La Perfusión de Branquias Como Modelo de Valoración de La Calidad de Agua y Su Relación Con La...
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YUNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Veterinaria
Departamento de Produccin Animal
LA PERFUSIN DE BRANQUIAS COMO MODELO DEVALORACIN DE LA CALIDAD DE AGUA YSURELACIN CON LA PRODUCCIN INTENSIVA DETRUCHAS
Jos Antonio Martnez-Pereda Calvo
Madrid, 1996
-
ACTA DEL GRADO DE DOCTORReunido el Tribunal axaminador,
constituido por los miembros que suscri-ben la presente Acttj, el aspirante defen-di su Tesis
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Tesis presentada por Jos Antonio Martnez-Pereda Calvo para optar al grado de Doctor en
Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid.
Esta tesis doctoral ha sido realizada en el Area de Toxicologa del Medio Ambiente de]
Centro de Investigacin en Sanidad Animal del Instituto Nacional de Investigacin y
Tecnologa Agraria y Alimentaria (CISA-INIA), bajo la direccin del Dr. D. Jos Vicente
Tarazona Lafarga
y presentada como tutora por la Dra. D~. Blanca Mas Alvarez
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aMINISTERIO DE AGRICULTURA, PESCA Y ALIMENTACION
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACION Y TECNOLOGA
AGRARIA Y ALIMENTARIACENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL
D. Jos Vicente Tarazona Lafarga, Doctor en Veterinaria por laUniversidad Complutense de Madrid, y Coordinador del Aiea deToxicologa del Medio Ambiente del CISA-INIA
INFORMA
que el trabajo presentado por el Licenciado D. Jos AntonioMartnez-Pereda Calvo para optar al Grado de Doctor enVeterinaria, titulado La perfusin de branquias como modelo devaloracin de la calidad del agua y su relacin con la produccinintensiva de truchas ha sido realizado bajo mi direccin, eneste Aiea de Toxicologa del Medio Ambiente, y que lo consideroperfectamente apto para su exposicin y defensa.
Valdeolmos a 15 de Abril de 1996
FdO: Dr. Jos V. Tarazona Lafarga
28130 VALDEOLMOS - MADRID - Tei(91)202300 - FAXf91)~202247
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INDICE
1. INTRODUCCION
1.11. Acuicultura
1.2. Importancia de la calidad del agua en
1.3. Contaminacin
1.3.1. Metales pesados
1.3.2. El cobre
1.3.3. Nitritos
1.3.4. Xileno de almizcle
1.4. Toxicocintica
1.4. 1. Modelos compartimentales.
1.4.2. Modelos no compartimentales.
1.4.3. Modelos fisiolgicos
1.5. Enfermedades infecciosas
1.5.1. Yersinia ruckeri
1.5.2. Renibacterium salmoninarum.
1.6. Metodos alternativos in vitre
1.7. La branquia como sistema fundamental.
1.8. La perfusin de branquias
1.8.1. Tipos de preparaciones
1.8.2.
1.8.3.
1.8.4.
1
la acuicultura
2
3
6
.7
.9
13
16
.18
.19
23
23
24
25
27
30
31
34
35
36
37
38
Preparacin de branquias en cabeza aislada.
Medida de la viabilidad de la tcnica
Estudios realizados
-
1.8.5. Utilidad de esta tcnica.
1.9. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
11. MATERIALES Y METODOS
2.1. Materiales
2.1.1. Animales
2.1.2. Resumen de los materiales empleados
2.2. Mtodos
2.2.1. Perfusin branquial
2.2.1.1. Circuitos
2.2.1.2. Fase quirrgica.
2.2.2. Desarrollo experimental
2.2.2.1. Eliminacin in vivo de nitritos.
2.2.2.2. Eliminacin iii vitro de nitritos.
2.2.2.3. Metabolismo iii vitro de nitritos.
2.2.2.4. Absorcin iii vivo de nitritos.
2.2.2.5. Absorcin it vitro de nitritos.
2.2.2.6. Eliminacin it vitro de cobre.
2.2.2.7.
2.2.2.8.
2.2.2.9.
2.2.2.10.
2.2.2.11.
2 .2 .2. 12.
2.2.2.13.
46
47
.47
47
.49
.49
.49
.51
.53
53
.54
.54
.55
.55
.56
56
57
57
58
Eliminacin it vitro de cobre con clulas.
Absorcin it vitro de cobre
Absorcin in vitro de xileno de almizcle.
Eliminacin it vitro de xileno de almizcle
Eliminacin de xileno de almizcle con clulas..
Ingreso de prticulas va branquial
Ingreso de bacterias va branquial
.58
.59
.60
.43
.45
-
2.2.2.13.1. Cultivo
2.2.2.13.2. Inactivacin de las bacterias.
2.2.2.13.3. Perfusin branquial.
2.2.2.13.4. Inmunohistoquimica
2.3. Anlisis, clculos y estadsticas
2.3.1. Anlisis y clculos estadsticos
2.3.2. Clculos cinticos
111. RESULTADOS
3.1. Eliminacin a vivo de nitritos.
3.2. Eliminacin a vitro de nitritos
3. Metabolismo/captacin it vftro de nitritos por los
3.4. Comparacin a vivo la viero.
3.5. Absorcin a vivo de nitritos.
3.6. Absorcin a vitro de nitritos.
3.7. Eliminacin a vitro de cobre
3.8. Eliminacin a vitre de cobre con clulas.
3.9. Absorcin a vitro de cobre
3.10. Absorcin a vitro de xileno de almizcle.
3.11. Eliminacin iii vitro de xileno de almizcle.
3.12. Eliminacin de xileno de almizcle con clulas.
3.13. Ingreso de prticulas va branquial
3.14. Ingreso de bacterias va branquial..
eritrocitos.
.60
60
.61
62
.64
.64
.65
.71
.72
.74
.77
.79
80
.81
.85
87
.90
.90
.92
93
.95
96
IV. DISCUSION .99
-
4.1. Utilidad de la perfusin branquial para la produccin intensiva de truchas.. 100
4.2. La perfusin branquial como alternativa a los estudios a vivo.
4.2.1. Empleo de la tcnica en toxicologa
4.2.2. Empleo de la tcnica en los estudios toxicocinticos.
cuantitativa
4.3. La perfusin branquial como modelo para valorar
toxicocinticos
4.4. La perfusin branquial como modelo para el estudio del ingreso de
4.4.1. Uso de panculas inertes
4.4.2. Utilizacin de bacterias
102
104
Aproximacin
105
mecanismos
109
bacterias..113
115
116
V. CONCLUSIONES 119
VI. BIBLIOGRAFA 123
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INTRODUCCIN
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INTRODUCCION 2
1.1. Acuicultura.
La necesidad de alimentos proteicos en los pases en desarrollo, as como la tendencia hacia
dietas ms sanas, con menos grasas, en los pases desarrollados, presagia un continuado
aumento de la acuicultura (Tomasso y Brune, 1991). En este sentido la FAO ha hecho un
llamamiento al desarrollo de la acuicultura como una alternativa para la obtencin de
protenas de origen animal.
La produccin acucola mundial ha crecido en los ltimos diez aos de 6.9 millones de
toneladas a 15.9. Por otra parte, el 21 96 del pescado que se consume es producido en
cautividad. La acuicultura continental representa el 65 96 del total. La importancia de la
acuicultura continental ha crecido de tal modo que la produccin est un SO 96 por encima
de las capturas (Josupeit, 1995).
Dentro de la produccin acucola, la salmonicultura es el ms practicado y con un grado de
desarrollo tcnico y una explotacin ms racional. Los salmnidos, principalmente trucha
arco iris Oncorhynchus mykiss y salmn atlntico Salmo salar, son los ms importantes en
piscicultura, representando un 40 96 de la produccin total. La produccin anual de trucha
arco iris fue de 200.000 toneladas en 1985 (Shephered, 1988).
En el siglo pasado, ante el aumento de la pesca fluvial se pens en desarrollar piscifactoras
a fin de repoblar las aguas. Luego la demanda para el consumo hizo multiplicar la
produccin de truchas y la hizo ms intensiva.
-
INTRODUCCiON 3
Diversas razones hacen de nuestro pas un lugar muy adecuado para la acuicultura. La
produccin pisccola se ha incrementado notablemente en los ltimos 30 aos y, a pesar de
los problemas econmicos coyunturales, el ascenso de la piscicultura en detrimento de la
pesca tradicional es imparable.
Aun cuando se produce una gran variedad de especies en Espaa, la produccin de trucha
es la que reviste una mayor importancia econmica. Est orientada principalmente a la
produccin de ejemplares para el consumo y, en menor medida, para la repoblacin y laproduccin de huevos y alevines.
La produccin de trucha en Espaa se ha incrementado de 14.000 toneladas en 1986 a 19.700
en 1994. Son casi 115.000 toneladas anuales la produccin total de los paises mediterrneos
(Lacroix, 1995).
Oncorhynchus mykiss (Wa]baum) es la especie ms criada en aguas continentales. Fueimportada de Amrica del Norte, se ha adaptado anuestras condiciones climatolgicas y tiene
un desarrollo ms rpido que la trucha autctona Salmo truttafao.
1.2. Importancia de la calidad del agua en la acuicultura.
La calidad del agua es uno de los factores ms importantes a la hora de considerar la cra
intensiva de peces, pues de ella dependen una serie de factores que condicionan tanto la
productividad como la aparicin y desarrollo de procesos patolgicos, bien sean de tipo
infeccioso o toxicolgico (Rosenthal, 1989).
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INTRODUCCION 4
Es esencial una mayor comprensin de las relaciones entre productividad acutica y calidad
del aguapara asegurar una continuidad en el crecimiento de la acuicultura (Tomasso y Brune,
1991).
La calidad de agua en los modernos sistemas de produccin tiene una incidencia directa en
la salud y el crecimiento de las especies criadas y de este modo juega un papel en eldesarrollo de los sistemas productivos. Esta relacin puede definirse grficamente como sigue
(Rosenthal, 1989):
Fig. 1.
Cualquier elemento txico en el ambiente puede causar una respuesta de estrs, lo que reduce
la capacidad del organismo para expresar su potencial gentico de desarrollo afectando a los
objetivos de los piscicultores (Schreck y Hiram, 1991).
Si los costes metablicos se incrementan en respuesta a los txicos, los procesos de
produccin deben reducirse. Esta reduccin puede ser mayor an si la exposicin al txico
conduce a una disminucin en el apetito, que es uno de los primeros signos de estrs por
pobres condiciones ambientales.
CALIDAfl tEL AGUA
~* RTOLDGICAti a ESTRHSINFERMEDAD
DENSIDAD DR PGRLLCION
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INTRODUCCION 5
La construccin de los sistemas de cra intensiva requiere complejas infraestructuras y losinversores estn forzados a maximizar ]a produccin de biomasa por unidad de volumen para
mantener la viabilidad econmica. Por esto, los piscicultores tienden a utilizar densidades por
encima del lmite. Con una creciente densidad de poblacin, la calidad del agua desciende
y tiende a fluctuar dramticamente dentro del sistema (Rosenthal, 1989).
