LAB3

MEDICIÓN DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA DE LA

GLUCOSA-OXIDASA

Alejandra Díaz, Julián Gómez, Paola Prieto y Nathalie Suarez

RESUMEN

Los estudios de las reacciones biológicas catalizadas por enzimas, son de gran importancia a nivel de salud, debido a que varias de estas pueden desencadenar diversos trastornos metabólicos como la diabetes, si el organismo no responde de manera adecuada. Con el fin de encontrar tratamientos que diagnostiquen de manera oportuna y que permitan controlar la concentración de sustratos en fluidos corporales, se han desarrollado investigaciones para analizar la cinética enzimática de una gran variedad de reacciones biológicas. Es por esto, que en el presente laboratorio, se estudió la reacción de oxidación de la glucosa en presencia de glucosa oxidasa como enzima catalizadora. Para esto, se realizó un análisis espectrofotométrico para calcular la concentración de glucosa en el tiempo, alterando factores como la cantidad de sustrato, el pH de la muestra y la presencia de un inhibidor, que nos permitieran concluir sobre el efecto que tienen estas variables en la reacción enzimática en estudio. Fue así como se llegó al resultado de que en presencia de una cantidad significativa de inhibidor, la velocidad a la que varía la concentración de glucosa en el tiempo disminuye, al igual que al alterar el pH de la solución. Además, se lograron calcular los parámetros Km y Vmax de esta reacción al ajustarla a la cinética Michaelis-Menten, obteniendo valores para estos de 0,1051 y -4,78 respectivamente.

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades generadas por altos y bajos niveles de glucosa en la sangre afectan a una gran cantidad de personas a nivel mundial. Un ejemplo de esto es la diabetes, que se produce cuando la insulina que secreta el páncreas es insuficiente, impidiendo que esta hormona controle el azúcar que se encuentra en la sangre

(Organización Mundial de la Salud, 2014), aumentando los niveles de glucosa disuelta en este fluido fisiológico. Por el contrario, la hipoglucemia es la enfermedad que se origina por el descenso de nivel de glucosa en la sangre generalmente por malos hábitos alimenticios (The Scott Hamilton CARES Initiative, 2015). Según las estadísticas del 2014 de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en el mundo hay más de 347 millones de personas con diabetes, mientras que de acuerdo con el estudio Donelli Staldiabement llevado a cabo en el 2005, 42.9% de las personas que padecen de diabetes presenta hipoglucemia (NTR, 2014).

Es por esto, que la determinación de la concentración de glucosa en fluidos fisiológicos es relevante, ya que permite el diagnóstico oportuno de estas alteraciones en el organismo. Actualmente, existen 3 métodos médicos para cuantificar el nivel de glucosa, que son la prueba de tolerancia oral a la glucosa, la prueba de glucosa sanguínea en ayuno y la prueba de glucosa sanguínea a cualquier hora del día (BD,2015). Sin embargo, para obtener los resultados de estas pruebas se requiere de varias horas, incluso días. Es por esto, que se están intentando desarrollar nuevos métodos para determinar la concentración de glucosa en fluidos corporales, que permitan obtener resultados en el menor tiempo posible, utilizando una cantidad reducida de reactivos y con la ventaja de poder automatizar los procesos (Medición de la cinética enzimática dela glucosa-oxidasa, 2015).

Un ejemplo de lo anterior, es el desarrollo de biosensores, que son dispositivos bioquímicos-electrónicos capaces de identificar, transformar y cuantificar una situación biológica (LópezRodriguez).Existen biosensores de enzima, que combinan un transductor y una capa delgada enzimática, los cuales son usados generalmente para cuantificar la concentración de un sustrato debido a que a través de la reacción enzimática

se convierte al sustrato en un producto que puede ser detectado por el transductor (LópezRodriguez). Sin embargo, como la concentración de la sustancia se cuantifica teniendo en cuenta la influencia que genere su presencia a la velocidad de reacción enzimática(López Rodriguez), se deben analizar los parámetros Km y Vmax , propios de este tipo de reacciones, para poder predecir la concentración del sustrato en el tiempo.

Fue así, como en el presente laboratorio se buscó medir la cinética enzimática de la oxidación de glucosa en presencia de glucosa oxidasa partir de la reacción Trinder, la cual ha sido ampliamente utilizada para la determinación de glucosa en fluidos biológicos en laboratorios clínicos (AccuLine Plus):

Imagen 1. (2015.). Recuperado en March 30, 2015, de: https://sicuaplus.uniandes.edu.co/webapps/blackboard/execute/

displayLearningUnit?course_id=_56925_1&content_id=_1108941_1&framesetWra

pped=true

Como se puede observar en esta imagen, la glucosa oxidasa actúa como catalizador en la reacción de oxidación de glucosa que genera como productos ácido glucónico y peróxido de hidrogeno. Este último compuesto conlleva a la oxidación de la o-dianisidina en presencia de peroxidasa, para dar lugar a un tinte de quinonimina rojo que colorea la muestra, y cuya intensidad varía dependiendo de la concentración de glucosa en la solución(AccuLine Plus). Esta se puede cuantificar a partir de una análisis espectrofotométrico a 545nm, dado que la oxidación de la o-dianisidina absorbe fuertemente luz monocromática a esta longtud de onda(Medición de la cinética enzimática de laglucosa-oxidasa, 2015). Además, en esta práctica se modificaron factores como la

concentración de sustrato (Glucosa), pH en el que se da la reacción (adicionando HCl) y cantidad de inhibidor (azida de sodio), con el fin de determinar su efecto en la reacción en estudio.

Para determinar los parámetros de la cinética deseados, es decir Km y Vmax, se ajustó la cinética enzimática de la oxidación de la glucosa a la expresión de la forma Michaelis-Menten, que logra explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas:

−r s=V max C s

C s+K m

(1)

Donde Km y Vmax están dados por:

V max=k3 Cw C et (2)

Km=k2+K 3Cw

K1

(3)

Teniendo en cuenta que la reacción enzimática que se llevó a cabo en el presente laboratorio, pudo ser planteada a partir del siguiente mecanismo, donde S correspondía al sustrato, E la enzima libre, ES el complejo sustrato enzima, W agua y P el producto (Medición dela cinética enzimática de la glucosa-oxidasa,2015), se pudo establecer la concentración total

de enzima C et, ya que se supuso que esta era

constante al igual que la concentración de agua (Cw):

Imagen 2. (2015.). Recuperado en March 30, 2015, de: https://sicuaplus.uniandes.edu.co/webapps/blackboard/execute/

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pped=true

C et=C e+K1 C e C s

K2+k3 Cw

(3)

Donde

C e=C et (K2+ K3Cw )K2+K3 Cw+k1C s

(4)

Por otro lado, teniendo en cuenta que la relación estequiometrica entre la o-dianisidina oxidasa (CDO) y la glucosa era 1 a 1, se pudo calcular la cantidad de glucosa consumida en la reacción a partir de la formación de o-dianisidina oxidasa(Medición de la cinética enzimática de laglucosa-oxidasa, 2015), ya que como se mencionó anteriormente el análisis espectrofotométrico se realizó a la longitud de onda que absorbe este sustancia. Por tanto se pudo hacer uso del modelo de Beer-Lambert:

A (t )−Ablanco=εLCDO (5)

Donde A ( t ) correspondía a la absorbancia en el

tiempo, Ablanco a la absorbancia del blanco, ε el

coeficiente de extinción de sustancia analizada, L la longitud de la celda que generalmente es

de 1 cm y CDO era la concentración del

producto rosado (Medición de la cinéticaenzimática de la glucosa-oxidasa, 2015).

