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“La Química Analítica va a ser devorada por la cromatografía”
Gaston Charlot, Químico Francés.
INDICE.
Introducción. 1
Antecedentes. 4
Espectrofotometría UV-vis. 4
Puntos Isosbésticos 7
Fuerza iónica. 8
Electroforesis. 9
Electroforesis capilar. 10
Flujo electroosmótico. 10
Capilar. 12
Introducción de la muestra (método de inyección por presión). 12
Detección por absorción. 12
Electroforesis Capilar de Zona. 13
Aspectos teóricos a considerar. 14
Absorbancia. 15
Movilidad electroforética. 15
Descripción del programa computacional SQUAD. 16
Parte experimental. 18
UV-vis (T= 310.15K y I= 0.15M) 18
CZE (T= 298.15K y I= Variable) 20
Resultados. 23
Estabilidad. 23
Determinación de los pKa’s por UV-vis. 27
Determinación de los pKa’s por CZE. 30
Conclusiones. 33
Bibliografía. 34
1
Introducción.
La hipertensión arterial y los problemas cardiovasculares representan un
gran riesgo para la salud a nivel mundial. Se trata de una enfermedad silenciosa la
cual afecta a diferentes órganos del cuerpo humano debido a los efectos directos
de la presión alta sobre estos. Los casos que se diagnostican a tiempo son pocos
comparados con los que no son controlados, de aquí el hecho de que se trate de
un problema el cual es de gran preocupación en todo el planeta.
La hipertensión se debe en gran parte a factores hereditarios, pero también a
malos hábitos en la vida diaria de los que la padecen como son el tabaquismo, el
alcoholismo, una mala alimentación, etcétera; a trastornos de la salud como la
obesidad y la diabetes y en ocasiones a problemas emocionales.
En la actualidad existe un gran número de medicamentos antihipertensivos,
como lo son los diuréticos por ejemplo, desgraciadamente estos presentan efectos
secundarios que resultan contraproducentes para los pacientes a los que le es
administrado el medicamento, por lo que es de gran importancia el diseño y
estudio de nuevos fármacos que tengan menos efectos adversos [1,2].
La Changrolina (figura 1), un derivado de una planta medicinal china (Dichroa
fedrifuga), es ampliamente utilizado como medicamento antiarrítmico en China y
estudios clínicos han demostrado que es de gran ayuda en enfermedades de las
arterias coronarias y en enfermedades del miocardio. Investigaciones han
demostrado que al cambiar la estructura de la Changrolina se pueden obtener
moléculas con propiedades similares a ésta, por ejemplo se pueden intercambiar
los anillos de pirrolidina por anillos de morfolina, piperidina o tiomorfolina [3,4].
2
HN
N
N
N
N
OH
Figura 1. Estructura de la Changrolina, la parte del recuadro es una de las que se ha modificado para
dar lugar a nuevas moléculas con propiedades parecidas a las de ésta.
En el Laboratorio de Química Medicinal de la FES Cuatitlan de la Universidad
Nacional Autónoma de México, dirigido por el Dr. Enrique Ángeles Anguiano, se
dieron a la tarea de sintetizar una gran variedad de moléculas las cuales
presentan propiedades muy parecidas a las de la Changrolina. Se pretende que
estas nuevas moléculas presenten propiedades antihipertensivas o antiarrítmicas,
esperando que tengan menos efectos secundarios [5,6].
Por otra parte, un fármaco debe atravesar una serie de barreras (membranas
celulares) para que pueda acceder al sitio en el que el efecto ha de ser realizado,
así como también para que pueda llegar a producirse posteriormente su
eliminación. En el caso de los fármacos que tienen propiedades ácido-base
pueden presentar formas cargadas o no, dependiendo del pH, y son las formas no
ionizadas las que tienen mayor capacidad de atravesar las membranas celulares.
El pKa (entre otras propiedades fisicoquímicas) se ha convertido en un parámetro
de gran importancia para el desarrollo de nuevos fármacos ya que como se
menciona anteriormente es indispensable para que sean transportados a través de
las células [7,8].
3
En este trabajo se calcularon las constantes de acidez (valores de pKa) para
uno de los compuestos obtenidos en el Laboratorio de Química Medicinal de la
FES Cuatitlan el cual tiene por nombre 4-terbutil-2,6-bis(morfolin-4-ilmetil)fenol y
cuya fórmula desarrollada se presenta en la figura 2. El estudio se realizó por
medio de dos métodos: Espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-vis) y
Electroforesis Capilar de Zona (CZE por sus siglas en inglés).
N
O
N
O
OH
Figura 2. Estructura del compuesto 4-terbutil-2,6-bis(morfolin-4-ilmetil)fenol.
4
Antecedentes.
Espectrofotometría UV-vis.
