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ACIÓN

ii

CERTIFICACIÓN

Ingeniero

Juan Carlos Romero Benavides

DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de fin de titulación: “Obtención de extractos, aislamiento y

caracterización de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata y P.

indecora con actividad citotóxica”, realizado por Karina Noemí Torres García, ha sido

orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del

mismo.

Loja, agosto de 2013

Ing. Romero Benavides Juan Carlos

CI: 1103018477

iii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

Yo, Karina Noemí Torres García, declaro ser autor del presente trabajo de fin de titulación:

“Obtención de extractos, aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios de

Passiflora cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad citotóxica”, de la titulación

de Bioquímica y Farmacia, siendo el Ing. Juan Carlos Romero Benavides, director del

presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y a sus

representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las

ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo

son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 67 del Estatuto Orgánico de

la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice:

“Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigaciones,

trabajos científicos o técnicos, o tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo

financiero, académico e institucional (operativo) de la Universidad.

Karina Torres García

Nº 1104440316

iv

DEDICATORIA

El presente trabajo va dedicado a mi madre Lcda. Noemí García Álvarez, por ser mi

ejemplo, mi compañera, mi amiga y apoyo incondicional; a mi niño Ian Yariel Pullaguari

Torres el motivo de culminar mi carrera profesional; a mi padre Lcdo. Julio Torres Jiménez

(+) y mi hermana Cristina (+), por las bendiciones recibidas día a día; a Santiago Pullaguari

y su familia por todo el apoyo brindado; a toda mi familia y compañeros por compartir estos

años de valiosos recuerdos.

Karina Torres.

v

AGRADECIMIENTO

Le agradezco a Dios por haberme acompañado y guiado a lo largo de estos cinco años, por

ser mi fortaleza en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de

aprendizajes y experiencia, a mi madre por apoyarme en todo momento, por los valores que

me han inculcado, y por haberme dado la oportunidad de tener una excelente educación en

el transcurso de mi vida y por ser mi ejemplo de vida a seguir; a mi hijo Ian Yariel por llenar

mi vida de alegría y amor, y ser el motivo para seguir adelante; a mi familia y compañeros

por compartir grandiosos momentos.

Le agradezco la confianza, apoyo y dedicación de tiempo al Ing. Juan Carlos Romero

Benavides, por haber compartido conmigo sus conocimientos y amistad; a la vez al

departamento de Química Aplicada de la Universidad Técnica Particular de Loja y todos sus

integrantes por el apoyo y facilidades otorgadas para el desarrollo del presente trabajo

investigativo.

Karina Torres

vi

ÍNDICE DE CONTENIDOS Página

CARATULA i

CERTIFICACION ii

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE

DERECHOS

iii

DEDICATORIA iv

AGRADECIMIENTO v

ÍNDICE DE CONTENIDOS vi

LISTADO DE TABLAS, GRÁFICAS Y FIGURAS viii

ABREVIATURAS xi

RESUMEN Y PALABRAS CLAVE 1

ABSTACT AND KEY WORDS 2

INTRODUCCIÓN 3

CAPITULO I

1. Fin, propósito y componentes del proyecto 5

CAPITULO II

2. Aspectos generales 7

2.1. Medicina Tradicional. 7

2.2. Productos Naturales, fitoquímica y cáncer. 7

2.3.Fitoesteroles y Aldehídos. 9

2.3.1.Fitoesteroles. 9

2.3.2. Aldehídos. 11

2.4. Antecedentes. 11

2.4.1. Género Passiflora y cáncer. 11

2.5.Características botánicas y taxonómicas de

las especies a estudiar.

14

2.5.1.Passiflora cumbalensis. 14

2.5.2.Passiflora manicata. 15

2.5.3.Passiflora indecora. 16

CAPITULO III

3. Materiales y métodos 18

vii

3.1. Recolección de material vegetal. 19

3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del

crecimiento celular de los extractos y

compuestos identificados mediante MTT.

20

3.3. Cromatografía en columna. 20

3.4.Cromatografía en capa fina. 22

3.5.Recristalización. 22

3.6. Caracterización de los MS. 22

CAPITULO IV

4. Resultados y análisis 24

4.1. Rendimiento del material utilizado. 24

4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas

celulares de cáncer humano.

24

4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía

en columna.

27

4.4. Identificación y caracterización de

metabolitos secundarios.

27

4.5. Porcentaje de inhibición de crecimiento

celular de los compuestos identificados.

33

4.6. Extracto de P. cumbalensis en acetato de

etilo, se aisló e identifico 1 compuesto

35

4.7.Extracto metanólico de P. cumbalensis, se

obtuvo 2 compuestos.

36

4.8. Extracto hexánico de P. manicata se

obtuvo dos mezclas de compuestos.

36

CONCLUSIONES 39

RECOMENDACIONES 40

BIBLIOGRAFIA 41

ANEXOS 46

viii

LISTA DE TABLAS Página

Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis. 14

Tabla 2. Taxonomía de P. manicata. 15

Tabla 3. Taxonomía de P. indecora. 16

Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los

extractos de las especies P. cumbalensis, P.

manicata y silica gel, utilizados en cromatografía en

columna abierta.

20

Tabla 5.Peso de extractos obtenidos, rendimiento de

las especies P. cumbalensis, P. manicata y P.

indecora

23

Tabla 6.Número de fracciones obtenidas en el

fraccionamiento por cromatografía en columna de los

extractos P. cumbalensis y P. manicata.

27

LISTA DE GRAFICAS

Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento

celular en la línea de cáncer de colon RKO; de los

extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.

indecora.

24


celular en la línea de cáncer de mama MCF7; de los

extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.

indecora.

24

Gráfica 3.Porcentaje de inhibición del crecimiento

celular en la línea de astrocitoma cerebral D384; de

los extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P.

indecora

25


celular en la línea RKO de los fitoesteroles

identificados.

33

Gráfica 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento 34

ix

celular en la línea D384 de los fitoesteroles

identificados. LISTA DE FIGURAS Página

Figura 1. Mecanismo anti - cancerígeno de los

fitoesteroles 10

Figura 2. Resumen de la metodología utilizada en el

estudio de las tres especies del género Passiflora. 18

Figura 3. Mapa del cantón Loja, ubicando los sitios

de recolección de las especies (San Cayetano Alto y

Uritusinga).

19

Figura 4. Compuesto 1. Estructura molecular de

dodecanal. 28


hexacosanal. 29

Figura 6. Compuesto 3. Estructura molecular de 5,

22 dien – 3 estigmasterol. 30


gamma sitosterol. 31


beta sitosterol. 32


ergosterol. 33


nonadecanal. 36

LISTA DE FOTOGRAFIAS Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en

columna: a cromatografía en columna del extracto

hexánico de P. cumbalensis; b: cromatografía en

columna del extracto de acetato de etilo de P.

cumbalensis, c: cromatografía en columna del

extracto de metanol de P. cumbalensis; d:

21

x

cromatografía en columna del extracto hexánico de

P. manicata. LISTA DE FORMULAS Fórmula 1. Rendimiento del extracto obtenido y

peso de la materia vegetal seca. 20

xi

ABREVIATURAS MS

AcOEt

Hex

MeOH

DCM

CC

TLC

UV

Pf

RMN

RMN 1H

RMN 13C

EM

CDCl3

CMI

P

RKO

MFC7

D384

MTT

Metabolito secundario

Acetato de Etilo

Hexano

Metanol

Diclorometano

Cromatografía en Columna

Cromatografía en capa fina

Ultravioleta

Punto de fusión

Resonancia Nuclear Magnética

Resonancia Nuclear Magnética de Hidrogeno

Resonancia Nuclear Magnética de Carbono

Espectrometría de masas

Cloroformo deuterado

Concentración mínima inhibitoria

Passiflora

Línea celular humana de cáncer de colon

Línea celular humana de cáncer de mama

Línea celular humana de astrocitoma cerebral

Metiltetrazolium

1

RESUMEN

P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora se recolectaron en Uritusinga y San Cayetano

Alto (Loja); de las partes aéreas se obtuvieron extractos en Hex, AcOEt y MeOH, se realizó

un estudio de inhibición de crecimiento celular en tres líneas de cáncer humano RKO, MCF7

y C384 mediante MTT; los más activos se los fraccionó por CC, los extractos con mayor

actividad fueron hexánico de hojas de P. manicata (60%), hexánico de P. cumbalensis

(50%); de éste se aislaron seis MS: cuatro fitoesteroles (estigmasterol; gamma-sitosterol;

beta-sitosterol y ergosterol) cuya actividad fue 50-60% en D384 y 15-20% en RKO y dos

aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos identificados por primera vez en esta especie;

del extracto AcOEt de P. cumbalensis se aisló e identificó un aldehído (nonadecanal); todos

los compuestos se identificaron utilizando: RMN: 1H, 13C; y EM, la caracterización de los MS

se efectuó por medio de comparación con datos espectroscópicos previamente informados;

del extracto metanólico de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos que no se lograron

caracterizar, y del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos.

PALABRAS CLAVE: Passiflora, fitoesteroles, MTT, inhibición del crecimiento celular.