A nivel industrial se debe tener sumo cuidado con los reactivos y productos, ya que la azida de sodio (NaN3), es extremadamente reactiva y puede llegar a ser fatal si es ingerida o absorbida por la piel. (Universidad de Sonora,2001). De igual forma por ser una sustancia mutagenica se la debe tratar como un posible carcinógeno y por tanto el límite recomendado de exposición según la National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) no debe exceder 0,3mg/m3 (Departamento de Saludy Servicios para Personas Mayores de NewJersey, 1986).

En cuanto al ácido clorhídrico (HCl), se sabe que a concentraciones altas del gas, es altamente corrosivo a la piel y membranas mucosas, generando dificultad para respirar. Por tanto se recomienda que sus niveles se encuentren por debajo de 7mg/m3 (Hoja deSeguridad III- Acido Clorhidrico). De igual forma si pone en contacto el líquido o los vapores de esta sustancia con los ojos, puede causar quemaduras y hasta pérdida total de la visión. Por otro lado, el reactivo trinder podría

ser fatal si es ingerido o si se pone en contacto con la piel, ya que es un toxico de nivel 4(Sigma- Aldrich, 2013). Es por esto, que se debe procurar realizar los análisis en laboratorios ventilados, preferiblemente manejando los reactivos en cabinas de extracción, tener en los laboratorios kits de derrames, almacenar los reactivos teniendo en cuenta las incompatibilidades y la MSDS de cada uno (Ministerio de Trabajo e Inmigración,1997) y utilizando el material de seguridad obligatorio, es decir, batas, gafas, guantes y si es necesario mascaras para evitar inhalar gases y vapores.

En cuanto al impacto ambiental generado por este tipo de análisis químico, se puede establecer que se encuentra más relacionado con los ecosistemas acuíferos. Esto se debe a que la azida de sodio y el Trinder son toxicas para los organismos que viven en el agua, ya que a pesar de la dilución, el compuesto produce mezclas peligrosas con esta sustancia. Además, la NaN3 tiene efecto herbicida y nematicida, que puede alterar significativamente la cadena trófica (FavelaPro).Por tanto, para mitigar estos efectos, se debe procurar no desecharlos por las tuberías ni drenajes, tampoco deben ser enviados a la atmosfera o ser enterrados debido al riesgo de ser nuevamente liberados, sino que se debe procurar antes de desecharlos, reducir su toxicidad en el laboratorio a partir del conocimiento de las propiedades químicas del compuesto. De igual forma, se podría intentar incinerar los líquidos en un equipo adecuado, en el que se puedan retener por aspiración los vapores a través de un filtro de gran eficacia(Gadea Carrera).

METODOLOGIA

El método usado en esta práctica de laboratorio fue la espectrofotometría, ya que a partir de este se puede determinar la cantidad de luz monocromática que absorbe una muestra en estudio, y por ende le concede al operador conocer la concentración de determinada sustancia en dicha solución. Esto, se pude ver representado en la siguiente imagen:

Imagen 3. Chirinos, A., Guarenas, A., & Sanchez, M. (n.d.). Calidad del Agua. Recuperado en March 29, 2015,

de:http://www.monografias.com/trabajos40/calidad-agua-miranda/calidad-agua-miranda2.shtm

Como se observa en la imagen 3, el espectrofotómetro cuenta con una lámpara, un lente, un monocromador, un detector y un amplificador. Estos elementos permiten que el equipo arroje en su pantalla el valor de la absorbancia de la muestra, ya que, en primer lugar, al ingresar la longitud de onda por el operario, el quipo emite un haz de luz por medio de un bombillo, que luego se descompone por el monocromador, el cual aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto (Juanto, 2005). Teniendo en cuenta que la muestra en estudio ya se encuentra dentro del equipo, esta comienza a absorber fotones de luz, y aquellos que logran atravesar la muestra son cuantificados por el detector, quien envía la señal al amplificador para que se logre mostrar en la pantalla la absorbancia de la solución que se encuentra en la celda, y así determinar la concentración de la misma a partir de la Ley de Beer.

Esta práctica de laboratorio se dividió en 2 sesiones; la primera consistía en determinar el efecto que tenía la concentración de sustrato y el pH en la reacción en estudio, mientras que la segunda tenía como objetivo establecer la influencia de un inhibidor en la misma reacción.

Para esto, en la primera sesión se prepararon 3 soluciones de glucosa en balones aforados, una de ellas con una concentración desconocida de este sustrato, otra de concentración 50mg/L de glucosa, y la ultima de la misma concentración pero adicionándole 2 gotas de HCl. Luego, se calibró el espectrofotómetro con el blanco, que consistía en agua desionizada, utilizando una longitud de onda fija durante toda la experimentación de 545nm. A continuación, se

adicionó a una cubeta de plástico de 3mL, 1.8mL de la solución de concentración desconocida y 0.2mL de Trinder, que es un reactivo indicador colorimétrico (Nutrianalisis,s.f.), y se procedió a introducir esta cubeta y el blanco en el espectrofotómetro. De esta manera se registró la absorbancia de la solución cada 30 segundos por 15 minutos y luego cada minuto hasta completar 30 minutos o hasta que se estabilizara la medida (Medición de la cinéticaenzimática de la glucosa-oxidasa, 2015). Este procedimiento se repitió para la solución de 50mg/L de glucosa y para la solución de la misma concentración pero con 2 gotas de HCl.

Para la segunda sesión se llevó a cabo el mismo procedimiento que en la sesión anterior, pero utilizando dos soluciones diferentes. Ambas con 1.8mL de glucosa 50mg/L y 0.2mL de Trinder, pero con la variación de que la primera solución contenía 0,5mL de Azida de sodio como inhibidor, mientras que a la segunda se le adicionó 0,2mL de esta misma sustancia.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con el objetivo de obtener la gráfica de la concentración de la glucosa con respecto al tiempo, se realizó la curva de calibración mostrada en la introducción de la guía de la práctica de laboratorio, utilizando los datos que se encuentran en la tabla 1 de ese documento, con el que se obtuvo la siguiente gráfica:

Gráfica 1. Curva de calibración: Absorbancia (545 nm) Vs. Concentración de glucosa (mg/L)

Para realizar la línea de tendencia, se probó, en primer lugar, una regresión lineal; sin embargo el R2 que alcanzó fue de 0,9185. Luego, llevo a cabo una regresión polinómica, y al visualizar que se ajustaba un poco mejor a los datos, se modificó el orden de éste hasta que se encontró que la curva que mejor se adecuaba a estos era polinómica de grado 3, ya que el R2 que se obtuvo fue de 0,9902 como se puede ver en la gráfica 1.