La espectrofotometría de absorción fue uno de los primeros métodos físicos
que se aplicó al análisis cuantitativo y la determinación de estructuras, La
espectrofotometría UV-vis supera en costo y sencillez al resto de métodos ópticos
de análisis cuantitativo y es también una técnica auxiliar útil para la elucidación de
estructuras.
La región del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta próximo o cercano
(que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagnético) y el ultravioleta
lejano o de vacío (10 a 200 nm). Este último presenta el inconveniente de que el
oxígeno atmosférico absorbe en esa región y por ello no es considerado en el
análisis por espectrofotometría UV-vis. La división entre las regiones ultravioleta
próximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que el ojo
humano sólo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm [9].
Cuando una onda electromagnética de cierta longitud de onda incide sobre
una sustancia, la fracción de la radiación absorbida es función de la concentración
de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la muestra, que
también se llama longitud de paso óptico. La compensación de la reflexión y la
absorción en la ventana puede evitarse definiendo 0 como el poder de radiación
que pasa a través de una muestra testigo (blanco) contenida en la misma celda de
la muestra. La transmitancia T se define como la relación de las intensidades de la
radiación no absorbida, , y de la radiación incidente. De esta forma:
La absorbancia (A) es el logaritmo del recíproco de la transmitancia.
5
Si el porcentaje de T es 100T; el porcentaje de absorción será 100(1-T).
Las aplicaciones analíticas del comportamiento de absorción de las
sustancias pueden ser cualitativas o cuantitativas, como antes se ha mencionado.
Las primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular sólo
absorbe luz en regiones específicas del espectro y en grado variable,
característicos de dicha especie, al resultado se le llama espectro de absorción de
esa especie molecular y es una huella dactilar para propósitos de identificación.
Las aplicaciones cuantitativas dependen de la relación entra la absorbancia y la
concentración de la solución.
A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una especie
absorbente, el grado de absorción con respecto a la distancia atravesada es
directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones . La
reducción de la intensidad en la trayectoria x, -d, puede escribirse
matemáticamente de la forma siguiente.
Donde k es una contante de proporcionalidad característica de la naturaleza
de la especie absorbente y de la energía de los fotones, e representa el poder de
la radiación a cualquier distancia x en el medio absorbente. Reordenando la
ecuación anterior.
Este es el enunciado matemático de que la fracción del poder de radiación
absorbido es proporcional al espesor atravesado. Si ahora se estipula que 0 es el
poder de radiación a x=0, y que representa el poder de la radiación transmitida
que emerge del medio absorbente a x = l. La ecuación puede integrarse con
respecto al total del trayecto de la radiación.
dIkI
dx
(ln )
dId I kdx
I
6
Ésta es la ecuación de Lambert la cual indica que, para una cierta
concentración de sustancia absorbente, la intensidad de la luz transmitida
disminuye logarítmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en
forma aritmética.
Beer determinó que, al aumentar la concentración del absorbente, se
producía el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del trayecto
de absorción de la radiación. De esta forma, la constante de proporcionalidad k es,
a su vez, proporcional a la concentración de la sustancia que absorbe.
Por lo tanto la forma combinada de la ley es:
Donde a incorpora el factor de conversión del logaritmo base 10 a logaritmo
natural. Esta expresión es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir como
Donde es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm-1 mol-1,
l es la longitud del paso óptico (longitud de la celda) y C es la concentración de la
sustancia absorbente en unidades de mol L-1 [10].
0
(ln )
o
I
I
d I k dx
ln ln ln o
o
II I k
I
log oI
a CI
A C
7
Figura 3. Absorción de radiación.
Punto Isosbéstico.
En la mayoría de los casos durante la duración de una reacción química, una
especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y (en el caso que
sólo estén involucradas 2, para los casos en donde hay más especies se aplica el
mismo concepto). Si los espectros de los componentes puros X e Y se cruzan a
una longitud de onda, cualquier espectro registrado durante la reacción química
pasará por ese mismo punto, este punto se conoce como punto isosbéstico, este
es una buena prueba de que existe más de una especie. En la figura 5 se muestra
un ejemplo de los espectros de absorción que corresponde al verde de
bromocresol (figura 4), se puede observar que hay una longitud de onda en que
los tres espectros se cortan, este es el punto isosbéstico y corresponde a la
longitud de onda en que las dos formas tienen la misma absortividad [11].
Figura 4. Espectros de absorción del verde de bromocresol a diferentes valores de pH, donde se
observa el cambio de una especie a otra dejando en evidencia el punto isosbéstico.
l
8
Figura 5. Estructura del verde de bromocresol en equilibrio ácido-base.
Fuerza Iónica ()
Los equilibrios en que participan especies iónicas son afectados por la
presencia de todos los iones en solución. La fuerza iónica es una medida de la
concentración total de los iones en la solución. Cuanto más cargado está un ion
contribuye más a y ésta se define como (para n iones en la solución):
Donde:
ci = concentración molar de la especie i.
zi = carga de la especie i.
