La Reaccion en Cadena de La Polimerasa PCR a Dos Decadas de Su Invencion

Ciencia UANLUniversidad Autnoma de Nuevo [email protected] ISSN (Versin impresa): 1405-9177MXICO

2004 Iram Pablo Rodrguez Snchez / Hugo A. Barrera Saldaa

LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU INVENCIN

Ciencia UANL, julio-septiembre, ao/vol. VII, nmero 003 Universidad Autnoma de Nuevo Len

Monterrey, Mxico pp. 323-335

CIENCIA UANL / VOL. VII, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2004 323

*Unidad de Laboratorios de Ingeniera y Expresin Genticas, De-partamento de Bioqumica, Facultad de Medicina de la Universi-dad Autnoma de Nuevo Len.

LA REACCIN EN CADENADE LA POLIMERASA A DOS DCADASDE SU INVENCIN

IRAM PABLO RODRGUEZ SNCHEZ*, HUGO A. BARRERA SALDAA*

P ocos descubrimientos del complejomundo cientfico actual pueden serconsiderados realmente revoluciona-rios. Sin embargo, cuando ocurrense transforma el modo en que se piensa y trabaja enel laboratorio.

Aunque el progreso en las diferentes ramas de laciencia parece ser lento y su evolucin resulta unaletana de paso a paso, en el caso de la biologamolecular ha sucedido lo contrario. Esta disciplinaha sido afortunada con grandes cambios en tiem-pos relativamente cortos.

Una poca nutrida de dichos cambios fue la d-cada de 1970, en la que se produjo un gran nme-ro de descubrimientos, como el de las enzimas derestriccin, la clonacin de genes en plsmidos yfagos, y las tcnicas de hibridacin en filtro paraADN y ARN, conocidas como Southern y Northernblot, respectivamente; as como las invenciones delas tcnicas de secuenciacin qumica y enzimticapara el ADN.1

Otro salto tecnolgico ocurri en 1983, cuandoKary Mullis (figura 1) desarroll una nueva tcnicaque hizo posible la sntesis de grandes cantidadesde un fragmento de ADN sin tener que clonarlo: lareaccin en cadena de la polimerasa (conocidacomo PCR por sus siglas en ingls). Esta tcnica esconsiderada la ms revolucionaria del ltimo cuar-to del siglo XX.2 Con sta se consigue copiar millo-nes de veces, en un par de horas, una secuenciapredeterminada, dentro de una mezcla de ADN tancompleja como el propio genoma humano, dondela secuencia de inters representa tan slo una diez-millonsima parte.3

Pero la PCR no esslo una tcnica exqui-sitamente especfica,sino tambin muy sen-sible, pues en principiopara practicarla basta-ra una sola molcula,por ejemplo, del geno-ma humano (~6 pico-gramos), aunque habi-tualmente se empleancantidades excesivasde ste (en el orden dehasta microgramos).

Adems, por si es-tos atributos fueranpocos, la tcnica es tanrobusta que puede usarcomo substrato para lareaccin al ADN, sintener que purificarlo de su fuente natural, y es co-mn emplear productos biolgicos diversos comotejidos embebidos en parafina, semen recuperadode escenas de violacin, lavados bronquiales,exudados de mucosas, races de cabellos o cejas,sangre, extendidos citolgicos, etc.; muchas vecesbasta una simple ebullicin de la muestra para lisar,liberar y de paso desnaturalizar el ADN, dejndololisto para la reaccin.

Fig. 1. Kary B. Mullis. Este sin-gular empleado de la compa-a Cetus Corporation, enEmeryville, California, se hizoacreedor del Premio Nobel en1993 por la invencin de laPCR, tcnica utilizada paramultiplicar millonariamente invitro fragmentos especficos decualquier ADN. Fuente: Archi-vos de la ULIEG.

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Qu es la reaccin en cadenade la polimerasa?

La PCR es un mtodo in vitro de sntesis de ADN conel que un segmento particular de ste es especfica-mente amplificado al ser delimitado por un par decebadores o iniciadores que lo flanquean. Su co-piado se logra en forma exponencial a travs derepetidos ciclos de diferentes periodos y temperatu-ras de incubacin en presencia de una enzima ADNpolimerasa termoestable. As se obtienen en cues-tin de horas millones de copias de la secuenciadeseada del ADN.3,4

La PCR es una tcnica de biologa molecular al-tamente especfica, rpida, sensible y verstil paradetectar cantidades nfimas de un cierto ADN espe-cfico, posibilitando su fcil identificacin y prescin-diendo del uso de radioistopos, indispensablesantes de su invencin.