A partir de la ecuación obtenida en la gráfica anterior, se pudo determinar la concentración de la glucosa, ya que en términos de las variables en estudio, esta queda:

Absorbancia (t )=9× 10−6 [ glucosa ]3−0,0007 [ glucosa ]2+0,0221 [ glucosa ]+0,0146(6)

Para conocer la concentración de la glucosa en el tiempo, se realizó un solver para cada uno de los valores de la tabla 15 en la que se encuentran registradas las absorbancias obtenidas experimentalmente correspondientes a un tiempo específico, obteniendo como resultado los valores para la concentración de glucosa en el tiempo para cada uno de los casos en estudio (ver tablas 1-5). Esto, permitió obtener la gráfica que se muestra a continuación:

Gráfica 2. Concentración de glucosa Vs tiempo

Como se puede observar, la solución de glucosa 50mg/L que contiene 0.2mL de azida, es la que presenta una variación de concentración de glucosa más rápida en comparación con las otras 4 muestras, ya que en los primeros 28 minutos, aproximadamente, crece de manera rápida mientras que después de este tiempo la concentración varia a una tasa constante, como estabilizándose alrededor de los 46 minutos.

Así mismo, se puede observar que el primer valor de concentración registrada se encontraba en 6.56mg/L mientras que el siguiente fue de 10.41mg/L, por lo que se puede decir que en los primeros segundos de la toma de datos de la absorbancia, la concentración de glucosa en la muestra cambio abruptamente. Esto, se pudo generar, porque la azida no se encontraba, en principio, bien mezclada en la solución, por lo cual se pensó en descartar este dato, para realizar los cálculos que se muestran más adelante.

En cuanto a la curva que corresponde a una solución de glucosa de 50mg/L, se puede observar que la velocidad a la que cambiaba la concentración de glucosa era elevada, alcanzando valores finales altos cercanos a 40mg/L, comportamiento semejante al de la curva correspondiente a la solución con 0.2mL de azida. Además, como se observa en la gráfica 2, existe una discontinuidad entre la concentración de glucosa registrada a los 45 y 46 minutos, ya que la diferencia entre estos dos valores era mucho mayor en comparación con los datos registrados hasta ese momento. Este error, se pudo generar porque los valores de absorbancia registrados en la tabla 15 de anexos, no se tomaron exactamente en el tiempo estipulado sino unos segundos después, debido a que el espectrofotómetro no arrojaba el valor en el momento preciso en que se hundía el botón para que la pantalla mostrara el dato correspondiente.

Para la curva que representa la solución de glucosa de 50mg/L con HCl, se puede visualizar que la velocidad a la que varía la concentración de glucosa es menor con respecto a las dos curvas analizadas anteriormente. De igual forma, como se logra observar en la gráfica 2, el tiempo que tarda en estabilizarse esta curva es mayor en comparación con las otras 4 soluciones.

Las curvas que representan las soluciones de concentración desconocida y de 50mg/L con 0,5mL de azida tienen un comportamiento similar. Esto se puede afirmar, debido a que como se observa en la gráfica anterior, la forma de crecimiento de la concentración de glucosa

tiene la misma forma en ambas, por lo que se podría decir que la tasa a la que cambia la concentración con el tiempo es la misma, pese a que los valores de concentración sean diferentes. Aunque en la gráfica 2, se observe que las curvas se encuentren representadas hasta los 46 minutos, no quiere decir que a ese tiempo se logren establecer, sino que el tiempo de experimentación solo nos permitió tomar datos por este tiempo para ambas muestras.

A partir de lo anterior, se puede decir que se presenta un problema con la solución de glucosa de 50mg/L con 0,2 mL se azida, ya que teóricamente se esperaba que al adicionar a la solución de glucosa el inhibidor, se disminuyera la actividad enzimática, es decir que la velocidad a la que cambiara la concentración de glucosa disminuyera, como está estipulado teóricamente. Esta discrepancia, tendría como posible explicación que el volumen adicionado de azida en esta muestra, es decir 0,2mL no fue el suficiente para reducir la actividad enzimática, ya que para la muestra en la que se agregó 0,5mL del inhibidor sí se logró disminuir la tasa a la que la concentración variaba con el tiempo. Además, se puede decir que la presencia del pH en la reacción afecta directamente la concentración de glucosa en el tiempo, ya que como se observa en la gráfica 2, la solución de 50mg/L con 2 gotas de HCl disminuye la tasa de crecimiento de la concentración de sustrato en la muestra.

Lo anterior también se puede evidenciar en la siguiente gráfica de velocidad vs concentración:

Gráfica 3. Velocidad de reacción vs concentración de glucosa (50 Mg/L) con presencia y ausencia de HCl

En la gráfica 3, la solución de 50mg/L con 2 gotas de HCl, la reacción inicia con un incremento acelerado en la velocidad de la reacción. Posteriormente, cuando sobrepasa una concentración de 17 mg/L aproximadamente, demuestra una caída rápida en la velocidad de reacción, por lo cual se obtiene una concentración menor en comparación a la reacción de la misma solución de glucosa, pero en ausencia de HCl. Al comparar estos resultados con la teoría, encontramos que son congruentes, ya que la actividad enzimática es muy sensible a los cambios en el pH y cada proteína tiene un valor óptimo de operación, o si no se puede provocar su desnaturalización (Mañas, s.f.). Para el caso de la glucosa oxidasa, su valor óptimo de pH oscila entre 3 – 6,5 (SosaRomero & Galvis Franco, 2010), por lo que se puede concluir que al adicionar HCl a la solución, el pH descendió a valores cercanos a 3.

Luego de calcular la velocidad de reacción para los casos de concentración es posible determinar los parámetros cinéticos correspondientes a velocidad máxima teórica de la reacción (Vmáx) donde se asume que todas las moléculas de enzima están unidas al sustrato y constante de Michaelis (Km) que refleja la afinidad de la enzima por el sustrato (Cinéticaenzimática, 2009) a través de diversos diagramas1 tales como Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee , Hanes- Woolf y regresión no lineal . La utilidad de estos diagramas radica en que se facilita el cálculo de los parámetros cinéticos antes mencionados. (Bioquímica,2005)

Lineweaver-Burk

1 Cada gráfica proporciona la ecuación de su regresión correspondiente, sin embargo en la parte de anexos en la Tabla 6 se encuentra un resumen con estas ecuaciones

Se hizo un ajuste a una regresión lineal teniendo en cuenta el conjunto de ecuaciones (7)

graficando 1V

vs1

[S ].

