La malignización celular analizada mediante proteómica comparativa de

líneas celulares trofoblásticas humanas

Sandra Susana Novoa Herrán

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C., Colombia

2016

La malignización celular analizada mediante proteómica comparativa de

líneas celulares trofoblásticas humanas

Sandra Susana Novoa Herrán

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Doctor en Ciencias - Química

Directora:

Myriam Sánchez de Gómez, Química, M.Sc.

Profesora Emérita

Línea de Investigación:

Factores de crecimiento diferenciación y cáncer

Grupo de Investigación en Hormonas - GIH

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C., Colombia

2016

“The world always seems brighter when

you've just made something that wasn't there

before”. Neil Gaiman

A Sergio, mi renovador de fortaleza y fé.

El desarrollo de una tesis no solo es

dedicación y disciplina; es intuición para

escoger el camino, fortaleza para sobrellevar

la adversidad y los obstáculos y coraje para

continuar.

Agradecimientos Agradezco a Colciencias por el Crédito-Beca para Doctorados en Colombia “Generación

del Bicentenario” que me permitió desarrollar mis estudios de doctorado. A L’Oreal y la

UNESCO por el Premio “Mujer para la Ciencia” y la beca que me permitió consolidar los

resultados de mi investigación. A la División de Investigación Bogotá (DIB) por el apoyo

económico otorgado a través de los proyectos: Estudios genéticos y bioquímicos en

cáncer (código DIB 20708) y Papel del TGF-beta en la regulación del trofoblasto humano

y sus implicaciones en malignización (código DIB 20697); y a la Universidad Nacional de

Colombia, mi alma mater.

A la profesora Myriam Sánchez de Gómez, directora del Grupo de Investigación en

Hormonas por sus enseñanzas y conocimiento, por creer en mí y por ser mi tutora en

todo mi proceso formativo. A la doctora Adriana Umaña por sus consejos, apoyo y

orientación. A todos los integrantes del Grupo de Investigación en Hormonas por su

amistad y por compartir estos años conmigo, a Carolina, Sandra, Francisco, Andrea,

Felipe, Claudia Patricia, Wilmer, entre muchos otros que han pasado por el grupo; y

gracias especiales a los estudiantes que me apoyoran en mi trabajo y tuve la oportunidad

de participar en su proceso de formación: a Mariela, Sebastian Paez, y ahora Juan

Sebastian Arcila.

Al Prof. Dr. med. Udo Markert, director de Placenta-Lab, Friedrich-Schiller University de

Jena, Alemania, por acogerme en su laboratorio y permitirme completar mi proyecto de

tesis. A la Dra. Diana Morales por su guía y amistad. A mis compañeros del grupo

Placenta-Lab, a aquellos que me brindaron su amistad, y a quienes me ayudaron de una

u otra forma durante mi estancia, especialmente a Stephanie, Jana, Christhin, Karolin,

André, Julia, Rodolfo, Ivan, Wittaya y Stella; gracias por los buenos momentos, los

consejos científicos, la ayuda experimental y su amistad.

VIII Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Al Dr. Francesc Canals, director del Laboratorio de Proteómica del Instituto de Oncología

Vall d’Hebron VHIO, en Barcelona, España, por acogerme en su laboratorio, despejar mis

dudas y permitirme profundizar en el campo de la proteómica y analizar las muestras

SILAC y llevar a cabo los análisis DIGE. A Marta Monge y Luna por acompañarme en la

fase experimental, a JoanJo por las discusiones científicas y bioinformáticas que me

motivaron a reorientar mi trabajo, a Carolina y Gemma por su amistad y compañía y a los

demás miembros del laboratorio con los que disfrute de una gran estancia: Núria, Anna,

Marta Vilà, y a Candy, Olga y los vecinos del laboratorio de biomarcadores.

Al Dr. Roland Lehmann y a la Dra. Hortense Slevogt del Centro de Investigación

Septomic, Beutenberg Campus, en Jena, Alemania, por creer en mi proyecto y

colaborarme generosamente en los análisis por espectrometría de masas nLC Orbitrap

Fusion de las extravesículas y el análisis estadístico de los resultados.

Al Leibniz-Institut für Photonische Technologien (IPHT) en Jena, Alemania y al Dr. Robert

Müller del grupo Nanobiophotonik por abrirme las puertas y permitirme realizar los

análisis de nanopartículas en el equipo Nanosight.

Al Ing. Frank Steiniger y al Dr. Martin Westermann del Elektronenmikroskopisches

Zentrum de la Friedrich-Schiller University de Jena, Alemania, por su colaboración en el

análisis por microscopía crio-electrónica de las extravesículas y microvesículas.

A la Dra. Patricia Cuervo Escobar y a la Dra. Monica Losada, del Instituto Oswaldo Cruz

– FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil, por el apoyo brindado para el análisis por

espectrometría de masas MS MALDI TOF/TOF y nLC-ESI-MS/MS Q/ToF.

Al Dr. Leopold Ilag, del Departamento de Química Analítica de la Universidad de

Estocolmo, Suecia, por la asistencia inicial brindada para el análisis por espectrometría

de masas nLC-MS/MS.

Resumen Las células trofoblásticas comparten varias características con células cancerosas; sin

embargo, su función se encuentra altamente controlada a diferencia del cáncer. El TGF-β

es un regulador del trofoblasto, pero no del coriocarcinoma. El objetivo de este trabajo

fue comparar los proteomas de la línea inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo y de

coriocarcinoma JEG-3, incluyendo sus vesículas extracelulares, usando diferentes

aproximaciones experimentales y estrategias proteómicas. Las proteínas identificadas

pertenecen a diferentes vías metabólicas, y regulación de transducción de señales y

expresión génica. De estos resultados es posible deducir un aumento en la actividad

metabólica, antioxidante y transcripcional en células JEG-3 comparado con células HTR-

8/SVneo, como una estrategia de supervivencia. En conclusión, la proteómica

comparativa permitió identificar proteínas diferenciales claves entre los dos modelos, con

posibles implicaciones en malignización celular.

Palabras clave: Proteómica, Trofoblasto, Coriocarcinoma, Cáncer, Factor de crecimiento transformante beta, Vesículas extracelulares, Bioinformática. Nota: El material suplementario que acompaña esta tesis se encuentra disponible a

través de la autora (ssnovoah@unal.edu.co )

II Resumen y Abstract

Abstract Trophoblast cells share several features with cancer cells; however, its function is highly

controlled, unlike to cancer. TGF-β is one of the factors that regulate trophoblast process,

but not choriocarcinoma. The aim of this work was to compare the proteomes of the

immortalized trophoblast HTR-8/SVneo and the choriocarcinoma JEG-3 cell lines,

including their extracellular vesicles, through different experimental approaches and

proteomic strategies. The identified proteins belong to several metabolic pathways and

signal transduction and gene expression regulation. From these results, it is possible to

deduce a rise in metabolic, antioxidant and transcriptional activities on choriocarcinoma

JEG-3 cells compared to trophoblast HTR-8/SVneo cells, as a survival strategy. In

conclusion, comparative proteomic allowed the identification key differential proteins

between these two models, with potential implications in cell malignization.

Keywords: Proteomic, Trophoblast, Choriocarcinoma, Cancer, Transforming Growth Factor beta, Extracellular Vesicles, Bioinformatics

Contenido III

Contenido

Pág.

Resumen .......................................................................................................................... 1

Abstract............................................................................................................................ 2

Lista de figuras .............................................................................................................. VII

Lista de tablas ................................................................................................................. X

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................. XII

Publicaciones y divulgación ....................................................................................... XVI

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Capítulo 1: El trofoblasto como modelo de estudio del cáncer ............................ 5 1.1 Influencia del suero en el cultivo como condición nutricional .............................. 6

1.1.1 Efecto del suero y su depleción en la viabilidad celular de la línea HTR-8/SVneo ..................................................................................................................... 7 1.1.2 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta a una dosis baja de suero (SFB 0,5%) .................................................................................................. 8 1.1.3 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de suero 20 1.1.4 Discusión de resultados influencia del suero ................................................. 26

1.2 Efectos del factor de crecimiento transformante β – TGF-β .............................. 28 1.2.1 Determinación de las condiciones de estímulo con TGF-β ............................ 32 1.2.2 Análisis de la expresión de proteasas por células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β ................................................................................................................... 33 1.2.3 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β ............ 41 1.2.4 Discusión de resultados efecto del TGF-β ..................................................... 55

1.3 Análisis general de resultados .......................................................................... 63 1.3.1 Paralelo microambiente tumoral y microambiente uterino y estrategias de supervivencia ........................................................................................................... 65 1.3.2 Influencia recíproca del microambiente y el TGF-β ........................................ 66

2. Capítulo 2: Estudio comparativo del trofoblasto y el coriocarcinoma ............... 69 2.1 Caracterizacion celular y análisis funcional ...................................................... 74

2.1.1 Características de las líneas empleadas ........................................................ 74 2.1.2 Influencia del suero en la proliferación y metabolismo celular ........................ 78 2.1.3 Capacidad de formación de esferoides como rasgo stem cell ........................ 81 2.1.4 Homogenización de condiciones de cultivo .................................................... 83 2.1.5 Discusión de la caracterización celular .......................................................... 87

IV Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

2.2 Análisis proteómico en condiciones fisiológicas ................................................ 94 2.2.1 Análisis de proteomas totales .........................................................................94 2.2.2 Análisis de sub-proteomas de citoplasma .......................................................97 2.2.3 Análisis cuantitativo de proteomas totales mediante SILAC ......................... 104 2.2.4 Análisis proteómico del efecto del TGF-β ..................................................... 118 2.2.5 Discusión de los resultados proteómicos ...................................................... 126

2.3 Análisis general de resultados ........................................................................ 133 2.3.1 Comparación de la línea HTR-8/SVneo y la línea JEG-3 .............................. 133 2.3.2 Efecto regulador del TGF-β en los modelos estudiados ............................... 138

3. Capítulo 3: Estudio de vesículas extracelulares derivadas de trofoblasto ....... 143 3.1 Aislamiento de vesículas extracelulares .......................................................... 149 3.2 Caracterización de vesículas extracelulares ................................................... 152

3.2.1 Caracterización bioquímica .......................................................................... 153 3.2.2 Caracterización física ................................................................................... 155

3.3 Análisis proteómico de EVs ............................................................................ 160 3.3.1 Análisis proteómico preliminar ...................................................................... 160 3.3.2 Análisis proteómico comparativo .................................................................. 164

3.4 Análisis general de resultados ........................................................................ 188 3.4.1 Consideraciones sobre las EVs obtenidas .................................................... 190 3.4.2 Las EVs derivadas de JEG-3 y HTR-8/SVneo presentan un contenido proteico diferente acorde con su origen ................................................................................ 193 3.4.3 Comparación de las EVs derivadas de HTR-8/SVneo y JEG-3 inducidas por la estimulación con TGF-β .......................................................................................... 201 3.4.4 Implicaciones in vivo de las EVs derivadas de los modelos de trofoblasto JEG-3 y HTR-8/SVneo .................................................................................................... 204 3.4.5 Perspectivas: Exosomas como fuente de biomarcadores plasmáticos y blanco terapéutico .............................................................................................................. 205

4. Discusión general e implicaciones biológicas en la malignización .................. 207 4.1 Estrategias proteómicas empleadas ............................................................... 207 4.2 Biología del cáncer y procesos biológicos ....................................................... 210

4.2.1 Fusión celular, citocinesis y cariotipo alterado .............................................. 211 4.2.2 Reprogramación metabólica como una estrategia de supervivencia ............ 212 4.2.3 Actividad antioxidante como una ventaja intrínseca ..................................... 213 4.2.4 Regulación epigenética y reparación del ADN .............................................. 214 4.2.5 Plasticidad del programa transcripcional y adaptabilidad celular .................. 216

4.3 Influencia del microambiente y regulación recíproca ....................................... 218 4.3.1 Influencia del microambiente en los efectos del TGF-β ................................ 220

4.4 Propuesta de proteínas claves en la malignización: chaperonas, proteínas adaptadoras y scaffolds de señalización ................................................................... 225

4.4.1 Proteínas de choque térmico – HSP ............................................................. 226 4.4.2 Co-reguladores transcripcionales ................................................................. 228 4.4.3 Reguladores de proteínas de señalización: Familia 14-3-3 .......................... 229

5. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 231 5.1 Conclusiones .................................................................................................. 231 5.2 Perspectivas y Recomendaciones .................................................................. 232

A. Anexo: Materiales y Métodos ............................................................................... 233 1. Cultivo celular y tratamientos .............................................................................. 233 2. Ensayos de proliferación y viabilidad celular ...................................................... 234

Contenido V

a. MTT ............................................................................................................. 234 b. MTS ............................................................................................................. 234 c. Conteo celular ............................................................................................. 235

3. Obtención de EV por ultracentrifugación .............................................................235 4. Preparación general de extractos proteicos ........................................................237

a. Obtención de extractos proteicos ................................................................. 237 b. Desalinización y concentración por precipitación ......................................... 238 c. Cuantificación de proteínas ......................................................................... 239

5. Separación de proteínas por electroforesis bidimensional (E2D) ........................239 a. E2D - Coomassie ......................................................................................... 239 b. Electroforesis bidimensional en gel diferencial fluorescente (2-D DIGE) ...... 240