2

ABSTACT

P. cumbalensis, P. manicata and P. indecora were collected in Uritusinga and San Cayetano

Alto (Loja),the aerial parts extracts were obtained in Hex, EtOAc and MeOH, a study of

inhibition of cell growth of three human cancer cell lines: RKO, MCF7 and C384 by MTT; the

more active they are fractionated by CC, the most active extracts were hexane from leaves

of P. manicata (60%), hexane from P. cumbalensis (50%) of it is isolated six MS: four

phytosterols (stigmasterol, gamma-sitosterol, beta-sitosterol and ergosterol) whose activity

was 50-60% in D384 and 15-20% in RKO and two aldehydes (dodecanal and hexacosanal),

all identified for the first time in this species, the AcOEt extract of P. cumbalensis was

isolated and identified an aldehyde (nonadecanal); all compounds were identified using:

NMR: 1H, 13C, and MS, the MS characterization was effected by means of spectroscopic data

compared to previously reported, the methanol extract of P. cumbalensis was obtained two

compounds which characterize not achieved, and the hexane extract of P. manicata was

obtained two mixtures of compounds.

KEY WORDS: Passiflora, phytosterols, MTT, cell growth inhibition

3

INTRODUCCION

El desarrollo alcanzado en las técnicas de aislamiento e identificación de productos y el nivel

de las investigaciones mundiales hacen que el área de los productos naturales es la de

mayor crecimiento dentro del campo de la química orgánica, en la actualidad se reportan

cerca de un millón de productos naturales aislados a partir de diferentes especies. Han

surgido novedosos y sofisticados métodos y técnicas de aislamiento, dependientes del

creciente desarrollo de la biotecnología y la bioingeniería y la aparición de nuevas

demandas en la terapia humana (Krishnaswamy, 2000). Aproximadamente el 53% de los

fármacos de uso clínico actual proceden de una fuente natural o sus derivados sean

sintéticos o semisintéticos (Chamba, 2012); la zona sur del Ecuador es considerada uno de

los 10 lugares sobresalientes de diversidad biológica a nivel global, y de gran valor ancestral

debido a la presencia de dos grupos étnicos: Saraguro y Shuar, en donde la medicina

tradicional sobresale destacando algunas especies de gran interés (Pineda et al., 2010).

Todas las especies vegetales cuentan con el metabolismo, que es el conjunto de reacciones

químicas que realizan las células de los seres vivos para sintetizar sustancias complejas a

partir de otras más simples o para degradar las complejas y obtener las simples. Las

plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario presente en todos los

seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les permite producir y acumular

compuestos de naturaleza química diversa, estos compuestos derivados del metabolismo

secundario se denominan metabolitos secundarios, se distribuyen diferencialmente entre

grupos taxonómicos, presentan propiedades biológicas, muchos desempeñan funciones

ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos; un grupo relevante son los fitoesteroles

que son esteroles de origen natural, son moléculas orgánicas que conforman parte de las

células vegetales, además del efecto hipocolesterolemiante, algunos estudios

experimentales sugieren que puedan también ejercer un cierto efecto preventivo sobre el

desarrollo de distintos tipos de cáncer, como: de colon, estómago, pulmón, mama, y de

próstata; además se les puede atribuir funciones en la resolución de procesos patológicos

crónicos mediados por anormalidades de la respuesta inmune (infecciones virales crónicas,

tuberculosis, alergias, artritis reumatoide), incluso, algunas investigaciones en animales han

demostrado que algunos poseen una actividad antiinflamatoria y antipirética (contra la

fiebre) aunque todavía estas nuevas propiedades de los fitosteroles se encuentran en

estudio y presentan controversia entre los diferentes autores(Giménez, 2012).

4

CAPITULO I

5

1. Fin, propósito, y componentes del proyecto.

1.1. Fin del proyecto. Contribuir con el estudio de metabolitos secundarios de Passiflora cumbalensis, P. manicata

y P. indecora, y su acción inhibitoria en el crecimiento de líneas celulares de cáncer

humano.

1.2. Propósito del proyecto. Obtener extractos, purificar y caracterizar metabolitos secundarios de Passiflora

cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria en el crecimiento de líneas

de cáncer humano.

1.3. Componentes del proyecto. Seleccionar y recolectar las especies vegetales.

Obtener extractos de acuerdo a la polaridad con diversos disolventes: hexano (Hex), acetato

de etilo (AcOEt) y metanol (MeOH).

Determinar la actividad inhibitoria del crecimiento celular mediante MTT de los extractos

obtenidos, en líneas de cáncer humano.

Realizar el fraccionamiento de los extractos por cromatografía en columna.

Obtener, purificar y caracterizar metabolitos secundarios y determinar su actividad inhibitoria

en líneas celulares de cáncer humano.

6

CAPITULO II

7

2. Aspectos generales.

2.1. Medicina tradicional.

La organización mundial de la salud (OMS) define a la Medicina Tradicional como un

conjunto de prácticas, enfoques, conocimientos y creencias diversas que incorporan

medicina de origen animal, mineral y vegetal; también incluye terapias espirituales, técnicas

manuales o ejercicios practicados de forma individual o grupal con la finalidad de mantener

el bienestar del individuo y en algunos casos para tratar, diagnosticar y prevenir

enfermedades (OMS, 2010).

2.2. Productos naturales, fitoquímica y cáncer.

Los productos naturales hacen referencia a los extractos o sustancias obtenidas de materia

vegetal, en especial de las que se conoce un uso medicinal o nutricional, en la década de

los cincuenta México fue pionero en el desarrollo de productos naturales con la producción

de esteroides a partir de la “cabeza de negro” y el “barbaso” (Lara et al,. 1996).

Desde tiempos ancestrales, el hombre utilizó diversas plantas para satisfacer sus más

urgentes necesidades como la alimentación y la medicina, originando de esta manera el

interés de algunos por el estudio químico de las plantas, permitiendo la formación de la

fitoquímica, una disciplina científica que emplea diversas técnicas que le permiten aislar

extractos y fraccionarlos sucesivamente hasta obtener metabolitos secundarios (Badawy et

al., 1999), que son sustancias ecológicamente eficaces, frente a los metabolitos primarios

que son biológicamente efectivos, estos son el resultado de la biosíntesis, transformación y

degradación de compuestos endógenos mediante proteínas de especialización, las cuales

se han formado como resultado de los procesos de diferenciación y se los puede clasificar

según su significación biológica y función en la célula protectora (Valdés y Valbín, 2000); en

los organismos vivos se conocen tres rutas biosintéticas por la que se los puede producir:

ruta del sikimato, ruta del acetato-malonato y la ruta acetato-mevalonato; los metabolitos

secundarios se encuentran presentes en pequeñas cantidades, sin embargo, en base a las

técnicas espectroscópicas es posible reconocer su estructura molecular (Olmedo et al

2009).

Los estudios fitoquímicos en las últimas décadas, han seguido el modelo de fraccionamiento

biodirigido; los extractos crudos y parcialmente purificados, así como los metabolitos

secundarios aislados, son probados frente a la actividad biológica esperada, de estas

actividades las de mayor interés son la antioxidante y la anticancerígena (Benjamin, 2012).

El cáncer es una enfermedad producida por la división y crecimiento descontrolado de

determinadas células, las cuales no sólo poseen la capacidad de invadir el órgano donde se

8

originaron, sino de viajar por la sangre y el líquido linfático hasta otros órganos y

desarrollarse, se calcula que sería el causante de la muerte de 84 millones de personas

entre 2005 y 2015 (Laza et al., 2006), entre los principales fármacos utilizados en la

quimioterapia del cáncer está la doxorrubicina, que es un antibiótico que actúa en la

intercalación del ADN inhibiendo algunos ácidos nucleicos dificultando el avance de algunas

enzimas, su administración por lo general es intravenosa, o el placlitaxel que es una droga

citoesquelética, las células tratadas con ésta sufren disfunción en el ensamblamiento de los

microtúbulos alterando su mitosis, al ser fármacos muy agresivos causan elevados efectos

secundarios por lo que se pretende encontrar anticancerígenos naturales y con menores

repercusiones al paciente (Callacondo, et al 2008) ante esto en los últimos años se han

investigado diversas especies vegetales y sus componentes para combatirla: reportes en

mangos donde se aisló el lupeol y la mangiferina que contienen importante actividad anti

cáncer (Croweel 1997), los isotiocianatos presentes en el Brassica oleracea italica son

capaces de eliminar la proteína del gen p53 defectuoso y dejar libres las proteínas sanas

para suprimir el desarrollo de tumores; el licopeno presente en el Solanum lycopersicum es

capaz de inhibir la proliferación celular, al tiempo que posee un efecto anti-carcinogénico y

anti-aterogénico; el resveratrol presente en las uvas para la fabricación de vino reduce un

50% el riesgo de cáncer de próstata, y los fitoesteroles presentes en las nueces son

capaces de desacelerar el crecimiento del cáncer, en especial el de mama (Sanz 2011). A

todo el grupo de Symphytum spp, se le otorgan características cicatrizantes,

antiinflamatorias y para aliviar el cáncer, mientras que la Beta vulgaris (remolacha) se la

utiliza para ayudar en las lesiones provocadas por las radioterapias aplicadas en pacientes

con presencia de tumores, que los efectos sean mejor tolerados (Navarro, et al 2011).Una

de las especies que ha revolucionado el mundo de la fitoterapia contra el cáncer es la fruta

de Annona muricata considerada 10.000 veces más potente que la quimioterapia: sus

extractos revelaron que destruye las células malignas en 12 tipos de cáncer, entre ellos:

colon, pecho, próstata, pulmón y de páncreas, los compuestos de este árbol demostraron

una mejor inhibición en el crecimiento de las células de cáncer que la adriamiacina, una

droga quimioterapéutica, normalmente usada en el mundo y lo más destacado es que solo

destruye las células malignas del cáncer y no afecta las células sanas (Street, 2006).