(7 ){ Pendiente=K M

V Max

Interceptoeje y=−1KM

Interceptoeje x= 1V Máx

Gráfica 4. Diagrama de Lineweaver-Burk para concentración desconocida de glucosa

Gráfica 5 Diagrama de Lineweaver-Burk para concentración de glucosa 50 mg/L

Tabla 7 Parámetros cinéticos determinados por diagrama de Lineweaver-Burk

Concentración de glucosa

VMáx KM

Desconocida 0,1051 -4,7850 mg /L 0,6226 -1,9794

Eadie-Hofstee

Para determinar los parámetros cinéticos a través del diagrama de Eadie-Hofstee nuevamente se hace un ajuste a una regresión lineal donde se gráfica V vs V /[S ], esta vez tomando el conjunto de ecuaciones (8) que

(8 ){ Pendiente=K M

Intercepto eje y=V Máx

Interceptoeje x=V Máx

K M

Gráfica 6 Diagrama de Eadie-Hofstee para concentración desconocida de glucosa

Gráfica 7 Diagrama de Eadie-Hofstee para concentración de glucosa 50 mg/L

Tabla 8 Parámetros cinéticos determinados por el diagrama de Eadie-Hofstee


VMáx KM

Desconocido 0,144 4,07850 mg/L 0,654 1,764

Regresión no lineal

Al realizar una regresión no lineal graficando la velocidad de reacción y la concentración sobre

los datos obtenidos experimentalmente se obtienen las siguientes gráficas asumiendo que:

V Máx

2=KM (9)

Gráfica 8 Regresión no lineal para concentración de glucosa desconocida

Gráfica 9 Regresión no lineal para concentración de glucosa 50 mg/L

Tabla 9 Parámetros cinéticos determinados por regresión no lineal

Concentración glucosa

VMáx KM

Desconocida 0,44 13,193850 mg/L 1,0378 37,9431

Gráfico de Hanes-Woolf

Nuevamente se hace una regresión no lineal a

partir del gráfico obtenido por [ S ]V

vs [S ] y por

el conjunto de ecuaciones (10)

(10 ) { Pendiente= 1V Máx

Intercepto eje y=K M

V Máx

Intercepto eje x=−KM

Gráfica 10 Gráfica de Hanes-Woolf para concentración desconocida de glucosa

Gráfica 11 Gráfica de Hanes-Woolf para concentración glucosa 50 mg/L

Tabla 10 Parámetros cinéticos determinados por el gráfico de Hanes-Woolf


VMáx KM

Desconocido 0,0737 -6,40250 mg/L 0,525 -40,805

Para establecer cuál de estos métodos se ajusta más a los datos experimentales se usan los

parámetros cinéticos calculados para cada método y se reemplazan en la ecuación (1).

De esta manera se obtienen los diferentes valores para la velocidad de reacción a partir de los parámetros cinéticos de Vmáx y Km

calculados por los métodos mencionados anteriormente.

Gráfica 12 Comparación métodos para concentración desconocida glucosa

Se puede decir que para la concentración desconocida de glucosa, ningún método se ajusta a los datos experimentales, los diagramas de Hanes-Woolf y Lineweaver-Burk muestran ciertas similitudes entre sí al igual que la regresión no lineal y el diagrama de Eadie-Hofstee.

Gráfica 13 Comparación métodos para concentración de glucosa 50 mg/L

Contrario al caso anterior, para la concentración de glucosa 50 mg/L el método que más se ajusta a los datos experimentales es el diagrama de Lineweaver-Burk. Nuevamente el diagrama de Eadie-Hofstee y la regresión no lineal muestran similitudes.

Para el caso del inhibidor se grafica la concentración y el tiempo con el fin de obtener una regresión lineal que modela el comportamiento para los casos de las dos muestras con volúmenes de 0.5 y 0.2 mL de azida de sodio.

Gráfica 14 Regresión no lineal Concentración vs tiempo 0.5 ml de azida de sodio

Gráfica 15 Regresión no lineal Concentración vs tiempo 0.2 ml de azida de sodio

Al derivar estas ecuaciones es posible obtener la velocidad de reacción y haciendo uso del diagrama de Lineweaver- Burk es posible determinar los parámetros cinéticos Vmáx y Km

ya que este modelo tiene en cuenta la inhibición.

Gráfica 16 Diagrama de Lineweaver-Burk para la muestra con 0.5 mL de azida de sodio

Gráfica 17 Diagrama de Lineweaver-Burk para muestra con 0.2 mL de azida de sodio

Tabla 11 Parámetros cinéticos para los volúmenes de azida de sodio

Volumen azida (mL)

VMáx KM

0.5 6,211 72,580.2 0,291 10,395

Gráfica 18 Comparación entre métodos muestra azida de sodio 0.5 mL

A partir de esta gráfica puede verse que para concentraciones muy pequeñas se ajusta el diagrama de Lineweaver-Burk .

Gráfica 19 Comparación entre métodos muestra azida de sodio 0.2 mL

Puede decirse que el diagrama de Lineweaver Burk no se ajusta en lo absoluto para la muestra de azida 0.2 mL.

Simulando en la herramienta computacional Matlab®, una conversión en el tiempo para un Reactor Batch, de glucosa en ácido gluconico. Para la simulación del reactor se sabe que:

N AodXdt

=−r A. . V (11)

d C A

dt=−r A(12)

Lo que quiere decir, se toma la simulación para la velocidad de reacción, con el fin de determinar la conversión para el tiempo de experimentación. Asimismo, se sabe que la velocidad de reacción para esta práctica, es la de Michails-Menten:

−r s=V max C s

C s+K m

(1)

CS=C so (1−X )(13)De esta forma, se procede a hacer la simulación para todos los métodos con los cuales se hallaron los parámetros cinéticos para la reacción con el fin de observar diferencias en la simulación, las concentraciones experimentales

y el efecto en la concentración inicial del sustrato.

Utilizando la función Ode45 de MatLab®, para las condiciones temporales del reactor se observa en la Gráfica 20, la concentración desconocida de glucosa. Aun así tal concentración se fijó en el programa como la concentración de estabilización obtenida en la Grafica 2 para la sesión 1, la cual es 16,173mg/L.

Gráfica 20 Conversión de Glucosa con concentración 16,173 hallada experimentalmente.

En la Gráfica 21, se observa la simulación de reacción para una concentración inicial de glucosa de 50mg/L.

Gráfica 21 Conversión de Glucosa con concentración de 50mg/L

En la Gráfica 22 se observa la simulación para la concentración inicial de 50 mg/L e glucosa

con la presencia del inhibidor azida en diferentes cantidades.

Gráfica 22 Conversión de Glucosa con presencia de inhibidor azida.

De esta forma, es posible ver la conversión para cada una de las sesiones y experimentación con y sin inhibidor en la reacción.

Analizando las tres graficas presentadas del cálculo de conversión para una concentración desconocida, se puede ver como para el mismo tiempo de experimentación el método de Lineweaver y Regresión no lineal convergen a una conversión cercana de 0,6, en tanto los métodos de Hofstee y Woolf llegan solo a conversiones de 0,35 y 0,5 respectivamente.

En tanto para una concentración inicial de 50mg/L el método de Woolf no converge a una solución concreta, por lo que se puede descartar como un comportamiento acertado de la conversión de glucosa en el tiempo. Para los métodos de Lineweaver, Hofstee y Regresión no lineal se obtienen valores de conversión de aproximadamente 0,8; 0,75 y 0,6 respectivamente.

Lo que quiere decir, que la conversión máxima de la concentración de 16,173mg/L puede ser la mínima conversión alcanzada para la concentración de 50 mg/L.También, se puede analizar el efecto de la concentración inicial de sustrato en la celda, para la solución de concentración desconocida de glucosa, se sabe experimentalmente que es menor a la solución de concentración de 50

mg/L. Dado que los resultados de conversión sin inhibidor son menores para la solución de concentración desconocida que para la solución de 50mg/L, esto puede ser gracias a que la mezcla con respecto a la glucosa está más diluida el reactivo de Trinder puede no tener los mismos efectos a la reacción debido a un exceso en la mezcla, asimismo puede atribuirse un error experimental donde la mezcla no esté completamente mezclada y por lo tanto el espectrofotómetro arroje valores de absorbancia errados, y por lo tanto concentraciones erradas.