6. Marcación con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares - SILAC ........................................................................................................................242 7. Identificación de proteínas por espectrometría de masas MS .............................243

a. Procesamiento de los spots en el Laboratorio de Hormonas, Unal – Bogotá 243 b. Análisis por LC-ESI-MS/MS (Instituto Karolinska – Suecia) ......................... 243 c. Análisis por MALDI MS/MS (Instituto Karolinska – Suecia) .......................... 244 d. Análisis por MS-MALDI-ToF/ToF (Fiocruz, Brasil) ....................................... 244 e. Análisis por LC-ESI-Q/ToF, (FUNDAO, Brasil)............................................. 245 f. Análisis en el Laboratorio de Proteómica, VHIO - Barcelona ....................... 245 g. Análisis eFASP nLC-ESI-MS/MS - Centro de Investigación SEPTOMIC, Jena247

8. Análisis bioinformático de las proteínas identificadas ..........................................249 9. Análisis de la expresión génica por RT-qPCR.....................................................250

a. Extracción de ARN ...................................................................................... 250 b. Obtención de ADNc por Retro-Transcripción ............................................... 250 c. Evaluación de la expresión por PCR en tiempo real – genes MMP9 y uPA . 251 d. Evaluación de la expresión por PCR en tiempo real – genes TβRII ............. 251 e. Análisis Estadístico ...................................................................................... 252 f. Análisis bioinformático de la región promotora y regulación por factores de transcripción ........................................................................................................... 252

10. Análisis de la expresión proteica por Western Blot ..........................................252 11. Análisis de la expresión proteica por Dot Blot ..................................................253 12. Ensayo de formación de esferoides mediante gotas colgantes .......................253 13. Análisis de rastreo de nanopartículas ..............................................................254 14. Obtención de cultivo primario de trofoblasto ....................................................254

B. Anexo: Estudios, ensayos y análisis preliminares ............................................ 255 1. Comparación de los medios de cultivo empleados .............................................255 2. Niveles séricos de TGF-β1 .................................................................................257 3. Propuesta y evaluación de un pipeline para análisis de datos proteómicos por redes de interacción...................................................................................................258 4. Criterios de análisis 2DE – MS ...........................................................................259

a. Análisis estadístico de las imagenes ............................................................ 259 b. Depuración y reducción de listas ID MS ...................................................... 259

5. Criterios para el análisis SILAC y verificación manual .........................................260 6. Radio de proteínas y otras estructuras subcelulares ...........................................260

C. Anexo: Capítulo 1 ................................................................................................. 263 1. Evaluación y determinación de las condiciones de tratamiento con TGF-β .........263 2. Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta a la depleción del suero ...264

VI Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

D. Anexo: Capítulo 2 ................................................................................................. 267 1. Adaptación del cultivo celular JEG-3 a medio RPMI 1640 .................................. 267 2. Adaptación del cultivo celular HTR-8/SVneo a medio F-12 ................................. 268 3. Ensayo de migración desde esferoides .............................................................. 269 4. Confirmación del marcaje de células HTR-8/SVneo en Lisina pesada K(6) ........ 271

E. Anexo: Capítulo 3 ................................................................................................. 273 1. Implementación del protocolo de obtención y purificación de EVs ...................... 273 2. Evaluación de posibles efectos de la depleción de EVs bovinos del medio de cultivo ........................................................................................................................ 277 3. Análisis proteómico preliminar - proteínas anotadas para placenta o trofoblasto 279

Bibliografía ................................................................................................................... 283

Contenido VII

Lista de figuras Pág.

Figura 1-1 Viabilidad y crecimiento de células HTR-8/SVneo con varias dosis de suero. . 8 Figura 1-2 Estadística de spots de proteína expresados por células HTR-8/SVneo cultivadas con SFB 0,5% en comparación con SFB 10% ............................................... 11 Figura 1-3 Agrupación de anotaciones funcionales para proteínas identificadas como A) diferenciales y B) invariables expresadas por células HTR-8/SVneo SVneo cultivadas con SFB 0,5% o SFB 10%. ................................................................................................... 19 Figura 1-4: Estadística de spots de proteína expresados por células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de SFB. ................................................................................... 21 Figura 1-5 Proteínas diferenciales identificadas ante la depleción de suero A) Gel control representativo con spots de proteína identificados B) Razón de cambio de algunos spots. ....................................................................................................................................... 21 Figura 1-6 Análisis de enriquecimiento en anotaciones para proteínas identificadas como diferenciales por células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de suero. .............. 22 Figura 1-7: Análisis de redes para las proteínas diferencialmente expresadas por células de HTR8/SVneo ante la depleción de suero; A) STRING network B) PCViz network. .... 25 Figura 1-8: Validación de la expresión de Vimentina por Western Blot. .......................... 26 Figura 1-9 Vía de señalización TGF-β / SMADs. ............................................................ 29 Figura 1-10 Evaluación del tiempo de estimulación y dosis de TGF-β relativo a las condiciones de cultivo, mediante MTT en células HTR-8/SVneo .................................... 32 Figura 1-11 Efecto del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 (A.) sin suero o (B.) con 0.5% SFB, y de uPA (C.) sin suero o (D.) con 0.5% SFB. ....................................................... 34 Figura 1-12 Efecto del TGF-β relativo a la presencia de suero sobre la expresión de MMP-9 (A.) a las 12 (B.) y 24 horas, y de uPA (C.) a las 12 (D.) y 24 horas. .................. 35 Figura 1-13 Cinética del efecto del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 y uPA. ............ 36 Figura 1-14 Factores de transcripción con sitios de unión en los promotores de los genes MMP-9 y PLAU (uPA). .................................................................................................... 37 Figura 1-15 Vía de señalización del TGF-β y factores de transcripción involucrados en la expresión de MMP-9 y PLAU (uPA). .............................................................................. 38 Figura 1-16 Análisis de vías Pathway Commons. ........................................................... 39 Figura 1-17: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo control. ........ 42 Figura 1-18: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo estimuladas con TGF-β 1 ng/mL. ....................................................................................................... 43 Figura 1-19: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo estimuladas con TGF-β 10 ng/mL. ..................................................................................................... 43 Figura 1-20: Comparación de secciones de gel con spots de proteínas diferenciales. ... 44

VIII Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 1-21 Agrupación de anotaciones funcionales para proteínas identificadas por células HTR-8/SVneo en respuesta a TGF-β. ................................................................. 45 Figura 1-22 Análisis de redes y anotaciones GO CC para las proteínas diferencialmente expresadas por células HTR8/SVneo en respuesta a TGF-β. ......................................... 52 Figura 1-23 Red enriquecida para las proteínas diferencialmente expresadas por células de HTR8/SVneo en respuesta a TGF-β. ......................................................................... 53 Figura 2-1 Células HTR-8/SVneo en cultivo con 10% de SFB en RPMI 1640 ................. 75 Figura 2-2 Células JEG-3 en cultivo con 10% de SFB en F-12 ....................................... 75 Figura 2-3 Cultivo primario de trofoblasto aislado de placenta a término ........................ 76 Figura 2-4 Gonadotropina coriónica secretada por células HTR-8/SVneo y JEG-3 ......... 77 Figura 2-5 Expresión basal del receptor TBRII y E-caderina ........................................... 78 Figura 2-6: Efecto del SFB en el metabolismo de células HTR-8/SVneo y JEG-3 ........... 79 Figura 2-7 Viabilidad y proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 con varias dosis de suero ............................................................................................................................... 79 Figura 2-8 Morfología celular del ensayo de viabilidad de células HTR-8/SVneo y JEG-3 con varias dosis de suero ............................................................................................... 80 Figura 2-9 Efecto del TGF-β en la viabilidad y proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 en sus respectivos medios ................................................................................... 80 Figura 2-10 Efecto del TGF-β en la formación de esferoides de células HTR-8/SVneo y JEG-3 por el método de gota colgante ............................................................................ 82 Figura 2-11 Efecto del TGF-β en la proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 sin adaptar, en diferentes condiciones de cultivo. ................................................................. 84 Figura 2-12: Efecto de las condiciones de cultivo en la proliferación y viabilidad de células HTR-8/SVneo y JEG-3 adaptadas a RPMI/F12............................................................... 86 Figura 2-13 Efecto del TGF-β en células adaptadas e influencia del medio de cultivo .... 87 Figura 2-14 Comparación proteomas totales de células HTR-8/SVneo y JEG-3 ............. 95 Figura 2-15 Comparación sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3 ....................................................................................................................................... 97 Figura 2-16 Sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3 .................. 99 Figura 2-17 Análisis de redes de anotaciones para las proteínas identificadas en sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3. ......................................... 102 Figura 2-18 Red de interacción de proteínas identificadas en spots únicos a JEG-3. ... 103 Figura 2-19 Esquema experimental para el análisis proteómico comparativo SILAC .... 104 Figura 2-20 Distribución de frecuencia de la cuantificación de péptidos (datos crudos). 105 Figura 2-21 Ejemplo de la cuantificación de las proteínas CLIC4 y PCNA. ................... 107 Figura 2-22 Sub red de acciones para 14-3-3 y Hsp ..................................................... 116 Figura 2-23 Red enriquecida en base a las proteínas 14-3-3 sobre-expresadas en JEG-3 ..................................................................................................................................... 117 Figura 2-24 Estadística de spots de proteína diferencialmente expresados en respuesta al TGF-β por células HTR-8/SVneo y JEG-3 ................................................................. 124 Figura 2-25 Análisis de redes de anotaciones para las proteínas identificadas al alza en respuesta al TGF-β en células HTR-8/SVneo y JEG-3. ................................................. 125 Figura 3-1 Proceso de generación de vesículas y acción extracelular .......................... 146 Figura 3-2 Protocolo de ultracentrifugación implementado para la obtención de EVs ... 151

Contenido IX

Figura 3-3 Flujo de análisis físico y bioquímico de los exosomas aislados ....................152 Figura 3-4 Perfil proteico de EVs obtenidas con el protocolo inicial ...............................153 Figura 3-5 Perfil proteico de EVs obtenidas con el protocolo final .................................154 Figura 3-6 Análisis por Dot Blot de marcadores exosomales .........................................154 Figura 3-7 Imágenes cryo-TEM de EVs derivadas de células JEG-3 .............................156 Figura 3-8 Análisis de Rastreo de Nanopartículas (NTA) para EVs derivadas de líneas celulares de trofoblasto .................................................................................................158 Figura 3-9 Localización subcelular de proteínas identificadas en EVs de JEG-3 ...........162 Figura 3-10 Clasificación funcional de proteínas identificadas en EVs de JEG-3 ...........163 Figura 3-11 Caracterización general de EVs derivadas de trofoblasto ...........................165 Figura 3-12 Función molecular general de las proteínas identificadas en EVs derivadas de trofoblasto ................................................................................................................166 Figura 3-13 Vías anotadas para el proteoma de EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo ...........168 Figura 3-14 Vía de migración transendotelial de leucocitos ...........................................172 Figura 3-15 Vía de señalización Ras de KEGG .............................................................173 Figura 3-16 Análisis de redes para las proteínas humanas diferencialmente identificadas en EVs de células JEG-3 y HTR-8/SVneo .....................................................................176 Figura 3-17 Diagrama de Vulcano de proteínas cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en cada modelo .............................................................................................................179 Figura 3-18 Diagrama de Vulcano de proteínas cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en común. .....................................................................................................................184 Figura 5-1 Comparación protocolos de ultracentrifugación para la obtención de EVs....236 Figura 5-2 Protocolo de ultracentrifugación implementado para la obtención de EVs. ...236 Figura 5-3 Establecimiento del cultivo celular SILAC. ....................................................242 Figura 5-4 Propuesta general de pipeline para análisis de datos proteómicos ..............258 Figura 5-5 Propuesta detallada de pipeline para análisis e interpretación de datos proteómicos ...................................................................................................................258 Figura 5-6 Evaluación efecto del TGF-β sobre la viabilidad celular y dependencia con el suero. ............................................................................................................................263 Figura 5-7 Spots de PKM1/2, Enolasa y Vimentina identificados en geles DIGE. Comparación 0,5% vs 10% SFB en células de HTR-8/SVneo. ......................................264 Figura 5-8 Spots de PKM1/2, Enolasa, IMPDH2, KRT8 y Vimentina identificados en geles 2DE. Comparación 0% vs 10% SFB en células de HTR-8/SVneo .................................265 Figura 5-9 Células JEG-3 adaptadas a cultivo en medio RPMI 1640 .............................268 Figura 5-10 Células HTR-8/SVneo adaptadas a cultivo en medio F-12 .........................269 Figura 5-11 Ensayo de migración desde esferoides de células HTR-8/SVneo ..............270 Figura 5-12 Espectro para el péptido de masa 1.203 de actina .....................................271 Figura 5-13 Ensayo inicial de la implementación del protocolo. .....................................274 Figura 5-14 Lavado del pellet de exosomas con 0,05% Tween 20/ PBS. ......................276 Figura 5-15 Lavado del pellet de exosomas con dos volumenes de PBS. .....................277 Figura 5-16 Efecto de la remoción de EVs bovinos en la viabilidad celular. ...................278 Figura 5-17 Efecto de la remoción de Evs bovinos en la función celular........................278

Contenido X

Lista de tablas Pág.