Una característica fundamental de la sal que se adiciona para imponer la
fuerza iónica es que no debe de reaccionar con las especies involucradas en el
equilibrio químico que se está estudiando.
9
Para electrolitos de estequiometría 1:1 la fuerza iónica es igual a la molaridad
del electrolito en la solución. Para otras estequiometrías la fuerza iónica será
mayor a la molaridad [12].
Electroforesis.
La electroforesis es un método de separación que se basa en la diferente
velocidad de migración de especies cargadas dentro de un campo eléctrico de
corriente directa. En macroescala se aplica a una diversidad de problemas de
separación analítica difíciles: aniones y cationes inorgánicos, aminoácidos,
catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteínas, ácidos
nucleicos, nucleótidos, polinucleótidos y otras numerosas especies.
Una separación electroforética se lleva a cabo mediante la inyección de una
pequeña banda de la muestra en la solución amortiguadora alojada en un tubo
estrecho o en un medio poroso y plano. Se aplica un alto voltaje a lo largo de la
solución amortiguadora mediante dos electrodos ubicados en los extremos. El
campo impulsa los iones de la muestra a emigrar hacia uno u otro de los
electrodos. La velocidad de migración de una especie depende de su carga y
también de su tamaño. Por consiguiente, las separaciones se basan en las
diferencias de la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos dentro de la
muestra.
La velocidad de migración de un ion, , en centímetros por segundo, dentro
de un campo eléctrico, es igual al producto de la fuerza del campo eléctrico E
(V cm-1) por la movilidad electroforética e (cm2 V-1 s-1):
A su vez e es directamente proporcional a la carga iónica del analito e
inversamente proporcional a los factores de retardo por fricción. Si dos especies
difieren en la carga o en las fuerzas de fricción, se desplazan por la solución
amortiguadora y se separan entre sí. En el caso de iones del mismo tamaño,
10
cuanto mayores la carga mayor es la fuerza impulsora y habrá una velocidad de
migración más rápida. Para los iones que presentan la misma carga, cuanto
menor sea el ion, más pequeña es la fuerza de fricción y la velocidad de migración
será más rápida.
Electroforesis capilar.
La investigación y aplicación de la electroforesis llevada a cabo en tubos
capilares tuvieron un gran crecimiento en los años ochenta del siglo XX. La
electroforesis capilar produce separaciones de alta velocidad y alta resolución con
muestras extremamente pequeñas.
La velocidad de migración de un ion, , depende de la intensidad del campo
eléctrico aplicado. El campo eléctrico es proporcional a la magnitud del voltaje
aplicado, V, e inversamente proporcional a la longitud, L, sobre la que éste se
aplica, por lo tanto:
Con esta relación se puede observar que si se quiere una separación rápida
deben aplicarse voltajes elevados.
Flujo electroosmótico.
El flujo electroosmótico es una característica única de la electroforesis
capilar. Cuando se aplica un alto voltaje a un capilar de sílice fundida que contiene
una solución amortiguadora, se origina por lo regular el flujo electroosmótico en el
cual el líquido migra hacia el cátodo. La causa de éste se debe a la doble capa
eléctrica que se forma en la interfase sílice-solución como se muestra en la figura
6.
11
Figura 6. Distribución de cargas en la interfase sílice-solución y flujo electroosmótico resultante.
A valores de pH por encima de 3, la pared interna de un capilar de sílice
presenta carga negativa debido a la ionización de los grupos silanol en su
superficie. Los cationes de la solución amortiguadora se agrupan sobre la doble
capa eléctrica adyacente a la superficie negativa del capilar. Los cationes situados
en la capa exterior difusa de la doble capa son atraídos hacia el cátodo o electrodo
negativo, y dado que los cationes están solvatados arrastran entonces al solvente
con ellos.
Por lo general la velocidad del flujo electroosmótico es mayor que la
velocidad de migración electroforética de los iones individuales y llega a hacer, en
la práctica, el mecanismo de bombeo de la fase móvil en la electroforesis capilar.
La velocidad del flujo electroosmótico se expresa mediante la siguiente
ecuación.
En presencia de la electroósmosis, la velocidad de un ion es la suma de su
velocidad de migración y la velocidad del flujo electroosmótico.
El tiempo de migración tm en la electroforesis capilar es el tiempo que tarda
un soluto para migrar desde el punto en que es introducido hasta el detector. Si se
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utiliza un capilar de longitud total L y la longitud el detector es l, el tiempo de
migración es.
Debido a la importancia del flujo electroosmótico, se debe poner un marcador
del mismo; es decir, una sustancia que permita medir su velocidad. Para esto se
pide que dicha sustancia sea neutra a cualquier valor de pH y de preferencia que
tenga un coeficiente de absortividad lo suficientemente grande, de manera que
sea detectable a una cantidad mínima, esto con el fin de que dicha sustancia sólo
sirva para medir el valor de la velocidad del flujo electroosmótico y no sea
necesariamente parte del sistema en estudio.