La calidad de agua en su ms amplio sentido incluye todas sus caractersticas fsicas,
qumicas y biolgicas (Boyd, 1981), y en el caso de una piscifactora industrial de trucha
arco iris este concepto no puede restringirse (Blanco, 1994). Sin embargo, hasta ahora la
calidad del agua se ha considerado habitualmente como una serie limitada de parmetros
como la temperatura, el oxigeno disuelto, la salinidad, la alcalinidad, la dureza, etc. Pero
actualmente, dada la extensin de la contaminacin del medio acutico y el riesgo de
determinados contaminantes, la ubicuidad de microcontaminantes orgnicos y metales pesados
hace considerar tambin estos factores.
La trucha arco iris se cra normalmente con un flujo continuo de agua para mantener lacalidad de la misma en la unidad de cultivo. De este modo, las piscifactoras estn expuestas
a dos tipos de agresiones en relacin con la calidad de agua: una, los propios efectos de sus
metabolitos; otra, los posibles contaminantes que entran con el torrente de agua. Por ello,
la calidad de agua se ha considerado uno de los factores limitantes para la acuicultura.
La muerte de los peces no es la nica respuesta a los problemas de calidad del agua.
Problemas a una escala subletal que afectan al crecimiento y a los ndices de conversin
pueden originar costes de todo tipo para las piscifactoras. Los efectos subletales ms
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INTRODUCCION 6
importantes son aquellos que afectan a la reproduccin, crecimiento, y susceptibilidad a
enfermedades infecciosas (Tarazona y Muoz, 1995).
Condiciones habituales en la piscicultura industrial como altas densidades de peces, estrs por
manejo, etc. implican que las enfermedades infecciosas se conviertan en un riesgo constante,por afectar a las respuestas inmunolgicas del pez aumentando la susceptibilidad a bacterias
(Plumb, 1984), virus (Hetrick a al., 1979) y parsitos (Carballo y Muoz, 1991). La
reduccin en la inmunocompetencia puede estar asociada a la respuesta de estrs producida
por la exposicin a sustancias qumicas. Sin embargo, otros contaminantes como cobre,
amoniaco o hexaclorobenceno tienen mecanismos de inmunotoxicidad independientes del
estrs que produce la exposicin (Carballo y Muoz, 1991).
El riesgo derivado de la presencia de contaminantes no slo radica en su toxicidad para los
peces sino tambin en su influencia sobre el consumidor humano.
1.3. Contaminacin.
El concepto de contaminacin ha variado considerablemente. En 1983 la FAO aport esta
definicin: se entiende por contaminacin la introduccin por el hombre, directa o
indirectamente de sustancias o energas en el medio acutico, causando efectos perjudicialestales como daos a los recursos vivos, peligros para la salud humana, el deterioro de la
calidad de agua o la reduccin de los atractivos naturales.
No obstante, en la actualidad, y bajo los principios del desarrollo sostenible, se omite la
-
INiRODUCCION Y
necesidad de que se produzcan efectos perjudiciales. Por ello, la contaminacin podradefinirse como cualquier carga adicional de sustancias o energa como resultado de la
actividad humana (Lloyd. 1992).
Las causas de esta contaminacin hay que buscarlas en la industrializacin y el incremento
de la poblacin, lo que ha significado un aumento de las sustancias de desecho.
La gran capacidad de autodepuracin del agua ha motivado que, tradicionalmente, los cursos
de agua hayan sido los lugares ms utilizados para desprenderse de los residuos. La
capacidad asimiladora de los nos ha sido desbordada producindose el problema de la
polucin, es decir, la aparicin de efectos adversos producidos por niveles de contaminantes
capaces de producir efectos patolgicos sobre los seres vivos.
Existen multitud de contaminantes ambientales que pueden llegar a afectar a los peces. En
este trabajo se han utilizado tres sustancias concretas elegidas como modelo de~ algunos delos grupos de contaminantes ms caractersticos. En primer lugar, como ejemplo decompuestos inorgnicos metlicos, el cobre. En segundo lugar, como ejemplo de compuestosinorgnicos no metlicos, los nitritos. Por ltimo trataremos, como ejemplo de sustanciaorgnica, del xileno de almizcle.
1.3.1. Metales pesados.
Dentro de los contaminantes inorgnicos, los metales pesados son uno de los grupos de
mayor importancia para la toxicologa ambiental (Hodson, 1988). Entendemos por metales
-
INTRODUCCION 8
pesados aquellos elementos del sistema peridico de elevada densidad y pequeo volumen
atmico (Babor e Ibarz, 1973). Su importancia radica, entre otras caractersticas, en que no
se degradan, puesto que son elementos qumicos, no compuestos, y permanecen
indefinidamente en el medio.
En el agua, estos metales pueden ser absorbidos por los organismos acuticos penetrando
fundamentalmente por el sistema branquial (Hodson, 1988). Tras la absorcin estos metales
se distribuyen por el organismo, acumulndose en diversos rganos y tejidos. La eliminacines lenta y difcilmente completa (Hellawell, 1988).
En las piscifactoras existe un riesgo evidente relacionado con la contaminacin por metales
pesados, debido a una serie de factores que vamos a analizar. En primer lugar, las
piscifactoras aprovechan los cauces de los ros, tomando agua de ellos y devolvindola de
nuevo una vez utilizada. Dada la contaminacin existente por vertidos a los cursos de agua,
existe e] riesgo de que este problema se detecte tambin en los criaderos acucolas. Adems,
los sedimentos de los ros retienen fcilmente los metales, pudiendo stos liberarse ante
cambios del pH, etc.
Por otra parte, la alimentacin introduce una serie de metales en el medio acutico. En este
sentido, puede existir contaminacin de las materias primas o a travs de las mquinas de
elaboracin de los piensos. Adems estos alimentos llevan en su composicin metales
esenciales. Restos de alimentos no ingeridos pueden ceder al agua metales en proporcin
mayor a la tolerable. Pero el mayor peligro lo constituyen los tratamientos qumicos. El
sulfato de cobre, por ejemplo, es muy usado en piscifactoras como alguicida, molusquicida
-
INTRODUCCION 9
y antiparasitario. La utilizacin incorrecta de estas sales ha tenido como consecuencia grandes
prdidas en la produccin por la aparicin de grandes mortandades (Hellawell, 1988). De
este modo, en las explotaciones de piscicultura nos encontramos con problemas toxicolgicos
aadidos a los de las poblaciones naturales.
En funcin de lo hasta aqu expuesto, podemos concluir que existen tres posibilidades
fundamentales por las que un metal pesado puede ocasionar problemas en las piscifactoras:
contaminacin industrial aguas arriba de la piscifactora, contaminacin asociada a la
presencia del metal en el alimento y las excretas, y utilizacin directa del metal por el
piscicultor. Como hemos visto, el cobre, puede aparecer por cualquiera de los tres
mecanismos, al ser al mismo tiempo un contaminante industrial, un elemento esencial y
agente quimioterapetico, lo que justifica su eleccin como modelo en este trabajo.
1.3.2. El cobre.
El cobre se encuentra normalmente en el agua como un metal traza, en concentraciones
menores de 5 xg/l, aunque por diversas razones esta concentracin puede estar aumentada.
La toxicidad del cobre est determinada por la calidad del agua. As, la toxicidad se
incrementa al disminuir la dureza, temperatura y porcentaje de oxgeno disuelto y decreceen presencia de agentes quelantes como EDTA y NTA, cidos hmicos, aminocidos y
slidos en suspensin.
El principal factor que afecta a la toxicidad es la dureza (Lloyd, 1992). La diferencia de
-
INTRODUCCION 10
toxicidad del cobre en peces en aguas de diferente dureza podra ser dependiente de su
complejacin con carbonatos (Stiff, 1971).
Se ha sugerido que la mxima concentracin de seguridad debera basarse en los percentiles
anuales 50 y 95 de cobre soluble de 0.05 y 0.2 respectivamente de la LC5O umbral para
trucha arco iris. Este sistema, para distintos valores de dureza, se refleja en la tabla 1.
Tabla 1. Cobre. Valores de seguridad segn la dureza del agua.
Dureza del agua
(mg/l de CaCO3)
Percentil 50 Percentil 95
10 1.0 5.0
50 6.0 22.0
100 40.0
300 112.0
Un incremento en la temperatura puede acortar la supervivencia de peces, sin embargo la
CL5O se reduce por la reduccin de la temperatura.
Otros factores que afectan a la toxicidad del cobre son la disminucin de pH (Lauren y
MacDonald, 1986.), La reduccin de oxgeno (Lloyd, 1961.) y la alcalinidad (Miller y
McKay, 1980; Lauren y Mcdonald, 1986).
-
INTRODUCCION 11
Estos efectos de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad pueden explicarse por
la especiacin del metal. El trmino especiacin hace referencia a las distintas formas
fisicoqumicas en que un metal puede existir en las aguas naturales (Han y Davies, 1979).
La toxicidad de un metal depende indudablemente de su especiacin. dado que la
biodisponibilidad est influida por la forma qumica en la que se encuentra.
El cobre puede encontrarse en el agua bajo diferentes formas qumicas. La forma ms txicaes el ion Cu2~ (Giesy a al., 1986). Por otra parte, el cobre puede unirse a iones carbonato
e hidrxido (Pagenkopf a al., 1974) formando compuestos de distinta toxicidad. El cobre
presenta gran afinidad por especies qumicas orgnicas, lo que facilita su complejacin conalgunos quelantes tales como EDTA, NTA y cidos hmicos. La presencia de materia
orgnica puede incrementar hasta 3 veces los valores de la tabla 1. De este modo, segn
determinadas condiciones de calidad del agua, como el pH, se pueden dar distintas formas
qumicas del cobre de distinta biodisponibilidad y, por tanto, toxicidad. La absorcin de
formas biodisponibles determina, pues, la toxicidad del cobre.
En cuanto al modo de accin del cobre no se conoce bien. La toxicidad se refleja enmodificaciones del comportamiento, alteraciones fisiolgicas, lesiones en branquias, acmulo
en rganos, alteraciones enzimticas y hemticas (Carbonel, 1993).
Dentro del comportamiento, el efecto tipico es un incremento en la actividad de los peces.
Tambin se ha citado, en trucha arco iris, una prdida de inters por el alimento (Left et al.,
1976) congruente con una disminucin en la tasa de crecimiento (Waiwood y Beaniish,
1978).
-
INTRODUCCION 12
Pasando al segundo aspecto, las alteraciones en la frecuencia respiratoria han sido observadas
frecuentemente por la accin del cobre (Drummond a aL, 1973; Sellers a al., 1975).
Bilinski y Jonas (1973) encontraron que la exposicin de la trucha arco iris a niveles letales
de cobre reduca la capacidad de oxidacin del lactato. La hiptesis de que la muerte se
produce por asfixia es probablemente una simplificacin.
