de aquellas muestras que estuvieron expuestas al ambiente, por lo que se nota una mayor presencia de las bacterias Gram positivas.

7) RECOMENDACIONES Se debe tener cuidado al momento de pasar el portaobjetos en el mechero y evitar quemaduras o rupturas del material, adems de la conservacin de las colonias. Hacer un adecuado uso del microscopio al observar los colores de las bacterias. Tener en cuenta la limpieza para disminuir el crecimiento de las bacterias y as evitar algunas enfermedades que causan estas. Los tornillos (macromtrico y micromtrico) y el revlver deben moverse siempre con cuidado y sin apresuramiento, para evitar que los lentes se rompan o rayen. Siempre debemos trasladar el microscopio, agarrndolo con las dos manos una de ellas en el brazo, y la otra con la palma hacia arriba sosteniendo la base o pie. Debemos utilizar una gota de aceite para realizar la observacin con el objetivo de inmersin 97X. Al acercar la lente del objetivo a la preparacin, debemos mirar directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. Para limpiar la lente debe usarse solo papel lente. Puesto que otro material puede rayarlo. Ningn lquido debe mojar pieza alguna del microscopio. Las lminas que se colocan en la platina debern estar siempre secas.

8) REFERENCIAS BILIOGRAFICAS

BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS.- MICHAEL T. MADIGAN; JOHN M. MARTINEZ; JACK PARKER. http://www.maristasourense.com/extras/materias/bioloxia/Microscopio.PDF http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/biologia2010/Apuntes%20Te%F3ricos%202010/Microscop%EDa%202010.pdf http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_4.htm

9) ANEXO

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