Capilar.
Se trata de un capilar de sílice fundida, que casi siempre tienen de 10 a 100
m de diámetro interno y de 30 a 100 cm de longitud y está lleno de con una
solución amortiguadora. Conecta entre sí dos recipientes que contienen la misma
solución amortiguadora y también dos electrodos de Pt. Las paredes exteriores del
capilar están casi siempre recubiertas en el exterior con poliimida, por razones de
durabilidad, flexibilidad y estabilidad. La muestra se introduce por una de los
extremos del capilar y la detección se efectúa en el otro extremo.
Introducción de la muestra (Método de inyección por presión).
El extremo del capilar por donde se introduce la muestra se coloca de
manera momentánea en un pequeño recipiente que la contiene y se utiliza una
diferencia de presión para conducirla al interior del capilar. Esta diferencia de
presión se origina al aplicar vacio en el extremo del detector, al aplicar presión en
el recipiente que contiene la muestra o bien, elevando el extremo que contiene la
muestra (inyección hidrodinámica). El volumen se controla mediante la duración
de la inyección, los volúmenes de inyección más usuales están comprendidos
entre 5 y 50 nL. Para una solución amortiguadora de densidad y viscosidad
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similares a las del agua, una diferencia de altura de 5 cm durante 10 s inyecta
aproximadamente 6 nL en un capilar cuyo diámetro interno es de 75 m.
Detección por absorción.
Los detectores de fluorescencia y absorción se usan ampliamente en
electroforesis capilar, aunque los últimos son más comunes debido a que su
campo de aplicación es mayor. Para que el volumen de detección se mantenga
dentro del orden de magnitud de los nanolitros o menos, la detección se lleva a
cabo en la columna. Para ello se elimina la poliimida de la parte externa de una
pequeña sección del capilar mediante combustión o con ácido. La longitud de la
trayectoria para tales mediciones no es mayor que 50 a 100 m, lo cual restringe
los límites de detección en términos de la concentración.
Electroforesis capilar de zona.
En la electroforesis capilar de zona (CZE) la composición de la solución
amortiguadora es constante en toda la zona de separación. El campo aplicado
hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según
su propia movilidad y se separen en zonas que pueden estar definidas por
completo o parcialmente traslapadas. Entre las zonas resueltas del todo ay
huecos ocupados por la solución amortiguadora como se muestra en la figura 7.
Figura 7. En la electroforesis capilar de zona, los iones se separan en las zonas 1, 2, y 3. Las zonas
mostradas están resueltas por completo con solución amortiguadora entre cada una de ellas.
Mediante la CZE es posible separar y analizar una gran variedad de
moléculas pequeñas, como herbicidas, plaguicidas y fármacos, siempre que sean
iones o que puedan producirlos.
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La CZE se caracteriza por la migración de la muestra en un electrolito
soporte, el cual conduce prácticamente toda la corriente. La composición del
electrolito se mantiene constante a lo largo de la ruta de migración y no cambia
con el tiempo la conductividad del electrolito dentro del capilar es prácticamente
constante antes y durante el proceso de separación y cualquier desviación de la
conductividad en las posiciones de las zonas de migración es despreciable.
Obviamente la intensidad del campo eléctrico también es constante a lo largo del
capilar. La separación se lleva a cabo de tal manera que los analitos contenidos
en la muestra (la cual se introduce en un extremo del capilar), después de sentir la
presencia del campo eléctrico aplicado comienzan a migrar, separándose debido a
la diferencia en sus movilidades [11, 13].
Aspectos teóricos a considerar.
Si todas las especies involucradas están relacionadas por un equilibrio
químico rápido, o un intercambio cinético, la respuesta total es una media
ponderada por la contribución de todas las especies presentes en el sistema y
dicha ponderación está dada por una fracción de las especies. En este caso el
compuesto tiene comportamiento ácido-base; consideremos un equilibrio de la
siguiente forma:
De donde se obtienen las fracciones molares para cada especie, de acuerdo
a:
Donde L’ representa la suma de las concentraciones de las (n+1) especies
del componente L en el sistema.
15
Absorbancia.
Si todas las especies absorben, deben de seguir la ley de la aditividad. Por lo
tanto, la absorbancia del sistema a una determinada longitud de onda (A()) y una
longitud de paso óptico (l) está determinada por las siguientes expresiones.
Como se puede observar, la absorbancia o el coeficiente molar de L’ puede
ser escrito como la media ponderada de las fracciones molares de todas las
especies en el sistema.
Movilidad electroforética.
La movilidad electroforética de una especie cargada está definida por
la siguiente ecuación.