En las branquias se producen diversas lesiones: imbibicin del epitelio, exceso de produccin
de mucus con posterior retraccin y disolucin de los tejidos. (Reichenbach-klinke, 1982).Por ltimo, en la sangre se han citado variaciones del contenido en hemoglobina, cortisol o
sodio (Beckman y Zaugg, 1988; Ckyriac a al., 1989).
De estos tres factores, el primero esta ligado a un mecanismo especifico de accin del cobre
descrito en mamferos pero no demostrado en el caso de las especies pisccolas; el segundo,
corresponde a la respuesta primaria de estrs, que debe esperarse ante cualquier exposicin
a un txico y que, en concreto, ha sido perfectamente descrita en el caso del cobre (Muoz
et al., 1991). En cuanto al tercero, es un mecanismo especfico de toxicidad del cobre en
peces (Lauren and McDonald, 1986; 1987) ligado a los efectos del metal sobre los flujos deiones a nivel branquial.
Por consiguiente, tanto los efectos de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad,
como el propio mecanismo de accin estn ligados a la interaccin del metal con la branquia,
y en particular a la cintica del cobre en este rgano, lo que justifica la importancia de losestudios presentados en este trabajo.
-
INTRODUCCION 13
1.3.3. Nitritos
En la piscicultura industrial tienen gran importancia los compuestos nitrogenados, al ser
txicos y productos principales de excrecin del metabolismo de las truchas (Blanco, 1994).
Los nitritos, aunque txicos para los peces, no se suelen dar en sistemas acuticos naturales
en concentraciones consideradas txicas. En acuicultura, sin embargo, donde las
concentraciones de amoniaco puede ser altas, los nitritos tienen mayor probabilidad de
alcanzar concentraciones txicas. Adems, los salmonidos estn entre los peces ms sensibles
a los nitritos (Lewis y Morris, 1986).
Nitritos, amoniaco y nitratos estn interrelacionados a travs del proceso de nitrificacin, la
oxidacin biolgica del amoniaco a nitrato. Bajo condiciones aerbicas el amoniaco (NH3)se oxida rpidamente a nitrito (NO< por la accin bacteriana de las Nitrosomonas, de
acuerdo con la siguiente ecuacin:
2NH, + 302 2NQ + 2H~ + 2H,O
Los nitritos, a su vez, se oxidan a nitrato (N03-) por la accin bacteriana de Nitrobacter
2N0; -+ 20, 2N0;
En los sistemas acuticos bien oxigenados, la conversin de amoniaco a nitrito es el paso
limitante del proceso y la conversin de nitrito a nitrato ocurre rpidamente, por eso en la
mayora de los sistemas naturales las concentraciones de nitritos suelen ser bajas (Russo y
-
INTRODUCCION 14
Thurston, 1991).
La oxidacin de nitrito a nitrato en sistemas de agua recirculada en acuicultura no es tan
rpida, causando acumulacin de cantidades de nitrito potencialmente txicas. Los factores
que afectan a la conversin de nitritos son pH, temperatura, oxigeno disuelto, cantidad de
bacterias nitrificantes y la presencia de agentes inhibitorios como cido nitroso y amoniaco.
En solucin acuosa se establece el siguiente equilibrio:
N01{ + H~ = FINO2
Este equilibrio se ve afectado por el pH. A medida que la concentracin de H~ se
incrementa, la concentracin de nitrito ionizado (NO) decrecer, desplazando el equilibrio
hacia un incremento en la formacin de cido nitroso (FINO2).
La causa principal de toxicidad de los nitritos es la oxidacin del hierro de la hemoglobina
sangunea a su estado frrico, formndose metahemoglobina, molcula incapaz de unirse al
oxigeno, produciendo hipoxia y muerte (Rodriguez-Moreno y Tarazona, 1994).
La presencia de metahemoglobina suele delatarse por el color marrn que confiere a la
sangre. Unos niveles elevados de nitritos en el agua, incluso tan bajos como 0.015 mgl NO~N provocan niveles elevados de metahemoglobina en sangre de pez (Smith y Williams,1974). El efecto de la metahemoglobinemia se exacerba cuando la demanda de oxgeno es
alta (EIFAC, 1984).
-
INTRODUCCION 15
La intoxicacin por nitritos produce anemia, marcha vacilante y depsito de pigmento
hemtico en hgado, bazo y riones (Reichenbach-Klinke, 1982). Los nitritos tambin han
sido citados como implicados en la formacin de compuestos de nitrgeno nitroso (Archer
etal., 1971).
Resulta imposible ofrecer un valor nico como nivel de toxicidad aguda de los nitritos en
peces, ya que el rango de concentraciones txicas (por ejemplo, CL,~, o concentracionesletales umbrales) es muy amplio. Los dos factores fundamentales que explican esta enorme
dispersin son la diferencia en susceptibilidad de las diferentes especies de peces, y para cada
especie, la influencia de las condiciones de calidad del agua sobre la toxicidad de los nitritos.
Los principales factores que afectan a la toxicidad de los nitritos son el pH, cloruros y
calcio. Un incremento del pH implica una disminucin de N02-N y un aumento de HNO2-N.
Esta modificacin en la especiacin est ligada a fluctuaciones en la toxicidad. No obstante,
de todos los parmetros mencionados, el que produce mayores variaciones es la
concentracin de cloruros en el agua.
La toxicidad de los nitritos para trucha arco iris decrece cuando se incrementan las
concentraciones del ion cloruro (Brown, 1993), lo que ha sido citado para otras especies. Es
evidente que la absorcin de nitritos est relacionada con la de cloruros. Se ha visto que
branquias de trucha arco iris expuestas a nitritos tenan mayor nmero de clulas del cloruro
sugiriendo una respuesta para mantener los niveles fisiolgicos de cloruro en presencia de
nitritos (Gamo et al., 1984). La explicacin de este efecto es la siguiente. El ion nitrito es
absorbido por la branquia utilizando el mecanismo de absorcin del ion cloruro en un proceso
-
INTRODUCCION 16
competitivo entre ambos iones. Por lo tanto la influencia de la concentracin de cloruro en
el agua sobre la toxicidad de los nitritos es tan directa que pueden establecerse relaciones
lineales entre la toxicidad de los nitritos (expresada como CL50) y la concentracin de cloruro
en el agua (Gamo a aL, 1984).
La toxicidad, por tanto, depende de la cintica del compuesto en el animal. En consecuencia,
es necesario conocer la toxicocintica de los nitritos para comprender y preveer su accin
txica sobre las especies de cultivo. La existencia de relaciones cuantitativas permitir
extrapolar los resultados a las condiciones particulares de cada explotacin.
1.3.4. Xileno de almizcle
El xileno de almizcle ha sido utilizado en esta tesis como ejemplo de un compuesto orgnicoque, sin ser txico, puede tener una importancia comercial por su bioacumulacin en las
truchas, y el peligro potencial para el consumidor humano.
Los almizcles son sustancias que se utilizan para fijar los perfumes. Se obtienen de plantasy animales o por sntesis qumica. Los almizcles naturales son cetonas o lactonas
macrocclicas con un anillo de aproximadamente quince carbonos (Merck ndex, 1989).
El xileno de almizcle es una sustancia sinttica ntroaromtca muy usado en la industria
cosmtica, enjabones y cremas. El consumo mundial de almizcle, slo en detergentes, puederondar las mil toneladas por ao. Esto hace que acabe por aparecer en el medio, de hecho
ya se ha encontrado en muestras de aguas y peces. Tiene un alto poder de bioconcentracin
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INTRODUCCION 17
y una distribucin ubicua (Yamasagishi et al., 1983; Rimkus y Wolf, 1995).
La toxicidad aguda es baja pero se ha citado como posible carcingeno. Tambin induce laactividad de algunas enzimas (Helbling et al., 1994). Este hecho, unido a que se ha detectadoen leche humana y grasa corporal ha levantado la alarma sobre las posibles rutas de
exposicin del ser humano.
El xileno de almizcle tiene un alto potencial como contaminante ambiental debido a su
estabilidad ante la degradacin qumica y biolgica y su alta lipofilia. Es esta ltima
caracterstica la que le confiere la capacidad de bioacumulacin, aunque algunos autores
afirman que, en el caso de las truchas, sta no es tan grande como permitira predecir su
lipofilicidad (Boleas a al., 1995).
En un estudio de distribucin en trucha arco iris, las concentraciones ms altas se
encontraron en intestino y las ms bajas en msculo y branquias (Fernndez et al., 1995).El problema de su acumulacin, debe ser estudiado desde el punto de vista cintico, sin
embargo, los escasos estudios it vvo han sido ineficaces, debido a su lenta eliminacin.
Los conocimientos sobre toxicocintica son muy limitados, Dada su baja toxicidad para pecespodra acumularse en estos inadvertidamente con los consiguientes riesgos para la salud
humana.
Tanto la acumulacin, como la posible eliminacin son procesos toxicocinticos que deben
ser estudiados para poder dar una solucin a los problemas que estos compuestos pueden
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INTRODIJCCION 18
causar sobre el consumo humano.
1.4. Toxicocintica.
Como hemos visto en los apartados anteriores, existen muchos compuestos para los cuales
el factor fundamental que regula su toxicidad, y, por tanto, la aparicin de problemas en las
piscifactoras, es su cintica, y, en particular, su absorcin y/o eliminacin por las branquias.
La toxicocintica puede definirse como el estudio cuantitativo de los procesos que
experimenta, en funcin del tiempo, una sustancia txica en un organismo (Repetto, 1988).
El trmino toxicocintica no es ms que una adaptacin al terreno de la toxicologa de
farmacocintica acuado por E. H. Dost que la defini como la ciencia del anlisis
cuantitativo entre organismo y medicamento (Wagner, 1983). Su objetivo es estudiar el
trnsito de los medicamentos en el organismo en funcin del tiempo y sus cantidades en el
cuerpo y en la excreta, as como elaborar modelos cinticos aplicables a la interpretacin de
los datos obtenidos.
La farmacocintica ha sido definida como la ciencia matemtico-biolgica que estudia la
velocidad de los procesos de LADME (siglas de liberacin, absorcin, distribucin,
metabolismo y excrecin) y sus repercusiones en la concentracin de los compartimentos
que se consideran en medicamento y metabolitos (Pa y Pozo, 1974). La Farmacocintica
relaciona matemticamente concentraciones y velocidades y permite representar grficamente
el curso de los medicamentos en sus formas de dosificacin, en el organismo, en los lugares
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INTRODUCCION 19
de absorcin y en los emunctorios en funcin del tiempo. Para ello utiliza modelos cinticos
sencillos pero adecuados (Pa y Pozo, 1974).