Medicamentos hechos en base a plantas presentan una inmensa ventaja con respecto a los

tratamientos químicos. En las plantas los principios activos se hallan siempre biológicamente

equilibrados por la presencia de sustancias complementarias, que van a potenciarse entre

sí, de forma que en general no se acumulan en el organismo, y sus efectos indeseables

están limitados. Sin embargo, a pesar de que han aumentado las investigaciones y los

9

estudios científicos de las plantas medicinales, todavía no se conoce a fondo muchos de los

principios activos a los que deben las plantas sus extraordinarias cualidades (Hua K, 2002).

Existen gran cantidad de tipos de metabolitos secundarios en plantas una de las

clasificaciones se basa en la presencia o no de nitrógeno en su composición, no obstante,

los tres grupos de metabolitos secundarios más importantes en plantas son los terpenoides

(o isoprenoides), fenil propanoides (o compuestos fenólicos) y los alcaloides (este último

grupo lleva nitrógeno en su estructura) (Olmedo, 2009), sin embargo en el presente trabajo

se logró aislar los fitoesteroles y aldehídos.

2.3. Fitoesteroles y aldehídos.

2.3.1. Fitoesteroles. El grupo de los fitoesteroles comprende esteroles y estanoles de origen vegetal, que

cuentan con una estructura casi idéntica a la del colesterol, difieren únicamente en la

presencia de grupos metilo o etilo en la cadena lateral de la molécula (Higdon, at al 2008).

Están considerados como compuestos antiinflamatorios, antitumorales, bactericidas y

fungicidas, aunque su propiedad más estudiada es su efecto hipocolesterolémico, el cual se

ha observado tanto en el colesterol total, como en el colesterol-LDL (Rodríguez, et al 2008).

Los fitoesteroles se encuentran disponibles en todas las plantas, por lo que los vegetarianos

son los que cuentan con un mayor consumo de estos compuestos, sin embargo, pueden

encontrarse en mayor concentración en aceites vegetales no refinados, nueces, semillas,

granos enteros, legumbres y germen de trigo (Ostlund, 2002).

Dentro de las principales funciones que se atribuyen a los fitoesteroles está la de ser

antiinflamatorio aunque limitada, hay un poco de información acerca de cómo los

fitoesteroles podrían atenuar las reacciones inflamatorias del sistema inmunológico, en

algunos estudios se observó que el tratamiento de células con fitoesteroles reducía la

producción de prostaglandinas, compuestos involucrados en la respuesta

inflamatoria (Woyengo, et al 2009); también juegan papeles importantes en enfermedades

cardiovasculares gracias a su influencia en el nivel de colesterol en la sangre, los

fitoesteroles pueden jugar un papel importante en la prevención de arterioesclerosis y

enfermedades coronarias (Jenkins, et al 2005). Y actúan en hiperplasia prostática benigna,

que se refiere a un crecimiento no canceroso de la próstata, y se ha encontrado que la

administración de fitoesteroles ayuda al tratamiento de síntomas de presión en la

uretra (Bergues, et al 1995).

Se han encontrado algunas evidencias de que los fitoesteroles, particularmente el sitosterol,

podrían inducir apoptosis en células de cáncer de próstata, de mama y de colon mediante el

incremento en la actividad de la caspasa-3, enzima proteasa que participa en la cascada de

10

la apoptosis, los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento y la multiplicación

celular aunque se desconoce la forma en que se lleva acabo. En las etapas de angiogénesis

y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las células cancerígenas,

finalmente, el sitosterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la

superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y

potenciales carcinogénicos (Honey, 2012) en la Figura 1, se puede observar las actividades

inhibitorias y activación en la carcinogénesis. Figura 1. Diversos mecanismos anti-cancerígenos de los fitoesteroles.

Fuente: Modificado de Honey, 2012

De forma similar al colesterol, para que se lleve a cabo su absorción, los fitoesteroles deben

ser incorporados a micelas, mezclas de sales biliares, lípidos y esteroles, que pueden ser

absorbidas por los enterocitos del intestino (Jong, et al 2009), una vez en las células del

intestino, deben ser incorporados a lipoproteínas conocidas como quilomicrones, estos

complejos son liberados al torrente sanguíneo, y al ser ricos en triglicéridos y colesterol van

distribuyendo estos compuestos al cuerpo, hasta llegar al hígado (Plat y Mensink, 2003).

11

En algunos estudios en ratones y conejos se ha observado que en grandes cantidades los

fitoesteroles pueden alterar las propiedades de la membrana y el metabolismo de la

testosterona (Jones, et al 2005); además son fácilmente tolerados, sólo en algunas

ocasiones se han asociado a casos de nausea, indigestión, diarrea y constipación (Bergues,

et al 1995).

Aunque no se trate directamente de un efecto negativo sobre la salud, cabe mencionar que

se ha visto una correlación entre el consumo de alimentos enriquecidos con fitoesteroles y

una reducción de la concentración plasmática de α-caroteno, β-caroteno y licopeno (Ntanios,

et al 2002). En cuanto a su interacción con otros compuestos, además de lo ya mencionado

sobre los carotenoides, no se han encontrado reducciones importante en la absorción de

otros compuestos liposolubles como son las vitaminas A, D, E y K (Katan, et al 2006).

2.3.2. Aldehídos.

Los aldehídos son compuestos orgánicos caracterizados por poseer el grupo funcional –

CHO; se utilizan principalmente para la fabricación de resinas, plásticos, disolventes,

pinturas, perfumes y esencias (Olmedo, et al 2009).

Los aldehídos están presentes en numerosos productos naturales y grandes variedades de

ellos son de la propia vida cotidiana, como la glucosa que existe en una forma abierta que

presenta un grupo aldehído, o el acetaldehído formado como intermedio en la

metabolización se cree responsable en gran medida de los síntomas de la resaca tras la

ingesta de bebidas alcohólicas y causante del 15.6% cáncer de esófago, sin embargo existe

la aldehído deshidrogenasa 2 (ALDH2), que es responsable de descomponer el

acetaldehído en una sustancia no tóxica, por lo tanto de disminuir la incidencia de cáncer;

sin embrago los no bebedores carecen de la ALDH2, por lo que su estudio es controversial

(Espinoza et al., 2005), se los ha identificado y caracterizado en diversas especies entre las

principales tenemos Eucaliptus citriodora, Lippis citriador y Melissa officinalis, en donde se

les otorgan funciones como antiinflamatorio, antiinfeccioso, ansiolíticohipotérmicos,

inmunoestimulantes y antialérgico (Garbarino, et al 2003); el principal uso que se les otorga

a los aldehídos aislados de especies vegetales es la hidrogenación selectiva de estos,

utilizando catalizadores metálicos, con el propósito de satisfacer el mercado de

saborizantes, de fragancias químicas y de productos farmacéuticos (Espinoza, et al 2005).

2.4. Antecedentes.

2.4.1. Género Passiflora y cáncer.

12

El género Passiflora (P.) conocida comúnmente como Pasiflora, pertenecen a la familia de

Passifloraceae, cuenta con 18 géneros y alrededor de 630 especies distribuidas en zonas

tropicales y subtropicales de todo el mundo, en América la mayoría de las especies se

hallan en Centro y Sudamérica (Labardén 2005). Extractos de pasiflora se han clasificado en

varias categorías de la actividad química: ansiolíticos, espasmolítico, hipnóticos, sedantes,

narcóticos (Ozarko 2001) estos extractos son parte de un tratamiento que ha tratado con

éxito a pacientes ambulatorios con trastorno de adaptación y estado de ansiedad (Bourin

1997).

Dentro de las investigaciones en especies de este género sobresalen:

P. quadrangularris es utilizada tradicionalmente por los curanderos para mordeduras de

serpientes, ya que esta especie causa la coagulación sanguínea evitando la hemorragia

(Worldnet, et al 2001). Cuando un extracto de las hojas y ramas de P. quadrangularis se

administra por vía oral, ya sea antes o después de una inyección de veneno, la

neutralización de la hemorragia se reduce por debajo de 25% en ratones (Otero, et al 2000)

P. incarnata L. es el miembro más ampliamente investigado del género, sus extractos tienen

propiedades sedantes en ratones, demostrado en la disminución de pasos en una escalera,

lo que explica por qué los extractos de Passiflora se utilizan ampliamente como “remedios

del sueño”, varios flavonoides han sido aislados a partir de P. incarnata L. como: crisina y

apigenina, (Zanoli 2000) junto con orientin, isoorientin, vitexina y isovexin (Soulimani, et al

1997).Las mayores acumulaciones de flavonoides en P. incamata se encuentran en las

hojas entre las etapas de prefloración y floración de la planta (Menghini 1998). La crisina y la

apigenina combinadas son utilizadas para reducir la capacidad del aparato locomotor (Zanoli

2000). La crisina y la apigenina han demostrado inhibir el crecimiento de células de

carcinoma de mama (Yin 2001), células de cáncer de tiroides en humanos (Yin 1999), y los

tumores de próstata humanos (Knowles, 2000). La apigenina se considera anti-mutagénica,

ya que reduce los efectos mutagénicos en ratas (Nakasugi 2000). Los flavonoides presentan

actividad hormonal significativa (Zand 2000); la apigenina y la luteolina (otro flavonoide)

resultaron ser eficaces en la prevención del embarazo por lo que se los encuentra en los

anticonceptivos orales comúnmente prescritos, además demostraron ser citotóxicos contra

las bacterias resistentes a la meticilina, Staphylococcus aureus (Sato, 2000).Los extractos

de las partes aéreas de P. incamata L. contienen las β-carbolinas: harman, hamun, hannalin,

harmol y harmalol (Soulimani 1997). La -carbolina, aislado de P. incamata L., inducen al

consumo voluntario de etanol en ratas (Baum 1996). Algunas personas pueden estar

interesados en el hecho de que la harman se ha identificado en la cerveza, el vino (Bosin

1988) y el humo del cigarrillo (Totsuka 1999). Se ha descubierto que las β-carbolinas puede

prevenir el daño a las neuronas del cerebro de ratones, por actuar como un antioxidante

13

(Lee, et al 2000). Harman actúa como un vasodilatador (reduce la inflamación o edema),

funciona mediante la liberación de GABA, serotonina y noradrenalina (Dolzhenko 1997).

