Laboratorio de Fisiología Animal II

PROCESOS FÍSICOS Y QUÍMICOS DE LA DIGESTIÓN

Integrantes:

Francisco Dumas

Felipe Herrera

01 de septiembre de 2014

Introducción

La primera enzima que actúa sobre el almidón es la amilasa, la cual se encuentra en la mayoría de los animales. Esta enzima hidroliza el almidón o el glucógeno para formar los disacáridos maltosa e isomaltosa, más oligosacáridos como la maltotriosa. Hay formas moleculares de amilasa salival en la saliva y en el jugo pancreático de los mamíferos; por lo tanto, la amilasa actúa como una enzima intraluminal en la boca, en el intestino anterior y en el intestino medio. Los disacáridos y los oligosacáridos resultantes de la acción digestiva de la amilasa se hidrolizan para formar glucosa libre por la maltosa, un disacárido, y por otras enzimas.1

Al ser la amilasa una enzima, esta es dependiente del pH y de la temperatura. Si se representa gráficamente la actividad enzimática en función del valor del pH por lo general se obtiene una curva con forma de campana más o menos simétrica. En las enzimas animales el pH óptimo, es decir el pH en el cual la actividad es máxima, habitualmente se aproxima al pH de las células (alrededor de 7). La dependencia de la actividad enzimática de la temperatura en general es asimétrica. Cuando aumenta la temperatura se observa una aceleración inicial de la reacción debido al aumento del calor generado por el movimiento de las moléculas. A determinada temperatura la enzima se torna inestable y luego de un corto intervalo a esa temperatura su actividad empieza a decrecer por desnaturalización hasta perderse totalmente. La temperatura óptima de las enzimas no supera los 50 ° C. 2

En este práctico variaremos el Ph y la temperatura de la amilasa para determinar cuáles son los valores óptimos de esta enzima.

Materiales y métodos

Para la ejecución de este práctico utilizamos el software PhysioEx 6.0. El cual simula experimentos fisiológicos en favor del tiempo.

El procedimiento es el descrito en el práctico:

1.- Pulsa sobre el tubo de ensayo que cuelga más cerca de la incubadora, arrastrándolo a la ranura número 1 en la parte superior de la incubadora y suelta el botón del ratón. El tubo de ensayo se colocará en su lugar. Repite esta acción, llenando la ranura número 2, la ranura 3, etc, hasta que las siete ranuras en la parte superior de la incubadora contengan tubos de ensayo.

2.- Llena los siete tubos de ensayo con tres sustancias cada uno:

- tubo de ensayo n°1: almidón (starch), agua desionizada (deionized water), tampón pH 7 (pH7 Buffer)

- tubo de ensayo n°2: amilasa (amylase), agua desionizada (deinized water), tampón pH 7 (pH7 Buffer)

- tubo de ensayo n°3: almidón (starch), amilasa (amylase), tampón pH 7 (pH7 Buffer)

- tubo de ensayo n°4: almidón (starch), amilasa (amylase), tampón pH 7 (pH7 Buffer)

- tubo de ensayo n°5: maltosa (maltose), agua desionizada (deionized water), tampón pH 7 (pH7 Buffer)

- tubo de ensayo n°6: almidón (starch), amilasa (amylase), tampón pH 2 (pH2 Buffer)

- tubo de ensayo n°7: almidón (starch), amilasa (amylase), tampón pH 9 (pH9 Buffer)

Para hacer esto, pulsa sobre el cuentagotas de la sustancia deseada, arrastrándolo encima del tubo de ensayo correspondiente y suelta el botón del ratón.

3.- Pulsa el número <<3>> debajo del tubo n°3. El tubo bajará en la unidad de incubación. Entonces pulsar Hervir (Boil). El tubo hervirá y después volverá a subir. Observa que la única diferencia entre el tubo n°3 y el n°4 es que el n°3 ha hervido.