Donde es la carga eléctrica de las especies
, es el
equivalente a la conductividad y F es la constante de Faraday. Ahora, para un
conjunto de especies la movilidad electroforética seguirá la siguiente relación.
Sustituyendo.
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Esta ultima ecuación muestra que la movilidad electroforética de L’ es, igual
que la absorbancia, una media ponderada de las movilidades electroforéticas de
las especies.
Ahora, si las conductividades equivalentes de cada especie son parecidas se
tienen las siguientes expresiones.
Esta relación presenta la movilidad electroforética de L como una media cuya
ponderación está dada por la carga eléctrica de la fracción de las especies y
además nos dice que es directamente proporcional al promedio de la carga
eléctrica [14].
Descripción del Programa SQUAD.
SQUAD (Stability QUotients from Absorbance Data) es un programa
computacional escrito en lenguaje FORTRAN escrito por David J. Leggett. Este
programa está diseñado para refinar constantes de equilibrio a partir de un modelo
químico propuesto, empleando una regresión de mínimos cuadrados no lineal, a
partir de datos de absorbancia obtenidos al ser variadas las longitudes de onda y
el pH de un sistema en solución acuosa.
Para cada valor de absorbancia Ai,k se aplica la siguiente ecuación.
Donde [especies]i,j es la concentración de la especie j-ésima en la solución i-
ésima (espectro) y εj,k es la absortividad molar de la j-ésima especie en la k-ésima
longitud de onda.
17
El modelo químico propuesto puede depender o no del pH y el refinamiento
de las constantes se realiza por medio de una minimización de la suma de los
residuos entre los valores experimentales de absorbancia y los valores calculados
por SQUAD como se muestra en la siguiente expresión:
Dónde:
I= todas las soluciones.
K = todas las longitudes de onda.
= Absorbancia calculada por SQUAD en la i-ésima solución a la késima
longitud de onda.
= Absorbancia experimental en la i-ésima solución a la k-ésima longitud de
onda.
Para conocer los valores de absorbancia SQUAD necesita resolver la
ecuación de Beer; además propone los coeficientes de absortividad molar por
especie y determina la concentración de cada una empleando el algoritmo de
Newton-Raphson. La convergencia se da si la diferencia en la minimización de un
ciclo iterativo a otro difiere como máximo 0.1%. Que el criterio anterior se cumpla
no significa que se tiene el mejor refinamiento de constantes, debido a que se
puede caer en el caso de una convergencia en un mínimo local.
SQUAD calcula un número de parámetros estadísticos que permite validar el
modelo propuesto para el refinamiento. El parámetro de correlación; la desviación
estándar sobre los datos de absorbancia (σdatos), la desviación estándar sobre la
constante (σconst); la desviación estándar total sobre las constantes (σtot), la suma
de cuadrados de las absorbancias calculadas (U) y la desviación estándar sobre
los coeficientes de absortividad molar (σcoef), son parámetros estadísticos que
SQUAD muestra en el archivo de salida [15].
18
Parte experimental.
Todas las soluciones fueron preparadas con agua desionizada, con
resistividad de 18.2 Mcm, obtenida con un equipo Millipore Milli-Q Gradient y
todos los reactivos fueron de grado reactivo, el compuesto estudiado fue
sintetizado en el Laboratorio de Química Medicinal de la FES-Cuautitlán, UNAM.
UV-vis (T=310.15K y I=0.15M).
Reactivos.
Nitrógeno molecular.
NaOH.
HCl.
NaCl.
Agua desionizada.
Equipos.
Potenciómetro TACUSSEL LPH430T.
Electrodo combinado de Ag/AgCl.
Celda de doble camisa.
Baño termostatado digital LAUDA E200.
Espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 900.
Estabilidad.
Se pesaron 4.25mg de compuesto y se colocaron en un matraz volumétrico
de 10mL, para esto se colocó previamente en el matraz 1.0mL de una solución de
ácido clorhídrico 0.1M, esto para obtener un pH de aproximadamente 2, y se llevó
19
al aforo hasta la marca con agua desionizada; esta solución se rotuló como SAP y
el compuesto se encuentra a una concentración de 1.22x10-3M. De la solución
anterior se tomaron 2.0mL y se depositaron en un matraz volumétrico de 5.0mL,
éste contenía 0.7mL de una solución de hidróxido de sodio 0.1M, se llevó al aforo
con agua desionizada y se rotuló como SBP, esta solución tiene una concentración
de 4.88x10-4M. De ambas soluciones se obtuvieron espectros de absorción desde
una longitud de onda de 200nm a 500nm, esto acabando de preparar las
soluciones después cada 10min, luego cada hora y después cada día siguiente
hasta el quinto día.
Se preparó otra solución básica tomando 4.0mL de la solución SAP, se
depositó en un matraz volumétrico de 10.0mL además se agregó 1.5mL de una
solución de NaOH 0.1M y se llevó al aforo con agua desionizada, para ésta se
siguió el mismo procedimiento que para las dos anteriores.