Harman y compuestos relacionados son mutagénicos y se vuelven más mutagénicos en

condiciones ácidas del estómago (Lin, et al 1986). El Maltol es un compuesto aromático que

tiene propiedades antioxidantes en la inhibición de la oxidación del hexanal en un 84% (Lee

2000). Además es responsable del desarrollo de enfermedades relacionadas con la

disfunción renal y el desarrollo de ciertos trastornos neurodegenerativos (Ginkel, et al 1993).

Shatfocide es un glucósido de apigenina, se aisló de P. incamata L. (Li 1991); experimentos

realizados con brotes de trigo sugieren que es responsable de propiedades antimutagénicas

(Peyrt, et al1992). Extractos de P. morifolia contienen el glucósido cianhidrina, y la

linamarina (Jaroszewski 1996). La linamarina provoca un aumento de ácido láctico y el

colesterol total en el hígado y cerebro además del agotamiento de los fosfolípidos cerebrales

en conejos (Padmaja 1989).Varios compuestos monoterpenoides (compuestos con 10

carbonos) se han aislado de P. quadrangularis (Osorio 2001); algunos monoterpenos

dietéticos han demostrado actividad quimioprotectora contra el cáncer mamario de rata

(Crowell 1997).4-Hidroxi-2-ciclopentenona es responsable de la actividad anti-bacteriana de

un extracto de hojas de P. tetrandra contra las bacterias: Escherichia coli, Bacillus subtilis, y

Pseudomonas aeruginosa, también encontró que la 4-hidroxi-2-ciclopentenona fue

citotóxica para las células de leucemia (Perry 1991) P. mollissima se caracteriza por poseer

un alto contenido de compuestos polifenólicos hidrofílicos y lipofílicos con propiedades

antioxidantes determinados por métodos fluorescentes ORAC (oxygen radical absorbance

capacity), determinando que en su extracto acuoso tiene un alto potencial nutracéutico,

debido al contenido de polifenoles, que inciden directamente en su capacidad para atrapar

radicales y especies reactivas de oxígeno (Rojano et al,. 2012). En P. edulis se aisló e

identificó cianidina-3-O-β-D-glucopiranosido como antocianina mayoritaria, a la que se

atribuyen funciones como antioxidante, actividad contra alergias, inflamación, diferentes

virus, hipertensión, artritis, diabetes y cáncer (Jiménez, 2010).

Junto con todos estos usos terapéuticos de los extractos de Passiflora vienen algunos

efectos secundarios negativos y propiedades recientemente reportadas P. alata puede

inducir enfermedades alérgicas ocupacionales en los seres humanos (Giavina-Bianchi

1997).

De las especies estudiadas en el presente trabajo: P. cumbalensis, P. manicata y P.

indecora no hay reportes de estudios de aislamiento y caracterización de metabolitos

secundarios.

14

La mayoría de estudios sobre el género Passiflora se enfoca a buenos resultados sobre

inflamaciones por ende al cáncer, debido a que en los seres humanos en diversas partes del

organismo con inflamación crónico es más frecuente la aparición de tumores, hecho que

indica que el proceso irritativo favorece a la carcinogénesis; la inflamación actúa como un

agente genotóxico e indirectamente favorece la aparición de tumores y rompe el control

celular, permitiendo la división celular con el ADN dañado y al mismo tiempo frena la

apoptosis (Espinosa, 2009).

2.5. Características botánicas y taxonómicas de las especies a estudiar.

2.5.1. Passiflora cumbalensis.

Comúnmente conocida como coruba roja, son plantas trepadoras con zarcillos filamentosos

enrollados, sus hojas son alternas, miden hasta 14 cm de largo, tienen tres lóbulos más o

menos triangulares; los bordes son aserrados, sus flores son solitarias y colgantes se

encuentran distribuidas desde el Sur Colombia al Centro de Perú, y en Ecuador localizada

en Tungurahua y Ambato(Torsten et al., 2004)..

Tabla 1. Taxonomía de P. cumbalensis

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Subclase: Dilleniidae

Superorden: Violanae

Orden: Violales

Familia: Passifloraceae

Subfamilia: Passifloroideae

Tribu: Passifloreae

Género: Passiflora

Subgenero: Passiflora

Sección: Tacsonia

Especie: Cumbalensis Fuente: (Torsten et al., 2004).

15

2.5.2. Passiflora manicata.

Planta trepadora con los tallos más o menos pubescentes, redondeados, estriados sus

estípulas son reniformes, de 0,5-2,5 cm de longitud, glandular-aserradas, sus hojas

trilobadas, de 4-11 x 4,5-14 cm, glabras en el haz y algo pubescentes en el envés, de

margen aserrado. Pecíolo de 1-3 cm de longitud, con 4-9 glándulas, poseeflores solitarias,

sobre pedúnculos robustos de 5-10 cm de largo, con brácteas ovadas, de 2-4 cm de largo,

libres o unidas en la base, son de color rojo, de 6-9 cm de diámetro, con los sépalos rojos en

la cara superior y verdosos en la inferior, sus pétalos rojos, oblongos, de 2,5-4 cm de

longitud con una corona con 3-4 series de filamentos, los de las dos series externas de 0,2-

0,4 cm de largo, de color púrpura oscuro, su fruto de ovoide a ovoide-oblongo, de 3,5-5,5 x

2-3,7 cm, verdoso, con semillas ovoides, reticuladas, negruzcas, de unos 4-5 mm de largo,

se cultiva entre los 1.800 y 3.500msnm, su floración se caracteriza por ser en verano y otoño

y puede soportar hasta temperaturas de 5ºC; su fruto es muy apreciado en la alimentación

por su sabor y aroma, por el contenido de vitaminas A, B y C, calcio, fósforo y hierro, tiene

un amplio mercado, especialmente en Colombia, Perú, Venezuela y al Sur del Ecuador,

(Torsten et al., 2004). Tabla 2. Taxonomía de P. manicata

Reino: Plantae





Orden: Violales



Tribu: Passifloreae

Género: Passiflora

Especie: manicata

Fuente: (Torsten et al., 2004).

16

1.5.3. Passiflora indecora.

Es endémica se puede encontrar en el sureste de Ecuador, especialmente en las provincias

de Loja y El Oro, esta especie prospera en los bosques remanentes pequeños (Torsten et

al., 2004).

Tabla 3. Taxonomía de P. indecora

Reino: Plantae





Orden: Violales



Tribu: Passifloreae

Género: Passiflora

Especie: indecora .

Fuente: (Torsten et al., 2004)

17

CAPITULO III

18

3. Metodología.

En la figura 2. se indica la metodología utilizada en el presente estudio.

Figura2. Resumen de la metodología utilizada en el aislamiento y caracterización de metabolitos

secundarios de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora con actividad inhibitoria de líneas de

cáncer humano.

Fuente: Autor

19

3.1. Materia vegetal.

De la especie P. cumbalensis se recolectó 5.56 Kg en Uritusinga ubicada a 17 kilómetros al

suroeste de la Provincia de Loja, entre las parroquias de El Tambo, Malacatos y San

Sebastián coordenadas: 04o02´21” -04º 08´09” Latitud Sur; 79º12´21” -79º14´47” Longitud

Oeste.; de P. manicata se recolectó 7.023 Kg y de P. indecora se recolectó 1.789 Kg, ambas

especies fueron recolectada en el barrio San Cayetano Alto – UTPL coordenadas 3º49´53”

Latitud Sur; 79o14´58” a 79º04´38” Longitud Oeste. Una vez identificadas las especies se

depositó una muestra de cada una en el herbario de la UTPL.

Figura 3. Mapa del cantón Loja, priorizando la ubicación de San Cayetano Alto y Uritusinga.

El extracto fue preparado a partir de las hojas y tallos (muestra seca) mediante maceración

estática empleando disolventes de polaridad creciente (Hex, AcOEt, MeOH); la materia

vegetal se colocó en maceración por dos días, y se realizó tres repeticiones de cada

extracto, el rendimiento de los extractos se evaluó en relación al peso del extracto obtenido

y al peso de la materia vegetal seca, como se indica en la fórmula 1.