4.- Asegúrate de que la temperatura de incubación esté fijada a 37°C y el temporizador (timer) está fijado en 60 minutos. Si no es así, pulsa los botones (+) o (-) para ajustarlo.

5.- Pulsa incubar (incubate). Los siete tubos de ensayo bajarán al interior de la unidad de i cubación y serán agitados suavemente mientras se incuban. Al final del período de incubación, los tubos de ensayo volverán a subir, y la puerta del armario de análisis se abrirá.

Observarás que en el armario de análisis hay 7 tubos de ensayos vacíos y dos botellas cuentagotas. Las dos botellas cuentagotas contienen los reactivos IKI y de Benedict. La prueba de IKAI detecta la presencia de almidón, mientras que la prueba de Benedict detecta la presencia de azúcares tales como, glucosa, o maltosa. Añadirás estos reactivos a tus 7 tubos de ensayo experimentales para determinar si ha habido o no digestión.

6.- Pulsa sobre el tubo de ensayo n°1 de la ranura 1 de la incubadora. Verás cambiar el cursor a un tubo de ensayo en miniatura. Arrástralo al borde del primer tubo del armario de análisis, después suelta el botón del ratón. El contenido del tubo de ensayo en miniatura se vaciará en el tubo de análisis.

7.- Repite el paso 6 para los tubos de ensayo restantes. Asegúrate de hacer esto secuencialmente (tubo de ensayo n°2, n°3, luego el n°4, etc.)

8.- Una vez que las soluciones de cada uno de los tubos de la incubadora se han transferido a los tubos del armario de análisis, pulsa sobre el tapón de la botella cuentagotas del reactivo IKI, arrastrándolo a la boca del primer tubo del armario de análisis y suelta el botón del ratón. Se verterán las gotas del reactivo de IKI. Repite esto para todos los tubos de ensayo del armario de análisis y observa cualquier cambio de color. Un color azul oscuro o gris indica una prueba positiva para el almidón; un color amarillo indica una prueba negativa. Anota tus resultados de la prueba IKI en la tabla que hay más adelante.

9.- Después, pulsa sobre el tapón de la botella cuentagotas de Benedict, arrástralo a la boca del tubo de ensayo n°1, (en la ranura 1 de la incubadora) y suelta el botón del ratón. Las gotas del reactivo de Benedict se añadirán al tubo de ensayo. Repítelo para los restantes tubos de ensayo de la incubadora.

10.- Después de que el reactivo de Benedict se haya añadido a cada tubo de ensayo, pulsa Hervir (Boil). Todos los tubos de ensayo descenderán a la unidad de incubación, hervirán y volverán a subir. Examina los cambios de color de los tubos. Un color verde, naranja o rojizo indica la presencia de maltosa, considerando positivo el resultado de la prueba de Benedict. Un color azul indica que no hay maltosa y el resultado de la prueba de Benedict se considera negativo.

Resultados

Tubo n° 1 2 3 4 5 6 7

Sustancia

AlmidónAgua

desionizadaTampón pH7

AmilasaAgua

desionizadaTampón

pH7

AlmidónAmilasaTampón

pH7

AlmidónAmilasaTampón

pH7

MaltosaAgua

desionizadaTampón

pH7

AlmidónAmilasaTampón

pH2

AlmidónAmilasaTampón

pH9

Condiciones de incubación

37°C 37°C

Hervido y luego

incubado a 37°C

37°C 37°C 37°C 37°C

Prueba del reactivo IKI +

- + - - + +

Prueba del reactivoBenedict

- - - + + + +

Prueba del reactivo IKI: cuando es positivo (+) determina la presencia de almidón, es decir no actúa la enzima amilasa.

Prueba del reactivo Benedict: las pruebas positivas (+) detectan los azucares reductores, es decir actúa la enzima amilasa.

Discusión

¿Cuál era el propósito de los tubos n°1 y n°2?

En el tubo 1 es para determinar el efecto del reactivo IKI el cual detecta almidón. En el tubo 2 como no hubo almidón, no se debía detectar nada, como ocurrió.