Tabla 1-1: Proteínas identificadas en respuesta al suero 0,5%: ensayo preliminar. .......... 9 Tabla 1-2: Proteínas identificadas en respuesta al suero 0,5%: análisis DIGE. ............... 12 Tabla 1-3: Proteínas relevantes identificadas en respuesta a la depleción de suero. ...... 23 Tabla 1-4: Spots de proteína identificados por MS MALDI ToF. ...................................... 41 Tabla 1-5: Confirmación del alineamiento mediante identificación de spots de proteína. 42 Tabla 1-6: Clústers de spots de proteína encontrados. ................................................... 44 Tabla 1-7: Razón de cambio en el nivel proteico de los spots identificados, en respuesta al TGF-β ......................................................................................................................... 45 Tabla 1-8: Proteínas identificadas en respuesta al TGF-β 10 ng/mL ............................... 47 Tabla 1-9 Clasificación funcional de las proteínas identificadas en respuesta a TGF-β.. 51 Tabla 2-1 Diseño experimental adaptación celular .......................................................... 85 Tabla 2-2 Proteínas identificadas en proteomas totales de HTR-8/SVneo y JEG-3. ....... 96 Tabla 2-3 Spots de proteína identificados en los sub-proteomas de citoplasma............ 100 Tabla 2-4 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas mediante análisis SILAC 106 Tabla 2-5 Proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3, cuantificadas mediante SILAC ...................................................................................... 109 Tabla 2-6 Proteínas sobre-expresadas en JEG-3 con respecto a HTR-8/SVneo, cuantificadas mediante SILAC ...................................................................................... 110 Tabla 2-7 Clúster de interes producto de la clasificación funcional de proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo ....................................................................................... 112 Tabla 2-8 Clústers de interes producto de la clasificación funcional de proteínas sobre-expresadas en JEG-3 ................................................................................................... 113 Tabla 2-9 Proteínas diferencialmente expresadas por TGF-β en células HTR-8/SVneo 119 Tabla 2-10 Proteínas diferencialmente expresadas por TGF-β en células JEG-3 ......... 121 Tabla 2-11 Correlación resultados proteómicos entre E2D comparativo y SILAC 1D-LC ..................................................................................................................................... 128 Tabla 2-12 Resumen proteínas expresadas diferencialmente en JEG-3 vs. HTR-8/SVneo ..................................................................................................................................... 135 Tabla 2-13 Datos identificación y cuantificación del transportador de monocarboxilato 4 ..................................................................................................................................... 136 Tabla 2-14 Resumen proteínas expresadas diferencialmente en respuesta al TGF-β .. 138 Tabla 3-1 Características de algunas poblaciones de EV. ............................................ 145 Tabla 3-2 Rango de material trofoblástico perdido de la placenta a la circulación materna ..................................................................................................................................... 147 Tabla 3-3 Medición de EVs derivadas de líneas celulares de trofoblasto usando NTA.. 159

Contenido XI

Tabla 3-4 Esquema experimental para el análisis proteómico comparativo de EVs ......164 Tabla 3-5 Clúster de interes producto de la clasificación funcional de proteínas identificadas en EVs derivadas de JEG-3 y HTR-8/SVneo ............................................170 Tabla 3-6 Términos vinculados al clúster de interes ......................................................171 Tabla 3-7 Proteínas humanas más intensas identificadas unicamente en un modelo ...174 Tabla 3-8 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en cada modelo .............................................................................................................179 Tabla 3-9 Proteínas cuantificadas significativamente en EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo, inducidas por TGF-β ......................................................................................................180 Tabla 3-10 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en común ............................................................................................................184 Tabla 3-11 Proteínas cuantificadas significativamente en EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo, inducidas por TGF-β de forma conjunta ........................................................................185 Tabla 3-12 Proteínas identificadas a nivel general en EVs derivados de trofoblasto .....193 Tabla 3-13 Proteínas identificadas y reguladas por TGF-β en EVs de HTR-8/SVneo ....194 Tabla 3-14 Proteínas identificadas y reguladas por TGF-β en EVs de JEG-3 ................195 Tabla 5-1 Tipos de rotor y conversión de aceleraciones de ultracentrifugación. ............235 Tabla 5-2 Condiciones de cultivo celular según experimento. .......................................237 Tabla 5-3 Composición buffer lisis EVs. ........................................................................238 Tabla 5-4 Condiciones E2D según experimento. ...........................................................240 Tabla 5-5 Diseño experimento DIGE. ............................................................................241 Tabla 5-6 Muestras analizadas en el experimento DIGE. ..............................................241 Tabla 5-7 Comparación medio F-12 contra RPMI 1640, componentes únicos. .............255 Tabla 5-8 Comparación F-12 contra RPMI, componentes compartidos. ........................256 Tabla 5-9 Comparación medio DMEM contra RPMI 1640, componentes únicos. ..........256 Tabla 5-10 Comparación DMEM contra RPMI, componentes compartidos. ..................257 Tabla 5-11 Niveles séricos maternos de TGF-β1. ..........................................................257 Tabla 5-12 Niveles séricos maternos de TGF-β.............................................................257 Tabla 5-13 Radio mínimo estimado para proteínas de diferentes masas.......................261 Tabla 5-14 Proteínas globulares de peso molecular y Rs conocido ...............................261 Tabla 5-15 Resultados Nanosight aguas de lavado del tubo. ........................................276 Tabla 5-16 Proteínas identificadas con expresión reportada en placenta o trofoblasto ..279

Contenido XII

Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición

g Aceleración de la gravedad Nkg

fuerza gravitatoria por unidad de

masa del cuerpo que la experimenta

rpm Revoluciones por minuto 160

Hz =π

30∙

rads

Unidad de frecuencia Velocidad

angular

a Coeficiente 1 Tabla 3-1

c Concentración de la cantidad de materia

molm3

𝑛𝑛𝑉𝑉

D Constante de difusión Ec. 3.1

K Coeficiente de equilibrio 1 Ec. 2.5

kB constante de Boltzmann 1,3806×10−23J/K

L Longitud m DF

N Número de Avogadro Ec. 3.1

Q Calor kJ 1. LT

R Constante de los gases Ec. 3.1

r Radio de una partícula Ec. 3.1

T Temperatura K Ec. 3.1

t tiempo s Ec. 3.1

Abreviaturas Abreviatura Término (PAI)-I ADM

Inhibidor del activador de plasminógeno Adrenomedulina

Contenido XIII

Abreviatura Término Akt Serín / treonín proteína quinasa ALK Quinasa similar al receptor de activina AMPc Adenosina monofosfato cíclico ARNm Ácido ribonucléico mensajero AMPK Proteín quinasa activada por AMP ATP Adenosín trifosfato BMP Proteína morfogénica de hueso BSA Albúmina sérica bovina CAF fibroblastos asociados a cáncer / cancer-associated fibroblasts CAM Molécula de adhesión celular / cell adhesión molecule CDK Quinasa dependiente de ciclina

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- propanesulfonate

CLIC Chloride intracellular channel protein / Canal intracellular de cloruro CRI Inflamación relacionada a cáncer CSC células madre de cáncer / cancer stem cells CT Citotrofoblasto C.V. Coeficiente de variación Cy Cyanine / Cianina DAG Diacilglicerol DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium, medio de cultivo DMSO Dimetilsulfóxido DNA Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico DRM membranas resistentes a detergentes, detergent-resistant membranes DSB Rompimientos de doble hebra, double-strand breaks DTT Ditiotreitol E2D Electroforesis bidimensional en gel ECM Matriz extracelular EGF Factor de crecimiento epidermal / epidermal growth factor EGFR Receptor del Factor de crecimiento epidermal EIC Cromatograma de iones extraidos (extracted-ion chromatogram) ENO Enolasa ER endoplasmic reticulum E.S. Puntaje de enriquecimiento (Enrichment Score) ESI Electrospray, ionizador de masas ETG Enfermedad Trofoblástica Gestacional EV Vesícula extracelular EVT Citotrofoblasto extravelloso F-12 Ham's F12 Medium FAK Quinasa de adhesión focal F.C Razón de cambio (Fold change) FGF Factor de crecimiento de fibroblastos /fibroblast growth factor

XIV Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Abreviatura Término GDF Factor de diferenciación de crecimiento GFR Receptor de factor de crecimiento GMP Guanidína monofosfato cíclico GO Ontología Génica HAT Histona acetil transferasa hCG Hormona gonadotropina coriónica humana HDAC Histona deacetilasa HIF Hypoxia inducible factor / Factor inducible de hipoxia HLA-G Antígeno de histocompatibilidad clase I, G HM Mola hidatidiforme Hpa Heparanasa HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia HSP Proteína de choque térmico / Heat shock protein HTR8/SVneo Línea celular inmortalizada de citotrofoblasto extravelloso invasivo humano IAA Iodoacetamida ICAM Molécula de Adhesión Intercelular / Intercellular Adhesion Molecule IEF Isoelectroenfoque IL Interleucina ILV Vesículas Intraluminales / Intralumenal Vesicles INC Instituto Nacional de Cancerología IP3 Inositol 1,4,5-trifosfato iPS stem cell pluripotente inducidas JAR Línea celular derivada de coriocarcinoma humano JEG-3 Línea celular derivada de coriocarcinoma humano KRT8 Citoqueratina 8 kVH KiloVoltios – Hora LC Liquid Chromatography, cromatografo líquido LFQ Cuantificación libre de marcaje, label free quantification LIF Factor inhibitorio de leucemias LTBP Proteína de unión al TGF-β MALDI Matrix-assisted laser desorption ionization, ionizador de masas MAPKs Proteínas quinasa activadas por mitógenos MEC Matriz extracelular

MET Factor de transición mesenquimal epitelial, Receptor del factor de crecimiento hepatocito

MHC Complejo Mayor de Histocompatibilidad / Major Histocompatibility Complex miRNA microRNA MIS Sustancia inhibitoria müleriana MMP Metaloproteasa de matriz MPI Inhibidores de metaloproteasas MS Espectrometría de masas MS/MS Espectrometría de masas en tándem MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-

Contenido XV

Abreviatura Término 2H-tetrazolium

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MVB Cuerpo Multi-vesicular / Multivesicular body MVE Endosoma Multi-vesicular / Multivesicular endosomes NHEJ non-homologous end joining, recombinación no homóloga NR Receptor nuclear / Nuclear receptort nLC Cromatografía líquida nano, nanoliquid chromatography PBS Phosphate Buffered Saline, buffer fosfato salino PI3K Fosfoinositol 3-quinasa PI3P Fosfoinositol 3 fosfato PKM Piruvato quinasa PLAP Fosfatasa Placental Alcalina / Placental Alkaline Phosphatase PDXN Peroxiredoxina PTEN Fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa PTK Proteína tirosina quinasa Q Cuadrupolo, analizador de masas RET Rearreglo durante transfección, Receptor tirosina quinasa RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico ROS Especie reactiva de oxígeno / reactive oxigen species RPMI Roswell Park Memorial Institute medium, medio de cultivo RTK Receptor tirosina quinasa SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS SFB Suero fetal bovino SILAC Marcación con isótopos estables en cultivo Smad Proteína efectora intracelular de TGF-β SNA Agregados ucleares sincitiales / syncytial nuclear aggregates ST Sincitiotrofoblasto SWI/SNF SWItch/Sucrose Non Fermentable TAM macrófagos asociados a tumores / tumour-associated macrophages TEM Microscopía Electrónica de Transmisión / transmission electron microscopy TGF-β Factor de crecimiento transformante tipo β TIMP Inhibidor tisular de metaloproteasas ToF Time of Flight, tiempo de vuelo, analizador de masas TRK Receptor tirosina quinasa transformante TβRII Receptor serina/treonina quinasa del TGF-β TXN Tioredoxina uPA Activador de plasminógeno tipo uroquinasa

VCP Proteína conteniendo valosin / ATPasa del retículo endoplasmático transicional (TER ATPasa)

VIM Vimentina VT Citotrofoblasto velloso XIC Corriente de iones extraidos / Extracted ion currents

Contenido XVI

Publicaciones y divulgación Artículos Originales Novoa-Herran, S. S., A. Umaña-Pérez, F. Canals and M. Sanchez-Gomez. Serum

depletion induces changes in protein expression in the trophoblast-derived cell line HTR-8/SVneo. Cellular & Molecular Biology Letters. 2016; 21-22 DOI: 10.1186/s11658-016-0018-9

Novoa-Herrán, S. S. and M. Sánchez-Gómez. Obtención de un sub-proteoma de citoplasma de una línea celular de trofoblasto mediante fraccionamiento con detergentes. Revista de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales.2011; 35(136): 277 - 285.

Participación y Memorias de Eventos Ponencia oral y participación en el Segundo Congreso Colombiano de Bioquímica

y Biología Molecular – C2B2, noviembre 3-5, 2016 en Medellín, Colombia. CO1 Isolation of extracellular vesicles secreted by trophoblast-derived JEG-3 cells suitable for proteomic analysis; Novoa-Herrán SS, Morales-Prieto DM, Schmidt A, Lehmann R, Slevogt H, Sanchez-Gomez M, Markert U. Memorias Segundo Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular, 2016;2:66. Reconocido con Mención de honor al mejor trabajo en el área temática Humanos. PO116 Efecto del TGF-beta en la actividad enzimática de MMPs y la expresión génica de TIMPs en células HTR-8/SVneo de trofoblasto humano. Gaitán FA, Gómez Esguerra G, Novoa Herrán SS, Umaña Pérez A, Sánchez de Gómez M. Memorias Segundo Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular, 2016; 2:218.

