INFORME LABORATORIO BIOQUIMICA

CRECIMIENTO MICROBIANO

GRUPO 4

ROLANDO ALZATE ALVAREZ 307501

EDUVIER ARANGO GRISALES 308002

LUISA TRUJILLO TABARES 308549

PRESENTADO A: JUAN CARLOS HIGUITA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

SEDE MANIZALES

2011

INFORME

Materiales y métodos

Cultivo en el reactor: para el cultivo en el reactor, teníamos una concentración de sustrato 1 litro de sustrato, el cual fue inoculado con 100 ml de una solución que contenía la cepa Saccharomyces cerevisiae. Al inicio del experimento se trabajó con temperatura ambiente, mas adelante en el transcurso del experimento se mantuvo una temperatura constante de 35ºC.

Absorbancia: la absorbancia fue realizada con un espectrofotómetro de luz, teniendo como solución de partida 1 ml de la solución de cultivo sin inocular, los otros datos de absorbancia fueron medidas en los tiempos presentados con 1 ml de la solución cultivada.

Peso seco: pesamos los tubos de esppendorf numerados en una pesa analítica, después agregábamos 1 ml de la solución en el reactor en ese momento, para después llevarlo a una micro centrifugadora para separar el sustrato de la biomasa; la micro centrifugadora trabajaba a 10000 rpm por 5 minutos. Después con una micro pipeta extraíamos el sustrato para un posterior análisis de azucares reductores, el tubo de eppendorf con la biomasa fue llevado a un horno a 60ºC para secado y después pesado.

Cámara de Neubauer: para el conteo en cámara de NB extraemos 1 ml de la solución de el reactor agregándolo a un tubo de ensayo al cual añadíamos un tinte para determinar las células viables, del tubo de ensayo con una micro pipeta extraíamos 500µl que eran puestas en la cámara de NB, para luego ser llevada al microscopio para hacer el conteo de células; con el microscopio enfocábamos la cámara de tal manera que pudiéramos tener un cuadrante de 4 celdas por 4 celdas.

Unidades formadoras de colonias: se introducía 1 ml de la solución del reactor, en un tubo de ensayo que contenía agua pectonada diluida, esto se hace con la necesidad de llevar la muestra a una dilución adecuada para su posterior cultivo, esto lo hacíamos con base en el conteo que nos dada en la cámara de NB. El cultivo lo hacíamos al extraer 1 ml de la solución diluida, para llevarlo a la caja de petri la cual anteriormente era revestida de agar; se repartía la solución por toda la caja con un rastrillo de vidrio, se tapaba y era llevada al congelador para que se formara las colonias.

Todos los anteriores procedimientos fueron llevados en un ambiente esterilizado, con el uso de mechero en la extracción de la solución, así de la esterilización de las pipetas y demás instrumentos con alcohol, los procedimientos de esterilización fueron eficientes ya que se vio reflejado, por el hecho de no encontrar otros microorganismos, que pudieran haber interferido en el cultivo.

Resultados y gráficas

Tabla de datos de laboratorio

Tabla 1

HORAS (h) HORAS DE FERMENTACION ABSORBANCIA(540nm) NB(conteo células)0 09:30 0.041 1.20E+00

2.5 12:00 0.092 3.00E+004.5 14:00 0.233 6.10E+006.5 16:00 0.478 1.10E+018.5 18:00 0.821 1.50E+01

22.5 08:00 1.234 2.60E+0124.5 10:00 1.268 2.89E+01

Tabla 2

PESO TUBO VACIO SECO(g)

PESO TUBO+BIOMASA(g)

PESO BIOMASA (g) POR LITRO UFC/ml UFC/L

0.9544 0.9549 0.5 66750 667500000.938 0.9403 2.3 119000 1190000000.949 0.9503 1.3 241000 241000000

0.9266 0.9272 0.6 460000 4600000000.955 0.9572 2.2 550000 550000000

0.8986 0.9005 1.9 9.36E+06 93600000000.9406 0.9422 1.6 106800000 1.068E+11

La tabla 1 y 2 es la recopilación de los datos obtenidos durante la práctica.

Gráficas

Son las curvas de crecimiento microbiano reportadas a partir de los datos de las tablas anteriores.

Grafica 1.

0 5 10 15 20 25 300

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Abs vs Tiempo

tiempo (h)

Abso

rban

cia (5

40nm

)

Grafica 2.

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

Peso biomasa vs Tiempo

Tiempo (h)

peso

bio

mas

a (g

) en

un l

itro

Grafica 3.

0 5 10 15 20 25 300.00E+00

5.00E+00

1.00E+01

1.50E+01

2.00E+01

2.50E+01

3.00E+01

3.50E+01

Cámara de NB vs Tiempo

tiempo (h)

cont

eo ce

lula

s(ca

mar

a N

B)

Grafica 4.

0 5 10 15 20 25 300

20000000000

40000000000

60000000000

80000000000

100000000000

120000000000

tiempo vs UFC/L

Tiempo

UFC/

L

Grafica 5.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

100000

200000

300000

400000

500000

600000

UFC/L vs Tiempo (omitiendo los ul-timos dos datos)

Tiempo

UFC/

L

Análisis de azucares reductores: Para tener una curva representativa de crecimiento microbiano, es indispensable tener en esta misma los datos de la concentración de sustrato para hacer los análisis comparativos.