20

(Formula 1)

A los extractos obtenidos se les hicieron pruebas de inhibición de crecimiento mediante MTT

en tres líneas RKO, MCF7 y D384; los extractos que presentaron la mayor actividad fueron

analizados mediante cromatografía en columna.

3.2. Evaluación de la actividad inhibitoria del crecimiento celular de los extractos y compuestos aislados mediante MTT.

Se utilizaron 3 líneas celulares de cáncer humano: RKO (cáncer de colon), MCF-7 (cáncer

de mama) y D384 (SNC), para el estudio de los extractos, y 2 líneas celulares de cáncer

humano: RKO y D384 para los compuestos; cada línea celular se cultivó en medio RPMI

(GIBCO) a 37°C, humedad del 95%, en una atmósfera con un 5% de CO2. Todas las líneas

celulares fueron expuestas por 48 horas a todos los extractos y compuestos a dosis de

50μg/mL y compuestos a 50 uM respectivamente, determinándose el efecto inhibitorio

empleando el método de MTT, siguiendo el siguiente protocolo: en un caja multidish de 96

pocillos se sembró 3000 células con 100uL de medio de cultivo por pocillo, se incubó por 24

horas; se aplicó tratamiento con cada uno de los derivados disueltos en DMSO (0,5%) y

medio de cultivo , también se aplicó DMSO 0,5% como control negativo y Doxorrubicina 2μM

como control positivo; en todos los casos se llegó a un volumen final de 200μL en cada

posillo; cada dosis se aplicó por triplicado en tres experimentos diferentes, se incubó por 48

horas y se añadió 20μL de reactivo de MTT Gibco (Kit cell titer 96º, Aqueous one solution

reagent), se incubó por 2 horas y se realizó la lectura en el espectrofotómetro (Sunrise) a

una absorbancia de 490nM; los datos obtenidos fueron analizados por medio del programa

Prisma. Los extractos más activos en la inhibición de crecimiento en las líneas celulares se

los fracciono en cromatografía en columna, y la evaluación de la actividad inhibitoria celular

de metabolitos secundarios se realizó en los que se obtuvo en mayor cantidad y sin

problemas de solubilidad.

3.3. Cromatografía en columna.

De acuerdo a los datos obtenidos de la actividad inhibitoria celular de los extractos, a los

más activos se los fraccionó por cromatografía en columna; para las corridas de

cromatografía en columna abierta se utilizó silica gel g 60 F254, se fraccionó el extracto

hexánico de P. cumbalensis, el extracto de acetato de etilo de P. cumbalensis, el extracto

metanólico de P. cumbalensis y el extracto hexánico de P. manicata; la relación extracto -

silica se indica en la tabla 4:

21

Tabla 4. Proporción y peso de cada uno de los extractos de las especies P. cumbalensis y P.

manicata y silica gel utilizados en cromatografía en columna abierta.

Especie vegetal Disolvente utilizado

en el extracto

Proporción extracto :

sílica gel

Peso del extracto

(g)

P. cumbalensis

tallos y hojas Hexano 1:15 18.3

P. cumbalensis

Tallos y hojas Acetato de etilo 1:17 19

P. cumbalensis

tallos y hojas Metanol 1:18 34.5

P. manicata

tallos y hojas Hexano 1:13 13

Fuente: Autor

La elución de las columnas se hizo utilizando mezclas de hexano, acetato de etilo y

metanol, recolectando fracciones (eluatos) de 100 mL, se evaporó el disolvente por medio

de un rotaevaporador, y se realizó cromatografía en capa fina a cada una de las fracciones.

Fotografía 1. Fotografía de Cromatografía en columna: a) cromatografía en columna del extracto

hexánico de P. cumbalensis; b) cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo de P.

cumbalensis, c) cromatografía en columna del extracto de metanol de P. cumbalensis; d)

cromatografía en columna del extracto hexánico de P. manicata.

a) b)

c) d)

Fuente. Autor

22

3.4. Cromatografía de capa fina.

Los análisis cromatográficos en capa fina (CCF) se realizaron siguiendo técnicas

convencionales empleando placas de aluminio recubiertas con gel de sílice F254, se observó

con luz ultravioleta de onda corta (254nm) y larga (350nm) y se reveló con una solución de

sulfato cérico.

3.5. Re-cristalización.

En base a la similitud del perfil cromatográfico se unió diversas fracciones, se limpiaron

utilizando disolventes adecuados y se purificaron por el método de par de disolventes

(Sakura, 2011) hasta obtener fracciones puras.

3.6. Caracterización de los metabolitos secundarios.

Los puntos de fusión de cada compuesto en estudio se determinaron en un equipo Fisher

Johns y no fueron corregidos. Los espectros de RMN de 1H y 13C se adquirieron a 400 MHz

y 100 MHz respectivamente en un equipo Varian 400 ASC, los desplazamientos químicos

se expresaron en ppm (δ), y las constantes de acoplamiento (J) se informaron en Hz, se

empleó el tetrametilsilicio (TMS) como referencia interna. Los espectros de masas se

obtuvieron en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 6890N) acoplado a

espectrómetro de masas (Agilent Technologies 5973 inert) con una columna cromatografía

BSNS.

23

CAPITULO IV

24

4. Resultados y discusión.

4.1. Rendimiento del material utilizado. El rendimiento se obtuvo en base a la fórmula 1: en relación al peso del extracto obtenido y

el peso de la materia vegetal seca; en la tabla 5 se indica el peso de los extractos obtenidos

de cada especie en los diferentes disolventes y el rendimiento de cada uno de ellos. Tabla 5.Extractos obtenidos. Rendimiento de especies P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora, y

peso de cada uno de los extractos en los diversos solventes utilizados.

Especie vegetal Parte de la

especie

Extracto

Disolvente

utilizado: Hex

peso del

extracto (g) y

rendimiento (%)

Disolvente

utilizado: AcOEt

peso del extracto

(g) y rendimiento

(%)

Disolvente

utilizado: MeOH

peso del

extracto (g) y

rendimiento (%)

P. cumbalensis

Tallos 6.39 g

0.87%

5.16 g

0.70%

5.30 g

0.72%

Hojas 12.19 g

1.78%

13.81 g

2.01%

17.80 g

2.60%

P. manicata

Tallos 10.23 g

1.03%

7.03 g

0.71%

9.36 g

0.95%

Hojas 14.00 g

2.62%

12.13 g

2.27%

10.36 g

1.94%

P. indecora Tallos y

Hojas

6.29 g

1.6%

2.10 g

0.56%

7.24 g

1.90%

Fuente: Autor

4.2. Inhibición de crecimiento de tres líneas celulares de cáncer humano de los extractos.

La inhibición de crecimiento celular de los extractos se estudió es tres líneas celulares: RKO,

MCF7 y D384mediante MTT, los extractos más activos fueron: extracto hexánico de hojas y

tallos de P. cumbalensis y extracto hexánico de hojas de P. manicata (50 – 60%), como se

observa en las gráficas 1-3.

25

Gráfica 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de colon RKO, en

extractos de P. cumbalensis, P. manicata y P. indecora. Los datos representan la media más el error

estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones

Fuente: Autor

Gráfica 2. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea de cáncer de mama MCF7, en


estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.

Fuente: Autor

26

Gráfica 3. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea astrocitoma cerebral D384, en


estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.

Fuente: Autor

Las tres especies de Passiflora presentaron baja actividad inhibitoria de crecimiento celular

frente a las líneas celulares RKO, MCF7 y D384, excepto el extracto hexánico de P.

manicata y el extracto hexánico de P. cumbalensis, cuya actividad fue moderada (60-70%);

algunas especies pertenecientes del genero Passifloraceae como P. incarnata L. no

presentaron actividad citotóxica (Visozo et al., 2010), a diferencia de otras especies

vegetales caracterizadas por alto valores de citotoxicidad (Valdiviezo, 2010), como es el

caso de P. manicata, cuyo extracto presento altos valores de citotoxicidad (60-70%) contra

una línea de cáncer de próstata PC3 (Suffredini et al,. 2006).

La bioactividad observada se explicaría posiblemente por la presencia de terpenoides,

saponinas y fitoesteroles; en base a que su presencia ha sido confirmada en especies del

mismo género como P. edulis, a estos tres grupos de metabolitos secundarios se les otorga

funciones muy variadas como: anti-cáncer, inhibidores de acetil-colenesterasa,

antiinflamatoria, antimicrobiana, hipolipemiantes, etc. (Olmedo, 2009).Los terpenoides

constituyen el más amplio conjunto conocido como metabolitos secundarios de los

vegetales, los que se han evaluado en diversos compuestos procedentes de plantas

27

demostrando su potencial anticancerígeno (Setzer et al., 2003) como el caso del ácido

kaurenoico un diterpeno aislado de la oleoresina de Copaiferalangsdorffii, que demostró

inhibir in vitro el crecimiento de células leucémicas, cáncer de mama y cáncer de colon

(Costa et al,. 2002); las saponinas constituyen un amplio grupo de heterósidos muy

frecuentes en los vegetales con propiedad antimicótica, antibacteriana, antiinflamatoria,

antioxidante, anticancerígena (Liang et al,. 1995) y los fitoesteroles en la actualidad se los

conoce por sus diversas funciones como disminución de colesterol, enfermedades

coronarias y como antiinflamatorio, actualmente hay estudios que los reconocen capaces de

retardar el crecimiento tumoral y cáncer hereditario en un modelo en ratas y conejos. (FABA,

2012).