La aplicacin de la ciencia y tcnica de la cintica qumica al comportamiento qumico en
los sistemas biolgicos permite caracterizar matemticamente los procesos de absorcin,
distribucin y eliminacin. La caracterizacin matemtica de esos procesos permite hacer una
prediccin cuantitativa de cantidades y concentraciones de una sustancia qumica en el cuerpo
en funcin del tiempo y del rgimen de administracin. El valor de la farmacocintica en el
campo de la toxicologa acutica se ha incrementado pero an hay poca informacin (Barron
et al., 1990).
Existen diferentes modelos farmacocinticos, de los que mencionaremos los
compartimentales, no compartimentales y fisiolgicos.
1.4.1. Modelos compartimentales.
Un modelo compartimental es una descripcin matemtica simplificada del comportamiento
de una sustancia en un animal, donde el cuerpo est representado por un sistema de
compartimentos. Un compartimento no representa necesariamente rganos o tejidosespecficos, ms bien representa grupos de tejidos que son cinticamente indistinguibles parauna sustancia determinada, Los compartimentos del modelo normalmente no tienen una
fisiologa o anatoma real. Ellos simplemente caracterizan la dinmica de una sustancia. El
tamao del compartimento est caracterizado por el volumen de distribucin aparente.
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INTRODUCCION 20
Desde el punto de vista farmacocintico se considera dividido el organismo en
compartimentos, que son sectores hipotticos en los que el frmaco se considera distribuido
en l uniformemente.
El nmero de compartimentos en que conviene dividir el organismo depende de la naturaleza
del frmaco objeto de estudio. Si ste no presenta afinidad por ningn elemento orgnico en
particular y se distribuye instantneamente por toda el agua corporal se utilizar un modelo
de distribucin monocompartimental. Si el frmaco no se distribuye instantneamente o lo
hace de un modo heterogneo convendr dividir el organismo en dos o ms compartimentos
(Pa y Pozo, t974).
Las dos asunciones primarias de un modelo compartimental son distribucin instantnea y
distribucin lineal. Distribucin instantnea significa que una vez que la sustancia entra en
un compartimento, se distribuye instantneamente dentro de l. La distribucin lineal
significa que la concentracin de la sustancia en cada tejido asociado con un compartimentoes directamente proporcional a la cantidad de sustancia en el compartimento. Mientras
diferentes tejidos pueden tener diferentes concentraciones de la sustancia, un cambio en laconcentracin en un tejido ser acompaada por un cambio proporcional en la concentracinde todos los dems tejidos dentro del compartimento. Esta asuncin permite el uso de untejido como referencia, de tal modo que la dinmica del xenobitico en el tejido de referencia
ser proporcional a su dinmica en el compartimento.
Los modelos farmacocinticos usan generalmente sangre o plasma como tejido de referenciapor su fcil recoleccin y su contacto ubicuo con todos los dems tejidos. Se puede analizar
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INTRODUCCION 21
el cuerpo entero lo que permite una medida de todos los compartimentos y no slo del tejido
de referencia.
Generalmente, se asume una cintica de primer orden en los modelos compartimentales
(cintica lineal). La tasa de transferencia de una sustanca desde o hacia un compartimento
es directamente proporcional a la concentracin en el compartimento. La asuncin de una
cintica de primer orden es implcita en el modelo a no ser que un proceso no-lineal se
incorpore explcitamente. Aunque la asuncin de una cintica de primer orden es
normalmente una buena aproximacin de la mayora de los procesos de transferencia, la
asuncin puede ser verificada experimentalmente determinando los parmetros del modelo
a dos diferentes dosis, diferentes en al menos un factor de 5. Cuando los procesos cinticos
son de primer orden, los datos de concentracin-tiempo pueden ser superpuestos
normalizndolos para la dosis (principio de superposicin). Cinticas no lineales pueden ser
incorporados en el modelo si los procesos no lineales pueden ser caracterizados
experimentalmente.
El modelo monocompartimental fue el primero en desarrollarse. Considera al organismo
como un compartimento nico constituido por el agua plasmtica, el agua intersticial y el
agua intracelular. El frmaco se supone distribuido uniformemente, de tal modo que la
concentracin plasmtica es la misma que existe en todo el compartimento. El equilibrio de
concentraciones del frmaco entre plasma, fluido intersticial y agua intracelular es
instantneo.
Como se trata de un slo compartimento homogneo, existe un proceso de entrada y un
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INTRODUCCION 22
proceso de salida de ese nico compartimento: agrupa los procesos de liberacin y absorcin
en uno slo (incorporacin o absorcin). Asimismo agrupa el metabolismo y excreccin en
un proceso nico (eliminacin). Ambos procesos (absorcin y eliminacin) se consideran
constantes.
Frente a este modelo se pueden hacer una serie de crticas:
- Noexiste ninguna sustancia que se distribuya instantnea y uniformemente en el organismo.
- Por el distinto aporte sanguneo que reciben los tejidos, existiendo zonas ms vascularizadas
que otras, habr sectores a los que el frmaco acudir antes y otros a los que tardar ms
en llegar (e irse). As, las zonas ms accesibles formaran un compartimento central, donde
se produciran los principales procesos de biotransformacin y excrecin y donde la
distribucin sera prcticamente instantnea. Habra tambin un compartimento perifrico en
el cual no sucederan esos procesos, donde el frmaco estara depositado de forma pasiva y
su eliminacin hacia el plasma dependera del grado de eliminacin en el compartimento
central.
- Por la propia heterogeneidad de los tejidos, se prev una afinidad distinta por los
medicamentos
No obstante, la importancia relativa en la prctica de cada uno de estos problemas depende
de las caractersticas del compuesto y del sistema biolgico, por lo que son los datos
experimentales los que deben condicionar la utilizacin de modelos monocompartimentales
o de modelos multicompartimentales, entre los que los bi y tricompartimentales son los ms
empleados.
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INTRODUCCION 23
1.4.2. Modelos no compartixnentales
El modelo no compartimental usado en farmacocintica est basado en la teora del momento
estadstico. Se ha usado de forma limitada en toxicologa acutica pero cada vez se utiliza
ms en farmacologa y toxicologa de mamferos. La aplicacin del momento estadstico en
farmacocintica se desarrolla del concepto de que la eliminacin de una sustancia es un
proceso estocstico y que el tiempo de residencia de la sustancia en un animal es una funcin
de los tiempos de residencia individuales de cada molcula.
La teora de los momentos estadsticos, aplicada desde 1956 en otras reas de la ciencia como
en ingeniera qumica y en cromatografa, ha sido aplicada en farmacocintica para el clculo
de los parmetros de absorcin, distribucin y eliminacin.
Para solventar los defectos de los modelos compartimentales se aplic la teora de los
momentos estadsticos que muestra mediante integracin simple los parmetros que definen
la evolucin de la curva concentracin-tiempo.
Esta teora se basa en considerar la curva de concentracin-tiempo como una distribucin
estadstica cuyos momentos se definen de la siguiente manera
1.4.3. Modelos fisiolgicos
Se parte de la idea de que los parmetros estimados por modelos compardmentales pueden
tener poca relacin con la anatoma o fisiologa del animal. Un modelo farmacocintico
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INTRODUCCION 24
fisiolgico pretende dar una descripcin ms realista, incorporando los procesos fisiolgicos
que tienen lugar.
Requiere, por tanto, informacin detallada acerca del pez y de las propiedades del frmaco:
anatmicas (volmenes de tejidos), termodinmicas (coeficientes de particin entre sangrey tejidos), fisiolgicas (perfusin de los distintos tejidos, biotransformacin). La mayorventaja es que, una vez que los principales mecanismos estn caracterizados, se puedeextrapolar el modelo a otras condiciones y especies distintas. Estos modelos se han usado
mucho en mamferos y en peces para el rojo fenol y el metotrexate.
Los modelos fisiolgicos usan un balance de masa, agrupando tejidos segn sus diferenciasde perfusin.
Para desarrollar estos modelos es necesario estimar el coeficiente de particin sangre/tejidopara todos los tejidos que se incluyen en el modelo. En peces, es necesa~Xxo usar peces
grandes pues se necesitan datos de concentracin-tiempo. En trucha se conocen muchos datos
de la fisiologa como para poder desarrollar estos modelos.
1.5. Enfermedades infecciosas.
La trucha, del mismo modo que otras especies, est expuesta a padecer una serie de
enfermedades infecciosas que provocan grandes mortandades en las poblaciones.
Por otra parte, los sistemas fisiolgicos de los organismos acuticos se ven influidos por los
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INTRODUCCION 25
cambios que se produzcan en la calidad del agua. Son especialmente vulnerables el sistema
de osmorregulacin y el sistema respiratorio. Estas alteraciones en la calidad de agua son
responsables de la aparicin de estrs, lo que puede tener como consecuencia un proceso
patolgico (Parker, 1986). En este sentido, muchos estudios revelan la relacin entre
exposicin de los peces a contaminantes y aparicin de enfermedades (Brucke, 1991).
As, la relacin entre calidad del aguay enfermedad infecciosa puede ser debida a una accin
directa del contaminante o a la situacin de estrs inespecfica que provocan los txicos.
Por otra parte este estrs puede medirse de diversas maneras e incluso, en condiciones de
cra intensiva, por la eficiencia en la conversin del alimento (Smart, 1981), es decir: tiene
una influencia clara en la produccin.
Hay dos infecciones de una gran importancia en acuicultura: la producida por Yersinia
ruckeri, denominada boca roja y la llamada enfermedad bacteriana del rin, BKD,producida por Renibacterium salmoninarum.
1.5.1. Yersinia neckeri
Es el agente productor de la enfermedad de la boca roja (ERM -Enteric Red Mouth).Esta enfermedad se empieza a conocer en la dcada de los cincuenta. Hasta hace unos aos
la ERM estaba restringida a los salmnidos y a los EEUU. A partir de los setenta se
registran casos en Australia y Europa. Se ha encontrado en la mayora de las reas en que
se cultiva trucha arco iris (Brown, 1993). En Espaa, el primer aislamiento del germen fue
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INTRODUCCION 26
en 1985 (De la Cruz et al., 1985) y desde entonces ha causado grandes prdidas econmicas.Afecta principalmente a salmnidos aunque tambin se han dado casos en no salmnidos
como carpas.
Actualmente se reconocen dos biotipos de bacterias: biotipo 1 (sorbitol negativas) que son las
ms patgenas, correspondindose al serotipo 01 y biotipo II (sorbitol positivas) que rene
5 serotipos (CAICYT, 1988).
La sintomatologa incluye inflamacin y erosin de las mandbulas y el paladar, hemorragia
subcutnea en boca y garganta, aunque esta ltima lesin, que le ha dado el nombre a la
enfermedad, no es patognomnica, ya que a veces no existe la boca roja (Brown. 1993).Puede presentarse obscurecimiento de la piel, hemorragias en la base de las aletas, exoftalmia
bilateral y tendencia al aletargamiento.
Entre las lesiones internas posibles estn la hipertrofia del bazo y hemorragias en el msculo
e intestino, donde se acumula un fluido amarillo. Se han descrito desde la forma hiperaguda
a la crnica.