Determinación de los pKa.
Se pesaron 6.32mg del compuesto a estudiar y se disolvieron en la mínima
cantidad de ácido clorhídrico 0.1M, una vez disuelto se colocó en un matraz
volumétrico de 50.0mL y se llevó al aforo con agua desionizada, esta solución se
rotuló como SA1.
De la solución SA1 se tomaron 20.0mL y se depositaron en un matraz
volumétrico de 250.0mL, en este también se colocaron 9.6mL de HCl 0.1M y 2.0g
de NaCl, el matraz se llevó hasta la marca con agua desionizada. Ésta se rotuló
como SA2.
Se tomaron 20.0mL de SA1 y se depositaron en un matraz volumétrico de
250.0mL, en éste también se colocaron 20mL de NaOH 0.1M y 2.0g de NaCl, el
matraz se llevó hasta la marca con agua desionizada. Esta se rotuló como SB.
Se llevo a cabo una valoración ácido–base; se valoró primero la solución SA2
con la SB agregando volúmenes de esta última de tal manera que el pH aumentara
0.2 unidades aproximadamente y hasta llegar a un pH de 7, para cada cambio de
20
pH se tomó el espectro de absorción de la solución (el espectrofotómetro se
calibró con agua desionizada). Lo anterior se realizó bajo una atmósfera de
nitrógeno, esto para que el pH no variara a consecuencia del CO2 del ambiente,
además se impuso la temperatura a 37°C con un baño de agua.
El mismo procedimiento se realizó para la solución SB, valorándola con la
solución SA2 a las mismas condiciones que en el procedimiento anterior.
CZE (T= 298.15K, I= Variable).
Reactivos.
H3PO4 (85.4% J.T.BAKER)
KH2PO4 (100.2% J.T.BAKER)
Na2HPO4 (99.5% J.T BAKER)
Na3PO4 (96% ALDRICH)
NaOH.
HCl.
Acetona
Agua desionizada.
Equipos.
Potenciómetro TACUSSEL LPH430T.
Electrodo combinado de Ag/AgCl.
Beckman Coulter P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System.
21
Determinación de valores pKa
Se prepararon buffers de fosfatos a diferentes valores de pH a concentración
0.05 M, para ello se prepararon soluciones 0.5 M de H3PO4, KH2PO4, Na2HPO4, y
Na3PO4 y de éstas se tomó el volumen necesario para preparar 25mL de buffers a
los diferentes valores de pH deseado, ajustando éste con NaOH o HCl según sea
el caso, por ejemplo para el buffer de pH=7 se tomaron 1533μL de la solución de
KH2PO4 y 967μL de Na2HPO4 y fueron depositados en un matraz volumétrico de
25.0mL aforando éste con agua desionizada.
La solución del fármaco a analizar fue preparada pesando 7.08mg del
compuesto y disolviéndolos en la mínima cantidad de HCl 0.1M para después
llevarlo a aforo en un matraz con capacidad de 25mL.
Se utilizó un capilar de sílice fundida de 50μm de diámetro interno, 50.2cm
de longitud total y 40 cm de longitud del capilar al detector. Al ser nuevo el capilar
se acondicionó lavándolo de la siguiente manera:
5 minutos con H2O a una presión de 30 psi a 25°C.
10 minutos con NaOH 1M a una presión de 30 psi a 25°C.
15 minutos con NaOH 1M a una presión de 30 psi a 40°C.
10 minutos con H2O a una presión de 30 psi a 25°C.
20 minutos con Buffer de pH=7 a una presión de 20 psi a 25°C.
Cada vez que se cambiaba el buffer de trabajo, antes de introducir la
muestra, se hacía la siguiente secuencia de acondicionamiento, lavando a una
temperatura de 25°C:
1 minutos con NaOH 0.1M a una presión de 20 psi.
1 minutos con H2O a una presión de 20 psi.
22
2 minutos con el buffer de trabajo a una presión de 20 psi.
En un vial, figura 8, se colocaron 200μL de la solución a analizar, 1300μL de
Buffer de trabajo y 25μL de acetona, este último se utilizó como marcador de flujo
electroosmótico. La muestra se inyectó al capilar por presión a 1psi por un tiempo
de 5 seg.
Figura 8. Viales utilizados para el equipo de CZE.
La separación se efectuó a 20KV por tiempos que iban desde 5 min para
valores de pH altos y 60min para pH bajos. Lo anterior se siguió para todos los
valores de pH.
Nota: La metodología de la referencia número 16 se utilizó como guía para la
elaboración de la parte experimental.
23
Resultados.
Estabilidad.
Como se puede observar en la figura 2 la molécula podría presentar hasta 3
desprotonaciones y por consecuencia 3 valores de pKa. En la figura 9 se
presentan 3 formas diferentes en las cuales se podría desprotonar la molécula.