Al principio, su inventor enfrent dos problemasfundamentales: uno era que en cada ciclo habaque aadir la enzima ADN polimerasa, ya que stase inactivaba con las temperaturas tan altas deman-dadas para desnaturalizar el ADN y exponer las ba-ses nitrogenadas de sus nucletidos. Otro inconve-niente era que haba que hacerlo manualmente entres baos mantenidos a las diferentes temperaturasrequeridas, pasando rpidamente la muestra de unbao al otro y luego al ltimo, repitiendo esto variasdecenas de veces.5

El descubrimiento de una bacteria (Thermusaquaticus) que vive en aguas termales junto a geissersa 75C, la cual tiene una ADN polimerasa que fun-cionaba bien a altas temperaturas (72C) e inclusoes estable a 94C, supuso un gran avance, ya queslo tena que ser aadida al principio y se mante-

Fig. 2. Termociclador (Mastercycler gradient thermalcycler).9 A estos aparatos se les atribuye junto con las ADNpolimerasas termoestables el permitir automatizar por com-pleto la PCR.

na activa durante todo el proceso.6 Esto, junto conel diseo de los termocicladores o aparatos queconsisten en un bloque que puede ser programadopara calentarse y enfriarse rpidamente en determi-nados tiempos, condujo a la automatizacin totaldel proceso (figura 2).7,8

Cmo funciona la PCR?

La reaccin consta, por lo regular, de una treintenade ciclos repetitivos conformados cada uno de trespasos: el primero consiste en la ruptura de los puen-tes de hidrgeno del ADN para desnaturalizarlo, paralo que se incuba a una temperatura de alrededor de95C, por un minuto. Este paso expone las basesnitrogenadas del ADN blanco. En el segundo ocu-rre la hibridacin de las cadenas desnaturalizadasdel ADN blanco con los denominados cebadores oiniciadores (ADN sinttico de hebra sencilla), a unatemperatura que facilita el apareamiento de las ba-ses nitrogenadas complementarias de ambas clasesde ADNs. Esta temperatura depende de la tempera-tura de fusin (Tm) de los iniciadores, la cual puedecalcularse mediante una frmula (ver ms adelan-te), pero generalmente oscila entre 50 y 60C. Eltercer paso se efecta a 72C, temperatura a la quela polimerasa extiende la longitud de los cebadores,aadiendo los diferentes nucletidos libres en el or-den que le va dictando la secuencia de nucletidosde la cadena que acta como molde10 (figura3).

Fig. 3. Ciclos de la PCR. La PCR se integra por ciclos de tresdiferentes periodos de incubacin y temperaturas.


Con qu ingredientes se practicala reaccin?

Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tuboel ADN que contiene la secuencia a amplificar, am-bos cebadores que se alinearn a las cadenas sim-ples del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribo-nuclesidos trifosfatados (dNTPs) en cantidades su-ficientes, el tampn de reaccin para la polimerasa,agua ultrapura para completar el volumen final dereaccin (que normalmente oscila entre 20 y 100l), y como ingrediente final crucial para la reac-cin, la enzima ADN polimerasa termoestable.2

Solucin amortiguadora

La solucin amortiguadora para la reaccin seemplea, comnmente, concentrada diez veces, y porlo general incluye Tris-HCl (pH=8.4 a temperaturaambiente), KCl, gelatina y MgCl2.

Algunos autores recomiendan el uso de adyu-vantes, los cuales en la prctica aumentan la espe-cificidad y fidelidad de la reaccin, tales como eldimetilsulfxido (DMSO) aadido para disminuir laestructura secundaria del ADN,11 detergentes comoel tween 20 o el Tritn X-100, que ayudan a estabi-lizar la enzima, y, finalmente, el polietilenglicol (PEG),el glicerol, la formamida, o la seroalbmina bovi-na, entre otros; aunque en ningn caso estos lti-mos son imprescindibles.

Magnesio

Tanto el in magnesio como el manganeso tienenuna funcin crtica en la reaccin, requirindose auna concentracin que oscila regularmente entre 0.5y 2.5 mM. La concentracin de MgCl2 debe optimi-zarse para cada ensayo en particular, ya que puedetener efecto tanto en la especificidad como en elrendimiento de la reaccin. En general, concentra-ciones insuficientes de Mg+2 dan lugar a bajo rendi-miento, mientras que en exceso se obtienen amplifi-caciones inespecficas.2

Desoxirribonuclesidostrifosfatados (dNTPs)

Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP;distinguibles por sus bases nitrogenadas) son los la-drillos con los que se construyen las nuevas cadenasde ADN (figura 4).