El diagnstico se basa en el aislamiento e identificacin del agente causal a partir del rin
en placas de TSA, incubadas a 20-25 0C durante 24-48 h
Las colonias de Y. ruckeri son regulares, abultadas, blancas, de 2-3 mm de dimetro. El
microorganismo es un bacilo gram negativo, mvil, oxidasa negativo, que fermenta la
glucosa sin produccin de gas. Se diferencia de EdwardseIla tarda por ser indol negativa y
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INTRODUCCION 27
por la presencia de gelatinasa. Se han empleado mtodos de deteccin rpida como el
API-20E, que permiten incluso distinguir los biotiopos por la reaccin del sorbitol.
Se han utilizado tambin mtodos serolgicos. Recientemente se han obtenido anticuerpos
monoclonales para utilizarlos en inmunofluorescencia, inmunohistoquimica y ELISA (Vallejosetal., 1995).
Se discute si hay portadores asintomticos que actan como reservorios. Se necesita que
exista un estrs para que los portadores sean capaces de transmitir la bacteria (Austin y
Austin, 1987). Algunos autores consideran a la bacteria como saprfita (Rucker, 1966).Otros consideran que es parte de la flora normal de las branquias (Brown, 1993).
Existen varias vacunas en el mercado pero, paradjicamente, no se conoce como son captadaspor el pez ni el exacto mecanismo de accin (Austin y Austin, 1987).
1.5.2. Renibacterium salmoninarum
Produce la enfermedad bacteriana del rin (BKD). Fue descrita por vez primera en los aos
treinta en el salmn atlntico en Escocia. Posteriormente se ha dado en un gran nmero de
pases. La infeccin es crnica y sistmica, limitada a las distintas especies de salmnidos.
La enfermedad se caracteriza por un hinchamiento y desorganizacin del rin, con abscesos
blanco-grisceos, los cuales pueden presentarse tambin en hgado y bazo. En peces de
mayor edad puede acumularse lquido asctico en la cavidad abdominal. Externamente los
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INTRODIJCCION 28
peces pueden presentar exoftalmia, lesiones en los ojos, abdomen hinchado y lceras (Austin
y Austin, 1987).
El diagnstico presuntivo se realiza por observacin al microscopio de frotis teidos de
rin. Son bacilos cortos gram-positivos que estn localizados tanto intra como
extracelularmente. El diagnstico confirmativo debe realizarse por inmunofluorescencia
directa o indirecta.
Para el aislamiento del agente causal deben utilizarse medios especficos para Renibacterium
como KDM-2, SKDM y KDMC-C. La incubacin en estos medios se realiza a 15-20 C
durante 20-30 das. Se han descrito otras pruebas como ELISA o inmunofluorescencia aunque
son menos sensibles ante reducida carga microbiana (White et al., 1995). Sin embargo, otros
autores apuestan por el ELISA (Gudmundsdottir a al., 1993). Recientemente se ha puestoa punto una tcnica de PCR para detectar la bacteria en huevos y lquido ovrico (H4ie,
1995), tejido infectado y huevos (Figueroa et al., 1995)
R. salmoninarum es un bacilo corto, gram-positivo, oxidasa negativo y catalasa positivo. No
mvil, sin cpsula ni endosporas. Aerobio. Crecimiento entre 5 y 22 0C, siendo su
temperatura ptima 15 0C. Esta bacteria es incapaz de utilizar la mayora de los azcares y
no produce gelatinasa ni amilasa.
La HKD no es una enfermedad oportunista causada por un organismo ampliamente
diseminado en el medio ambiente aqutico. Sin embargo el microrganismo puede resistir unos
limitados perodos en el medio, al menos lo suficiente para asegurar una transmisin
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INTRODUCCION 29
horizontal entre peces en el mismo acuario (Evenden et al., 1993).
El modo principal de transmisin es por contacto pez-pez, a travs de las heces o ingestin
de vsceras infectadas. Como tpico patgeno obligado el reservorio debe estar formado por
peces enfermos o portadores asintomticos (Austin y Austin, 1987) de hecho se ha
encontrado en Salvelnusfontnalis (Starliper y Teska, 1995). Se piensa tambin que puedantransmitirlo peces en libertad, como salmones (Roberts y Shepherd, 1986). Tambin juegaun papel fundamental en la diseminacin la transmisin vertical.
La manifestacin de la enfermedad est asociada a ciertos factores ambientales como
temperatura, salinidad, dureza del agua y dieta. Aparece caractersticamente al final del
invierno y primavera.
La supervivencia depende de la habilidad del patgeno para sobrevivir y multiplicarse dentro
de las clulas fagocticas del hospedador. Es importante escapar de la vacuola fagoctica y
quedar libres en el citoplasma. Al parecer R. Salmonnarum posee un factor daante de
membrana. Se ha demostrado que la incapacidad de los macrfagos para matar R.
Salmonnarum no es totalmente debida a la inhibicin de la actividad bactericida del
macrfago. Al parecer, la localizacin intracelular de R. salmoninarum proporciona un
ambiente de proteccin para el patgeno y un estimulo constante del sistema inmunitario del
hospedador que responde pero de una manera inadecuada (Evenden et al., 1993).
La BKD se considera una de las enfermedades bacterianas ms difciles de combatir. La
eritromicina aparece como el quimioterpico ms eficaz, si bien no elimina por completo al
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INTRODUCCION 30
patgeno y es muy costosa. La desinfeccin de la superficie de los huevos con yodforos
reduce la incidencia de la enfermedad, pero no la elimina totalmente al transmitirse tambin
Reaibacrerium dentro del huevo (CAICYT, 1988).
En cuanto a la inmunizacin, los favorables resultados descritos por algunos investigadores
no han sido confirmados por otros. Las vacunas son orales, intraperitoneales. o por
inmersin con o sin coadyuvante (Evenden et al., 1993). La capacidad protectora de lasvacunas es cuestionable (Austin y Austin, 1987>.
1.6. Mtodos alternativos iii vitro
El pez constituye un sujeto ideal en lo referente a contaminacin del agua. Sin embargo, los
estudios farmacocinticos en peces presentan dificultades experimentales mucho mayores que
en mamferos o animales terrestres en general. Los problemas comienzan al intentar mantener
unos parmetros ambientales bajo control: temperatura del agua, salinidad, dureza, oxgeno,densidad de poblacin, alimentacin y manejo pueden afectar a los datos. Adems influyenfactores endgenos como tamao y estado fisiolgico (esmoltificacin, sexo, madurez sexual,
salud). No hay que olvidar que los procedimientos experimentales pueden alterar las
condiciones del pez: la anestesia, la toma de muestras, etc. Las tomas repetidas de muestras
de sangre de un mismo individuo son muy difciles de llevar a cabo, haciendo necesario
tomar muestras de distintos individuos, introduciendose por ello un factor de variacin
individual. De este modo, la extrapolacin de los datos para otras condiciones es difcil.
Es necesario, por tanto, encontrar mtodos alternativos iii vitro para estudiar la fisiologa de
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INTRODUCCION 31~
los peces, en lo relativo a su relacin con el medio externo. Este nimo ha llevado a
investigar sistemas in vitro, incluyendo rganos aislados, para desarrollar en peces, igual que
han sido desarrollados para otros vertebrados. As se han desarrollado para diferentes
rganos, como la preparacin relativamente reciente de corazn de trucha (FarreIl et al.,
1989). No obstante y por razones que comentaremos a continuacin, las preparaciones ms
importantes y extendidas son las relacionadas con las branquias.
1.7. La branqula como sistema fundamental
La branquia es un rgano multifuncional especializado en funciones como el intercambio
respiratorio, la osmorregulacin, la eliminacin de productos de desecho del metabolismo del
nitrgeno y la regulacin del equilibrio cido-base (Girard y Payan, 1980). Posee una gran
rea irrigada lo que junto a una corta distancia entre sangre y agua les facilita esosintercambios. Esto implica que las branquias son la principal va de absorcin de compuestos
en disolucin (Prt y Svanberg, 1981).
En cuanto a la estructura, las branquias de un telesteo tpico comprenden dos series de
cuatro holobranquias que forman las paredes de la faringe. Cada holobranquia se compone
de dos hemibranquias que se prolongan desde el borde posterior del arco branquial. Las
hemibranquias estn formadas por una fila de laminillas primarias. Sobre toda la superficie
dorsal y ventral de cada laminilla primaria se disponen las laminillas secundarias. Los arcos
contienen arterias branquiales aferentes que provienen de la aorta ventral y arterias
branquiales eferentes que desembocan en la aorta dorsal.
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INTRODUCCION 32
En la branquia se pueden distinguir dos tipos de epitelio de acuerdo a su irrigacin sangunea
y sus caractersticas celulares:
- El epitelio de la laminilla primaria, que contiene en su mayora clulas del cloruro y est
conectado a la circulacin venosa (parte de la arteria lamelar primaria, incluye el seno venosocentral de la laminilla primaria y est conectado al sistema venoso branquial).
- El epitelio de la laminilla secundaria, de clulas respiratorias e irrigado por circulacin
arterial (parte de la arteria lamelar aferente y va a dar a la arteria lamelar eferente).
Las clulas respiratorias representan el 96 96 de la superficie epitelial. El resto son las clulas
del cloruro y las productoras de mucus.
Los peces obtienen el oxgeno de la pequea cantidad que est disuelta en el agua. Para
extraer este oxgeno eficientemente, la estructura branquial consiste en un fino tamiz a travs
del cual el agua es bombeado. Las laminillas estn superpuestas unas a otras formando un
tupido filtro. (Lloyd, 1992). Durante la respiracin el agua pasa a travs de la boca hacia las
branquias y sale por los oprculos. Una corriente continua de agua se mantiene gracias a
movimientos de compresin y expansin de las cavidades bucal y opercular. La sangre
circula en las laminillas secundarias en el sentido opuesto al del flujo del agua, con un
rendimiento de la extraccin de oxgeno de hasta el 80% (Roberts, 1981).
El intercambio gaseoso tiene lugar por simple difusin, facilitado por una gran superficie
(300 cf/lOO g para la trucha arco iris), cortas distancias de difusin (2-10 ~m)y por un
movimiento de sangre y agua a contracorriente (Prt, 1989a). La estructura de las laminillas
secundarias consiste en una fina capa de clulas epiteliales hacia el exterior y espacios por
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INTRODUCCION 33
los que fluye la sangre hacia el interior. As, el oxgeno disuelto en el agua tienen que
recorrer una corta distancia para llegar al torrente sanguneo (Lloyd, 1992).
Los peces, a diferencia de los organismos terrestres, tienen que mantener un equilibrio
osmtico con el agua en que viven. Por simple smosis el agua entra dentro del cuerpo. Este
agua es filtrado de la sangre por los riones pero, como en los peces no hay reabsorcin de
agua se produce un copioso flujo de orina. Los riones reabsorben bastante del sodio y
cloruro de la orina para prevenir una prdida de sal, ya que sta abandona el cuerpo tambin
a travs de la piel. Esta prdida es restituida por la absorcin activa de esos elementos en las
branquias, donde el sodio se cambia por hidrgeno y el cloruro por bicarbonato. De hecho
la mayor regulacin del equilibrio de sales la llevan a cabo las branquias y no el rin
(Lloyd, 1992).