4.3. Fraccionamiento mediante cromatografía en columna.

En la tabla 6, se indica el número total de fracciones obtenidas en las cuatro columnas

fueron corridas en el presente trabajo.

Tabla 6. Número de fracciones obtenidas en el fraccionamiento por cromatografía en columna de los

extractos de P. cumbalensis y P. manicata.

Especie vegetal

Disolvente utilizado

para la obtención del

extracto

Número de fracciones

obtenidas

P. cumbalensishojas y tallos Hexano 555

P. cumbalensishojas y tallos Acetato de Etilo 697

P. cumbalensishojas y tallos Metanol 672

P. manicata hojas y tallos Hexano 343

Fuente: Autor

4.4. Identificación de metabolitos secundarios.

Del extracto hexánico de P. cumbalensis se aisló e identifico seis compuestos:

4.4.1. Compuesto 1.

28

De la fracción 98 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 95% Hex-

5%AcOEt, se obtuvo 8mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión

de 78-80ºC, soluble en diclorometano.

Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.76 - 1.03

(m, 3 H) 1.14 - 1.34 (m, 19 H) 3.65 (t, J=6.65 Hz, 2 H). 13C NMR (100 MHz, CHLOROFORM-

d) ppm 14.4 (s, 1 C) 23.0 (s, 1 C) 26.0 (s, 1 C) 29.6 (s, 1 C) 29.7 (s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 29.9

(s, 1 C) 29.9 (s, 1 C) 30.0 (s, 1 C) 32.2 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 63.4 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 184

M+ (8), 155 (38), 80 (24), 72 (100), 57 (70).Ver espectro Nº 1,2 y 3. La caracterización se

efectuó por medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados

en la base de datos Spectral Data base for Organic Compounds (SDBS).

Que se identifico como dodecanal, de formula molecular C12H24O; peso molecular: 184.3 g

mol−1, se ha identificado como componente principal del aceite esencial de Oriandrum

sativum(cilantro) (Orendain, 2012);este compuesto no se ha identificado para ninguna de las

especies estudiadas en este trabajo. Figura 4. Estructura molecular de dodecanal

4.4.2. Compuesto 2. De la fracción 309 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 60% AcOEt.-

40% MeOH, se obtuvo 12 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de

fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.

Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.85 - 0.92

(m, 3 H) 1.13 - 1.43 (m, 32 H) 1.65 (dt, J=14.11, 6.73 Hz, 14 H) 2.43 (td, J=7.41, 1.93 Hz, 2

H) 9.77 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 14.27 (s, 1 C) 22.24

(s, 1 C) 22.85 (s, 1 C) 29.32 (s, 1 C) 29.51 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.73 (s, 1 C) 29.81 (s, 1

C) 29.85 (s, 15 C) 32.08 (s, 1 C) 44.08 (s, 1 C) 203.14 (s, 1 C).EM-IE: m/z % 380 M+ (8), 362

(30), 96 (75), 82 (100). Ver espectros Nº 4, 5 y 6. La caracterización se efectuó por medio de

la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura

(Fatland, et al 2005).

Que se identificó como hexacosanal; formula: C26H52O; peso molecular: 380.6 g mol−1,

pertenece al grupo de los aldehído, ha sido aislado de especie crucífera nativa de Europa

29

Arabido psisthaliana (Fatland, et al 2005), este compuesto no se ha identificado para

ninguna de la especies estudiadas en este trabajo. Figura 5. Estructura molecular de hexacosanal

4.4.3. Compuesto 3. De la fracción 133 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-

10%AcOEt, se obtuvo 9 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión


Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.71 (s, 3

H) 0.82-0.84 (m, 10 H) 0.92 (d, J=6.4 Hz, 3H) 1.18 (s, 7 H) 1.30 (m, 10H) 2.38 (m, 12H)

5.72 ( s, 4 H) . 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 11.9 (s, 1 C) 18.9

(s, 1 C) 19.1 (s, 1 C) 20.6 (s, 1 C) 20.7 (s, 1 C) 21.0 (s, 1 C) 23.9 (s, 1 C) 24.7 (s, 1 C) 28.1

(s, 1 C) 31.2 (s, 1 C) 31.5 (s, 1 C) 31.6 (s, 1 C) 31.7 (s, 1 C) 36.2 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 39.3

(s, 1 C) 40.3 (s, 1 C) 42.0 (s, 1 C) 42.3 (s, 1 C) 50.1 (s, 1 C) 50.6 (s, 1 C) 55.8 (s, 1 C) 56.3

(s, 1 C) 70.2 (s, 1 C) 120.1 (s, 1 C) 129.2 (s, 1 C) 137.6 (s, 1 C) 141.6 (m, 1 C).EM-IE: m/z %

412 M+ (10), 394 (100), 255 (60), Ver espectros Nº 7, 8 y 9.La caracterización se efectuó por

medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la

literatura (Rojas, et al 2000) y (Pérez, et al 2009).

Se identificó como 5, 22 dien – 3 stigmasterol, formula: C29H48O; peso molecular: 412.69 g

mol−1, este compuesto ha sido aislado en diversas especies, como en el extracto de

diclorometano de Piper pseudochurumayu, se obtuvo en las fracciones eluídas con hexano-

acetato de etilo en proporción 90-10, el precipitado tuvo la apariencia de escarcha

blanquecina, que concuerda con nuestros resultados; además ha sido aislado y

caracterizado de Baccharis decusata (Rojas et al 2000),también se ha identificado en el

extracto de diclorometano de las hojas de Synedrellanodiflora (L.) (Perez et al 2009), este

compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este trabajo.

30

Figura 6. Estructura molecular de 5,22 dien – 3 estigmasterol

4.4.4. Compuesto 4.

De la fracción 121 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-



Cuyos datos espectroscópicos son:1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.64 - 0.74

(m, 4 H) 0.79 - 0.89 (m, 11 H) 0.91 - 0.98 (m, 5 H) 0.99 - 1.21 (m, 15 H) 1.23 (br. s., 1 H)

1.24 - 1.32 (m, 5 H) 1.37 (br. s., 1 H) 1.39 - 1.63 (m, 13 H) 1.65 - 1.70 (m, 1 H) 1.76 - 1.91

(m, 4 H) 1.92 - 2.13 (m, 5 H) 2.18 - 2.37 (m, 4 H) 3.46 - 3.67 (m, 3 H) 5.05 (s, 1 H) 5.14 (d,

J=8.34 Hz, 2 H) 5.30 - 5.42 (m, 2 H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.86 (s,

1 C) 11.98 (s, 1 C) 12.05 (s, 1 C) 12.25 (s, 1 C) 18.77 (s, 1 C) 18.98 (s, 1 C) 19.03 (s, 1 C)

19.39 (s, 1 C) 19.82 (s, 1 C) 21.08 (s, 1 C) 21.21 (s, 1 C) 23.06 (s, 1 C) 24.30 (s, 1 C) 24.36

(s, 1 C) 26.07 (s, 1 C) 28.24 (s, 1 C) 28.92 (s, 1 C) 29.14 (s, 1 C) 29.70 (s, 1 C) 31.67 (s, 1

C) 31.90 (s, 1 C) 33.94 (s, 1 C) 36.14 (s, 1 C) 36.50 (s, 1 C) 37.25 (s, 1 C) 39.68 (s, 1 C)

39.77 (s, 1 C) 40.49 (s, 1 C) 42.21 (s, 1 C) 42.30 (s, 1 C) 42.32 (s, 1 C) 45.83 (s, 1 C) 50.12

(s, 1 C) 50.15 (s, 1 C) 51.23 (s, 1 C) 55.95 (s, 1 C) 56.05 (s, 1 C) 56.76 (s, 1 C) 56.86 (s, 1

C) 62.74 - 64.09 (m, 1 C) 71.80 (s, 1 C) 121.71 (s, 1 C) 129.26 (s, 1 C) 138.31 (s, 1 C)

140.75(s, 1 C) 150.66 - 193.59 (m, 1 C). EM-IE: m/z % 414 M+ (6), 273 (10), 255 (10), 231

(8), 42 (100), Ver espectros Nº 10, 11 y 12. La caracterización se efectuó por medio de la

comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura

(Gabirello, 2010).