Considerando el valor del pKa del fenol (9.95) podemos suponer que la
forma en la que se pierden los hidronios en la molécula es la correspondiente a la
de la figura 9a. Además, la molécula es simétrica y el sustituyente que se
encuentra en la posición para del fenol no es un grupo electroatractor o
electrodonador por lo tanto este no afecta considerablemente el valor del pKa del
fenol.
Se preparó una muestra del fármaco en medio básico y éste se dejó reposar
por un largo tiempo, al pasar aproximadamente 3 semanas se observó que la
solución presentaba una especie de precipitado el cual no estaba presente en los
primeros días en que la solución fue preparada.
Los gráficos 1 y 2 muestran los espectros de las soluciones ácida y básica
con las cuales se pretendía determinar la estabilidad del compuesto. Para la
solución ácida se observa que el cambio en los espectros es casi insignificante,
sin embargo para la solución básica el cambio entre un espectro y el otro es
demasiado notable.
24
Gráfico 1. Espectros del fármaco en medio ácido a diferentes tiempos.
Gráfico 2. Espectros del fármaco en medio básico a diferentes tiempos.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
225 245 265 285 305 325
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
0 min 10 min 20 min 30 min 40 min 60 min
70 min 80 min 90 min 125 min 140 min 170 min
260 min 3 dias 4 dia 5 dias 6 dias
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
245 260 275 290 305 320 335
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
0 min 10 min 20 min 30 min 40 min 60 min
70 min 80 min 90 min 120 min 125 min 130 min
140 min 147 min 160 min 167 min 170 min 174 min
186 min 193 min 265 min 272 min 277 min 3 dias
4 dia 5 dias 6 dias 7 dias
25
N+
O
N
O
OH
H
N
O
N
O
OH
N
O
N
O
O
pKa1 pKa2 pKa3N+
O
N+
O
OH
HH
a)
N+
O
N
O
OH
H
N+
O
N
O
O
N
O
N
O
O
pKa1 pKa2 pKa3N+
O
N+
O
OH
HH H
b)
N+
O
N+
O
O
H
N
O
N+
O
O
N
O
N
O
O
pKa1 pKa2 pKa3N+
O
N+
O
OH
HH H H
c)
Figura 9. Tres diferentes formas de desprotonación para la molécula del fármaco.
26
Debido a las diferencias entre los gráficos anteriores suponemos, que la
variación de los espectros en medio básico depende de la variación del pH ya que
éste se impuso con NaOH y puede reaccionar con el CO2 del ambiente haciendo
que el valor del pH disminuya. Para corroborar lo anterior se repitió la parte básica
pero en este caso se midió el pH, obteniendo el gráfico 3. En este último gráfico
nos damos cuenta de que el pH sí cambia, por lo tanto es el responsable del
cambio de los espectros y este último no se debe a la descomposición química del
fármaco.
Gráfico 3. Espectros en medio básicos con sus respectivos valores de pH.
Cabe mencionar que en los gráficos 2 y 3 se observan 3 puntos isosbésticos,
lo cual deja en evidencia la existencia de al menos de 2 especies que
intercambian protones.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
245 260 275 290 305 320 335
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
11.649 11.637 11.62 11.575 11.561
11.539 11.516 11.488 11.462 11.443
27
Determinación de los valores de pKa por espectrofotometría UV-vis
Los espectros obtenidos de las valoraciones ácido-base se muestran en los
gráficos 4 y 5, en el primero se muestran los espectros de la valoración donde se
comenzó en medio ácido y la 5 cuando se comenzó a valores básicos de pH.
Gráfico 4. Espectros de la valoración empezando en medio ácido para finalizar en medio básico.
Gráfico 5. Espectros de la valoración empezando en medio básico para finalizar en medio ácido.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
210 230 250 270 290 310 330
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
3.678 4.115 4.570 5.047
5.470 5.943 6.531 6.969
0
0.1
0.2
0.3
0.4
210 230 250 270 290 310 330
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
7.067 7.301 7.875 8.300
8.630 10.243 10.692 10.991
28
Utilizando SQUAD se refinaron los espectros experimentales, obteniendo
como resultado los coeficientes de absortividad y los valores de pka de los
equilibrios ácido-base.
Los coeficientes obtenidos se muestran en el gráfico 6 y los valores de los
pKa en la tabla 1.
Gráfico 6. Coeficientes de absortividad obtenidos con SQUAD.
Tabla 1. Valores de pKa obtenidos para el compuesto utilizando SQUAD. También se presentan los valores de la movilidad iónica efectiva.
Equilibrios y especies involucradas. pKa
4.885 ± 0.047
7.035 ± 0.042
11.491 ± 0.047
Con los datos obtenidos con SQUAD se continúo a elaborar los espectros
teóricos comparándolos con los espectros experimentales, obteniendo un buen
0.0E+00
3.0E+03
6.0E+03
9.0E+03
1.2E+04
1.5E+04
220 240 260 280 300 320 340
/ M
-1cm
-1
/ nm
H3L2+
HL
H2L+
L-
29
ajuste para la parte ácida pero no así para la básica. Esto se muestra en el gráfico
7.