Fig. 4. Bases nitrogenadas. Estos componentes de losnucletidos son la clave de la especificidad del apareo delas cadenas del ADN, aparendose siempre una purina conuna pirimidina

La variacin en su concentracin afecta la espe-cificidad y fidelidad de la reaccin. Concentracio-nes altas de los mismos hacen disminuir la fidelidadcon la que la polimerasa efecta su trabajo, e inclu-so pueden llegar a inhibir su actividad. Tambin afec-ta a la fidelidad de la reaccin el uso de concentra-ciones desbalanceadas de estos cuatro ingredien-tes, siendo las concentraciones usuales, en la ma-yora de los casos, entre 0.2 a 1 mM.

Los dNTPs pueden captar iones de magnesio porlo que las concentraciones de ambos componentesdeben guardar siempre la misma relacin, aconse-jndose que la concentracin de Mg+2 sea 0.5 a 1mM superior a la concentracin de los dNTPs.

Cebadores o iniciadores

stos son el componente ms sensible que determi-na el xito de un ensayo de PCR. Su longitud sueleestar entre 18 y 30 nucletidos, y su contenido enG+C entre 40-75%. La concentracin a la que sue-len emplearse en una PCR est en el intervalo de0.1-0.5 M. Los iniciadores normalmente se dise-an para ser exactamente complementarios al mol-de de ADN.2

Los cebadores ideales deben carecer lo ms po-sible de estructuras secundarias, as como de com-plementariedad entre s. La complementariedad enel extremo 3' induce a que ambos iniciadores setranslapen en dicho extremo y sirvan de templados ya su vez de iniciadores entre s, para que la polime-rasa los extienda y genere as pequeos ampliconesreferidos como dmeros de cebadores. Estos dmerosson productos cortos que se amplifican muy eficien-temente, reduciendo la cantidad de cebadores dis-ponibles en la reaccin, y provocando un menorrendimiento del amplicn de inters.12

Los iniciadores utilizados para la amplificacinde un grupo de secuencias gnicas relacionadas

IRAM PABLO RODRGUEZ SNCHEZ, HUGO A. BARRERA SALDAA


suelen usarse degenerados, y en realidad son unamezcla de cebadores de la misma longitud con cier-tas diferencias de secuencia en posiciones especfi-cas, de tal forma que se abarque un intervalo am-plio de posibles secuencias blanco.13

En estos casos se debe procurar que la degene-racin sea mnima en el extremo 3', puesto que enste, las bases desapareadas se extienden con pocaeficiencia. Ambos iniciadores deben tener una tem-peratura de fusin o Tm similar y, por ende, un con-tenido semejante en G+C. La frmula ms utiliza-da para calcular la Tm de un iniciador es: Tm =(2C) (# de A+T) + (4C) (# de G+C). 2

La distancia que separa los sitios donde seaparean los cebadores dentro del ADN molde de-termina el tamao del producto de amplificacin. Eltamao ideal depende de la aplicacin: los produc-tos largos se amplifican con menor eficiencia, mien-tras que los productos muy cortos pueden confun-dirse con dmeros de los iniciadores y limitan muchola posibilidad de caracterizarlos posteriormente.

Existen diferentes programas computacionalesque ayudan en el diseo de cebadores y calculansus Tms, estructuras secundarias y posibles interac-ciones entre ellos.14

Los cebadores se sintetizan en el laboratoriomediante un proceso escalonado en el que se vanaadiendo nucletidos libres al extremo de la cade-na en crecimiento. El extremo 3 del nucletido ini-ciador de la futura cadena se fija a un soporte sli-do como una partcula de gel de slice. Un sintetiza-dor de ADN o mquina de genes realiza la sntesisen fase slida, aadiendo paso a paso cadanucletido en una serie de etapas (figura 5). Al finalde cada ciclo de adicin, la cadena en crecimiento

Fig.5. Mquina de genes. Actualmente existen mquinascapaces de construir cadenas nucleotdicas de tamaos quehasta hace poco seran inimaginables. Mquinas como laaqu mostrada (Oligo 1000M DNA Synthesizer)16 son lasencargadas de fabricar los oligonucletidos utilizados du-rante la PCR.

se separa de la mezcla de reaccin mediante filtra-cin o centrifugacin. A continuacin se repite elprocedimiento para unir otro nucletido. Se invier-ten aproximadamente 40 minutos en aadir unnucletido a la cadena y es posible sintetizar cade-nas con una longitud de hasta 100 nucletidos.15

Como ya se dijo, estos iniciadores no deben sercomplementarios entre s, para que no se hibridenentre ellos. Y deben flanquear los extremos de laporcin de ADN que se desea amplificar, debiendode formar puentes de hidrgeno con dicho ADN aambos lados de la regin de inters.

Diseo de los cebadores

Para la eleccin de los iniciadores existe una seriede normas que pueden ayudar, aunque hay que in-dicar tambin que existen programas de cmputoque facilitan esta tarea (ADNsis, Primer3, Oligo, etc.).