Asimismo, se analiza la gráfica de conversión en presencia del inhibidor, en la cual se esperaría una menor conversión a mayor cantidad de inhibidor. Sin embargo, dado que se tienen tanto enzima como sustrato e inhibidor se podría deducir que el exceso de inhibidor en la celda pueda favorecer la conversión en la reacción, lo que resulta en una competencia entre el sustrato y el inhibidor por el sitio activo de la enzima, es decir una reacción en paralelo, de esta forma se observa una alta conversión en los resultados. También, puede atribuirse a la mezcla incompleta en la celda o que los datos de cinética por regresión no se ajustaron a los resultados como debería, arrojando los resultados obtenidos por la simulación.

A partir de la simulación se obtienen los datos de conversión para un tiempo aproximado al tiempo de experimentación, dada la ecuación de Cs, se pueden hallar las concentraciones finales de glucosa y ser comparadas con respecto a las experimentales con el fin de analizar qué modelo cinético se acomoda a la experimentación. De esta forma se puede ver para la Concentración de Glucosa desconocida en Anexos Tabla 12, asimismo en Tabla 13 se observa para la concentración inicial de glucosa 50mg/L. Por ultimo en Tabla 14 para la comparación en presencia de inhibidor.Según los resultados mostrados en las comparaciones se observa que el modelo q mejor se acomoda en la simulación a la experimentación es el de Linewaver para la solución de concentración de glucosa desconocida.

Finalmente se presentan los resultados del docking molecular realizado en SwissDock:

Imagen 4. Estructura molecular de proteína glucosa oxidasa Recuperado de: http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

Imagen 5. Estructura molecular de proteína glucosa oxidasa Recuperado de: http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

Imagen 6. Clusters de proteína glucosa oxidasa Recuperado de:http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

En las imágenes 4 y 5, se observa la estructura molecular de la cadena A de la proteína glucosa oxidasa. En ambas imágenes es posible identificar los plegamientos de las hélices alfa (color morado imagen 5) y las láminas beta (color amarillo imagen 5) y las cadenas de aminoácidos de la estructura primaria. En la imagen 4 se destacan los radicales libres de los aminoácidos, con los cuales la proteína puede formar diferentes conformaciones. En la imagen 6 se localizan los principales clusters, es decir las aglomeraciones de átomos, donde es energéticamente posible que surja la unión con el ligando. Sin embargo es en la imagen 5 donde se localiza el cluster más probable de acoplamiento. De un total de 41(ver archivos anexos correspondientes al docking de glucosa), el cluster 0 posee el menor valor de ∆G, -9.60 kcal/mol aproximadamente y un FullFitness de -2210.10 kcal/mol (ver imagen 1 en anexos). Un ligando puede ser cualquier molécula que se una específicamente a una proteína (Bioquibi). Partiendo de la anterior definición, se encontró que existe un grupo de ligandos, denominados PPARα, que se acoplan perfectamente con la glucosa. Éstos, son reconocidos como factores de transcripción que cuya activación da lugar a la proliferación de peroxisomas. PPARα es altamente expresado en diferentes partes del cuerpo, principalmente en el hígado, pues es donde se da la principal regulación de energía. Allí este ligado se une con la glucosa para permitir su metabolismo y así mantener la homeostasis de la energía hepática (King,2014).

De la glucosa oxidasa es importante mencionar que esta proteína sólo puede catalizar la oxidación de la glucosa a b-D-gluconolactona, sin que pueda reaccionar junto con otro azúcar natural (Riani).

Imagen 7. Estructura molecular de fuctose-1,6-bisphosphate aldolase Recuperado de: http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

Imagen 8. Estructura molecular de fuctose-1,6-bisphosphate aldolase Recuperado de: http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

En las imágenes 7 y 8, se observa la estructura molecular de la fructosa, azúcar que se seleccionó para realizar del docking. En ambas imágenes se identifican claramente los plegamientos de las hélices alfa (color morado imagen 8) y las láminas beta (color amarillo imagen 8), estructuras predominantes en la proteína. En la imagen 7 se destacan los radicales libres de los aminoácidos, con los cuales la proteína puede formar diferentes conformaciones. En especial resalta el ligando, señalado con color verde, el cual también se observa en su estructura molecular, en el centro de la proteína de la imagen 8. Esta estructura, está unida al centro activo de la proteína, para

que le permita cumplir su función de reacción metabólica.

Imagen 9. Clusters fructose-1,6-bisphosphate aldolase Recuperado de: http://www.swissdock.ch/docking/view/swissdockd_rRNAzm_FH9C915W2JVSA6W4UK1N

En la imagen 9, es posible observar los principales clusters donde sería posible la unión de la proteína, de los 78 posibles (ver resultados del docking de fructosa en los documentos adjuntos al informe y la imagen 11 en anexos), el cluster 0 se encuentra como el favorable, debido a que posee el menor valor de ∆ G ,−7.19 kcal /molaproximadamente y un fullfitness de −1663.55 kcal /mol(ver imagen 12 en anexos). Estos resultados son congruentes con la ubicación del ligando descrito en el párrafo anterior, pues se ubica en el cluster 0, localización energéticamente favorable.

CONCLUSIONES

Una conversión alta en la reacción de Trinder (cercana a 1) con 0.5 mL de azida de socdio, analizada bajo el modelo de parámetros cinéticos, se obtiene cuando la tasa de consumo de los reactivos es casi similar a la concentración inicial del espectrofotómetro.

Aunque los resultados de las conversiones obtenidas fueron menores a 1, estos valores pueden llevar consigo una incertidumbre acumulada, debido a errores experimentales al manipular los equipos y materiales (espectrofotómetro, balanza, etc.) y en las simulaciones, como en los métodos de calibración. Por lo tanto varios de los métodos de calibración no se acomodan a lo obtenido experimentalmente.

Para una solución de glucosa diluida su nivel de conversión en el tiempo disminuye, dado que la velocidad de reacción decrece como consecuencia de una baja concentración de sustrato en la celda al inicio, por lo que hay exceso de enzima.

El método de Lineware, para una solución de concentración de glucosa desconocida fue el que tuvo un mejor ajuste de los datos de cinética y conversión con respecto a los obtenidos en la experimentación.