Conferencista invitada al VI Simposio de Enfermedades Asociadas a Procesos Genéticos y Conmemoración del Día Internacional de las Enfermedades Raras y Día Internacional de los Defectos Congénitos, febrero 27, 2016, Bogotá, Colombia: El trofoblasto:de la Placenta a modelo de estudio del Cáncer. Publicado en: Novoa-Herrán SS. El trofoblasto: de la placenta a modelo de estudio del cáncer. Salutem Scientia Spiritus. 2016; 2(Suppl 1):52-3.

Poster y participación en HUPO 14th Annual World Congress Human Proteome

Organization HUPO 2015, septiembre 27 - 30, 2015 en Vancouver, Canada. S.S. Novoa-Herran, M Sanchez-Gomez (2015). Assessment of Network Systems Using Background Information to Reveal Relevance of Proteomic Data.

Contenido XVII

Poster en 35th Annual Meeting of the American Society for Reproductive Immunology – ASRI, Junio 2-5, 2015, Kingston, Canada. SS Novoa-Herran, DM Morales-Prieto, M Sanchez-Gomez, UR Markert. HTR-8/SVneo and JEG-3 cells respond differentially to serum conditions.

Poster en 12th Conference of the European Society for Reproductive Immunology – ESRI, Septiembre 21-24, 2015, Oxford, UK. Novoa-Herran, S. S., D. M. Morales-Prieto, M. Sanchez-Gomez and U. R. Markert. Serum and culture medium affect differentially HTR-8/SVneo and JEG-3 cells survival. Journal of Reproductive Immunology. 2015;111: 27-27.

Poster y participación en 7th Postgraduate Symposium on Cancer Research, Abril 25, 2015, Dornburg, Alemania. S. Novoa-Herran, M. Monge, A. Umaña-Perez, F. Canals, M. Sanchez-Gomez. Serum-depletion affects protein trophoblast expression, resembling a tumoral adaptive switch.

Poster en 13th Annual World Congress of the Human Proteome Organization HUPO 2014, Octubre 5-8, 2014, Madrid, Spain. Novoa-Herrán, S. S., M. Monge, F. Canals and M. Sanchez-Gomez. Transforming Growth Factor beta regulates novel proteins in a human trophoblastic cell model.

Poster y Participación en C2B2 2014 Primer Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular, junio 4-7, 2014, Bogotá. Novoa-Herran SS, Sanchez-Gomez M. PO-157 Propuesta de un pipeline para análisis bioinformático de datos proteómicos comparativos, mediante sistemas de análisis de redes. Memorias Primer Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular 2014, 1: 126

Novoa-Herran SS, Cuervo P, Sanchez-Gomez M. PO-31Análisis proteómico comparativo del trofoblasto humano y su forma maligna. Memorias Primer Congreso Colombiano de Bioquímica y Biología Molecular 2014, 1: 252. Mejor Poster Área de Salud Humana

Poster y Participación en 5th Congress of the Spanish Proteomics Society Seprot,

febrero 5-8, 2013, Barcelona, España. Novoa-Herran, S. S., M. Sanchez-Gomez, P. Cuervo and L. Ilag. P32 Subcellular fractionation as a strategy to identify key proteins related with oncogenesis.

Presentación oral y participación en XLVII Congreso Nacional de Ciencias

Biológicas, octubre 9-13, 2012, Cali, Colombia. Novoa-Herrán, S. S., P. Cuervo and M. Sanchez-Gomez. Búsqueda de oncogenes

mediante proteómica diferencial de citoplasma en líneas celulares de trofoblasto humano. Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas 2013;24 (Sup 1): 72.

Rodríguez RA, Urrego W, Novoa-Herrán SS, Umana-Perez A, Sanchez-Gomez M Obtención de proteomas en plasma humano para la identificación de biomarcadores. Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas 2012; 24 (Sup 1): 113.

XVIII Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Castelblanco, M., S. S. Novoa-Herrán, A. Umaña-Pérez and M. Sanchez-Gomez. TGF-β: modulador de la expresión de MMP-9 y uPA en trofoblasto humano. Revista de la Asociación Colombiana de Ciencias Biológicas 2012;24 (Sup 1): 149.

Conferencista invitada al Seminario de Investigación de la Facultad de Ciencias de

la Pontificia Universidad Javeriana, mayo 3, 2012, Bogotá, Colombia: Análisis de la malignización celular mediante comparación de los perfiles de proteínas del trofoblasto y el coriocarcinoma.

Conferencista invitada al Seminario Básico del Centro de Estudio de Enfermedades Autoinmunes CREA de la Universidad del Rosario, febrero 8, 2012, Bogotá, Colombia: Señalización intracelular y mecanismos de transducción de señales.

Desarrollo de Cursos y Talleres Instructora, junio 3 a 4, 2014, Bogotá, Colombia. Propuesta de los contenidos y organización del Curso Pre-Congreso “Estrategias de Análisis en Proteómica”, May, 2014; dictado en el marco del C2B2 - 2014. http://c2b2.com.co/actividades/cursos-pre-congreso/ Sesiones impartidas: Identificación de proteínas por búsqueda en bases de datos y

Análisis bioinformático de resultados proteómicos Diseño e implementación de los talleres: Identificación de proteínas por búsqueda en

bases de datos y Análisis bioinformático de datos proteómicos.

Introducción La malignización celular y el cáncer que origina constituye una enfermedad potencialmente mortal y un problema de salud pública, por eso es de gran interés conocer y comprender las claves moleculares implicadas en el proceso de malignización. Sin embargo, a pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento terapéutico, la mayoría de las muertes por cáncer resultan del crecimiento progresivo de las metástasis que son resistentes a las terapias convencionales; esto se da debido a que la metástasis puede ocurrir antes de que se diagnostique el tumor primario. No obstante, no todas las células que invaden son cancerosas; un ejemplo es el trofoblasto. Las células de trofoblasto hacen parte de la placenta y son las encargadas de invadir el endometrio materno durante el proceso de implantación del blastocisto. Estas comparten muchas características con células tumorales y metastáticas como el alto nivel de proliferación e invasión y evasión de los efectores del sistema inmune, así como vías de señalización intracelular (Ferretti et al., 2007). No obstante, los procesos celulares en el trofoblasto se encuentran altamente controlados, regulados espacial y temporalmente, diferenciándose de las células tumorales por la expresión y actividad de proteínas involucradas tanto en vías de señalización y otros procesos regulatorios, como por proteínas efectoras de las habilidades celulares. La comparación de células trofoblásticas con tumores y células cancerosas invasivas ofrece un atractivo modelo que no había sido explotado, y que permite comprender el origen y desarrollo del crecimiento maligno. El trofoblasto se desarrolla durante el primer trimestre de embarazo y está formado por diferentes poblaciones celulares, incluyendo: citotrofoblasto velloso, citotrofoblasto extravelloso y sincitiotrofoblasto. In vivo, las células citotrofoblásticas extravellosas (EVT) pasan inicialmente por un estadío de diferenciación altamente proliferativo, constituyendo columnas célulares que luego se diferencian en un fenotipo invasivo perdiendo su potencial replicativo, para finalmente diferenciarse y residir en el tejido materno como citotrofoblasto endovascular, intersticial o células gigantes del lecho placentario (Paul Bischof & Irminger-Finger, 2005). La invasión del trofoblasto es un proceso vital cuya desregulación genera patologías como la pre-eclampsia (PE), retardo en el crecimiento intrauterino (FGR) y enfermedades trofoblásticas (ETG) (Chakraborty et al., 2002). Una de las formas más malignas de la ETG es el coriocarcinoma, el cual es un tumor de rápido crecimiento y habilidad invasiva, debido a su alta afinidad y capacidad de invasión de las arterias espirales, o angioinvasión, que conduce a metástasis más extensas (Cheung, 2003). Uno de los factores que diferencia el comportamiento regulado del trofoblasto del coriocarcinoma es el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Suficiente evidencia demuestra la regulación que ejerce el TGF-β en la fisiología del trofoblasto, especialmente en la invasión (Pollheimer & Knöfler, 2005). Este controla de forma

2 Introducción

negativa la proliferación, migración e invasión del trofoblasto, mientras que en coriocarcinoma se ha observado una refractancia a sus efectos (Graham et al., 1994; Lala et al., 1998). Se piensa que esta resistencia puede ser debida a alteraciones en la vía de señalización del TGF-β (G. Xu et al., 2001b). Debido a las limitaciones que implica el trabajo con cultivos primarios de trofoblasto, diferentes líneas celulares se han desarrollado para estudiarlo. Las más empleadas han sido la línea celular inmortalizada de trofoblasto HTR8/SVneo (Graham et al., 1993) y la línea celular derivada de coriocarcinoma JEG-3 (Kohler & Bridson, 1971). Otras líneas celulares se han desarrollado, incluyendo a la línea celular de trofoblasto humano de primer trimestre ACH-3P (Hiden et al., 2007), la línea celular no transformada representativa de trofoblasto humano normal NPC (Zhao et al., 2006), la línea celular derivada de trofoblasto humano transformado ED27 (Smith et al., 2001), y una línea de citotrofoblasto normal establecida en medio libre de suero (Rong-Hao et al., 1996). El estudio de líneas celulares derivadas de trofoblasto y de coriocarcinoma puede permitir la identificación de los cambios moleculares que son la base de la progresión tumoral. Congruente con esto, la identificación de las proteínas y vías que juegan un rol en la regulación del trofoblasto y su papel durante el proceso de malignización, contribuirán a comprender mejor este proceso de desarrollo único. Estas proteínas pueden constituir claves moleculares que indiquen la falta de regulación existente en el coriocarcinoma con respecto al trofoblasto y que ayuden a diferenciar el fenómeno de invasión fisiológica del de invasión patológica, ampliando de esta forma el panorama que permita comparar la regulación existente en el trofoblasto con respecto al cáncer. Se sabe que alteraciones esenciales en la fisiología celular conducen al crecimiento maligno, y que la resistencia a supresores tumorales como el TGF-β es sumamente relevante en la progresión del tumor. Dada la importancia del TGF-β y la evidencia experimental que lo correlaciona con los procesos de carcinogénesis, el estudio de las proteínas expresadas en respuesta al TGF-β en modelos de trofoblasto y coriocarcinoma puede brindar un nuevo escenario para detectar diferencias claves entre los dos fenotipos celulares. Teniendo en cuenta las características de los circuitos moleculares, que generan una complejidad tanto en su proceso de señalización como en los efectos obtenidos, es necesario estudiar globalmente los perfiles de expresión de proteínas generados en respuesta al TGF-β para tener un abordaje más fidedigno a la naturaleza de los procesos regulados. Así se pueden determinar otros estamentos celulares potencialmente involucrados que ayuden a explicar las diferencias entre el trofoblasto y el coriocarcinoma. La hipótesis a probar en este trabajo fue si la pérdida de regulación de la proliferación e invasión que caracteriza al coriocarcinoma en comparación con el trofoblasto, se refleja en cambios en los perfiles de expresión de proteínas en condiciones fisiológicas y en respuesta a factores que los diferencian como el TGF-β; de tal forma que se puedan identificar proteínas implicadas en el cambio que conduce a un fenotipo maligno, y que juegan un rol relevante durante los fenómenos de proliferación e invasión descontrolada. Teniendo en cuenta lo anterior, este proyecto se planteó como un estudio básico experimental de tipo exploratorio, dirigido a comparar un modelo de trofoblasto humano con su contraparte maligna, e identificar las proteínas responsables de la diferencia en la

Introducción 3

regulación entre los dos modelos, y relevantes para el proceso de malignización celular. El objetivo general del trabajo fue estudiar y comparar los perfiles de expresión de proteínas en condiciones fisiológicas y en respuesta al factor anti-proliferativo / anti-invasivo TGF-β, en las líneas celulares derivadas de trofoblasto HTR8/SVneo, y de coriocarcinoma JEG-3, mediante técnicas proteómicas. Para desarrollar este estudio se consideraron tres enfoques, empleando como eje principal el análisis proteómico y complementándolo con caracterización celular, análisis funcionales y de expresión. En el primer capítulo se consideró a la línea celular inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo como un modelo interesante para el estudio del cáncer y se evaluó su idoneidad como modelo. En el segundo capítulo se realizó un estudio comparativo entre la línea HTR-8/SVneo y la línea derivada de coriocarcinoma JEG-3, considerando que la línea HTR-8/SVneo retiene la capacidad de responder a señales regulatorias y presenta un fenotipo regulado que genera una invasión fisiológica, a diferencia del fenotipo neoplásico que presenta la línea JEG-3. En el tercer capítulo se estudió de forma comparativa las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de estos dos modelos, incluyendo exosomas, como un mecanismo de comunicación y modulación del microambiente. Cada enfoque consideró diferentes condiciones de cultivo y la respuesta al tratamiento con el TGF-β. Para la obtención de estos resultados se implementaron diferentes estrategias experimentales y técnicas proteómicas, incluyendo cuantificación por marcación con isótopos estables en cultivo SILAC, y cuantificación libre de marcaje XIC. Por último, las proteínas identificadas se analizaron con herramientas bioinformáticas y generación de redes hipotéticas funcionales. Así, el abordaje de esta tesis pretende ser contextual, considerando no solo los cambios internos a la célula - reflejados en su proteoma, sino también la influencia del microambiente a través de diversas condiciones nutricionales y la posible modulación de este a través de EVs y exosomas derivados de trofoblasto. En síntesis, la comparación de células tumorales con su contraparte benigna permitiría la identificación de las proteínas que diferencian estos dos tipos celulares y que puedan juegar un rol en la regulación de la proliferación e invasión del trofoblasto a través de la gestación y su papel durante el proceso de malignización e invasión tumoral. Los resultados de este estudio contribuirán a un mejor entendimiento de este proceso de desarrollo único, así como constituirán claves que indiquen la falta de regulación del proceso invasivo del coriocarcinoma. Gran parte de las proteínas responsables de esta regulación y de la ejecución de los procesos celulares son aún desconocidos; por lo tanto, en el estudio del perfil de proteínas expresadas por estas células se pueden encontrar claves moleculares que ayuden a entender las diferencias existentes entre una célula normal y una maligna.