Deben evitarse tramos largos de una sola base yque el extremo 3 tenga una estructura secundariaimportante. Tambin se debe procurar en lo posibleque las ltimas bases del extremo sean G o C, paraque le brinden mayor estabilidad al punto de iniciode la etapa de extensin.17

Como ya se dijo, se debe evitar la complemen-tariedad entre la pareja de iniciadores para minimi-zar la posibilidad de que se creen dmeros decebadores.

Normalmente deben tener un tamao de 18-30nucletidos, y que ste sea similar para amboscebadores. La temperatura de hibridacin de loscebadores al molde se ajusta para que sea, cuandomucho, 5C menor que la temperatura calculadasegn la frmula arriba citada.

Enzima

Slo pueden utilizarse polimerasas que sean capa-ces de actuar a las altas temperaturas empleadasen la reaccin. En la actualidad la mayora de laspolimerasas que se suministran comercialmente sonversiones recombinantes e incluso mejoradas poringeniera gentica.18

Dos enzimas de uso muy extendido son la ADNpolimerasa Taq, proveniente de la bacteriatermoflica Thermus aquaticus6 y la Vent de la bac-teria Thermococcus litoralis.19 Sus temperaturas p-timas de catlisis oscilan alrededor de los 72C, tem-peratura a la cual incorporan aproximadamente 100nucletidos por segundo, siendo estables a altas tem-



peraturas, incluso por encima de 92C.De las dos enzimas sealadas, la popularidad

alcanzada por la Taq rebasa por mucho y en dife-rentes aspectos a otras polimerasas. Esta enzima esuna protena que consta de una sola cadenapolipeptdica con un peso molecular de aproxima-damente 95 kDa, cuenta con actividad de exonu-cleasa 53.20 Y su fidelidad de replicacin de-pende de la concentracin del in Mg+2 y de losdNTPs, as como del que exista o no balance en laconcentracin de estos ltimos.

Existen otras enzimas que se usan tambin apar-te de la Taq y la Vent, en donde se requiere activi-dad correctora para mayor fidelidad de copiado,como la Pfu, extrada originalmente de Pyrococcusfuriosus21 o UlTma, proveniente de Thermotogamaritima,22 o bien, que tienen tambin en determi-nadas condiciones actividad de reverso transcriptasa,lo que les permite catalizar tanto una transcripcinreversa (conversin de ARN a ADN), como la pro-pia PCR, como es el caso de la enzima de Thermusthermophilus, ya fabricada por ingeniera gentica ysimplemente conocida como rTth.23,24

ADN

La cantidad de ADN molde puede ser de tan slo 1 ngen el caso de material gentico clonado (en virus oplsmidos), o de un mnimo de 20 ng, cuando seutiliza ADN genmico proveniente de clulaseucariotas. De hecho, como se ha mencionado arri-ba, el molde puede ser tambin ARN que sea pre-viamente transformado en ADNc mediante transcrip-cin reversa. Hay muchas formas posibles de pre-parar el molde para PCR.

En general, no es necesario purificar el molde,porque la reaccin puede tolerar la presencia deimpurezas, pero hay que tener mucho cuidado deeliminar, lo ms posible, la presencia de inhibidoresde la polimerasa, sobre todo en las muestras clni-cas. Si el material son suspensiones celulares, pue-de ser suficiente con romper las clulas por calor.

Pero para la mayora de las muestras clnicas esnecesario realizar un procedimiento de extraccincon fenol-cloroformo y posteriormente precipitacinde cidos nucleicos con isopropanol o etanol.

Agua

El agua se usa como solvente del resto de los ingre-dientes y se requiere al menos destilada.

Las etapas de un ciclo de reaccin

Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclode la PCR. A stos comnmente se les refiere comodesnaturalizacin, alineamiento y extensin. Si detrabajar con ADN genmico se trata, regularmentese agrega una etapa previa de desnaturalizacin a94C, para relajar las posibles estructuras secunda-rias y de otros tipos. Despus de concluida sta, serepiten los diferentes ciclos en los que tanto la tem-peratura como el tiempo sern especficos del pro-ducto a amplificar y del origen del cido nucleicoque servir, como ya se mencion, de plantilla omolde a copiar por la polimerasa utilizada.25

Desnaturalizacin

El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN desimple cadena que acta como molde para la snte-sis de su nueva cadena complementaria. Medianteun calentamiento a 94C, el ADN de doble cadenalogra que sus cadenas se separen o desnaturalicen(figura 6).

Fig. 6. Desnaturalizacin del ADN. Los puentes se rompendejando al ADN en forma de cadena sencilla, permitiendoas exponer las diferentes bases nitrogenadas para la hibri-dacin con los oligonucletidos cebadores.

sta es una etapa crtica, ya que es muy impor-tante que el ADN molde se desnaturalice completa-mente, lo que se consigue a temperaturas de 94C,durante por lo menos un minuto. Si la muestra tienealto contenido de G+C, se recomienda aumentarde preferencia el tiempo.