Un docking molecular es una herramienta de la bioinformática que permite determinar cuál será la conformación preferida de una molécula en unión con otra, siguiendo los principios bioquímicos y bajo las leyes de la termodinámica, donde siempre se van a favorecer los procesos espontáneos, es decir con un menor delta de energía de Gibbs

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ANEXOS

Concentración de glucosa en el tiempo:- Sesión 1

Tabla 1 Concentración de glucosa en el tiempo para la solución de glucosa de concentración desconocida

Glucosa [] desconocida

Tiempo (min)Absorbancia

(545 nm)Concentración glucosa

0,5 0,085 3,57086

1 0,103 4,64171

1,5 0,11 5,08106

2 0,122 5,86814

2,5 0,128 6,27929

3 0,129 6,34904

3,5 0,13 6,41916

4 0,131 6,48964

4,5 0,131 6,48964

5 0,133 6,63171

5,5 0,135 6,7753

6 0,136 6,84768

6,5 0,142 7,29038

7 0,144 7,44129

7,5 0,146 7,59395

8 0,148 7,7484

8,5 0,149 7,82631

9 0,152 8,06287

9,5 0,154 8,22299

10 0,156 8,38512

10,5 0,158 8,5493

11 0,16 8,7156

11,5 0,162 8,88407

12 0,164 9,05479

12,5 0,166 9,22783

13 0,17 9,58112

13,5 0,173 9,85272

14 0,174 9,94457

14,5 0,176 10,1303

15 0,178 10,3188

16 0,182 10,7047

17 0,185 11,0021

18 0,188 11,3069

19 0,192 11,7254

20 0,194 11,9401

21 0,197 12,2694

22 0,198 12,3812

23 0,199 12,494

24 0,201 12,7228

25 0,203 12,956

26 0,205 13,1938

27 0,207 13,4363

28 0,209 13,6838

29 0,211 13,9365

30 0,213 14,1946

31 0,214 14,3257

32 0,215 14,4583

33 0,217 14,7278

34 0,218 14,8649

35 0,22 15,1437

36 0,221 15,2856

37 0,221 15,2856

38 0,222 15,4291

39 0,223 15,5743

40 0,223 15,5743

41 0,224 15,7213

42 0,225 15,87

43 0,226 16,0206

44 0,226 16,0206

45 0,227 16,173

46 0,227 16,173

Tabla 2 Concentración de glucosa en el tiempo para la solución de glucosa 50mg/L

Glucosa [50 mg/L]

Tiempo (min)Absorbancia

(545 nm)Concentració

n glucosa

0,5 0,071 2,7897

1 0,08 3,28704

1,5 0,082 3,3999

2 0,092 3,97781

2,5 0,102 4,58005

3 0,11 5,08106

3,5 0,116 5,46899

4 0,127 6,2099

4,5 0,127 6,2099

5 0,128 6,27929

5,5 0,129 6,34904

6 0,131 6,48964

6,5 0,133 6,63171

7 0,135 6,7753

7,5 0,137 6,92045

8 0,139 7,06719

8,5 0,141 7,21557

9 0,148 7,7484

9,5 0,15 7,90469

10 0,152 8,06287

10,5 0,156 8,38512

11 0,16 8,7156

11,5 0,164 9,05479

12 0,168 9,40324

12,5 0,172 9,76153

13 0,174 9,94457

13,5 0,179 10,4142

14 0,183 10,803

14,5 0,187 11,2045

15 0,191 11,6194

16 0,198 12,3812

17 0,206 13,3145

18 0,213 14,1946

19 0,221 15,2856

20 0,229 16,4836

21 0,235 17,4644

22 0,242 18,7112

23 0,248 19,878

24 0,254 21,1419

25 0,26 22,5022

26 0,265 23,7011

27 0,271 25,1952

28 0,276 26,4592

29 0,281 27,7118

30 0,286 28,9284

31 0,29 29,8632

32 0,294 30,7575

33 0,298 31,6086

34 0,302 32,4161

35 0,304 32,8038

36 0,307 33,366

37 0,309 33,7283

38 0,312 34,2538

39 0,315 34,7588

40 0,316 34,9228

41 0,318 35,2446

42 0,319 35,4024

43 0,32 35,5582

44 0,321 35,7121

45 0,322 35,8642

46 0,333 37,4225

47 0,333 37,4225

48 0,334 37,5548

49 0,336 37,815

50 0,337 37,9431

51 0,338 38,0698

52 0,339 38,1952

53 0,34 38,3193

54 0,341 38,4421

55 0,341 38,4421

Tabla 3 Concentración de glucosa en el tiempo para la solución de glucosa 50mg/L con HCl

Glucosa [50 mg/L] con HCl

Tiempo (min) Absorbancia Concentració

(545nm) n glucosa

0,5 0,062 2,3086

1 0,077 3,11937

1,5 0,084 3,51365

2 0,092 3,97781

2,5 0,1 4,45754

3 0,109 5,01744

3,5 0,114 5,33847

4 0,118 5,60076

4,5 0,118 5,60076

5 0,118 5,60076

5,5 0,118 5,60076

6 0,119 5,66712

6,5 0,12 5,7338

7 0,121 5,80081

7,5 0,123 5,93581

8 0,125 6,07216

8,5 0,13 6,41916

9 0,133 6,63171

9,5 0,136 6,84768

10 0,138 6,99362

10,5 0,142 7,29038

11 0,145 7,5174

11,5 0,148 7,7484

12 0,151 7,98354

12,5 0,154 8,22299

13 0,157 8,46695

13,5 0,16 8,7156

14 0,164 9,05479

14,5 0,168 9,40324

15 0,173 9,85272

16 0,179 10,4142

17 0,186 11,1029

18 0,192 11,7254

19 0,198 12,3812

20 0,209 13,6838

21 0,21 13,8095

22 0,216 14,5923

23 0,221 15,2856

24 0,226 16,0206

25 0,231 16,8021

26 0,236 17,6354

27 0,241 18,5258

28 0,245 19,2828

29 0,249 20,0819

30 0,253 20,9244

31 0,257 21,8104

32 0,261 22,7377

33 0,265 23,7011

34 0,269 24,6925

35 0,272 25,4476

36 0,276 26,4592

37 0,279 27,2138

38 0,282 27,9587

39 0,286 28,9284

40 0,288 29,4005

41 0,291 30,0907

42 0,293 30,5379

43 0,296 31,1885

44 0,298 31,6086

45 0,3 32,0178

46 0,302 32,4161

47 0,305 32,9938

48 0,306 33,1812

49 0,308 33,5484

50 0,31 33,9058

51 0,312 34,2538

52 0,313 34,4244

53 0,315 34,7588

54 0,316 34,9228

55 0,318 35,2446

56 0,319 35,4024

57 0,32 35,5582

58 0,322 35,8642

59 0,323 36,0143

60 0,324 36,1627

61 0,325 36,3093

62 0,326 36,4541

63 0,327 36,5973

64 0,328 36,7388

65 0,329 36,8786

66 0,329 36,8786

- Sesión 2

Tabla 4 Concentración de glucosa en el tiempo para la solución de glucosa 50mg/L con 0,5mL de azida

0,5 mL de azida

Tiempo (min)Absorbancia (545nm)