En el intercambio inico, los diversos grupos celulares desempean distintas funciones. Las
clulas del cloruro tienen un importante papel en la adaptacin de los peces a agua salada,
presentando una serie de cambios morfolgicos durante este proceso. El intercambio
Na~/NI-1 y CIIHCO; se produce en las clulas respiratorias, interviniendo tambin en el
equilibrio cido-base y en la excrecin. No obstante, las clulas del cloruro podran
intervenir en la eliminacin de ciertas sustancias orgnicas (Girard y Payan, 1980).
En los telesteos, la piel, intestino y branquias estn en contacto directo con el agua externa
y podran ser consideradas lugares potenciales de absorcin de sustancias. Sin embargo la
piel es casi impermeable y, al menos, los peces de agua dulce, no beben agua, siendo estas
vas de menor importancia en la absorcin.
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INTRODUCCION 34
Las sustancias disueltas pueden entrar en el epitelio por dos vas, a travs de las clulas
(transcelular) o entre las clulas, por sus uniones (paracelular). Las branquias de peces de
agua dulce tienen un epitelio con unas uniones muy apretadas lo que sugiere que la va de
penetracin es transcelular.
Las sustancias en el agua pueden ser absorbidas por las branquias, pasar al torrente
circulatorio y circular por el cuerpo. Si las concentraciones del txico son suficientemente
altas, las delicadas clulas de la laminilla secundaria pueden ser daadas afectando a las
funciones de respiracin y regulacin de sales. Las branquias son una ruta de principal
importancia para la captacin de sustancias txicas por los peces, y en la mayora de los
casos, la ingestin de esas sustancias con el alimento tiene mucha menor importancia (Lloyd,1992). Tanto los compuestos orgnicos hidrofbicos como los hidroflicos y los iones
metlicos entran en el pez a travs de las branquias; por ello, los estudios sobre la
biodisponibilidad de las sustancias deberan centrarse en este rgano.
El mecanismo de absorcin es el que determina si una determinada sustancia qumica estar
disponible. La tasa de absorcin podra usarse para estimar la biodisponibilidad (Prt, 1990).
1.8. La perfusin de branquias.
Desde principios de siglo se han venido desarrollando preparaciones de branquias para
estudiar la fisiologa branquial (Perry a al., 1984a).
Las preparaciones de perfusin branquial permiten medir muchas variables de la
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INTRODUCCION 35
funcionalidad branquial. El control de la composicin del lquido, la presin y el flujo y laexclusin de la circulacin postbranquial, junto con una elevada precisin de las medidas,son las principales ventajas. Pero la compleja estructura de las branquias y su variedad defunciones pueden llevar a conclusiones errneas. Adems, la perfusin y el aislamiento
introducen nuevas variables como los efectos del anestsico, deformaciones mecnicas y
estrs, y la muerte gradual de los tejidos. El principal criterio para juzgar una preparacines su habilidad para reproducir el comportamiento fisiolgico del tejido en animales intactos.Las dificultades existentes para obtener informacin sobre la funcin branquial in vivo impide
realizar una comparacin entre ambos mtodos. De hecho, esa es la razn para desarrollar
preparaciones in vitro. (Perry et al., 1984a).
1.8.1. Tipos de preparaciones.
Las preparaciones pueden ser de cuatro tipos: arcos branquiales aislados, cestas branquiales
incluyendo todos los arcos, cabezas y cuerpos enteros.
Los arcos branquiales aislados han sido utilizados por muchos investigadores (Ellis and
Smith, ~983). La preparacin consiste en un arco branquial separado perfundido por la
arteria branquial aferente, recogiendo el perfusado por un catter en la arteria branquial
eferente.
Las cestas branquiales perfundidas fueron utilizadas por los primeros investigadores (Reite,
1969). Suponen la canulacin del bulbo arterioso y el corte de los arcos cerca del techo de
la boca.
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INTRODUCCION 36
Las preparaciones de branquias en cabeza aislada se han utilizado ampliamente en los
experimentos de fisiologa branquial. Las cabezas tienen una cnula de entrada en la aorta
ventral o bulbo arterioso y una cnula de salida en la aorta dorsal.
Las preparaciones de cuerpo entero son iguales a las de cabeza aislada pero sin el catter
oclusivo en la aorta dorsal. En lugar de ello se utiliza una cnula no oclusiva para toma de
muestras y medidas de la presin.
1.8.2. Preparacin de branquias en cabeza aislada
La perfusin de cabeza ha sido muy utilizada en experimentos sobre la fisiologa branquial
(Prt y Svanberg, 1981; Prt et al., 1984; Gardaire a al., 1985; Prt a al., 1985;
Andersson y Prt, 1989; Avella y Bornancin, 1989; Block et al., 1991; etc).
El mtodo de perfusin ms empleado est representado en la Figura 2. Este mtodo incluye
un depsito de suero a una altura superior a la preparacin y una bomba cardiaca que
impulsa regularmente el lquido de perfusin. A flujo constante, cambios en la presin atravs de las branquias indican alteraciones en la resistencia vascular.
Las cabezas tienen la entrada en la aorta ventral o bulbo arterioso y una cnula de salida en
la aorta dorsal a la altura del oprculo caudal. La ventilacin se mantiene artificialmente
aunque algunas preparaciones ventilan espontneamente.
En una preparacin tpica, el 80 % del output cardiaco se recoge de la aorta dorsal mientras
-
INTRODUCCION 37
Figura 2. Esquema de la preparacin de branquias en cabeza aislada.
que el resto se lo lleva el flujo venoso. El flujo venoso se asume que est en contacto con
las clulas del cloruro que estn involucradas en el transporte inico, por lo que se ha dicho
que la circulacin venosa tienen una funcin ion-reguladora.
La utilizacin de sustancias radioactivas se ha generalizado por su facilidad y sensibilidad en
el anlisis. Sin embargo, para ciertos compuestos, como algunos orgnicos, la cromatografa
presenta ventajas, al no confundir los metabolitos con la molcula original.
1.8.3. Medida de la viabilidad de la tcnica
Las preparaciones de branquias estn limitadas por su deterioro natural. La viabilidad de la
preparacin se evala por tres mtodos:
OSi, C,RDhkOA un RuION
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INTRODUCCION 38
- Presin de perfusin aferente
- Flujo neto de sodio- Examen histolgico
Una preparacin viable se caracteriza por una presin estable. Un incremento de la presin
es un signo de vasoconstriccin en el circulatorio. Ese incremento va acompaado por la
formacin de edema en la laminilla secundaria, producindose un incremento de las distancias
de difusin entre sangre y agua. el resultado es una reduccin en la capacidad de difusin
(Prt et al., 1982). La presencia de adrenalina en el liquido de perfusin previene la
vasoconstriccin.
Una preparacin viable se caracteriza por una concentracin de Na estable o ligeramente
a la baja en el agua. Es un indicador de viabilidad muy sensible porque la absorcin contragradiente requiere energa metablica. Las branquias con edema poseen un flujo negativo desodio, mostrando como pierden este ion.
1.8.4. Estudios realizados
Las preparaciones a vitro de branquias han sido ampliamente utilizadas para estudiar la
fisiologa branquial. Desde Krakow (1913) se han usado estas preparaciones permitiendo
controlar y medir muchas variables de la funcionalidad branquial.
Uno de los temas fundamentales de investigacin ha sido el intercambio inico en la
branquia. As, esta tcnica se ha utilizado para examinar el mecanismo de la excreccin de
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INTRODUCCION 39
amoniaco y la absorcin de sodio. Primeramente Payan y colaboradores (1975) estudiaron
la bomba de sodio en la preparacin de perfusin branquial, comprobando que la entrada de
sodio era similar a la de peces a vivo. Tambin abordaron la exereccin de amoniaco en
dicha preparacin, comprobando el efecto de varias sustancias. De este modo vieron como
la adrenalina estimulaba la entrada de sodio y la excrecin de amoniaco. La acetazolamida
reduca la entrada de sodio y la excrecin de amoniaco, sin alterar la salida de sodio. Se
empez entonces a postular un intercambio normal en la branquia Na~/NH;.
Posteriormente se estudi el efecto de la temperatura y CO2 sobre la excrecin de amoniaco.
Un cambio brusco de temperatura reduca la permeabilidad de la branquia al amoniaco
mientras que la presencia de CO, activaba la excrecin (Payan y Matty, 1975). Payan (1978)
mostr nuevas evidencias de un intercambio Na~/NH; en la branquia de trucha, ofreciendo
un modelo en el que el sodio entraba gracias a la Na*1K4 ATPasa y el amoniaco atravesaba
la membrana en direccin contraria, en su forma no ionizada.
Sin embargo, otros autores (Avella y Bornancin, 1989) han rechazado el intercambio
sodio/amoniaco, vinculando la absorcin de sodio a la excrecin de iones H~.
Girard y Payan (1980) estudiaron las diferencias en agua dulce y agua salada y la
participacin de los distintos tipos celulares (clulas respiratorias y clulas del cloruro) en
la absorcin branquial de sodio. Esta lnea ha sido seguida por otros autores (Gardaire et al.,
1985) que demostraron que las clulas del cloruro de la primera laminilla contribuyen en un
20 96 a la misma. La absorcin de cloruro est relacionada con la concentracin de HCO3
y CO2 (Perry et al., 1984b) y est controlada adrenrgicamente, aumentada por la
estimulacin del receptor alfa e inhibida por la estimulacin del receptor beta (Perry et al.,
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INTRODUCCION 40
1984c).
Perry y colaboradores (1985) compararon el transporte inico en la preparacin de perfusin
branquial usando suero Ringer y sangre como lquido de perfusin, analizando Cl, Na~ y
NR;. La absorcin de sodio se deterior ms rpidamente en la perfusin con Ringer,
mientras la de CI se mantuvo relativamente estable. La excrecin de amoniaco fue similar
con ambos lquidos de perfusin.
Muchos estudios hemodinmicos se han realizado en branquias (Wood, 1974; Payan y
Girard, 1977; etc.). De hecho, causas hemodinmicas influyen en el intercambio inico, por
ejemplo alteraciones hemodinmicas son las responsables de la estimulacin de la entrada deC1 por el HCO; (Perry et al., 1984b).
En cabeza aislada se ha estudiado tambin como varia la resistencia vascular al aadir
adrenalina en el suero (Prt et al., 1982a). La adrenalina aument la resistencia vascular
notablemente por una vasoconstriccin alfa-adrenrgica. En un posterior estudio (PArt et aL,1982b) midieron tambin el intercambio de oxgeno comprobando que en ausencia de
adrenalina, ste disminua y en su presencia se mantena estable, junto con la resistenciavascular, atribuyendo esos resultados a cambios estructurales en la laminilla secundaria.