Identificando como gamma-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1, es

un fitoesterol que se ha aislado de Clematis montevidensis, a la vez se le otorga funciones

diuréticas (Petenatti, et al 2005). Se ha caracterizado en el extracto hexánico de las hojas

31

de Pentacalia vaccinioides (Gabirello, 2010). También fue caracterizado en el extracto de

diclorometano de Rhoeodiscolor, conocida como “maguey morado o barquilla”, en donde se

le atribuyen funciones de antiinflamatorio y bactericida (Domínguez, et al 2002), este

compuesto no se ha identificado para ninguna de las especies estudiadas en este trabajo. Figura 7.Estructura molecular de gamma sitosterol

4.4.5. Compuesto 5. De la fracción 132 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90% Hex-



Cuyos datos espectroscópicos son 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.69-0.73

(m, 3H) 0.76-0.89 (m, 9 H) 0.91-1.05 (m, 5 H) 1.07-1.13 (m, 3H) 1.35-1.42 (m, 4 H) 1.65 –

1.70 (m, 9H) 1.8- 2.0 (m, 10H) 2.38 (m, 1H) 3.2 (m, 1H)3.63 (m, 1H) 4.68 (m, 1H) 5.19 (m,

J=8.34 Hz 1H) 5.26 (m 2H). 13C NMR (101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 11.8 (s, 1 C) 17.7

(s, 1 C) 19.3 (s, 1 C) 21.6 (s, 1 C) 24.3 (s, 1 C) 26.1 (s, 1 C) 27.4 (s, 1 C) 28.1 (s, 1 C) 28.4

(s, 1 C) 29.8 (s, 1 C) 32.6 (s, 1 C) 34.3 (s, 1 C) 36.3 (s, 1 C) 37.1 (s, 1 C) 37.2 (s, 1 C) 38.6

(s, 1 C) 38.9 (s, 1 C) 39.2 (s, 1 C) 40.1 (s, 1 C) 40.8 (s, 1 C) 50.5 (s, 1 C) 55.1 (s, 1 C) 55.3

(s, 1 C) 79.0 (s, 1 C) 118.9 (s, 1 C) 121.7 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 145.2 (s, 1 C) 150.9 –

151.68 (m, 1 C).EM-IE: m/z % 414 M+ (25), 396 (100), 255 (60) Ver espectros Nº 13, 14 y

15.La caracterización se efectuó por medio de la comparación de los datos

espectroscópicos previamente informados en la literatura (Gabirello, 2010).

Identificado como: beta-sitosterol, formula: C29H50O; peso molecular: 414.7 g mol−1;

pertenece al grupo de los fitoesteroles, ha sido caracterizado en Daucus carota L.

(zanahoria), en donde se le atribuyen funciones como acción vasodilatadora, antitumorígena

y antimutagénica (Gutierrez, 2008). También se lo caracterizado en Buddleja globosa,

32

(matico)en donde se le otorga características antiinflamatorias y cicatrizantes (Goity, 2007);

este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este

trabajo. Figura 8. Estructura molecular de beta sitosterol

4.4.6. Compuesto 6.

De la fracción 124-127 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 90%

Hex-10%AcOEt, se obtuvo 15 mg de un compuestode color blanquecino,con un punto de

fusión de 79-81ºC, soluble en diclorometano.

Cuyos datos espectroscópicos son: 1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.63 (s, 3H)

0.83 (d, J=6.7 Hz 3H) 0.84 (d, 9H) 0.92 (d, J=6.8 Hz 4H) 0.95 (s, 10 H) 1.04 (d, J=6.6 Hz

6H) 3.63 (m, 1H) 5.18 (dd 3H) 5.22 (dd, J=8.0 Hz 1H) 5.39 (m, 1H) 5.58 (m, 3H) . 13C NMR

(101 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 12.0 (s, 1 C) 16.3 (s, 1 C) 17.6 (s, 1 C) 19.6 (s, 1 C) 21.1

(s, 2 C) 23.0 (s, 1 C) 28.3 (s, 1 C) 31.9 (s, 1 C) 33.1 (s, 1 C) 37.0 (s, 1 C) 38.4 (s, 1 C) 39.1

(s, 1 C) 40.4 (s, 1 C) 40.7 (s, 1 C) 42.8 (s, 2 C) 46.2 (s, 1 C) 54.5 (s, 1 C) 55.7 (s, 1 C) 70.4

(s, 1 C) 116.3 (s, 1 C) 119.6 (s, 1 C) 132.0 (s, 1 C) 135.6 (s, 1 C) 139.8 (s, 1 C) 141.3-141.9

(m, 1 C).EM-IE: m/z % 396M+ (64), 381 (3), 363 (100), 337 (35), 271 (5); 253 (20), 227 (4),

211 (15), 158 (5), 143 (17), Ver espectros Nº 16, 17 y 18.La caracterización se efectuó por

medio de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la

literatura (Chaparro, et al 2010).

Identificado como: ergosta-5,7,22-trien-3-ol, formula: C28H44O; peso molecular: 396.3 g

mol−1; corresponde al grupo de los fitoesteroles, por lo general se lo aislado de hongos y se

le atribuye funciones como precursor de la vitamina D2, se lo ha caracterizado del extracto

de metanol de Gonoderma lucilum y de Claviceps purpurea, en donde algunos estudios en

conejos han demostrado poseer propiedades antiinflamatorias y antipiréticas (Torpono, et al

33

2012), este compuesto no se ha identificado para ninguna de la especies estudiadas en este

trabajo. Figura 9. Estructura molecular de ergosterol

4.5. Actividad inhibitoria de crecimiento celular de los fitoesteroles identificados, en dos líneas de cáncer humano RKO y D384.

El estudió se lo efectuó en dos líneas celulares RKO y D384, de los fitoesteroles porque

había cantidades optimas y por los reportes anti-cancerígenos encontrados en la literatura;

se obtuvo entre 15-20% de inhibición celular en la línea RKO de todos los fitoesteroles; y de

50-60% en la línea D384 de todos los fitoesteroles, excepto beta-sitosterol que obtuvo 15%,

como se puede observar en las gráficas 4 y 5.

.

Fuente: Autor

Gráfica 4. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea celular RKO de los fitoesteroles identificados: 5, 22 dien 3 estigmasterol, gamma sitosterol, beta sitosterol y ergosterol. Los datos representan la media más el error estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.

34

Fuente: Autor

Se han encontrado algunas evidencias de que los fitoesteroles, particularmente el sitosterol,

podrían inducir apoptosis en células de cáncer de próstata, de mama y de colon mediante

un incremento en la actividad de la caspasa-3, enzima proteasa que participa en la cascada

de la apoptosis (Choi, et al 2003) los fitoesteroles también pueden interferir en el crecimiento

y la multiplicación celular aunque se desconoce la forma en que se lleva a cabo, en las

etapas de angiogénesis y metástasis, estos compuestos parecen reducir la capacidad de las

células, además el sitoesterol participa en la activación de enzimas antioxidantes como la

superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa, con esto se reducen los agentes oxidantes y

potenciales carcinogénicos (Woyengo, et al 2009), se conoce que los fitoesteroles inhiben el

crecimiento tumoral y la oxidación de las lipoproteína al incorporarlos en la dieta, afirmando

esta teoría con el estudio realizado en ratones en donde se confirma que los fitoesteroles en

la dieta retardan el crecimiento y el esparcimiento de células de cáncer de mama, fue

probado en la línea MDA-MB-231, xeno injertado en ratones SCID en donde los animales

fueron alimentados con el suplemento AIN-93G que contiene mezcla de fitoesteroles, por 15

días antes de la inoculación del tumor, al final se observó que el tamaño del tumor

Gráfica 5. Porcentaje de inhibición del crecimiento celular en la línea celular D384 de los fitoesteroles identificados: 5, 22 dien 3 estigmasterol, gamma sitosterol, beta sitosterol y ergosterol. Los datos representan la media más el error estándar de 3 experimentos con 3 repeticiones.

35

desarrollado en los ratones alimentados con fitoesteroles era 33% más pequeño y tenían

20% menos metástasis en nódulos linfáticos y pulmones (Honey, 2012).

En los estudios in vitro, gamma sitosterol y ergosterol inhibieron el crecimiento de las células

PC-3 un 70% y 14% respectivamente, los fitoesteroles también inhibieron la invasión de

membranas de Matrigel, disminuyeron la migración de células tumorales, redujeron los

enlaces de células PC3 con lalaminina y la fibronectina, se concluyó que los fitoesteroles

inhiben el crecimiento de las células tumorales PC3 directamente en cultivo in vitro e

indirectamente como suplemento en la dieta, y que el gamma-sitosterol es más efectivo

(Honey, 2012).

β-sitosterol, es considerado como el principal fitoesterol diétetico que ha sido probado en el

crecimiento delas células HT-29, una línea celular de cáncer de colon humano, cuyo estudio

indico que de 8 y 16 mM fueron eficaces en el crecimiento celular en un 50%, esto se dio por

la incorporación de este fitoesterol al grupo de fosfolípidos en la membrana, por lo que se

produjo una disminución del 50% de las membranas esfingomieliticas de las células

cultivadas, por lo que se considera posible quela inhibición del crecimiento observada por β-

sitosterol puede ser mediada a través de la influencia de la vía de transducción de señal que

implican fosfolípidos de la membrana (Awad, et al 1996).5, 22 dien stigmasterol 3 ol, es un

fitoesterol que se lo ha estudiado en ratones como un posible antitumoral contra el

carcinoma EhrilchAscites (Ghosh et al., 2011). No existen estudios de la identificación o

caracterización de fitoesteroles en las especies estudiadas en el presente trabajo.

4.6. Del extracto de acetato de etilo de P. cumbalensis se aisló e identificó un compuesto.

4.6.1. Compuesto 7.

De la fracción 309-311 corrida en cromatografía de columna con una polaridad de 20% Hex-

80% AcOEt, se obtuvo 8 mg de un compuesto de color blanquecino, con un punto de fusión

de 135-1386ºC, soluble en cloroformo.