La determinación de las concentraciones de sustrato se hacen con base en el análisis de los azucares reductores (DNS).

Determinación de azucares reductores: el procedimiento consiste en agregar a una solución que contenga azucares reductores, un químico por ejemplo acido diniclosalicilico de color amarillo para que los azucares reaccionen, al mezclarse con estas soluciones los azucares reductores se oxidan lo que hace que la solución tome un color rojo marrón.

Para la determinación de la concentración de sustrato, tenemos que construir una curva de solución patrón como referencia para determinar la concentración de sustrato con respecto a la absorbancia; la curva de solución patrón y el análisis de la muestra problema; se hicieron simultáneamente, el primer paso consistió para la curva de solución patrón, en diluir concentraciones conocidas de solución (glucosa), en mililitros de agua pectonada, para tener varias concentraciones de referencia, después de esto se le agrego el químico acido diniclosalicilico , inmediatamente después de esto la solución fue calentada al baño de maría por cinco minutos (para que la reacción se pudiera llevar a cabo) y después llevadas a enfriar, se le añaden 5ml de agua y se deja reposar por 15 minutos; esto mismo fue hecho y de manera simultánea con la muestra problema, pero todas las muestras fueron diluidas en 1 ml de agua pectonada. Las muestras problemas fueron obtenidas del mismo procedimiento de análisis de

peso seco, al ser extraídas del tubo de eppendorf llevadas a refrigerar y sacadas para el análisis de azucares reductores.

Después de enfriadas las soluciones, se construyo una curva patrón con base en los datos obtenidos a partir del espectrofotómetros de luz para concentraciones conocidas de glucosa, posteriormente se hizo este mismo análisis para las muestras problemas, y con base en la curva patrón podemos determinar las concentraciones de glucosa.

Tabla 3.

Análisis DNS Muestra patrón

blanco(g/ml) ABS(540nm)1 4 1.782 2 0.8893 1 0.4544 0.5 0.2025 0.25 0.103

Solución problema6 muesta6 1.6417 muestra5 1.5658 muestra4 1.4729 muestra3 1.349

10 muestra2 1.06211 muestra1 0.04912 muestra0 (tiempo inicial). 0.051

La tabla 3 son los datos de la absorbancia para la muestra problema y la solución patrón.

Grafica 6.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

f(x) = 2.24814705010377 xR² = 0.999865048735299

Muestra patronLinear (Muestra patron)

ABSORBANCIA (540nm)

Blan

co (g

/ml)

La grafica 6 es la curva de la solución patrón: con base en esta obtuvimos una ecuación de la línea recta que nos permite determinar a una absorbancia de la muestra problema su concentración de sustrato

Tabla 4.

horas (h) SUSTRATO (g/ml) SUSTRATO (g/l)0 3.6891321 3689.1321

2.5 3.5182765 3518.27654.5 3.3092032 3309.20326.5 3.0326869 3032.68698.5 2.3874822 2387.4822

22.5 0.1101569 110.1569

24.5 0.1146531 114.6531

Grafica 7.

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Sustrato vs Tiempo

Sustrato vs Tiempo

Tiempo (h)

Sust

rato

(g/m

l)

La grafica 7 es la concentración de sustrato en el tiempo.

Como ya tenemos la grafica de concentración de sustrato, ahora podemos construir una curva de crecimiento microbiano, comparativa para cada una de las técnicas de cálculo de biomasa.

Grafica 8.

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, absorbancia contra tiempo)

Sustrato (g/ml) Abs (540nm)

Tiempo (h)

Grafica 9.

0 5 10 15 20 25 300

0.5

1

1.5

2

2.5

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Curva de crecimiento bacteriano (peso seco, sustrato contra tiempo)

Peso seco (g)sustrato (g/l)

Tiempo (h)

Grafica 10.

0 5 10 15 20 25 300.00E+00

5.00E+00

1.00E+01

1.50E+01

2.00E+01

2.50E+01

3.00E+01

3.50E+01

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, camara de NB contra tiempo)

NB(conteo celulas)sustrato (g/l)

Tiempo (h)

Grafica 11.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

100000000

200000000

300000000

400000000

500000000

600000000

05001000150020002500300035004000

Curva de crecimiento bacteriano (sustrato, UFC contra tiempo) omitiendo los ultimos dos

datos

UFC/Lsustrato (g/l)

Tiempo (h)

Cálculos

rendimientosinicial final rendimiento rendimiento %

peso seco (g) 0.5 1.60.00030773

7 0.030773716

UFC/l 66750000 550000000135194.527

7 13519452.77

NB 1.20E+00 2.89E+010.00774938

1 0.77493811sustrato 3689.1321 114.6531

tiempo de generación total tg (h)peso seco (g) 0.5 1.6 14.6000895

UFC/l 66750000 1.07E+112.30179735

3

NB 1.20E+00 2.89E+015.33773344

8tiempo de fermentación (h) 0 24.5

tiempo generación fase exponencial tg (h) tiempo de fermentación (h)peso seco (g) 0 0