Perry y colaboradores (1985) revisaron el comportamiento de la preparacin de branquiasen cabeza aislada en cuanto a intercambio gaseoso, equilibrio cido-base y respuesta
hemodinmica, utilizando suero fisiolgico o sangre como lquido de perfusin. La perfusin
con sangre estimul la captacin de 02 y la excrecin de CO2 a travs de las branquias, por
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INTRODUCCION 41
un aumento en la capacidad de transporte de oxgeno y la presencia de anhidrasa carbnica
de los eritrocitos.
Ya centrados en el intercambio gaseoso, Prt et al. (1984) estudiaron la tensin de oxgeno
antes y despus de las branquias concluyendo que deba haber un shunt no respiratorio en
la segunda laminilla.
El papel de los eritrocitos y del epitelio branquial en la excrecin de CO2 fue estudiado por
Perry y colaboradores (1982). La entrada de HCO; en el eritrocito es el paso limitante en
la excrecin de CO2, no contribuyendo el paso de FICO; desde el plasma al epitelio
branquial.
Algunos trabajos se han llevado a cabo sobre la cintica de compuestos txicos. La principalruta de entrada de xenobiticos al pez son las branquias. La tcnica de la perfusin branquial
permite obtener informacin valiosa sobre la biodisponibilidad de los txicos, pues un primer
paso de esta consiste en como son captados por los organismos (Prt, 1990).
Ejemplo de cmo estos estudios pueden ir desarrollndose es el caso del cadmio.
Primeramente, Prt y Svanberg (1981) estudiaron la absorcin de cadmio por esta va viendo
como aumentaba al incrementarse el cadmio del medio. Se trataba de un experimento
preliminar sobre como se produca la absorcin de cadmio, lo que permiti trabajos
posteriores. As Prt et al. (1985) estudiaron la disponibilidad de cadmio en diferentes
calidades de agua. Por otra parte estudiaron la influencia de algunos agentes quelantes como
EDTA y citrato en la absorcin de cadmio (Prt y Wikmark, 1984). Posteriormente otros
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INTRODUCCION 42
autores han estudiado la absorcin de cadmio en presencia de xantatos, as como la
distribucin intracelular del cadmio (Block ci al., 1991).
La preparacin de cabeza de truchaha sido empleada para estudiar la absorcin, metabolismo
y eliminacin del benzo[a]pyreno, demostrndose que las branquias contienen sistemas de
enzimas capaces de metabolizar xenobiticos y que probablemente modificarn la absorcin
y toxicidad de los contaminantes en el organismo (Andersson y Prt, 1989).
Prt (1989a) estudi con esta tcnica la relacin del coeficiente de particin octanol-agua y
del pH en la absorcin de diversos compuestos orgnicos. Mientras que el coeficiente de
particin tiene un valor limitado como indicador de la biodisponibilidad, la absorcin de
compuestos ionizables son pH-dependientes. Paralelamente estudi las distintas tasas de
absorcin branquial de fenoles en agua dulce y salada. La adaptacin al agua de mar reduce
la permeabilidad de las branquias para las formas no ionizadas de los compuestos (Prt,
1989b).
La absorcin de compuestos hidrofbicos ha sido ampliamente estudiada, en sus aspectos
metodolgicos (Prt et al., 1992) concluyendo que la preparacin es muy adecuada para
investigar los mecanismos de absorcin de estos compuestos en relacin con sus
caractersticas fisicoqumicas. Esta absorcin disminua al bajar la temperatura (Sijm et al.,
1993) y aumentaba con el flujo de sangre y agua (Sijm ci al., 1994). Posteriormente se
determin su relacin alomtrica (Sijm et al., 1995).
Sijm (1993) observ tasas de absorcin comparables para varios compuestos orgnicos y
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INTROIMJCCION 43
sugiri el mtodo como una alternativa al uso de peces, reduciendo el nmero necesario para
cada experimento y el estrs de los mismos.
1.8.5. Utilidad de esta tcnica
La preparacin de cabeza perfundida posee muchas de los requerimientos de una buena
preparacin de perfusin branquial: ciruga rpida, no anestesia, se evitan largos perodos
de isquemia, las branquias estn bien irrigadas y perfundidas y el volumen del medio externo
pude ser pequeo. El mayor defecto es que la presin de la aorta dorsal se tiene a cero para
evitar que se derrame lquido de perfusin en el medio externo. Esto afecta al patrn de flujoa travs de las branquias y contribuye al rpido deterioro de la preparacin. Hay quien
aumenta la presin hasta valores que no suponen prdidas de suero.
El problema del deterioro hemodinmico puede ser superado aadiendo 10 M de adrenalina
o noradrenalina al liquido de perfusin o irrigando las branquias con agua hiperxica. El
deterioro hemodinmico est limitado a la trucha (en otras especies ocurre horas despus).
Si se usa este pez los experimentos no pueden superar 60 mm. (preferibles 30 mm.) y se
debe monitorizar la presin como un indicador de la viabilidad de la branquia.
Una gran ventaja de esta preparacin es que el flujo eferente puede ser partido en sus
componentes arteriales y venosos. Esto es posible porque el lquido que abandona la laminilla
en la branquia puede volver va eferente por las arterias filamentales y branquiales a la aorta
dorsal o ser enviado mediante anastomosis entre la arteria filamental eferente y el seno
venoso filamental a la circulacin venosa. Debido a esta particin es posible separar los
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INTRODUCCION 44
flujos en un componente de epitelio respiratorio (flujo a travs de clulas respiratorias) y un
componente de epitelio no respiratorio (flujo a travs de clulas del cloruro). As se hademostrado que en agua dulce el flujo de Na~ y Cl es a travs del epitelio respiratoriomientras que en el mar tiene lugar en las clulas del clorhdrico. La preparacin de cabeza
no desarrolla estos flujos salvo el de sodio (aadiendo adrenalina).
Uno de los mayores problemas de esta preparacin es separar los efectos especficos e
inespecficos, sobre todo cuando se emplean sustancias vasoactivas. Por eso es esencial
monitorizar la presin. P.ej. adicin de FICO; eleva el flujo de CF pero no especficamente
sino por alteraciones hemodinmicas con alteracin de la presin.
En resumen, las mayores desventajas de esta preparacin son: su progresivo deterioro conel tiempo, hacindolo nicamente adecuado para experimentos a corto pazo y bajas tasas deflujo de iones y 02 en ausencia de catecolaminas. Las principales ventajas son: ciruga simpley rpida que no necesita anestsico, no prdidas de agua con o sin presin dorsal artica y
divisin del flujo eferente en componentes arteriales y venosos. Esta preparacin es la msadecuada para estudios de transferencias de iones y gas, de corta duracin (no ms de 60
mm). Estudios futuros deberan incorporar plasma o sangre como medio de perfusin, si
fuera posible. Esto podra solucionar los problemas de formacin de edema y baja capacidadde transporte de 02. Tambin se sugiere aplicar niveles fisiolgicos de presin en la aorta
dorsal. No se recomiendan altos niveles de catecolaminas pero si 10 10~ adrenalina, para
ayudar a solventar el deterioro progresivo.
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INTRODUCCION 45
1.9. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
La introduccin de este trabajo ha permitido sealar una serie de aspectos bsicos,relacionados con la entrada de sustancias qumicas y de microorganismos patgenos, que
tienen una enorme importancia cientfico-tcnica y que al mismo tiempo representan aspectos
de inters para la acuicultura comercial.
El objetivo bsico de este trabajo es valorar las posibilidades de una metodologa concreta,la perfusin de branquias en cabeza aislada, para abordar el estudio de aquellos aspectos que
tienen una aplicabilidad inmediata, as como desarrollar nuevas posibilidades de esta tcnica,
entre las que destacan el estudio de los mecanismos que regulan estos procesos, as como un
aspecto totalmente innovador: la posibilidad de estudiar esta metodologa para estudiar el
paso de microorganismos en la branquia.
Para ello pretendemos comprobar la validez del sistema en los siguientes apartados:
- Comprobar su capacidad para estudiar cuantitativamente la toxicocintica de compuestos
estudiando su adecuacin a los resultados obtenidos in vivo.
- Estudiar sus posibilidades para valorar los mecanismos que intervienen en la toxicocintica
de cada compuesto.
- Comprobar la posibilidad de crear modelos mecnicos de ingreso de partculas inertes.
- Estudiar el ingreso de bacterias va branquial mediante esta preparacin.
-
MATERIALES Y METODOS
-
MATERIALES Y METODOS 47
2.1. Materiales
2.1.1. Animales
Todos los experimentos se han realizado utilizando trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)
procedentes de la piscifactora de Somolinos de la Vega (Guadalajara). Los individuos seeligieron al azar, una vez aclimatados en los acuarios.
Para las preparaciones de perfusin branquial se utilizaron truchas de un peso entre 80 y 120
gramos. Los peces se mantuvieron en acuarios de 120 litros con flujo continuo y aireacin.Para los estudios in vivo se utilizaron animales de mayor tamao (500-1200 g) mantenidos
en grupos de 5-10 individuos en acuarios de 1600 litros.
2.1.2. Resumen de los materiales empleados
- Mantenimiento de los peces: acuarios de 120 1 y 1600 1
- Equipo experimental: motor de agua (SICCE, Italia), tubos de silicona, bomba cardiaca
(IWAKI, Japn), filtro 0.2 ~m(Millipore, EEUU), bao (Julabo, Alemania), registro de
presin (PAN-LAB, Blgica), transductor de presin (DRUCK, Gran Bretaa), polmetro conelectrodos de sodio y de referencia (Orion, EEUU), bomba peristltica (ISCO, EEUU).
- Material quirrgico: cuchillo de diseccin, pinzas (de relojero, recta, curva, bulldogvascular), tijeras rectas, seda 4/0 (Lorca-Marn, Espaa), tubo de polietileno RE-SO, PE-90
-
MATERIALES Y METODOS 48
y PE-190 (Clay Adams, EEUU), aro de plstico, grafes de Michel 18 x 3 mm (Medicon,
Alemania), preservativos.
- Reactivos experimentales: PVP-40 (Sigma, EEUU), albmina (Sigma, EEUU), adrenalina
(Sigma, EEUU), heparmna (LEO, Espaa), 2-fenoxietanol (Merck, Alemania), nitrito sdico(Merck, Alemania), sulfato de cobre (Merck, Alemania), xileno de almizcle (Merck,
Alemania), formaldehido (Merck, Alemania), Hexaclorobenceno (Merck, Alemania),
amoniaco (Merck, Alemania), cloruro de cadmio (Sigma, EEUU), cianuro potsico (Sigma,EEUU), bolas de poliestireno con modificacin del extremo carboxilo con fluorescencia roja(Sigma. Alemania).