Cuyos datos espectroscópicos son: IR (ATR) νmax cm-1: 2916.5, 2848.9 (COH) 1725.4,

1472.8 1377.4.1H NMR (400 MHz, CHLOROFORM-d) ppm 0.78 - 0.85 (m, 3H) 1.18 (m, 30

H) 1.34 (m, 2 H) 2.35 (m, J=7.41, 1.93 Hz, 2 H) 9.70 (t, J=1.93 Hz, 1 H). 13C NMR (101 MHz,

CHLOROFORM-d) ppm 14.11 (s, 1 C) 22.09 (s, 1 C) 22.69 (s, 1 C) 29.16 (s, 1 C) 29.36 (s,

1 C) 29.43 (s, 1 C) 29.58 (s, 1 C) 29.66 (s, 1 C) 29.69 (s, 8 C) 31.92 (s, 1 C) 43.92 (s, 1 C)

202.98 (s, 1 C). EM-IE: m/z % 382 M+ (5), 82 (100). Ver espectros Nº 19, 20, 21 y 22.

Que se identificó como nonadecanal; formula: C19H38O; peso molecular: 382.21 g mol−1,

36

Como se puede ver en el espectro N° 19, existen dos bandas de intensidad parecida 2916.5

y 2848.9 entre 2900 y 2700 que indica la vibración de la tensión de C-H, lo que

generalmente sirve para identificar a los aldehídos. La caracterización se efectuó por medio

de la comparación de los datos espectroscópicos previamente informados en la literatura

(Tabrizi, et al 2010). Ha sido identificado como principal componente del aceite esencial de

T. transcaspicusen habitad natural (Tabrizi, et al 2010). Figura 10. Estructura molecular de nonadecanal

4.7. Del extracto de metanol de P. cumbalensis se obtuvo dos compuestos.

4.7.1. Compuesto 8.

De la fracción 217 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 10% Hex-


de 119-123ºC, soluble en DMSO.

El Espectro de CG/EM mostró tiempo de retención de 30.68, ver espectro Nº 23 y se

determinó su peso molecular de 530g mol−1, ver espectro Nº 24, pero por problemas

desolubilidad no seidentificó y al obtener cantidades pequeñas imposibilitó las repeticiones

de RMN.

4.7.2. Compuesto 9.

De la fracción 401 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 60% MeOH-


de 136-139ºC, soluble en DMSO.

El Espectro de CG/EM mostró un tiempo de retención de 7.99, ver espectro Nº 25 y se

determinó su peso molecular de 561g mol−1, ver espectro Nº 26, pero por problemas de

solubilidad no se identificó.

4.8 Del extracto hexánico de P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos.

37

4.8.1. Mezcla 1 (M1).

De la fracción 37 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de 90% Hex -

10%AcOEt, se obtuvieron7 mg de color blanquecino.

El Espectro de CG/EM mostró: ver espectro Nº 27

4.8.1.1. Compuesto 1-M1.

Tiempo de retención de 10.45, peso molecular de 281 g mol−1. Ver espectro Nº 28 a.


Tiempo de retención de 11.02, peso molecular de 355 g mol−1. Ver espectro Nº 28 b.


Tiempo de retención de 12.14, peso molecular de 278 g mol−1. Ver espectro 28 c.


Tiempo de retención de 17.43, peso molecular de 336 g mol−1. Ver espectro Nº 28 d.


Tiempo de retención de 22.08, peso molecular de 364 g mol−1. Ver espectro Nº 28 e.

4.8.2. Mezcla 2:

Fue obtenido de la fracción 138 corrida en cromatografía en columna con una polaridad de

30% Hex - 70%AcOEt, se obtuvieron8 mg de color blanquecino.

El Espectro de CG/EM mostró cuatro compuestos: ver espectro Nº 29.


Tiempo de retención de 12.13, con un peso molecular de 278g mol−1. Ver espectro Nº 30 a.


Tiempo de retención de 17.39 con un peso molecular de 308g mol−1. Ver espectro Nº 30 b.


Tiempo de retención de 22.01 con un peso molecular de 364g mol−1. Ver espectro Nº 30 c.


38

Tiempo de retención de 28.8, con un peso molecular de 392g mol−1. Ver espectro Nº. 30 d.

Al obtener cantidades pequeñas, no se pudo separar, aislar o caracterizar los compuestos

puros.

39

CONCLUSIONES

Los extractos con mayor actividad inhibitoria de crecimiento celular fueron el extracto

hexánico de hojas P. manicata, y el extracto hexánico tallos y hojas de P. cumbalensis frente

a las tres líneas celulares de cáncer estudiadas RKO, MCF7 y D384 con un porcentaje entre

el 50% y 60%, mientras que los demás extractos presentaron actividad inhibitoria entre

10y30%.

Del extracto hexánico de P. cumbalensis se identificaron seis metabolitos secundarios, de

los cuales cuatro son fitoesteroles (5,22-dien-3 estigmasterol; gamma-sitosterol; beta

sitosterol y ergosterol) y dos aldehídos (dodecanal y hexacosanal); todos aislados e

identificados por primera vez en esta especie; de los cuales los fitoesteroles poseen

importante actividad inhibitoria 50-60% en la línea celular de cáncer D384 y bajo entre el 15-

20% en la línea celular RKO.

Del extracto de acetato de etilo de hojas y tallos de P. cumbalensis se aisló e identificó un

aldehído (nonadecanal), del extracto de metanol de hojas y tallos de P. cumbalensis se

obtuvo dos compuestos pero no se los identifico por problemas de solubilidad y del extracto

hexánico de hojas y tallos P. manicata se obtuvo dos mezclas de compuestos en pequeñas

cantidades lo que imposibilito su caracterización.

40

RECOMENDACIONES

• Continuar con el estudio del género Passiflora, realizando el aislamiento e

identificación de metabolitos, con el fin de detectar cual son los componentes que le

dan las propiedades curativas de la especie.

• Sería recomendable hacer ensayos de inhibición de crecimiento en líneas celulares

normales para evaluar su efecto toxico en estas.

• Probar otras actividades de los extractos y compuestos identificados como:

antibacteriana, anti fúngica, antioxidante.

• Finalmente continuar realizando estudios en especies vegetales con antecedentes

etnobotánicas y endémicas de nuestra región, con el fin de respaldar científicamente

su aplicación tradicional.

41

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46

ANEXOS

Espectro Nº 1. Espectro de RMN 1H de dodecanal (C12H24O)

47

Espectro Nº 2. Espectro de RMN 13C de dodecanal (C12H24O)

48

Espectro Nº 3. Espectro de Masas dodecanal (C12H24O)

PM: 184 g/mol

49

Espectro Nº 4.Espectro de RMN 1H de hexacosanal (C26H52O)

50

A

Espectro Nº 5. Espectro de RMN 13C de hexacosanal (C26H52O)

51

Espectro Nº 6. Espectro de masas de hexacosanal (C26H52O)

PM: 380 g/mol

52

Espectro Nº 7.Espectro de RMN 1H de 5, 22 dien – stigmasterol (C29H48O)

53

Espectro Nº 8. Espectro de RMN 13C de 5, 22 dien - stigmasterol (C29H48O)

54

Espectro Nº 9. Espectro de EM de de 5, 22 dien - stigmasterol (C29H48O)

PM: 412 g/mol

55

Espectro Nº 10. Espectro de RMN 1H de gamma sitosterol (C29H50O)

56

Espectro Nº 11. Espectro de RMN 13C de gamma sitosterol (C29H50O)

57

Espectro Nº 12. Espectro de Masas de gamma sitosterol (C29H50O)

PM: 414 g/mol

58

Espectro Nº 13. Espectro de RMN 1H de beta sitosterol (C29H50O)

59

Espectro Nº 14. Espectro de RMN 13C de beta sitosterol (C29H50O)

60

Espectro Nº 15. Espectro de Masas de beta sitosterol (C29H50O)

PM: 414 g/mol

61

Espectro Nº 16.Espectro de RMN 1H de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)

62

Espectro Nº 17. Espectro de RMN 13C de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)

63

Espectro Nº 18. Espectro de Masas de ergosta 5-7-22 trien -3 ol (C29H50O)

PM: 396 g/mol

EEspectro Nº 19.

64

Espectro de IR

R de nonadecanal

65

Espectro Nº 20. Espectro de RMN 1Hde nonadecanal

66

Espectro Nº 21. Espectro de RMN 13C de nonadecanal

67

Espectro Nº 22. Espectro de Masas de nonadecanal

PM: 382 g/mol

68

Espectro Nº 23. Espectro de CG/EM de la fracción 217 del extracto de metanol de P. cumbalensis

69

Espectro Nº 24.. Espectro de Masas del compuesto 8 de la fracción 217 del extracto metanólico de P. cumbalensis

70

Espectro Nº 25.. Espectro de CG/EM de la fracción 401 del extracto de metanol de P. cumbalensis

71

Espectro Nº 26.. Espectro de Masas del compuesto 9 de la fracción 401 del extracto de metano de P. cumbalensis

72

Espectro Nº 27.. Espectro de CG/EM de la mezcla 1 de cinco compuestos de la fracción 37 del extracto hexanico de P. manicata

73

d. e.

Espectro Nº 28. Espectro de masas de la mezcla 1la fracción 37 del extracto hexanico de P. manicata: a) C1-M1, b) C2-M1, c) C3-M1,d)C4-M1, e) C5-M1.

a)

d) e)

c)b)

74

Espectro Nº 29: Espectro de GC/EM de la mezcla de cuatro compuestos de la fracción 138 del extracto hexánico de P. manicata

75

Espectro Nº 30. Espectro de masas de la mezcla 2 la fracción 138 del extracto hexánico de P. manicata: a) C1-M2, b) C2-M2, c) C3-M2, d) C4-M2.

a)

d)c)

b)

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