Sin embargo, hay que tener en cuenta que laactividad de la enzima decrece de manera muy r-pida a partir de los 95C (vida media a 92.5C =2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.), por loque a estas temperaturas o superiores es aconseja-ble disminuir el tiempo de incubacin. En la prcti-ca se suele empezar con un perodo de desnaturali-zacin prolongado (cinco minutos a 94C), para ase-gurarse que la desnaturalizacin se lleve a cabo alo largo de toda la molcula del ADN.2




Fig. 7. Inicio de la reaccin de la PCR. Los cebadores com-plementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazanformando puentes de hidrgeno. De esta manera la poli-merasa puede comenzar a extenderlos para copiar ambashebras molde.

Fig. 8. Progreso de la reaccin de la PCR. A la temperaturaptima de la ADN Polimerasa Taq (72C), la enzima agre-ga los dNTPs a partir del 5 hacia el extremo 3.

Fig. 9. Conclusin de la PCR. Tericamente entre ms ci-clos de reaccin integren el programa de amplificacin, msproductos idnticos se generarn. Pero al aumentar los ci-clos tambin se aumenta proporcionalmente la posibilidadde agregar errores en las nuevas secuencias.

Alineamiento

La enzima, como todas las ADN polimerasas, nece-sita del grupo OH- libre en el extremo 3 del inicia-dor ya apareado al sitio blanco de la amplificacin,a partir de donde iniciar la sntesis. Este punto cons-tituye el sitio de crecimiento de la cadena comple-mentaria al molde.

Mientras que un cebador (referido como el 5 osentido) es complementario a la secuencia del ex-tremo 5 de la regin del ADN molde a amplificar,el otro es al extremo 3 de la misma, pero en lacadena opuesta (figura 7).

El alineamiento especfico de ambos cebadoresse produce a una temperatura determinada por com-posicin de bases y oscila entre 40 y 72C. Ambascadenas originales del ADN sirven simultneamentecomo moldes para sintetizar sus respectivas cade-nas complementarias nuevas.

Un aumento de temperatura favorece la especi-ficidad, ya que disminuye las uniones incorrectas delos cebadores con sitios apcrifos del ADN molde.2

Extensin

Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto enlos sitios donde los iniciadores se aparean, la poli-merasa empieza a copiar la hebra, incorporandodesoxirribonuclesidos monofosfatos en direccin53 (figura 8). Esta etapa debe realizarse a unatemperatura alta, que es la que coincide con lamxima actividad de la polimerasa (72C) para evi-tar alineamientos inespecficos de los iniciadores.

El tiempo de extensin depende del tamao dela amplificacin, debiendo estimar 1 min. para alar-gar 1000 nucletidos. Es comn que al finalizar to-

dos los ciclos se realice un ltimo alargamiento por5 min. a 72C, para asegurarse que todos los pro-ductos de amplificacin estn completamente ter-minados y tengan, por ende, exactamente la mismalongitud.2

Naturaleza exponencial de los ciclos

Al final del primer ciclo, ambas hebras de una mo-lcula bicatenaria de ADN a las que se les hayanapareado los iniciadores han sido copiadas paragenerar dos nuevas cadenas bicatenarias (figura 9).

Cuando se repite por segunda ocasin el ciclode tres pasos, las dos molculas del primer ciclo secopian para producir ahora cuatro molculas. Eltercer ciclo genera ocho molculas.

En teora, 20 ciclos producirn aproximadamen-te un milln de copias de la molcula molde de ADN,y 30 ciclos generarn alrededor de mil millones decopias de sta.

Pero en la prctica, el proceso no es tan eficien-te. El nmero de ciclos que se utiliza adquiere granrelevancia a la hora de optimizar una PCR. Este n-mero depende de la cantidad de ADN que existe en


la muestra una vez que el resto de factores han sidooptimizados (normalmente de manera emprica).

Es importante evitar un nmero alto de ciclos, yaque pueden dar lugar a la amplificacin de produc-tos no deseados originados por hibridaciones ines-pecficas.