Concentración glucosa

0,5 0,03 0,7127

1 0,034 0,90337

1,5 0,039 1,14499

2 0,044 1,39046

2,5 0,053 1,84254

3 0,055 1,94487

3,5 0,055 1,94487

4 0,055 1,94487

4,5 0,055 1,94487

5 0,055 1,94487

5,5 0,056 1,99629

6 0,056 1,99629

6,5 0,057 2,04789

7 0,058 2,09967

7,5 0,059 2,15163

8 0,06 2,20377

8,5 0,062 2,3086

9 0,063 2,36129

9,5 0,064 2,41417

10 0,066 2,52049

10,5 0,067 2,57394

11 0,069 2,68143

11,5 0,071 2,7897

12 0,073 2,89877

12,5 0,075 3,00866

13 0,077 3,11937

13,5 0,078 3,17505

14 0,08 3,28704

14,5 0,084 3,51365

15 0,085 3,57086

16 0,089 3,80199

17 0,093 4,0369

18 0,096 4,21565

19 0,1 4,45754

20 0,104 4,70364

21 0,108 4,95412

22 0,112 5,20917

23 0,116 5,46899

24 0,12 5,7338

25 0,123 5,93581

26 0,127 6,2099

27 0,131 6,48964

28 0,134 6,70331

29 0,138 6,99362

30 0,141 7,21557

31 0,141 7,21557

32 0,147 7,67095

33 0,15 7,90469

34 0,154 8,22299

35 0,156 8,38512

36 0,157 8,46695

37 0,161 8,79956

38 0,164 9,05479

39 0,165 9,14102

40 0,167 9,31523

41 0,168 9,40324

42 0,17 9,58112

43 0,171 9,67101

44 0,173 9,85272

45 0,174 9,94457

46 0,178 10,3188

Tabla 5 Concentración de glucosa en el tiempo para la solución de glucosa 50mg/L con 0,2mL de azida

0,2 mL de azida

Tiempo (min) Absorbancia(545nm)Concentración glucosa

0,5 0,132 6,56048

1 0,179 10,4142

1,5 0,183 10,803

2 0,185 11,0021

2,5 0,187 11,2045

3 0,189 11,4102

3,5 0,191 11,6194

4 0,193 11,8322

4,5 0,195 12,0489

5 0,201 12,7228

5,5 0,205 13,1938

6 0,209 13,6838

6,5 0,214 14,3257

7 0,217 14,7278

7,5 0,221 15,2856

8 0,226 16,0206

8,5 0,231 16,8021

9 0,233 17,129

9,5 0,237 17,8088

10 0,242 18,7112

10,5 0,244 19,0897

11 0,249 20,0819

11,5 0,252 20,7097

12 0,256 21,5849

12,5 0,259 22,2691

13 0,262 22,9754

13,5 0,265 23,7011

14 0,269 24,6925

14,5 0,273 25,7004

15 0,274 25,9534

16 0,278 26,9631

17 0,282 27,9587

18 0,286 28,9284

19 0,291 30,0907

20 0,295 30,9744

21 0,299 31,8146

22 0,304 32,8038

23 0,307 33,366

24 0,311 34,081

25 0,315 34,7588

26 0,316 34,9228

27 0,319 35,4024

28 0,322 35,8642

29 0,325 36,3093

30 0,326 36,4541

31 0,328 36,7388

32 0,329 36,8786

33 0,331 37,1536

34 0,332 37,2888

35 0,334 37,5548

36 0,335 37,6856

37 0,337 37,9431

38 0,338 38,0698

39 0,34 38,3193

40 0,341 38,4421

41 0,342 38,5637

42 0,343 38,6841

43 0,344 38,8034

44 0,345 38,9214

45 0,346 39,0383

46 0,347 39,1541

Tabla 6 Resumen ecuaciones regresiones obtenidas para cada gráfica

# Gráfica Experimento Diagrama Tipo de regresión

Ecuación

3 Concentración desconocida de glucosa

Lineweaver-Burk

Lineal y=−45.484+9.506

4 Concentración glucosa 50 mg/L

Lineweaver-Burk

Lineal y=−3.179+1.606


Eadie-Hofstee Lineal y=4.078+0.144


Eadie-Hofstee Lineal y=1.764+0.654



No lineal y=−0.0002 x3+0.0031 x2+0.5711



No lineal y=−0.0001 x2−0.00887 x+1.0317


Hanes-Woolf Lineal y=13.564 x−86.844


Hanes-Woolf Lineal y=1.904 x−77.725

13 Solución azida 0.5 mL Concentración vs Tiempo

No lineal y=−0.0001 x3+0.0071 x2−0.0707+1.2636

14 Solución azida 0.2 mL Concentración vs Tiempo

No lineal y=−0.0002 x3−0.0075 x2−1.3748+6.7391

15 Solución azida 0.5 mL Lineweaver-Burk

Lineal y=11.686 x−0.161

16 Solución azida 0.2 mL Lineweaver-Burk

Lineal y=−35.677 x−3.462

Tabla 12 Comparación concentraciones de glucosa experimental contra simulación en Matlab®. De concentración inicial desconocida

Desconocida ExpConcentracion glucosa Cs1 Cs2 Cs3 Cs4

16,173 16,173 16,173 16,173 16,17316,173 16,1713827 16,1713827 16,1713827 16,171382716,0206 16,1713827 16,1713827 16,1713827 16,171382716,0206 16,1697654 16,1697654 16,1697654 16,1697654

15,87 16,1697654 16,1697654 16,1697654 16,169765415,7213 16,1649135 16,1649135 16,1649135 16,164913515,5743 16,1616789 16,1616789 16,1616789 16,161678915,5743 16,156827 16,156827 16,156827 16,15682715,4291 16,1535924 16,1535924 16,1535924 16,153592415,2856 16,1325675 16,1325675 16,1325675 16,132567515,2856 16,1131599 16,1131599 16,1131599 16,113159915,1437 16,092135 16,092135 16,092135 16,09213514,8649 16,0727274 16,0727274 16,0727274 16,072727414,7278 15,9708375 15,9708375 15,9708375 15,969220214,4583 15,8673303 15,8689476 15,8705649 15,867330314,3257 15,7654404 15,768675 15,7702923 15,763823114,1946 15,6619332 15,6684024 15,6700197 15,660315913,9365 15,4727091 15,5244627 15,3724365 15,503437813,6838 15,2818677 15,3821403 15,0780879 15,346559713,4363 15,0910263 15,2398179 14,7853566 15,188064313,1938 14,8969503 15,0991128 14,4958599 15,027951612,956 14,7044916 14,9567904 14,2095978 14,867838912,7228 14,5087983 14,8160853 13,9265703 14,704491612,494 14,3114877 14,6753802 13,6451601 14,541144312,3812 14,1141771 14,5346751 13,3669845 14,374562412,2694 13,9152492 14,39397 13,0920435 14,207980511,9401 13,7130867 14,2532649 12,8187198 14,039781311,7254 13,5109242 14,1141771 12,5486307 13,869964811,3069 13,3071444 13,973472 12,2833935 13,69853111,0021 13,1017473 13,8343842 12,0197736 13,523862610,7047 12,8931156 13,6952964 11,757771 13,347576910,3188 12,6828666 13,5578259 11,5006203 13,169673910,1303 12,4710003 13,4187381 11,2467042 12,98853639,94457 12,2575167 13,2812676 10,9944054 12,80578149,85272 12,0407985 13,1437971 10,7453412 12,62140929,58112 11,8208457 13,0063266 10,5011289 12,43218519,22783 11,5992756 12,8704734 10,2585339 12,24134379,05479 11,3744709 12,7330029 10,0191735 12,04565048,88407 11,1464316 12,5971497 9,7830477 11,84672258,7156 10,9151577 12,4612965 9,5517738 11,644568,5493 10,6790319 12,3254433 9,3221172 11,43754568,38512 10,4380542 12,1912074 9,0956952 11,22567938,22299 10,1938419 12,0553542 8,8725078 11,00896118,06287 9,9431604 11,9211183 8,6541723 10,78577377,82631 9,687627 11,7884997 8,4374541 10,55611717,7484 9,4240071 11,6542638 8,2239705 10,31675677,59395 9,153918 11,5216452 8,0153388 10,06930987,44129 8,8741251 11,3890266 7,8083244 9,81054187,29038 8,5846284 11,256408 7,6061619 9,53883546,84768 8,280576 11,1237894 7,407234 9,24772146,7753 7,9619679 10,9927881 7,2099234 8,93719986,63171 7,6207176 10,8617868 7,0174647 8,59594956,48964 7,2535905 10,7307855 6,8282406 8,20941486,48964 7,1274411 10,7162298 6,7198815 8,13663636,41916 6,9980571 10,7000568 6,6131397 8,06224056,34904 6,8622039 10,6855011 6,5063979 7,98622746,27929 6,7198815 10,6693281 6,4012734 7,90536245,868145,081064,641713,57086