UFC/l12000000

0 5.00E+08 2.91E+00 6NB 3.00E+00 1.50E+01 2.58E+00 6

velocidad especifica µ tg (h) µ

peso seco (g) 0indeterminad

oUFC/l 2.91E+00 2.38E-01

NB 2.58E+00 2.69E-01

Análisis de datos

Para el análisis de datos omitimos la curva de crecimiento microbiano que relaciona la absorbancia, sustrato contra tiempo ya que esta se hace a partir de un método analítico físico, lo cual no nos hace representativo los datos de la absorbancia como puntos de referencia para un análisis del comportamiento de los microorganismos, lo que si nos es útil si la tomamos de referencia como una curva patrón para análisis similares.

La curva de crecimiento microbiano que relaciona el peso seco, sustrato contra tiempo, es una curva de poca ayuda para los análisis del comportamiento de los microorganismos, por que presenta saltos y puntos de inflexión que la hacen totalmente descartable, sin embargo suponiendo que el dato inicial y final son factibles y no erróneos es posible hacer el análisis de rendimiento global, lo que no es posible es hacer un análisis de la fase exponencial, en esta curva no está definida la fase exponencial.

Las graficas que reportan los mejores datos son las de UFC/l y NB, sustrato contra tiempo, con un pequeño inconveniente, los últimos dos datos que fueron los que estaban separados por el mayor lapso de tempo presentan un crecimiento que no corresponde en la grafica con su respectiva concentración de sustrato, el sustrato ya se había acabado.

Sin embargo es de destacar que en la fase exponencial representan los mejores datos para el análisis de tiempo de generación y la velocidad especifica, en ambas graficas durante esta fase el tiempo de fermentación fue de aproximadamente 6 horas, de las cuales aproximadamente 2.5 horas fue el tiempo de generación, lo cual nos indica que en la fase exponencial casi la mitad del tiempo se dedico a la producción de microorganismos; así mismo al observar la velocidad especifica de generación durante esta fase, representan igualmente una gran similitud en dichas graficas.

La velocidad fue de aproximadamente 0.25/h, que es igual a 14.3 /minutos, lo cual son velocidades relativamente buenas, nos indica que las condiciones presentadas en el reactor, y el sustrato fueron buenas para el microorganismo a tratar.

Lo que si es de resaltar es que para el análisis de rendimiento no fue posible hacer un análisis apropiado de las unidades formadoras de colonias porque son valores muy altos,

lo cual modifica el rendimiento drásticamente, pero si comparamos las curvas de peso seco y la cámara de NB vemos que el porcentaje de rendimiento no alcanza la unidad, por lo tanto pensaríamos que los microorganismos no estuvieron tan afines hacia el sustrato o a la forma que fue suministrado el sustrato, lo que nos indica que este microorganismo tiene poco rendimiento con las condiciones dadas de cultivo.

CONCLUSIONES

Una conclusión importante es que al utilizar los métodos de cultivo es importante tener en cuenta que el método de unidades formadoras de colonias puede ser engañoso, en las graficas vemos que se dispara el crecimiento de microorganismos, bajo el hecho de que ya se les acabo el sustrato lo cual puede ser confuso si suponemos de que manera van a crecer si se les acabo el alimento, lo que nos pone a pensar que los microorganismos en la caja de petri encontraron condiciones mucho más favorables para crecer que en el propio reactor, por eso en algunas de estas graficas omitimos estos últimos valores para observar una curva que tuviera sentido para nuestro experimento.

Otra concusión que salta a la vista es que las curvas de peso seco son totalmente incoherentes para nuestro experimento por lo tanto es importante recomendar para futuros trabajos que al hacer este tipo de análisis la pesa este totalmente calibrada y sea la misma para todos los experimentos, y además el grupo de trabajo que empieza a hacer el análisis de peso seco sea el mismo durante todo el laboratorio de tal manera que puedan percatarse si durante el laboratorio cometieron errores al pesar la muestra o al pesar el tubo de eppendorf.

La curva de la cámara de NB es una de las curvas que mejores datos nos puede arrojar sobre el crecimiento microbiano, sin embargo para nuestro caso los últimos dos datos tendían a errar igualmente, esto podría ser por la dificultad que se presenta algunas veces de distinguir los organismos vivos de los muertos o de hacer otra toma de muestra y verificar que en ausencia total de sustrato el microorganismo este muriendo o de no ser así de que otro sustrato se esté alimentando el organismo en ausencia de glucosa.

Se demuestra nuevamente que los métodos físicos como la absorbancia son los mejores indicadores de la concentración de biomasa, presentan las curvas más coherentes, sin embargo son ineficientes a la hora de determinar la fase muerta de las curvas de crecimiento microbiano, estos métodos físicos no tienen en cuenta cuales células están vivas y cuales muertas, pero a partir de estos se pueden diseñar curvas patrón que serán

muy útiles para la determinación y comparación de otras propiedades durante los laboratorios.