Hay que tener en cuenta que la enzima sufre elefecto meseta que describe la atenuacin en la tasade la acumulacin del producto, reflejndose estoen que despus de un nmero determinado de ci-clos la amplificacin deja de comportarse de mane-ra exponencial, volvindose aritmtica, y finalmentellega a una fase estacionaria. Afortunadamente,cuando el efecto meseta se presenta, la cantidad deADN sintetizado es suficiente para su posterior utili-zacin.26,27

Evolucin de la tcnica

La tecnologa de la PCR est experimentando conti-nuas mejoras.28,29 Por ejemplo, y como ya se hizoreferencia arriba, ahora es posible util izareficientemente el ARN como substrato, ya que la ADNpolimerasa rTth tambin posee actividad de retro-transcriptasa, y, por ende, convierte el ARN a ADNc,y acto seguido lo amplifica.23

Como se ha mencionado anteriormente, el ADNblanco que se va a amplificar suele tener una longi-tud mxima a las 3000 bases. Pues bien, ya es co-mn emplear la tcnica de PCR larga, capaz deamplificar secuencias de hasta 40,000 bases de lon-gitud, lo cual facilita el desarrollo de proyectosgenmicos.30,31

Otro claro ejemplo de la sofisticacin de estareaccin es su versin en tiempo real, que permitecuantificar con una alta confiabilidad la concentra-cin de hasta mltiples substratos presentes de unareaccin, en virtud de que cada cadena copiadagenera una seal fluorescente de longitud de ondadistinta que es medida al instante por el mismotermociclador de tiempo real.32

Aplicaciones

Las aplicaciones de la PCR son mltiples, abarcandodesde la evolucin hasta la clnica, pasando por lagentica, la biologa molecular y la biotecnologa;amn de aplicaciones en la agricultura y la ganadera.

La PCR es especialmente til en la deteccin deenfermedades genticas tales como la fibrosisquistica,33 la hemofilia clsica34 y las distrofias mus-

culares Duchenne/Becker.35

Esta tcnica ha tenido un impacto maysculo enla medicina forense, campo en el que se est utili-zando en investigacin criminal como parte de latecnologa de la huella digital del ADN. Gracias asu aplicacin, es posible excluir o incriminar a sos-pechosos utilizando muestras extremadamente pe-queas de material biolgico encontrado en la es-cena del crimen.36

En microbiologa, la PCR permite identificar alagente infeccioso independientemente de su respues-ta serolgica, lo que representa una gran ventajaen casos donde los anticuerpos aparecen luego deun largo perodo de infeccin y a veces en formaimpredecible. Tambin en aquellos numerosos ca-sos donde se quiere distinguir si la presencia de an-ticuerpos es seal de infeccin antigua o activa,como ocurre ante el hallazgo de anticuerpos contrael virus de la hepatitis C, y la necesidad de precisarsi el virus est presente o no.37

Tambin es de gran utilidad en el diagnstico deenfermedades virales neonatales, donde el diagns-tico serolgico de la infeccin es generalmente en-mascarado por la presencia de anticuerpos mater-nos circulantes.38

Otra de sus aplicaciones es en el estudio del com-plejo mayor de histocompatibilidad que determinalos antgenos conocidos como molculas HLA declase II, que son las que establecen la compatibili-dad en transplante de rganos.39

La PCR permite estudiar no slo organismos vi-vos, sino tambin sus restos fsiles, congelados omomificados. Incluso se puede partir de ADN deespecies diferentes, y mediante el empleo de inicia-dores consenso lograr la amplificacin de secuen-cias gnicas de una especie cuya secuencia del gende inters es an desconocida.40

Tambin puede servir para medir la expresin deun determinado gen. Para ello se extrae ARN men-sajero, se le practica una retrotranscripcin con laque se obtiene un ADNc, y ste se utiliza como ma-terial de partida para la amplificacin. Al partir deARNm en vez de ADN genmico, se est estimandola expresin de un determinado gen que incluso pudellegar a realizarse de una manera semicuantitativa.41

Diagnstico de enfermedadeshereditarias

Un fragmento obtenido por PCR puede ser utilizadodirectamente para clonacin, para ser secuenciado,




Fig. 10. Mecanismos para el sexado y seleccin de embrio-nes. Mediante PCR se puede determinar el sexo de un feto eincluso de un embrin incipiente. Modificada de la imagen6-11 de Watson JD y cols.50

o para ser utilizado como sonda en hibridacionesen filtro tipos Southern o Northern.

Tambin mediante una simple electroforesis engel se puede estudiar, a nivel de ADN genmico, laexistencia de deleciones e inserciones en un gendeterminado.42

Enfermedades cuya base es una mutacin pun-tual pueden ser diagnosticadas por PCR, si luego setrata con una enzima de restriccin cuyo sitio se veafectado por dicho cambio puntual en la secuencianucleotdica.43 Incluso, puede estudiarse a los des-cendientes del paciente en cuestin que an no handesarrollado la enfermedad, para ver si han here-dado la mutacin responsable (portadores) de laenfermedad.

Aunque controversial por no disponer de cura,ya es posible estudiar tambin si un determinadogen causante de una enfermedad de la madurez estlatente desde la niez, como en el caso de la coreade Huntington,44 la enfermedad de Alzheimer,45 etc.