Gráfico 7. Espectros de absorción construidos con los datos de SQUAD (marcadores), espectros
experimentales (líneas continuas) para dos valores de pH.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
220 240 260 280 300 320 340
A
B
S
O
R
B
A
N
C
I
A
/ nm
4.069
10.991
4.069
10.991
30
Determinación de los valores de pKa por CZE.
En la siguiente figura se muestran las respuestas obtenidas del equipo de
electroforesis capilar a un pH de 7.502.
Figura 10. Respuesta obtenida con el equipo de electroforesis capilar a un pH de 7.502.
En el recuadro de la figura 10 que está en 3D se observa un par de
respuestas que son más notables que las demás, éstas corresponden al fármaco y
a la acetona, lo que se sabe porque se hicieron pruebas con cada una de ellas por
separado (la de tiempo de migración mayor corresponde al espectro de absorción
de la acetona).
Se tomaron los tiempos del fármaco y de la acetona; se aplicó la siguiente
fórmula para obtener la movilidad efectiva para cada valor de pH [13,15].
1 1ef
m of
lL
V t t
31
Dónde:
μef: Movilidad electroforética efectiva (m2/Vs).
L: Longitud del capilar total (m).
l: longitud del capilar al detector (m).
tm: tiempo de migración del analito (s).
tof: tiempo de migración del flujo electroosmótico (s).
V: Voltaje (V).
El gráfico 8 muestra las movilidades electroforéticas efectivas obtenidas
experimentalmente para diferentes pH del fármaco.
Gráfico 8. Movilidades electroforéticas efectivas del fármaco a diferentes valores de pH.
Los valores de las movilidades electroforéticas efectivas se ajustan muy bien
para un modelo de tres equilibrios ácido-base.
Estas movilidades experimentales se introducen en SQUAD y se obtienen los
valores de tres pKa’s y la movilidad iónica efectiva para cada una de las especies
involucradas en los equilibrios, cabe mencionar que el valor de la movilidad iónica
-1E-08
0
1E-08
2E-08
3E-08
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ef(m
2 V
-1 s
-1)
pH
32
de la especie neutra es igual a cero. Los valores antes mencionados se muestran
en la tabla 2.
Tabla 2. Valores de pKa obtenidos para el compuesto utilizando SQUAD. También se presentan los valores de la movilidad iónica efectiva.
Equilibrios y especies
involucradas.
pKa Movilidad iónica efectiva
(x 10-8) m2V-1s-1
4.268 ± 0.045
7.073 ± 0.035
11.730 ± 0.024
3.007 ± 0.039
1.761 ± 0.035
1.761*
*Este parámetro se mantuvo constante durante el refinamiento.
Con los datos presentados anteriormente se elaboró un ajuste teórico de las
movilidades electroforéticas obteniendo el siguiente gráfico, 9,.
Gráfico 9. Ajuste de la curva de movilidad en función del pH. Los marcadores representan los datos
experimentales y la línea el ajuste hecho con los datos arrojados por SQUAD.
-2E-08
-1E-08
0
1E-08
2E-08
3E-08
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
ef(m
2 V
-1 s
-1)
pH
L-H2L+H3L2+ HL
33
Conclusiones.
Se realizaron pruebas de estabilidad con las cuales se mostró que la
molécula es estable durante un tiempo considerablemente bueno para realizar las
valoraciones
Se determinaron los valores de pKa or medio de las dos técnicas, además se
demostró la existencia de cuatro especies químicas para el compuesto,
comprobando así que el número de valores de pKa a determinar en efecto son
tres. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 3 en manera de
comparación.
Tabla 3. Comparativo de los valores de pKa obtenidos mediante espectroscopia UV-vis y CZE.
Equilibrio pKa UV-vis CZE
pKa1 4.885 ± 0.047 4.268 ± 0.045
pKa2 7.035 ± 0.042 7.073 ± 0.035
pKa3 11.491 ± 0.047 11.730 ± 0.024
Los valores obtenidos por CZE y UV son similares, salvo el valor del pKa1
obtenido por ambos métodos. Hay que señalar que las condiciones para los
experimentos en ambos métodos fueron diferentes.
Al parecer, las primeras dos desprotonaciones ocurren en los átomos de
nitrógeno de la molécula ya que el sustituyente en la posición para del fenol no es
electroatrayente y no afectaría en la distribución de carga en la molécula, lo que
en caso inverso afectaría considerablemente a los valores de pKa.
Por último se determinaron las movilidades electroforéticas efectivas para las
especies ácido-base de la molécula, esto con ayuda de la CZE.
34
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