1. Capítulo 1: El trofoblasto como modelo de estudio del cáncer

El trofoblasto es un grupo de células que forman la capa externa del blastocisto, provee nutrientes al embrión y se desarrolla como parte importante de la placenta. Este tejido se forma durante el primer trimestre de embarazo y está compuesto por células invasivas y metastáticas por medio de las cuales se logra la implantación del embrión al endometrio uterino (P. Bischof et al., 2001). El trofoblasto se compone de varias poblaciones celulares con diferentes morfologías: el citotrofoblasto velloso (VTs) que está en el compartimiento fetal, el sincitiotrofoblasto (ST) que cubre la vellosidad coriónica flotante y es débilmente proliferativo, y el citotrofoblasto extravelloso (EVTs) que abandona su matriz extracelular (MEC), migrando a y residiendo en el tejido uterino materno, donde forma las vellosidades coriónicas de anclaje, que son columnas celulares altamente proliferativas que atacan y penetran la barrera uterina. El EVT rompe múltiples membranas basales (incluyendo el endometrio epitelial y glandular, vasos sanguíneos y células deciduales) y degrada la matriz extracelular intersticial del endometrio, hasta producir la invasión del estroma uterino y del tercio próximo del miometrio; asimismo invade las arterias espirales maternas, modificándolas drásticamente para aumentar el flujo sanguíneo al reemplazar las paredes de los vasos por un material fibrinoide y diferenciándose en EVT endovascular. Una adecuada invasión por parte del trofoblasto es vital para el establecimiento del embarazo (P. Bischof et al., 2001; Ferretti et al., 2007). El tejido trofoblástico comparte muchas características con células tumorales y cancerosas, desde las vías de señalización que implementa hasta las habilidades que desarrolla, como un alto nivel de proliferación, falta de inhibición por contacto celular, propiedades de migración e invasión y capacidad para escapar de efectores del sistema inmune, por lo cual muchas veces se le denomina “pseudo-maligno” o “fisiológicamente metastático”. Investigaciones realizadas en las últimas décadas se encuentran en línea con la hipótesis según la cual el trofoblasto y las células cancerosas usan mecanismos similares implementados por circuitos moleculares idénticos para llevar a cabo sus procesos de proliferación, migración e invasión (Ferretti et al., 2007; Fitzgerald et al., 2005; Holtan et al., 2009). No obstante, a pesar de que se han hecho varias revisiones al respecto y se han propuesto líneas celulares como modelos biológicos de progresión tumoral (Lala et al., 2002), no hay estudios experimentales que empleen cultivos celulares de trofoblasto como modelo in vitro para estudiar la bioquímica y fisiología / patología de la célula cancerosa. La línea celular HTR-8/SVneo es una línea inmortalizada de EVT invasivo, aislada de un explante de placenta humana de primer trimestre (Graham et al., 1993), y empleada usualmente como modelo in vitro en estudios de enfermedades asociadas al embarazo, principalmente pre-eclampsia (O'Tierney-Ginn & Lash, 2014), y en estudios específicos

6 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

como su respuesta frente a hipoxia (Canning et al., 2001; Kilburn et al., 2000; Salomon et al., 2013). Esta línea es un modelo interesante para estudiar el cáncer, no solo por el hecho de ser derivada de trofoblasto y compartir varias similitudes fenotípicas con las células normales HTR-8 - incluyendo habilidades invasivas in vitro - sino también por exhibir ciertas características que la alejan de un cultivo primario, debido al proceso de transformación/inmortalización con el antígeno T grande del virus de simio SV40, el cual tiene la capacidad de causar tumores. Estas características incluyen un nivel de proliferación y replicación ligeramente mayor que el de su línea parental (Graham et al., 1993; Lala et al., 2002), que puede ser generado por posible alteración de p53 y pRb como se ha visto en otros modelos (Khoo et al., 1998). Adicionalmente, se acerca a una stem cell, como sugiere Weber et. al. (Weber et al., 2013) al observar un perfil de expresión de factores de transcripción tipo stem cells, en el que las células de HTR-8/SVneo parecen presentarse como células progenitoras de citotrofoblasto, sugiriendo un proceso de de-diferenciación, lo cual le brinda múltiples potencialidades y opciones de diferenciación. Por otra parte, estudios del perfil de expresión de microRNA (Morales-Prieto et al., 2012), firmas de expresión génica (Bilban et al., 2010) y la expresión de genes relacionados con invasión (P. Suman & Gupta, 2012) confirman la cercanía de HTR-8/SVneo con células de trofoblasto primario, particularmente con el fenotipo invasivo de primer trimestre, empero también resaltan ciertas divergencias. Como hipótesis del presente capítulo considero a la línea HTR-8/SVneo como un modelo interesante para estudiar el crecimiento y la progresión maligna. El objetivo general es evaluar la validez de la línea celular inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo como modelo para estudiar la biología del fenotipo maligno. En consecuencia, se estudiarán el crecimiento celular y los perfiles de expresión de proteínas en condiciones fisiológicas (modeladas con SFB al 10%) y en respuesta a factores de crecimiento tipo supresor tumoral como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y a diversas situaciones nutricionales (generadas por diferentes dosis de SFB), utilizando células de la línea HTR8/SVneo como modelo biológico.

1.1 Influencia del suero en el cultivo como condición nutricional

Se sabe que los tumores sólidos en las etapas tempranas de desarrollo están expuestos con frecuencia a estresores ambientales como hipoxia, acidosis y deprivación nutricional, condiciones que son superadas por las células tumorales, al ganar un fenotipo más agresivo (Rofstad, 2000). De forma similar a los tumores, el tejido trofoblástico como constituyente principal de la placenta se ve sometido a condiciones cambiantes durante el desarrollo del embarazo: el microambiente intrauterino del trofoblasto en las primeras semanas de gestación presenta una baja concentración de oxígeno (G. Burton et al., 2003) y la nutrición está sustentada por las secreciones de las glándulas endometriales ante la baja circulación sanguínea materna, siendo conocida como histotrófica (G. J. Burton et al., 2007). Tras la implantación y el remodelamiento vascular de las arterias maternas por el trofoblasto, se da un cambio de nutrición histotrófica a hemotrófica, con un cambio de relación de deciduocorial a hemocorial (G. Burton et al., 2010; L. K. Harris, 2010), momento en el cual la tasa de proliferación e invasión del trofoblasto disminuye y se mantiene así durante el resto del embarazo, sufriendo incluso apoptosis inducida por macrófagos maternos (Huppertz et al., 2006).

Capítulo 1 7

Considerando estas habilidades del trofoblasto y enfatizando en el aspecto nutricional, se evaluó la respuesta de células de HTR-8/SVneo frente a diversas dosis de SFB, incluyendo su respuesta y supervivencia frente a la depleción de suero. Se determinó mediante MTT la viabilidad y el crecimiento celular. A continuación se estudió el perfil proteómico expresado por células cultivadas con SFB al 0,5% como una dosis baja, y cultivadas en ausencia de suero, comparando la respuesta con células cultivadas con SFB al 10%, considerado como control de cultivo y que brinda unas condiciones cercanas a las fisiológicas (S. Novoa-Herran et al., 2016).

1.1.1 Efecto del suero y su depleción en la viabilidad celular de la línea HTR-8/SVneo

La viabilidad y crecimiento de células de HTR-8/SVneo, cultivadas con diferentes dosis de SFB, fue evaluado mediante el ensayo colorimétrico de MTT, el cual permite determinar la actividad metabólica celular a través de la actividad de enzimas oxido-reductasas, lo cual, bajo ciertas condiciones, refleja el número de células viables (Anexo A 2a). En este ensayo, 10.000 células fueron sembradas por pozo en una placa de 96 pozos, adheridas por 12 horas, deprivadas toda la noche en medio libre de suero y cultivadas con diferentes dosis de SFB (0, 0,1, 0,5, y 10%) para ser finalmente evaluadas a diferentes tiempos: 0, 24, 48 y 64 horas. Se realizaron triplicados biológicos y los cambios en el número celular fueron monitoreados y confirmados por microscopía de contraste de fase. Los datos se analizaron con el test de ANOVA de doble vía y postest Bonferroni para la interpretación de los datos (n=3, * p<0.05, *** p<0.001). En la Figura 1-1 se puede observar el efecto de las dosis de SFB 0, 0,1, 0,5 y 10% en el crecimiento de células HTR-8/SVneo evaluadas por MTT a las 0, 24, 48 y 64 horas. Se determinó que estas células tienen una alta actividad metabólica y proliferación tanto en presencia como en ausencia de suero a tiempos menores a 64 horas. Los resultados espectrofotométricos correlacionaron con un incremento en el número celular, monitoreado por microscopía (datos no mostrados). Como se observa en la figura, la dosis de SFB 0,5% juega un rol de soporte, sin afectar significativamente el crecimiento celular. Por otro lado, dosis menores de SFB como 0,1% generaron resultados similares a la depleción de suero. De forma interesante, en estas situaciones se observó una tasa de crecimiento significativamente mayor que la registrada para 0,5% a las 48 horas (* p<0.05 para 0%; *** p<0.001 para 0.1%). No obstante, la viabilidad celular con estas bajas dosis de suero (0 y 0,1%) presentó una caída significativa a las 64 horas, comparado con la dosis de 0,5%, que mantiene la viabilidad celular sin un incremento apreciable en el número de células (p<0.05 para 0% SFB). La confluencia celular fue verificada de forma óptica, determinando un alto número de células en los cultivos con 0, 0,1 y 10% de SFB a las 24 y 48 horas, comparado con cultivos con 0,5%.

En síntesis, estos resultados muestran que las células de HTR-8/SVneo responden a la depleción de suero de forma diferente que frente a dosis bajas como 0,5%, sugiriendo un efecto de la depleción sobre el crecimiento celular, adicional a la simple deprivación de nutrientes y factores mitogénicos. La depleción de suero podría estar afectando no solamente procesos metabólicos, sino también influenciando la expresión de proteínas; así pues, es de interés estudiar los perfiles proteómicos que se presentan en respuesta estas dos condiciones de cultivo.

8 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 1-1 Viabilidad y crecimiento de células HTR-8/SVneo con varias dosis de suero.

n=3, test ANOVA de dos vías, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001 para cada pareja comparada

1.1.2 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta a una dosis baja de suero (SFB 0,5%)

Exploración inicial – minigeles 2DE Inicialmente se realizó un análisis proteómico usando geles E2D de 7 cm. Células de HTR-8/SVneo fueron sembradas en platos de 100 mm, deprivadas por 13 horas y cultivadas durante 24 horas en medio suplementado con SFB al 0,5% ó al 10%, considerado de aquí en adelante como control de cultivo. El extracto total de proteína fue obtenido mediante lisis con buffer RIPA y 150 μg de proteína fue separado en geles 2DE (7 cm, pI 4-7, tinción de proteínas con Comassie Coloidal, Anexo A: 5a) y se realizó un análisis comparativo de las imagenes. Los spots de proteína con expresión diferencial y algunos invariables con respecto al control fueron seleccionados e identificados por MALDI MS ToF y búsqueda con MASCOT (VHIO, Barcelona), dando lugar a 34 proteinas únicas identificadas. (Tabla 1-1). Las proteínas identificadas como reguladas a la baja en respuesta al SFB 0,5% (azul), anotan para procesos como regulación negativa de la apoptosis, morfogénesis de componentes celulares, procesos metabólicos de ácidos grasos, polisacáridos y purinas, regulación de la traducción, regulación por calcio y transporte del aparato Golgi al endosoma, entre otros. Estos procesos biológicos son coherentes con el papel fisiológico que ejerce una dosis normal de SFB (10%) sobre las células, al estimular procesos como proliferación celular y síntesis de proteínas, y activar el metabolismo. El número de proteínas reguladas al alza en respuesta al SFB 0,5% (rojo) es mucho menor, como es de esperarse en un estado quiescente, sugerido por los resultados de MTT (Figura 1-1); entre ellas se encuentran chaperonas y proteínas adaptadoras de complejos proteicos con funciones de plegamiento proteico y respuesta a estrés.