Diagnstico de enfermedadesoncolgicas

La PCR permite estudiar alteraciones genticas enproto-oncogenes y en genes supresores de tumoresque estn involucrados en el origen de las neopla-sias.46 El seguimiento de los resultados obtenidoscon un tratamiento puede ser monitoreado median-te la deteccin por PCR de clulas malignas; es po-sible llegar a detectar hasta una clula cancergenaen 106 clulas normales, siendo la sensibilidad al-canzada ms que la de cualquier otra tcnica.47 Estoes ampliamente aplicado en malignidades hemato-poyticas para la deteccin de enfermedad mnimaresidual.48

Diagnstico prenatal

De una pequea cantidad de sangre extrada al fetoo de una biopsia de tejido placentario (vellosidadescorinicas) es posible obtener ADN sobre el cual sepueden practicar estudios como los arriba descri-tos.

En efecto, desde hace ms de una dcada se havenido analizando el ADN de embriones incipientes(productos de fertilizacin in vitro), regularmente enla etapa de mrula, para el sexado de stos y laseleccin de aquellos que no porten mutaciones deenfermedades que se sabe frecuentemente en lapareja en cuestin (figura 10).49

Este anlisis puede ser de gran vala para el casode trastornos heredados ligados al cromosoma X,donde en los embriones o fetos del sexo femeninose descarta la enfermedad o en el peor de los casosse confirma la condicin de portadora; mientras queen los del sexo masculino se precisa si sern sanos oafectados.51

Actualmente, este tipo de estudios se puede rea-lizar tambin buscando clulas o ADN del feto en lasangre perifrica de la madre, sin la necesidad deintervenir al feto.52,53

Sin embargo, estas aplicaciones prenatales hanresultado polmicas por los posibles riesgos ticos yde discriminacin.

Deteccin de enfermedades infecciosas

Mediante PCR es posible monitorear infeccionesbacterianas54 y virales.55 Los procedimientos conven-cionales de deteccin se basan en la posibilidad decrecer los microorganismos en cultivo o en detectarsu presencia en el paciente mediante anticuerpos.La desventaja de estos mtodos es que pueden tar-dar semanas. La PCR detecta directamente los pa-tgenos tradicionalmente difciles de cultivar, talescomo Chlamidia trachomatis,56 Legionellapneumophila57 y Mycoplasma pneumoniae.58 Ascomo a aquellos que requieren de largos perodospara su cultivo y que se encuentran en muy bajaconcentracin en los lquidos biolgicos, como elcaso del Mycobaterium tuberculosis,59 enfermedad


Fig. 11. Estudios de evolucin. Los fsiles encontrados seconvierten en fuentes de material gentico confiables pararealizar estudios evolutivos a manera molecular.70

en la que muchas veces el tratamiento emprico tie-ne que iniciarse antes del diagnstico definitivo,apoyndose hasta hace poco nicamente en el cua-dro clnico.60

Mediante el PCR es posible amplificar secuen-cias correspondientes al virus o a la bacteria de unamanera especfica y muy sensible, pudiendo llegar adetectar un microbio entre 106 clulas infectadas conagentes infecciosos como el del SIDA,61 hepatitis B,62

tuberculosis,61 herpes,63 brucelosis,64 malaria,65 etc.Dentro del campo del SIDA se est utilizando parael diagnstico prenatal, y para cuantificar la carga yla actividad viral mediante la obtencin de ADNc yamplificacin de secuencias especficas del virus. Estoltimo se utiliza para dar seguimiento del xito delos tratamientos.

Estudios de evolucin molecular

La PCR ha sido utilizada para generar secuenciasde genes a lo largo de la evolucin y establecer elgrado de relacin entre especies y poder construiras rboles filogenticos.66,67 La homologa se midecomparando cambios nucleotdicos en el mismo genentre diferentes especies o por comparacin de ge-nes mitocondriales que no se recombinan durantela meiosis y tienen un alto porcentaje de puntos demutacin. Incluso se pueden estudiar especies ex-tintas o fsiles (se ha logrado amplificar ADN de

hasta millones de aos de antigedad), extrayendoel ADN de piezas que se encuentren en los museos(figura 11). 68

Tambin se han realizado estudios de evolucinentre poblaciones humanas, llegando a la conclu-sin del origen africano de nuestra especie, graciasal estudio del ADN mitocondrial.69

Biotecnologa y ciencias agropecuarias

La PCR tambin ha facilitado la obtencin y, de paso,la modificacin (va oligonucletidos mutagnicos)de secuencias gnicas para su integracin en vecto-res de expresin, dndole mayor versatilidad a lastcnicas de ingeniera gentica que han hecho posi-ble la biotecnologa moderna.71 Igualmente, es labase de mtodos para diferenciar variedades vege-tales, as como para identificar si un organismo, yasea animal o vegetal, corresponde a uno gentica-mente modificado.72