Desconocida Simulación Batch Tabla 13 Comparación concentraciones de glucosa experimental contra simulación en Matlab®. De concentración inicial 50mg/L

Concentración glucosa Concentración glucosa (HCl) Cs1 Cs2 Cs338,4421 36,8786 50 50 5038,4421 36,8786 49,995 49,995 49,99538,3193 36,7388 49,995 49,995 49,99538,1952 36,5973 49,99 49,99 49,9938,0698 36,4541 49,99 49,99 49,9937,9431 36,3093 49,975 49,975 49,97537,815 36,1627 49,965 49,965 49,96537,5548 36,0143 49,95 49,95 49,9537,4225 35,8642 49,94 49,94 49,9437,4225 35,5582 49,875 49,875 49,87535,8642 35,4024 49,815 49,815 49,81535,7121 35,2446 49,75 49,75 49,7535,5582 34,9228 49,69 49,69 49,6935,4024 34,7588 49,375 49,375 49,37535,2446 34,4244 49,06 49,06 49,06534,9228 34,2538 48,745 48,745 48,75534,7588 33,9058 48,43 48,435 48,44534,2538 33,5484 47,455 47,485 47,57533,7283 33,1812 46,48 46,54 46,7133,366 32,9938 45,505 45,595 45,85532,8038 32,4161 44,53 44,655 45,0132,4161 32,0178 43,55 43,71 44,16531,6086 31,6086 42,575 42,765 43,33530,7575 31,1885 41,595 41,825 42,50529,8632 30,5379 40,61 40,885 41,6928,9284 30,0907 39,63 39,945 40,87527,7118 29,4005 38,645 39,005 40,07526,4592 28,9284 37,66 38,065 39,2825,1952 27,9587 36,675 37,13 38,4923,7011 27,2138 35,685 36,195 37,7122,5022 26,4592 34,695 35,26 36,9421,1419 25,4476 33,705 34,325 36,17519,878 24,6925 32,71 33,395 35,4218,7112 23,7011 31,715 32,46 34,6717,4644 22,7377 30,72 31,53 33,9316,4836 21,8104 29,72 30,605 33,215,2856 20,9244 28,72 29,675 32,4814,1946 20,0819 27,715 28,75 31,76513,3145 19,2828 26,71 27,83 31,0612,3812 18,5258 25,695 26,905 30,36511,6194 17,6354 24,685 25,99 29,67511,2045 16,8021 23,665 25,07 2910,803 16,0206 22,645 24,155 28,3310,4142 15,2856 21,62 23,24 27,6659,94457 14,5923 20,59 22,33 27,0159,76153 13,8095 19,555 21,425 26,379,40324 13,6838 18,51 20,52 25,749,05479 12,3812 17,46 19,615 25,1158,7156 11,7254 16,405 18,72 24,58,38512 11,1029 15,335 17,825 23,898,06287 10,4142 14,26 16,935 23,2957,90469 9,85272 13,165 16,045 22,717,7484 9,40324 12,06 15,165 22,137,21557 9,05479 11,39 14,65 21,817,06719 8,7156 10,71 14,14 21,4956,92045 8,46695 10,02 13,63 21,1856,7753 8,22299 9,32 13,12 20,875

50mg/L Exp 50mg/L Simulación Batch

Tabla 14 Comparación concentraciones de glucosa experimental contra simulación en Matlab®. De concentración inicial 50mg/L y en presencia de inhibidor.

Imagen 10.

Imagen 11.

Imagen 12.

Concentración glucosa(0,5ml azida) Concentración glucosa(0,2ml azida) Cs1 Cs210,3188 39,1541 50 509,94457 39,0383 49,995 49,9959,85272 38,9214 49,995 49,9959,67101 38,8034 49,99 49,999,58112 38,6841 49,99 49,999,40324 38,5637 49,975 49,9759,31523 38,4421 49,965 49,9659,14102 38,3193 49,95 49,959,05479 38,0698 49,94 49,948,79956 37,9431 49,875 49,8758,46695 37,6856 49,815 49,8158,38512 37,5548 49,75 49,758,22299 37,2888 49,69 49,697,90469 37,1536 49,375 49,397,67095 36,8786 49,065 49,097,21557 36,7388 48,755 48,797,21557 36,4541 48,445 48,496,99362 36,3093 46,92 48,196,70331 35,8642 45,425 47,896,48964 35,4024 43,96 47,596,2099 34,9228 42,52 47,295,93581 34,7588 39,715 46,9955,7338 34,081 37,03 46,6955,46899 33,366 34,47 46,45,20917 32,8038 32,03 46,14,95412 31,8146 29,715 45,8054,70364 30,9744 27,52 45,514,45754 30,0907 25,445 45,2154,21565 28,9284 23,49 44,924,0369 27,9587 21,645 44,6253,80199 26,9631 19,92 44,333,57086 25,9534 18,3 44,0353,51365 25,7004 16,79 43,743,28704 24,6925 15,385 43,4453,17505 23,7011 14,075 43,153,11937 22,9754 12,86 42,863,00866 22,2691 11,735 42,5652,89877 21,5849 10,695 42,2752,7897 20,7097 9,74 41,9852,68143 20,0819 8,86 41,692,57394 19,0897 8,05 41,42,52049 18,7112 7,305 41,112,41417 17,8088 6,63 40,822,36129 17,129 6,005 40,532,3086 16,8021 5,44 40,242,20377 16,0206 4,925 39,952,15163 15,2856 4,45 39,6652,09967 14,7278 4,025 39,3752,04789 14,3257 3,635 39,091,99629 13,6838 3,28 38,8751,99629 13,1938 2,96 38,661,94487 12,7228 2,675 38,451,94487 12,0489 2,41 38,241,94487 11,8322 2,1751,94487 11,6194 1,961,94487 11,4102 1,7651,84254 11,2045 1,591,39046 11,0021 1,5251,14499 10,803 1,4650,90337 10,4142 1,410,7127 6,56048 1,355

50mg/L Exp con inhibidor 50mg/L Simulación con inhibidor

LAB3

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