Ensayo de MTT

0 24 48 640

100

200

300

400

600800

0% 0,1% 0,5% 10%

***

*

*

***

***

*

SFB:Tiempo (h)

% V

iabi

lidad

(rel

ativa

a S

FB 0

% 0

h)

Tabla 1-1: Proteínas identificadas en respuesta al suero 0,5%: ensayo preliminar.1 Gene name Protein name MW

(kDa) pI~ MS Score

Pep match (% Seq)

Fold FBS 0.5/10% Molecular function Biological process

HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha 85 4,94 103 31(41.7) 3,30 Nucleotide, Poly(A) RNA & protein binding protein folding

HSP90AB1 Heat shock protein HSP 90-beta 84 4,97 146 37(44.2) 3,30 Nucleotide, Poly(A) RNA & protein binding protein folding

STIP1 Stress-induced-phosphoprotein 1 63 6,4 75,8 23(36.1) 1,83 Poly(A) RNA and protein binding protein folding

WDR1 WD repeat-containing protein 1 67 6,17 88,3 16(36) 1,83 actin binding cellular component movement

SRRT Serrate RNA effector molecule homolog 101 5,7 85,6 30 (31.5) 1,71 Poly(A) RNA & protein binding Primary miRNA processing

KIF11 Kinesin-like protein KIF11 120 5,47 74.5 23(21.3) 1,71 microtubule motor activity vesicle-mediated transport

TLN1 Talin-1 272 5,77 256 61(33.4) 1,69 actin, vinculin & integrin binding Cell-cell junction assembly

ACTG1 Actin, cytoplasmic 2 42 5,31 169 27(73.6) 1,40 structural constituent of cytoskeleton intracellular protein transport

ANP32A Acidic leucine-rich nuclear

phosphoprotein 32 family member A

29 3,99 170 20(61.0) 1,39 phosphatase inhibitor activity Intracellular signal transduction, Nucleocytoplasmic transport

LIMA1 LIM domain and actin-binding protein 1 86 6,41 79,2 22(29.4) 1,18

Actin filament binding, sequence-specific DNA binding transcription factor

activity

Negative regulation of actin filament depolymerization

CCT2 T-complex protein 1 subunit beta 58 6,01 209 36(71.8) 1,13 ATP & protein binding protein complex assembly

HSPA5 78 kDa glucose-regulated protein 72 5,07 161 31(45.1) 1,06 Chaperone binding Regulation of protein folding in endoplasmic reticulum

TUBA1A Tubulin alpha-1A chain 51 4,94 94 15(42.4) 1,06 structural constituent of cytoskeleton cellular component movement

CCT5 T-complex protein 1 subunit epsilon 60 5,45 92 25(48.1) -1,26 ATP, unfolded protein & G-protein beta-subunit binding Response to virus

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 58 7,96 75,7 20(39.5) -1,26 Pyruvate kinase activity Glycolytic process

1 MW (kDa), peso molecular teórico y experimental en kDaltons; pI~, pI teórico; MS score, score de identificación dado por Mascot; % Seq, porcentaje de cubrimiento de secuencia; Pep match, número de péptidos asignados por proteína; Fold FBS 0.5% / 10%, razón de cambio de la densidad óptica del spot de proteína (nivel proteico) de proteomas con suero 0.5% (0.5% SFB) respecto al proteoma control (10% SFB). Términos GO relevantes para Función Molecular y Procesos Biológicos, obtenidos de la base de datos Nextprot y con la herramienta bioinformática DAVID.

10 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Gene name Protein name MW (kDa) pI~ MS

Score Pep match

(% Seq) Fold FBS 0.5/10% Molecular function Biological process

TCP1 T-complex protein 1 subunit alpha 61 5,8 82,5 22(41.0) -1,55 ATP, Poly(A) RNA & unfolded protein binding Tubulin complex assembly

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 58 7,96 121 24(43.9) -1,60 Pyruvate kinase activity Glycolytic process

IMMT Mitochondrial inner membrane protein 84 6,08 178 33(41.7) -1,68 Poly(A) RNA & protein binding Mitochondrial calcium ion

homeostasis

CSDE1 Cold shock domain-containing protein E1 90 5,88 62 16(17.9) -1,68 Poly(A) RNA & DNA binding Nuclear-transcribed mRNA

catabolic process, no-go decay

PFAS Phosphoribosylformylglycinamidine synthase 146 5,5 203 40(36.7) -1,77 ligase activity 'de novo' IMP biosynthetic

process

PSMD14 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14 35 6,06 129 19 (66.1) -2,05 Metallopeptidase activity, DNA binding

transcription factor activity Regulation of proteasomal protein catabolic process

ANXA2 Annexin A2 39 7,57 59 11(33.9) -2,05 protein & calcium ion binding fatty acid metabolic process, Membrane raft assembly

EEA1 Early endosome antigen 1 163 5,55 155 46(37.2) -2,21 1-phosphatidylinositol binding Endocytosis

HSPA9 Stress-70 protein, mitochondrial 74 5,87 206 33(47.1) -2,30 ATP, Poly(A) RNA & protein binding Negative regulation of apoptotic process

Gsn Gelsolin 86 5,9 129 25(38.6) -2,43 actin & calcium ion binding cellular component morphogenesis

CORO7 Coronin-7 102 5,51 117 25 (27.5) -2,62 Protein binding Golgi to endosome transport

Vcl Vinculin 124 5,5 215 45(41.5) -2,64 actin, catenin & cadherin binding cellular component morphogenesis

Pak2 Serine/threonine-protein kinase PAK 2 58 5,69 74 16(38.4) -2,79 Protein serine/threonine kinase activity Signal transduction

GANAB Neutral alpha-glucosidase AB 107 5,74 290 41 (43.1) -3,30 glucosidase activity polysaccharide metabolic process

LTA4H Leukotriene A-4 hydrolase 70 5,8 141 22(31.6) -4,15 metallopeptidase activity fatty acid biosynthetic process

IFT74 Intraflagellar transport protein 74 homolog 69 5,73 73 17(31.7) -4,15 Beta-tubulin & Chromatin binding Cilium assembly

EIF4B Eukaryotic translation initiation factor 4B 69 5,55 191 35 (51.7) -4,78 translation initiation factor activity regulation of translation

Dopey2 Protein dopey-2 260 5,9 62,6 25(12.3) -5,43 Golgi to endosome transport

PLS3 Plastin-3 71 5,41 112 23(44.0) -7,15 actin & calcium ion binding cellular component morphogenesis

Tabla 1-1: (Continuación)

Análisis proteómico diferencial – DIGE Mediante la técnica analítica de electroforesis en gel diferencial fluorescente - DIGE, se comparó el perfil proteico de células de HTR-8/SVneo cultivadas con SFB al 0,5% y al 10% (control) durante 24 horas. Para el cultivo celular y la obtención del extracto proteico se procedió de forma similar al análisis anterior, realizando triplicados biológicos. 40 μg de extracto total de proteína fue marcado con fluoroforos derivados de Cianina: la muestra de HTR8/SVneo cultivada con SFB 10% se tiñó con Cye 2, y la muestra con SFB 0,5% con Cye 3; adicionalmente se trabajó un pool de muestras teñido con Cye 5 y un pool invisible de 30 μg de proteína; los geles fueron teñidos de forma general con flamingo (ver Anexo A 5b, las imágenes de los geles están disponibles en Supl. Capítulo 2 DIGE). La comparación entre las imágenes se hizo con el test de ANOVA, spots con p <0,05 fueron considerados significativos (n=3), seleccionados y ordenados de acuerdo a su fold o razón de cambio en el nivel proteico (SFB 0,5% / SFB 10%), que se clasificó en los de mayor aumento (>2,0), aumento moderado (1,5 a 2,0), disminución moderada (-1,5 a.-2,0) y los de mayor disminución (<-2,0). El análisis estadístico muestra que el 25% de los spots de proteína presentaron un nivel diferencial, de los cuales un 39,3% fue aumentado y un 60,7% fue disminuido por el SFB al 0,5%. En general, los principales cambios fueron moderados (fold de 1,5 a 2,0 en el 30,9% de los casos; -2,0 a -1,5 en el 43,3% de los casos) (Figura 1-2). 120 spots de proteína fueron seleccionados entre spots diferenciales e invariables (fold de -1,5 a 1,5), analizados por MALDI MS-TOF (VHIO, Barcelona) e identificados por búsqueda en bases de datos con MASCOT, dando 69 proteínas identificadas únicas (Tabla 1-2).

Figura 1-2 Estadística de spots de proteína expresados por células HTR-8/SVneo cultivadas con SFB 0,5% en comparación con SFB 10%

n=3, test ANOVA, p<0.05. *, porcentaje de spots total analizados; **, porcentaje de spots

diferencialmente expresados

Tabla 1-2: Proteínas identificadas en respuesta al suero 0,5%: análisis DIGE2. Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor.

ANXA2 Annexin A2 36 38,6 8,5 103 11(36.6) 2,40

Phospholipase A2 inhibitor activity, Calcium-dependent

phospholipid and protein binding

Positive regulation of receptor activity Orphan transporters

GAPDH Glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase

37 36 9,3 133 15 (43) 1,65 Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (NAD+) (phosphorylating) activity

Negative regulation of translation, Oxidation-reduction

process

Glycolysis / Gluconeogenesis

ANXA2 Annexin A2 36 38,6 8,5 96,7 16 (47.8) 1,64

Phospholipase A2 inhibitor activity, Calcium-dependent

phospholipid and protein binding

Positive regulation of receptor activity Orphan transporters

MSN Moesin 73 67,8 6 66,5 12 (23.2) 1,62 Cell adhesion molecule,

protein kinase and receptor binding

Movement of cell or subcellular component

Regulation of actin cytoskeleton

ANXA1 Annexin A1 36 38,7 6,7 99,5 14 (47.1) 1,51 Annealing helicase activity, Calcium ion binding

EPCAM Epithelial cell adhesion molecule 36 34,9 8,7 59,7 9 (31.5) 1,51 Protein complex binding

Negative regulation of cell-cell adhesion mediated by

cadherin, Positive regulation of cell proliferation

TEC Tyrosine-protein kinase Tec 36 73,5 9,4 68,3 11 (19.5) 1,51

Non-membrane spanning protein tyrosine kinase

activity

Cell differentiation, Integrin-mediated signaling pathway,

Intracellular signal transduction

FCERI mediated Ca+2 mobilization,

Interleukin-3, 5 and GM-CSF signaling,

Signaling by SCF-KIT

ZSCAN25

Zinc finger protein 498 36 61,4 9 61,7 9 (19.1) 1,51

Sequence-specific DNA binding transcription factor activity, DNA and metal-ion

binding

Regulation of transcription Generic Transcription Pathway

ANXA2 Annexin A2 35 38,6 8,5 201 18 (48.4) 1,46 Phospholipase A2 inhibitor activity, Calcium-dependent

Positive regulation of receptor activity Orphan transporters

2 MW (kDa), peso molecular teórico y experimental en kDaltons; pI~, pI teórico; MS score, score de identificación dado por Mascot; % Seq, porcentaje de cubrimiento de secuencia; Pep match, número de péptidos asignados por proteína; Fold FBS 0,5% / 10%, razón de cambio de la densidad óptica del spot de proteína (nivel proteico) de proteomas con suero 0,5% (0,5% SFB) respecto al proteoma control (10% SFB). Términos GO relevantes para Función Molecular, Procesos Biológicos y Vías, obtenidos de la base de datos Nextprot y con la herramienta bioinformática DAVID.

Capítulo 1 13

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor. phospholipid and protein

binding

CDK16 Cyclin-dependent kinase 16 48 55 7,23 58 6 (20) 1,36

Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase

activity

Exocytosis, Regulation of cell cycle, Regulation of insulin

secretion involved in cellular response to glucose stimulus

EEF1A1 Elongation factor 1-alpha 1 48 50 9,1 59 8 (22) 1,36 Translation elongation factor

activity, tRNA binding

Regulation of transcription, Cellular response to epidermal

growth factor stimulus

RNA transport, Eukaryotic Translation

Elongation

THEGL Testicular haploid expressed gene

protein-like 48 53 10 63 6 (21) 1,36 --

SFPQ Splicing factor,

proline- and glutamine-rich

104 76,1 9,9 111 13 (22.3) 1,29

Transcription regulatory region sequence-specific

DNA binding, Core promoter binding

Alternative mRNA splicing, via spliceosome

PTBP1 Polypyrimidine

tract-binding protein 1

55 57,2 9,8 65,3 7 (13.6) 1,28 Poly(A) RNA and pre-mRNA binding

Negative regulation of mRNA splicing, via spliceosome

mRNA Splicing - Major Pathway, Processing of

Capped Intron-Containing Pre-mRNA

KRT1 Keratin, type II cytoskeletal 1 46 66 8,8 67,4 12 (26.4) 1,22 Carbohydrate and protein

binding, Receptor activity Regulation of angiogenesis, Response to oxidative stress

ANXA1 Annexin A1 37 38,9 6,57 71 10 (32) 1,20 Annealing helicase activity, Calcium ion binding

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 58 57,9 9 160 20 (39.5) 1,19