- Material de histologa: xilol, hematoxilina, tripsina, alcoholes, anticuerpo monoclonal anti
Renibacterium, anticuerpo policlonal antiyersinia, PBS, anticuerpo conjugado con peroxidasa(Sigma, Alemania), anticuerpo puente para Renibacterium (Dako, Dinamarca), anticuerpo
antiperoxidasa, Diaminobenzidina, sustrato cromgeno, hematoxilina, entelln,
- Material analtico: centrfuga de capilares (Orto, Espaa), microjeringa (Hamilton, EEUU),tubos de ensayo, rotativa (Heidolph, Alemania), microscopio de fluorescencia (Zeiss,Alemania), espectrofotmetro (Unicam, Gran Bretaa), Espectrofotmetro de absorcin
atmica con cmara de grafito HGA 300 (PERKJN-ELMER, Alemania), centrfuga de mesa(IEC, EEUU), Cromatgrafo de gases con detector selectivo de masas (Hewlett-Packard,
EEUU).
- Reactivos analticos: sulfanilamida (Merck, Alemania), N-(- 1 -naftil)-etilen-diamina, cido
-
MATERIALES Y METODOS 49
ntrico suprapur (Merck, Alemania), n-hexano (Merck, Alemania)
- Medios de cultivo: SKDM (selective kidney disease medium), TSA (triptona soja agar).
2.2. Mtodos
2.2.1. Perfusin branquial
La tcnica de perfusin branquial es un mtodo de reproduccin in vitro de la fisiologa
branquial, en la que se asla esta parte del animal para un mayor control de las distintas
variables (Perry et al, 1984).
Para cada perfusin se sigui la siguiente metodologa:
2.2.1.1. Circuitos
El aparataje para realizar la perfusin consta bsicamente de las siguientes partes: (fig.3)
- Un circuito externo cerrado por el que circula el agua, por medio de un motor (SICCE,
Italia), que representa al medio en el que vive el pez.
- Un circuito interno abierto por el que circula el liquido de perfusin impulsado por una
bomba cardiaca (IWAKI, Japn). Se utiliz el suero salino Cortland (Wolf, 1963). Contena
40 g/l de PVP-40 (polivinilpirrolidona, PMt= 40.00, Sigma, EEUU) segn Prt y Wikmark
(1984).
-
.11
vn
-
MATERIALES Y MiETODOS 51
Una vez preparada la solucin salina, se filtraba con un filtro de 0.2 pm (Millipore, EEUU)
y posteriormente se proceda a gasearlo con una mezcla de N2 conteniendo 0.7 96 de CO2 y
5 % de 02 (Alphagaz, Espaa). A continuacin se aada 1 ml/lOO ml de una solucin de
albmina (Sigma, EEUU) 20 96 y 100 M11100 ml de adrenalina (Sigma, EEUU) 0.1 % para
prevenir la vasoconstriccin espontnea (Prt et al. 1982). El suero Cortland preparado se
colocaba en el circuito de perfusin y se drenaba para eliminar la existencia de burbujas.
- Un receptculo cilndrico donde est alojada la cabeza del pez.
- La temperatura del circuito externo e interno estn mantenida por un bao (Julabo,
Alemania) a una temperatura de 10 0C.
2.2.1.2. Fase quirrgica
En resumen, la operacin consiste en una decapitacin de la trucha, una canulacin de las
aortas y una preparacin para su posterior colocacin en el sistema.
Para la operacin se siguen los siguientes pasos:
- Se pesa la trucha, cuyo peso debe estar entre 80 y 120 g.
La fase quirrgica comienza a los veinte minutos de inyectar 2000 unidades de heparmna
(LEO, Espaa) por 100 g de pez.
- Se corta la cabeza de la trucha 0.5 cm por detrs del nacimiento de las aletas operculares.
- A continuacin se coloca la cabeza en la mesa de operacin, haciendo pasar agua de pozo
-
MATERIALES Y METODOS 52
a travs de la boca para preservar la funcionalidad branquial.
- Se extraen con pinzas los rganos abdominales que queden, normalmente el hgado y un
asa intestinal.
- Posteriormente, se corta el pericardio con unas tijeras rectas, quedando accesible elcorazon.
- Se prepara una ligadura con seda 4/0 (Lorca-Marn, Espaa) a la altura del bulbo articousando la pinza curva y la recta de relojero.
- Enseguida se corta con tijera la punta del ventrculo para evitar que bombee en vacio.
- A continuacin se introduce un tubo de polietileno PE-SO (Clay Adams, EEUU) hasta la
aorta ventral. Una vez hecho esto es cuando se completa la ligadura.
- Para evitar la prdida de agua por esta va, se cierra el esfago con una pinza bulldog
vascular.
- Por ltimo, a fin de mantener la rigidez de la pared ventral de la cabeza, se coloca un aro
de plstico en la cavidad abdominal y se grapa con tres grafes de Michel de 18 x 3 mm
(Medicon, Alemania).
Una vez terminada esta operacin se fija la cabeza al sistema para lo cual se coloca un
preservativo por detrs de las branquias, unindose luego al sistema, por lo que queda
impermeabilizada la cmara donde est instalada la cabeza.
Colocada la cabeza se conecta la bomba para hacer funcionar el circuito de lquido externo
(agua de pozo) con un flujo de 1.5 l/min.para mantener una buena irrigacin de las
branquias. De igual modo se pone en funcionamiento la bomba cardiaca a una frecuencia de
40 pulsaciones por minuto y un flujo de 2 ml por minuto y 100 g de pez. Se conecta el
-
MATERIALES Y METODOS 53
extremo libre del circuito interno a la cnula PE-SO de la aorta ventral.
Una vez que se haya drenado todo el contenido del sistema circulatorio del pez, se introduce
un tubo PE-90 (Clay Adams, E.E.U.U) en la aorta dorsal. Por esta cnula tiene su salida cl
lquido de perfusin que ya ha pasado por la branquia. Este lquido se recoge cada cierto
tiempo, dependiendo del experimento.
Se conecta el registro de presin (PAN-LAB, Blgica) que va unido al transductor de presin(DRUCK, Gran Bretaa) situado en el circuito interno. As mismo se introducen en la cubeta
los electrodos de sodio y de referencia (Orion, EEUU), para empezar a registrar estos
valores.
Cuando se han estabilizado los valores de presin y concentracin de sodio se considera que
la branquia est funcionando correctamente y puede procederse a la parte experimental
propiamente dicha. Una vez acabado el experimento se extrajeron las branquias y se
incluyeron en parafina para posteriormente realizar cortes histolgicos.
2.2.2. Desarrollo experimental
2.2.2.1. Eliminacin iii vivo de nitritos
Para el desarrollo de este apartado se utilizaron 5 truchas entre 800 y 1300 g. Para cada
animal se sigui el siguiente protocolo:
- Anestesia por inmersin en una solucin de 0.3 ml de 2-fenoxietanol (Merck, Alemania)
-
MATERIALES Y METODOS 54
por litro de agua.
- Pesado del pez.
Colocacin de una cnula rgida en la aorta dorsal.
Inoculacin intravenosa de 0.5 m] por kg de p.v. de una solucin de
ppm, para alcanzar una concentracin aproximada en el pez de 3 mg/l.
- Extraccin de sangre en los tiempos: 0. 2, 4, 7, 9, 11, 14, 20, 25, 30,
- Centrifugacin de la sangre en centrfuga de capilares (Orto, Espaa)plasma con microjeringa (Hamilton, EEUU).- Anlisis de las cantidades de nitritos en plasma.
nitrito sdico 600
37, 45 y 60 mm.
y extraccin del
2.2.2.2. Eliminacin in vitro de nitritos
Se realizaron 4 perfusiones branquiales: las dos primeras se hicieron perfundiendo lquido
con 3 ppm de nitritos. Las siguientes se realizaron perfundiendo, en la misma preparacin,
primero lquido con 1 ppm y a la mitad del experimento con 6 ppm.
Se tomaron muestras de lquido de perfusin de la cnula de la aorta dorsal cada 2 minutos
as como muestras del lquido externo del circuito (agua de pozo). Las muestras se analizaron
por colorimetra.
2.2.2.3. Metabolismo frs vitro de nitritos
Se dise un experimento para ver la capacidad de metabolizacin de los nitritos a vitro.
Para comprobar si haba elementos en la sangre que metabolizaran los nitritos se prepararon
-
MATERIALES Y METODOS 55
4 tubos, cada uno de los cuales contena: sangre completa, plasma, lquido de perfusin y
liquido de perfusin con hemates. Se les aadi un estndar de nitritos para obtener
alrededor de 3,5 ppm. Se colocaron en una rotativa (Heidolph, Alemania) y se mantuvieronall tomando muestras en los tiempos siguientes: 0,1,2,3, y 24 horas. Las muestras se
centrifugaron en una centrfuga de mesa, diluyendo posteriormente el sobrenadante, para su
anlisis. Todas las pruebas se realizaron por cuadruplicado.
2.2.2.4. Absorcin iii vivo de nitritos
Se utilizaron 3 truchas de pesos comprendidos entre 530 y 625 g.
Cada una de ellas se mantuvo en acuario con un flujo continuo de 2.7 mg/l de nitrgenonitroso (1/10 de la CL5O para las condiciones de calidad de agua empleadas). Considerando
la rpida transformacin de los nitritos, se consider necesario realizar una exposicin en
flujo continuo con el objeto de garantizar los resultados. Para ello se us una bombaperistltica (ISCO, EEUU) para suministrar la solucin de nitritos y un mezclador para
mezclar el flujo de entrada de agua de pozo con la fuente de nitritos.
Se realizaron extracciones de sangre en el seno caudal a los tiempos 0, 30, 60, 90, 120 mm.,
4, 6, 8 y 24 horas. Se analiz la concentracin de nitritos en plasma.
2.2.2.3. Absorcin in vitro de nitritos
Para la determinacin de la absorcin a vtro de nitritos se utilizaron 4 truchas. En cada
perfusin se mantuvo una concentracin de 3 ppm de nitritos en el agua externa del circuito.
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MATERIALES Y METODOS 56
Para comprobar la capacidad del sistema para reproducir el funcionamiento in vivo, aplicado
al caso de los nitritos una de las preparaciones se realiz utilizando un medio externo sin
cloruros.
Se tomaron muestras de lquido de perfusin de salida cada 2 minutos as como muestras del
lquido externo. Las muestras se analizaron por colorimetra.
2.2.2.6. Eliminacin iii vitro de cobre
Se realizaron 4 preparaciones: dos con 1500 ppb de cobre y dos con 1500 y posteriormente
300 ppb. Las preparaciones se realizaron perfundiendo suero salino Cortland con las
concentraciones citadas de cobre en forma de sulfato. Se tomaron muestras de lquido de
perfusin de la cnula de la aorta dorsal cada 2 mm. y tambin de lquido externo.
2.2.2.7. Eliminacin u vitro de cobre con clulas
Se realizaron tres preparaciones en las cuales se perfundieron las branquias con cobre a una
concentracin de ISOO ppb. En la mitad de la preparacin se aadi al lquido de perfusin
sangre del propio animal extrada previamente (0.5 ml de sangre por 50 ml de lq