Pero quiz el mayor impacto en las cienciasagropecuarias se ha dado en el campo diagnsti-co, donde la PCR es la base de innumerables mto-dos de deteccin de plagas73 y parsitos.74

Finalmente, tambin se ha visto cmo en aosrecientes, mtodos de PCR para determinar la huellagentica en humanos, son ahora aplicados conxito en el ganado.75

Recomendaciones

Hasta aqu todo parece un camino sin obstculoalguno, en el que la PCR ha podido sustituir a mu-chas tcnicas dando mayor especificidad y sensibili-dad. Pero precisamente esto ltimo es su principalproblema. Su gran sensibilidad se ha vuelto en sucontra, pues, por pequea que sea la menor conta-minacin de la muestra inicial, puede tener seriasconsecuencias. Si el ADN de partida se contamina,se amplificarn tambin estas contaminaciones. Unafuente de contaminacin importante puede ser elADN del propio operario o el disperso en el am-biente. As, se han dado casos en ensayos de anli-sis de sexo en que el propio operario varn ha con-taminado la muestra o en anlisis de fsiles dondeha aparecido ADN humano; lo mismo en anlisisforenses donde la muestra se ha contaminado. Perola principal fuente de contaminacin son los pro-pios productos de reacciones anteriores: cualquierfragmento amplificado puede contaminar nuevasmuestras y ser de nuevo amplificado. Para intentar




evitar estos falsos positivos, siempre deben tenerseen cuenta las siguientes normas: deben separarseen el espacio y en el tiempo las etapas de preampli-ficacin y amplificacin; siempre deben utilizarsetestigos negativos, donde en lugar de poner ADN sesubstituya su volumen por agua. Adems, las mues-tras deben ser analizadas -por lo menos- por dupli-cado. Jams deben almacenarse productos de PCRscon muestras biolgicas que servirn de substratoso de reactivos. Igualmente, se recomienda no usarun alto nmero de ciclos, ya que la tasa de error esproporcional al nmero de stos.76

Los anteriores riesgos y limitaciones son el ver-dadero problema que ha impedido que la PCR sehaya popularizado an ms, despus de todos es-tos aos, como la tcnica nica para muchas prue-bas de diagnstico. Hoy por hoy existe la alta posi-bilidad de falsos positivos.

Como se puede apreciar, las aplicaciones de estanovedosa tcnica parecen no tener lmites, pues enesencia el proceso permite, como se ha dicho, en-contrar una aguja en un pajar, al generar un segun-do pajar lleno de copias de dicha aguja.

Resumen

La PCR, tcnica inventada por Kary B. Mullis en1983, emplea un par de oligonucletidos para de-limitar una regin de inters y una polimerasa paraextenderlos, utilizando ambas hebras del gen encuestin como plantilla. Al repetir este ciclo dece-nas de veces, se duplica cada vez el fragmento deADN en cuestin. As se logra copiar millones deveces la secuencia de inters, aunque se encuentreentre millones de otras secuencias de ADN.A 20 aos de su invencin, la PCR se cataloga comola estrella de las herramientas de la biologa mole-cular. En la actualidad son innumerables las aplica-ciones de su utilizacin en mltiples campos de lasciencias biolgicas, agropecuarias y de la salud.

Palabras clave: Taq ADN polimerasa, Oligonucle-tidos cebadores, PCR, Amplicones.

Abstract

The PCR, a technique invented by Kary B. Mullis in1983, uses a pair of oligonucleotides to flank a generegion of interest and a polymerase to extend them,using both strands of the gene as the template. Byrepeating this cycle dozens of times, the DNA frag-

ment of interest is duplicated even more. Thus, it re-sults in millions of copies of the specific DNA se-quence, even if it is part of a complex DNA mix. 20years after its invention, the PCR is catalogued asthe star tool of molecular biology. In the present time,its application in biological, farming, and health sci-ences are innumerable.

Keywords: Taq DNA polymerase, Oligonucleotideprimers, PCR, Amplicons.

Agradecimientos

La presente revisin se model tomando en cuentaun sinnmero de acertadas opiniones provenientesde amigos y colegas de la ULIEG, as como de losrevisores de la misma, con quienes estamos agra-decidos.

Dedicatoria

Los autores desean dedicar este trabajo al profesorRobert M. Chandler Burns, como un homenaje ps-tumo por sus dos dcadas de innumerables einvaluables revisiones a los manuscritos de la ULIEGpara revistas internacionales.

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La Reaccion en Cadena de La Polimerasa PCR a Dos Decadas de Su Invencion

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