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and

poly(A) RNA binding

Phosphorylation, Programmed cell death

Glycolysis / Gluconeogenesis, Purine metabolism

ANXA10 Annexin A10 69/68 37,3 5 58,5 5 (18.5) 1,18 Protein binding, Calcium-dependent phospholipid

binding

ANXA5 Annexin A5 38/32 35,9 4,8 169 16 (45.9) 1,16

Calcium-dependent phospholipid binding,

Phospholipase inhibitor activity

Negative regulation of apoptotic process, Signal

transduction, Negative regulation of catalytic activity

Gonadotropin releasing hormone receptor

pathway

HSPA5 78 kDa glucose-regulated protein 76 72,3 4,9 188 24 (42.8) 1,12 ATP, calcium ion, chaperone

and unfolded protein binding

Cellular response to glucose starvation,Positive regulation of

cell migration, Negative regulation of apoptotic process

Protein export, Protein processing in

endoplasmic reticulum

ENO1 Alpha-enolase 47 47,1 7,7 132 19 (63.4) 1,11 Phosphopyruvate hydratase

activity, Transcription corepressor activity

Negative regulation of cell growth, Negative regulation of

transcription from RNA polymerase II promoter

Glycolysis / Gluconeogenesis, RNA

degradation

KRT1 Keratin, type II cytoskeletal 1 47 66 8,8 63,7 13 (28.7) 1,11 Carbohydrate and protein

binding, Receptor activity Complement activation, lectin

pathway, Regulation of

14 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor. angiogenesis, Response to

oxidative stress

ENO1 Alpha-enolase 47 47,1 7,7 91,8 13 (31.6) 1,10 Phosphopyruvate hydratase

activity, Transcription corepressor activity

Negative regulation of cell growth, Negative regulation of

transcription from RNA polymerase II promoter

Glycolysis / Gluconeogenesis, RNA

degradation

NEUROG2 Neurogenin-2 47 28,6 9 56,1 8 (28.3) 1,10 E-box binding, Protein

dimerization activity

Positive regulation of sequence-specific DNA binding

transcription factor activity

TUBB4B Tubulin beta-4B chain 47 49,8 4,6 61,5 11 (26.3) 1,10

Structural constituent of cytoskeleton; double-

stranded RNA, GTP and MHC class I protein binding

Movement of cell or subcellular component, Spindle assembly

Gap junction, Assembly of the primary cilium

ANXA10 Annexin A10 38 37,3 5 62,1 8 (30.2) 1,06 Protein binding, Calcium-dependent phospholipid

binding

HSMCR30

Putative metaphase chromosome

protein 1 38 33 4,7 58,1 4 (22.8) 1,06

DNA replication, Mitotic nuclear division

ZNF624 Zinc finger protein 624 38 99,9 10,1 59,1 11 (18.8) 1,06

Sequence-specific DNA binding transcription factor

activity

Regulation of transcription, DNA-templated

Generic Transcription Pathway

TUBA1C Tubulin alpha-1C chain 57 49,9 4,8 71,6 13 (37.4) 1,05 Structural molecule activity,

GTP and protein binding

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular

transport, Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly

of the primary cilium

USP48 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase

48 57 119 5,7 66,3 21 (24.1) 1,05 Cysteine-type endopeptidase

activity

Proteasome-mediated ubiquitin-dependent protein

catabolic process

VIM Vimentin 57 53,6 4,9 294 35 (75.3) 1,05 Structural constituent of

cytoskeleton, Protein and double-stranded RNA binding

Movement of cell or subcellular component

Caspase-mediated cleavage of

cytoskeletal proteins

HSPA9 Stress-70 protein, mitochondrial 34 73,9 56 10 (27) 1,05 ATP, unfolded protein and

poly(A) RNA binding Negative regulation of

apoptotic process

RNA degradation, mitochondrial protein

import

KRT7 Keratin, type II cytoskeletal 7 52 51,4 5,3 76,4 15 (38.8) 1,04 Protein binding Viral process

TPM4 Tropomyosin alpha-4 chain 31 28,5 4,5 199 27 (68.1) 1,03 Actin and Calcium ion binding Movement of cell or subcellular

component Cardiac muscle

contraction

ANXA1 Annexin A1 37 38,7 6,7 90,1 11 (39.3) -1,01 Annealing helicase activity, Calcium ion binding

FAM208A

Protein FAM208A / Retinoblastoma-

associated protein 37 189 5,5 60,8 9 (5.8) -1,01 Poly(A) RNA binding

Capítulo 1 15

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor. RAP140.

MRPS23

28S ribosomal protein S23, mitochondrial

47 21,8 9,5 63,1 7 (40.5) -1,03 Protein and Poly(A) RNA binding

Mitochondrial translation intiation,

elongation and termination

PEAK1 Pseudopodium-enriched atypical

kinase 1 36 193 6,5 56,9 15 (11.8) -1,03

Non-membrane spanning protein tyrosine kinase

activity

Cell migration, Substrate adhesion-dependent cell

spreading, Peptidyl-tyrosine phosphorylation

PTBP1 Polypyrimidine

tract-binding protein 1

55/56 57,2 9,8 102 11 (28) -1,08 Poly(A) RNA and pre-mRNA binding

Negative regulation of mRNA splicing, via spliceosome

mRNA Splicing - Major Pathway, Processing of

Capped Intron-Containing Pre-mRNA

ACTB Actin, cytoplasmic 1 45 41,7 5,2 61,4 9 (37.1) -1,10

Structural constituent of cytoskeleton; ATP, nitric-

oxide synthase and protein kinase binding

Movement of cell or subcellular component, ATP-dependent

chromatin remodeling

Adherens junction, Focal adhesion,

Regulation of actin cytoskeleton

KRT18 Keratin, type I cytoskeletal 18 45 48 5,2 249 25 (56.3) -1,10

Scaffold protein binding, Structural molecule activity,

Poly(A) RNA binding

Intermediate filament cytoskeleton organization,

Negative regulation of apoptotic process, Cell cycle

Pathogenic Escherichia coli infection

ZNF823 Zinc finger protein 823 79/78 70,2 10,1 58,7 8 (16.6) -1,11 DNA and metal ion binding Regulation of transcription,

DNA-templated

CEP290 Centrosomal protein of 290 kDa 44 290 5,75 57 27 (13) -1,16 Protein binding

Cilium morphogenesis, Positive regulation of intracellular

protein transport

Anchoring of the basal body to the plasma

membrane, Recruitment of mitotic centrosome proteins

and complexes

DIP2A Disco-interacting

protein 2 homolog A

44 170 9,3 62,2 9 (7.4) -1,16 Protein binding

Negative regulation of gene expression, Regulation of

apoptotic process, Multicellular organismal development

IVD Isovaleryl-CoA

dehydrogenase, mitochondrial

44 46,3 9,3 84 9 (26) -1,16 Isovaleryl-CoA dehydrogenase activity Leucine catabolic process Valine, leucine and

isoleucine degradation

KRT1 Keratin, type II cytoskeletal 1 44 66 8,8 60,7 14 (29.7) -1,16 Carbohydrate and protein

binding, Receptor activity Regulation of angiogenesis, Response to oxidative stress

RRP36 Ribosomal RNA

processing protein 36 homolog

44 29 10,2 61 8 (36) -1,16 Poly(A) RNA binding Ribosomal small subunit biogenesis

ACTB Actin, cytoplasmic 1 43 41,7 5,2 136 16 (45.9) -1,16 Structural constituent of cytoskeleton; ATP, nitric-

oxide synthase and protein

Movement of cell or subcellular component, ATP-dependent

chromatin remodeling

Adherens junction, Focal adhesion,

Regulation of actin

16 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor. kinase binding cytoskeleton

ACTG1 Actin, cytoplasmic 2 43 41,8 5,2 146 17 (51.7) -1,16 Structural constituent of cytoskeleton; ATP and

protein binding

Movement of cell or subcellular component

Adherens junction, Focal adhesion,

VEGFA-VEGFR2 Pathway

KRT18 Keratin, type I cytoskeletal 18 43 48 5,2 75,8 15 (31.2) -1,16

Scaffold protein binding, Structural molecule activity,

Poly(A) RNA binding

Intermediate filament cytoskeleton organization,

Negative regulation of apoptotic process, Cell cycle

Pathogenic Escherichia coli infection

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 59 57,9 9 136 14 (30.9) -1,17

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and

poly(A) RNA binding

Phosphorylation, Programmed cell death

Glycolysis / Gluconeogenesis, Purine metabolism

DDX3Y ATP-dependent RNA helicase

DDX3Y 41 73,1 7,8 63 10 (20.6) -1,17 ATP-dependent RNA

helicase activity

Regulation of gene expression, RNA secondary structure

unwinding

RIG-I-like receptor signaling pathway

HSPA1A Heat shock 70 kDa protein 1A/1B 69/68 70 5,4 92,8 19 (37) -1,19 ATP, Poly(A) RNA and

protein binding

Cellular response to oxidative stress, Protein refolding,

Negative regulation of cell death and cell growth

Endocytosis, MAPK signaling pathway,

Protein processing in endoplasmic reticulum,

Spliceosome

HSPA1L Heat shock 70 kDa protein 1-like 69/68 70,3 5,7 60,1 14 (31.5) -1,19 ATP and unfolded protein

binding

Positive regulation of protein targeting to mitochondrion,

Protein refolding

Endocytosis, MAPK signaling pathway,

Protein processing in endoplasmic reticulum,

Spliceosome

HSPA6 Heat shock 70 kDa protein 6 69/68 71 5,8 67,1 16 (29.2) -1,19 ATP and unfolded protein

binding Cellular response to heat,

Protein refolding

Endocytosis, MAPK signaling pathway,

Protein processing in endoplasmic reticulum,

Spliceosome

HSPD1 60 kDa heat shock

protein, mitochondrial

60 61 5,6 116 20 (38.9) -1,27

p53, ATP, chaperone, DNA replication origin, unfolded protein and poly(A) RNA

binding

de novo' protein folding, Activation of cysteine-type

endopeptidase activity involved in apoptotic process

RNA degradation, Mitochondrial protein

import

TUBA1B Tubulin alpha-1B chain 56 50,1 4,8 99,6 17 (52.1) -1,28 GTP, protein and double-

stranded RNA binding

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular

transport, Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly

of the primary cilium

TUBA1C Tubulin alpha-1C chain 56 49,9 4,8 110 18 (55.7) -1,28 Structural molecule activity,

GTP and protein binding

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular

transport, Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly

of the primary cilium

VIM Vimentin 56 53,6 4,9 274 37 (86.9) -1,28 Structural constituent of cytoskeleton, Protein and

Movement of cell or subcellular component

Caspase-mediated cleavage of

Capítulo 1 17

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor. double-stranded RNA binding cytoskeletal proteins

DDX3Y ATP-dependent RNA helicase

DDX3Y 89 73,1 7,8 56,3 10 (18.9) -1,30 ATP-dependent RNA

helicase activity

Regulation of gene expression, RNA secondary structure

unwinding

RIG-I-like receptor signaling pathway

HSP90AA1

Heat shock protein HSP 90-alpha 89 84,6 4,8 86,1 21 (33.7) -1,30

Nitric-oxide synthase regulator activity, Protein homodimerization activity,

ATP, Poly(A) RNA and protein binding

Signal transduction, Chaperone-mediated protein

complex assembly, Mitochondrial transport

Pathways in cancer, Protein processing in

endoplasmic reticulum

HSP90AB1

Heat shock protein HSP 90-beta 89 83,2 4,8 117 20 (29) -1,30

Nitric-oxide synthase regulator activity, ATP,

Poly(A) RNA, kinase and protein binding

Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process,

Negative regulation of proteasomal ubiquitin-

dependent protein catabolic process

Pathways in cancer, Protein processing in

endoplasmic reticulum

ATP5B ATP synthase subunit beta, mitochondrial

50 56,5 5,1 168 19 (42) -1,32 Proton-transporting ATPase activity, rotational mechanism

Angiogenesis, Mitochondrial ATP synthesis coupled proton

transport, Regulation of intracellular pH

Oxidative phosphorylation,

Formation of ATP by chemiosmotic coupling,

Transcriptional activation of

mitochondrial biogenesis

ENO1 Alpha-enolase 36 47,1 7,7 70 10 (29) -1,33 Phosphopyruvate hydratase

activity, Transcription corepressor activity

Negative regulation of cell growth, Negative regulation of

transcription from RNA polymerase II promoter

Glycolysis / Gluconeogenesis, RNA

degradation

HSPA8 Heat shock cognate 71 kDa protein 71/70 70,9 5,2 198 25 (42.3) -1,37

ATP, G-protein coupled receptor, C3HC4-type RING finger domain, Poly(A) RNA,

Unfolded protein binding

Negative regulation of transcription, DNA-templated,

Negative regulation of fibril organization

Endocytosis, MAPK signaling pathway,

Protein processing in endoplasmic reticulum,

Spliceosome

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 54 58,4 7,96 123 10 (21) -1,39

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and

poly(A) RNA binding

Phosphorylation, Programmed cell death

Glycolysis / Gluconeogenesis, Purine metabolism

NCAPG2

Condensin-2 complex subunit G2 59 132 6,44 61 10 (9) -1,41 Methylated histone binding Cell division, Chromosome

condensation

Condensation of Prophase

Chromosomes

P4HB Protein disulfide-isomerase 59 57,1 4,6 78 12 (27) -1,41

Protein disulfide isomerase activity, Protein and poly(A)

RNA binding,

Cellular response to hypoxia, Regulation of oxidative stress-

induced intrinsic apoptotic signaling pathway

Protein processing in endoplasmic reticulum, Chylomicron-mediated

lipid transport

DUX2 Putative double homeobox protein 2 78 9,2 11,9 71,4 5 (77.5) -1,42 DNA binding

18 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Gene name Protein name

MW (kDa) pI ~ MS

Score Pep

match (% Seq)

Fold 0.5/10% Molecular Function Biological procces Pathways Obs.

app. Theor.