¿Qué puedes concluir de los tubos n°3 y n°4?

En el tubo 3 se encuentra almidón y amilasa, al ser hervido la amilasa, la cual es una enzima se desnaturaliza, por lo tanto el almidón no es degradado, dando positivo a la prueba de IKI y negativo a Benedict.

El tubo 4 tiene las mismas características del tubo 3 con la excepción de no ser hervido, con lo cual la enzima (amilasa) si actúa. La prueba de Benedict detecta la maltosa, el producto de la reacción enzimática.

¿Qué indican los tubos n°4, n°6 y n°7 sobre la actividad de amilasa y el pH?

En estos tubos las condiciones son iguales a excepción del pH:

El tubo 4 tiene un pH neutro (7) con lo cual la enzima trabaja de forma óptima.

En los tubos 6 y 7, se trabaja con pH 6 y 7 respectivamente, con los cuales la enzima trabaja deficientemente, por lo tanto la reacción del almidón no es completa, detectando almidón y maltosa en la muestra, esto es demostrado por que tanto la prueba de IKI como la de Benedict dan positivo.

¿Cuál es el pH óptimo para la amilasa?

El pH óptimo para la amilasa es cercano a 7 (neutro) esto es demostrado por las pruebas y descrito anteriormente.3

Acción de la enzima, actuando de forma eficiente.

¿La amilasa actúa a pH diferentes al óptimo?

Según las pruebas actúa, pero no degrada totalmente el almidón siendo su acción enzimática deficiente.

¿Cuál es el producto final de la digestión del almidón?

Glucosa, un azúcar reductor.4

¿En qué tubos detectaste la presencia de maltosa al final del experimento?

En los tubos 4, 5, 6 y 7.

¿Por qué la maltosa no estuvo presente en los otros tubos?

En el tubo 1 porque el almidón no fue degradado, en el tubo 2 porque no se añadió almidón, y en el tubo 3 porque se hirvió la muestra, desnaturalizando la muestra.

La amilasa salival sería desactivada casi por completo en el estómago. Sugiere una razón del porqué, basado en los resultados.

Debido a la acidez del estómago, el HCl le confiere a este órgano un pH cercano a 2, siendo la enzima desnaturalizada, suspendiéndose la acción de esta enzima.5

Conclusión

Gracias al trabajo realizado podemos entender de una manera más clara y sencilla las funciones que tienen el aparato o sistema digestivo en el primer “compartimento” que es la boca.

Aprendimos que las enzimas son de una gran importancia y trascendencia para lograr la liberación de nutrimentos y que no actúan por si solas ni en cualquier condición. En el aula, podemos acercar este conocimiento de manera práctica ya sea utilizando este mismo programa (PhysioEx 6.0) o bien bajo condiciones en laboratorio.

De manera práctica y a modo de ejemplo, podríamos recrear la condición de una proteína desnaturalizada y una que no lo está (hirviendo un huevo, y observando que al ponerse duro este no vuelve a su estado original, ocurriendo un cambio irreversible de la proteína) y relacionarlo con la acción de las enzimas que en realidad son proteínas.

Por lo tanto, es de suma importancia conocer el funcionamiento de las diferentes enzimas tanto en su acción con el sustrato correspondiente como también las condiciones de PH y temperatura optimas en las cuales es funcional. Esto nos dice que la maquinaria de la digestión es de una precisión única y que sin todos los procesos adicionales de preparación del alimento a medida que avanza por el tubo digestivo, no podría aprovecharse todas las propiedades que estos tienen.

Bibliografía

1.- Hill, R. (2006). Fisiología Animal. Ed. Médica Panamericana, 132.

2.- Koolman, J. (2004). Bioquímica. Ed. Médica Panamericana, 94.

3.-Gal B. (2007). Bases de la Fisiología. Editorial Tebar, 275.

4, 5.- Pena, A. (1988). Bioquímica. Editorial Limusa, 256.