TUBB Tubulin beta chain 54 49,6 4,6 158 19 (42.6) -1,48 GTP and protein binding, Structural molecule activity

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular

transport

Gap junction, Phagosome, Anchoring of the basal body to the

plasma membrane

TUBB2A Tubulin beta-2A chain 54 49,9 4,6 103 15 (33.5) -1,48 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium,

TUBB3 Tubulin beta-3 chain 54 50,4 4,7 86,1 11 (24.9) -1,48 GTP and protein binding Axon guidance

Gap junction, Phagosome, Assembly

of the primary cilium

TUBB4B Tubulin beta-4B chain 54 49,8 4,6 120 18 (38.4) -1,48

Structural constituent of cytoskeleton; double-

stranded RNA, GTP and MHC class I protein binding

Movement of cell or subcellular component, Spindle assembly

Gap junction, Assembly of the primary cilium

TUBB6 Tubulin beta-6 chain 54 49,8 4,6 72,2 8 (20.4) -1,48 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly

of the primary cilium

MAP3K2 Mitogen-activated

protein kinase kinase kinase 2

41 69,7 8,8 59,4 7 (18.7) -1,53 MAP kinase kinase activity,

Protein serine/threonine kinase activity

Activation of JUN kinase and MAPK activity, Cellular response to mechanical

stimulus, Positive regulation of transcription

Gap junction, GnRH and MAPK signaling

pathway

KRT8 Keratin, type II cytoskeletal 8 50 53 5,52 221 33 (64) -1,53 Scaffold protein binding

Extrinsic apoptotic signaling pathway, Cell differentiation

involved in embryonic placenta development

GUCY1B3

Guanylate cyclase soluble subunit

beta-1 41 70,5 5,1 56,2 12 (30) -1,65 Guanylate cyclase activity,

Receptor activity cGMP biosynthetic process Gap junction, Nitric

oxide stimulates guanylate cyclase

KRT19 Keratin, type I cytoskeletal 19 41 44,1 4,9 278 34 (71) -1,65 Structural constituent of

cytoskeleton

Response to estrogen, Cell differentiation involved in

embryonic placenta development

PSMD11

26S proteasome non-ATPase

regulatory subunit 11

37 47,4 6,1 56,5 7 (19.9) -1,68 Protein binding

Proteasome assembly, Stem cell differentiation, Ubiquitin-dependent protein catabolic

process

Proteasome

PPP1R21

Protein phosphatase 1

regulatory subunit 21

44 88,3 6,4 71,3 16 (19.7) -2,03 Phosphatase binding

NIT1 Nitrilase homolog 1 68 35,9 9,2 60,9 8 (33.3) -6,23 Nitrilase activity Nitrogen compound metabolic process

Tabla1-2: (Continuación)..

Entre las proteínas aumentadas por el suero 0,5% se identificaron Anexinas, importantes reguladores de la actividad de receptores de señal, y entre las proteínas disminuidas se identificaron varias proteínas relacionadas con la diferenciación celular, así como NIT1, la cual juega un rol en el crecimiento celular y apoptosis, proteínas que se pueden interpretar como aumentadas en el cultivo con SFB al 10%. Dentro de las proteínas encontradas como invariables se identificaron en múltiples spots a la Vimentina (Spot ID 2483, fold -1.1; Spot ID 2050, fold 1.3), PKM1/2 (Spot ID: 2657, 803 y 2547, fold 1.2; Spot ID 2306, fold -1.0; Spot ID 739, fold -1.2; Spot ID 798, fold -1.4) y ENO1 (Spot ID: 2561 y 2562, fold 1.1; Spot ID 1087, fold -1.2; Spot ID 2559 y 2560, fold -1.3) con variaciones mínimas entre cada spots. Figura 1-3 Agrupación de anotaciones funcionales para proteínas identificadas como A) diferenciales y B) invariables expresadas por células HTR-8/SVneo SVneo cultivadas con SFB 0,5% o SFB 10%.

Rigor de la clasificación (Classification Stringency): medio. E.S.: puntaje de enriquecimiento,

enrichment score.

20 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

En el Anexo C 2 se pueden observar imágenes ampliadas de los geles DIGE, mostrando algunos spots de proteína representativos para la comparación de los proteomas de HTR-8/SVneo cultivados con 0,5% o con 10% de SFB. Se observa que la presencia de Vimentina, Piruvato quinasa (PKM1/2) y Enolasa 1 (ENO) se mantiene invariable en los proteomas 0,5% con respecto a 10% Las proteínas identificadas fueron clasificadas en anotaciones ontológicas GO para procesos biológicos, función molecular y vías. Adicionalmente se realizó un Análisis de Enriquecimiento en Anotaciones detallado para los grupos de proteína diferenciales e invariables. Las proteínas diferencialmente expresadas fueron agrupadas de acuerdo a términos como ciclo celular, regulación de la apoptosis, segregación de cromosomas, organización del citoesqueleto entre otros procesos biológicos y funciones moleculares, concordante con el rol fisiológico del suero (Figura 1-3 A). En contraste, en el grupo invariable se encuentran proteínas relacionadas con el metabolismo glicolítico (Figura 1-3 B). Estos resultados muestran que las células de HTR-8/SVneo están respondiendo al suero 10%, comparado con 0,5% de suero, con procesos típicos como ciclo celular, proliferación y síntesis de proteínas, sin afectar aparentemente el metabolismo o la motilidad celular.

1.1.3 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de suero

Paralelamente, se investigó la influencia de la depleción de suero en el perfil de expresión de proteínas mediante un análisis 2DE comparativo empleando tres réplicas biológicas. De forma similar a los experimentos anteriores, células de HTR-8/SVneo fueron sembradas por triplicado y cultivadas durante 24 horas en medio con o sin SFB al 10% (control); 500 μg de proteína fueron separado en geles 2DE de gran formato (18 cm, pI 3-10, tinción de proteínas con Comassie Coloidal, Anexo A: 5a) y se realizó un análisis comparativo de las imágenes para establecer el posible efecto de la depleción de suero. Spots de proteína diferenciales con respecto al control fueron seleccionados e identificados mediante análisis LC-ESI-Q/ToF seguido de búsqueda en bases de datos usando MASCOT (Instituto Karolinska, Suecia). Según el análisis estadístico, de 281 spots de proteína analizados un 84% mostraron un nivel diferencial estadísticamente significativo (p<0,05), de los cuales 44,9% fueron aumentados en ausencia de suero. De estos spots diferenciales, 40,3% fueron observados exclusivamente en presencia de suero, mientras que tan solo el 14,8% se observó en ausencia de suero (Figura 1-4). Estos resultados muestran que la depleción de suero afectó - de una forma inusual - el perfil proteico en mayor proporción que una dosis baja de suero como 0,5% (84,0% para depleción vs. 24,6% para SFB 0,5%), incluso generando un mayor porcentaje de proteínas aumentadas en respuesta a la depleción a diferencia de la dosis baja de suero (44,9% para depleción vs. 39,3% para SFB 0,5%). En todo caso, el cultivo normal con suero (SFB 10%) generó el mayor porcentaje de spots diferenciales en los dos análisis, tanto inducidos de forma exclusiva, como aumentados, tal como se espera para esta condición control de cultivo (Figura 1-2 y Figura 1-4). Se identificaron 15 spots de proteína correspondientes a 13 proteínas únicas (Tabla 1-3). Interesantemente, y en contraste al análisis previo con 0,5% de SFB, se encontraron proteínas con roles importantes en el metabolismo y morfología que fueron inducidas por

Capítulo 1 21

la depleción del suero: Vimentina (VIM), Piruvato quinasa M1/M2 (PKM1/2), Alfa enolasa 1 (ENO1) e Inosin-5’-monofosfato dehidrogenasa 2 (IMPDH2); mientras que el spot de Citoqueratina 8 (KRT8) fue disminuido en respuesta a la depleción (Figura 1-5). Así mismo, mientras que la depleción del suero causó un incremento en el spot de la enzima PKM1/2 (Tabla 1-3), esta se ve ligeramente disminuida en respuesta al SFB 0,5% (Tabla 1-1). Figura 1-4: Estadística de spots de proteína expresados por células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de SFB.

n=3, Kolmogorov-Smirnov test, 0.10, D > 0.642; ANOVA test, p<0.05. *, porcentaje de spots total

analizados; **, porcentaje de spots diferencialmente expresados. Figura 1-5 Proteínas diferenciales identificadas ante la depleción de suero A) Gel control representativo con spots de proteína identificados B) Razón de cambio de algunos spots. (Siguiente página) MW: marcador de peso molecular (RPN5800, GE). n=3, Kolmogorov-Smirnov test (D value): 0.10, D > 0,642 (a, D=1.0; b, D= 0.67). Razón de cambio en el nivel proteico o protein level fold change

expresada como SFB 0% / SFB 10%.

22 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 1-6 Análisis de enriquecimiento en anotaciones para proteínas identificadas como

diferenciales por células HTR-8/SVneo en respuesta a la depleción de suero.

Agrupación de anotaciones funcionales realizado con DAVID 6.7. E.S.: puntaje de enriquecimiento, enrichment score

Proteoma HTR-8/SVneo con 10% SFB

3 10pI

205

116

97

80

66

55

45

MW(kDa)

Vimentina PKM2 ENO1 IMPDH2 KRT8-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.02.5

b

a

b a b

Razó

n de

cam

bio

SFB

0% /

10%

B

A

Tabla 1-3: Proteínas relevantes identificadas en respuesta a la depleción de suero.3

Gene name Protein name MW

(kDa) pI~ MS/MS score

% Seq

Pep match

K test

Fold FBS 0 / 10% Molecular function Biological process

ACTG1 Actin, cytoplasmic 2 41,8 5.31 221.9 47 15 1.00 * Structural constituent of cytoskeleton cellular component movement

VCP Transitional endoplasmic reticulum ATPase 89,3 5.14 350.8 39 25 1.00 * Hydrolase DNA repair, vesicle transport

ANXA1 Annexin A1 38,7 6.64 98.6 17 48 1.00 * Helicase activity, Receptor binding Cell surface receptor signaling pathway

HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha 84,6 4.94 37.67 4 3 1.00 * Chaperone Stress response

HSPA8 Heat shock cognate 71 kDa protein 70,9 5.37 562.7 68 36 1.00 -3.14 Chaperone, repressor Stress response,

transcription

HNRNPL Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L 64,1 47.04 6 4 1.00 -2.75 Transcription regulatory region DNA

binding. RNA processing

KRT8 Keratin, type II cytoskeletal 8 53,7 5.52 261.4 41 21 1.00 -1.51 Structural constituent of cytoskeleton, structural molecule activity

MET, cytoskeleton organization

HSPD1 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 61,1 5.7 497.2 66 34 0.67 -1.35 Chaperone Host-virus interaction

VIM Vimentin 53,6 5.06 332.7 47 23 0.67 1.51 Structural constituent of cytoskeleton EMT

DLD Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial 54,2 6.92 54.93 9 4 1.00 1.66 Dihydrolipoyl dehydrogenase activity cell redox homeostasis,

lysine catabolic process

PKM2 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 57,9 7.96 329.1 44 22 1.00 1.94 Kinase, transferase Glycolysis

IMPDH2 Inosine-5'-monophosphate dehydrogenase 2 55,8 6.44 83.48 13 6 0.67 2.08 Oxidoreductase GMP and Purine biosynthesis

ENO1 Alpha-enolase 47,2 6.99 142.5 26 11 0.67 2.07 Lyase, repressor Glycolysis, transcription regulation

3 MW (kDa), peso molecular teórico y experimental en kDaltons; pI~, pI teórico; MS/MS score, score de identificación dado por Mascot; % Seq, porcentaje de cubrimiento de secuencia; Pep match, número de péptidos asignados por proteína; K test, valor D del test Kolmogorov-Smirnov (0.10, D > 0.642); Fold FBS 0% / 10%, razón de cambio de la densidad óptica del spot de proteína (nivel proteico) de proteomas de la depleción de suero (0% SFB) respecto al proteoma control (10% SFB); *, spot de proteína detectado de forma única o exclusiva. Términos GO relevantes para Función Molecular y Procesos Biológicos, obtenidos de la base de datos Nextprot release 2014-09-19 y con la herramienta bioinformática DAVID 6.6.

A diferencia de los resultados obtenidos con suero al 0,5%, la ausencia de suero tuvo una profunda influencia en proteínas vinculadas a procesos como glicólisis y motilidad celular (Figura 1-6), los cuales se mantienen inalterados con suero al 0,5% (Figura 1-3). Esto se puede deducir de los cambios en la densidad de spots de proteínas como PKM1/2, ENO1, Vim y KRT8 (ver Anexo C 2, imágenes aumentadas de geles 2DE representativos con los spots de proteína diferenciales).

Análisis bioinformático y generación de redes

De forma general en el desarrollo de esta tesis, el análisis de las proteínas identificadas como diferenciales fue multivariado, en vez de univariado, ya que los genes y las proteínas codificadas no actúan de forma individual sino como parte de una red compleja de interacciones que da lugar a las vías de señalización, rutas metabólicas, regulatorias, etc; siendo esta la razón por la cual se realizó un estudio proteómico. Por tanto, cuando se analizan de forma conjunta se puede llegar a correlaciones significativas y una mayor validez de las hipótesis y conclusiones que se formulan en relación a los procesos biológicos que están siendo alterados. (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2014, 2015) (Ver Supl. Publicaciones C2B2 2014 y HUPO 2015). Así, con el fin de ganar conocimiento y obtener información relacionada con las relaciones físicas y funcionales predichas entre las proteínas identificadas con más confianza (Score de identificación MS/MS más alto, n=10), se realizó un análisis bioinformático con el software STRING (Jensen et al., 2009). Se obtuvo una red de alta-confianza, en términos de correlación de los datos de interacción (p-value = 5,87x10-12); 14 interacciones fueron observadas con un valor esperado de interacción (interaction expected value, E) de 1,02 para 10 proteínas. Todas las proteínas identificadas fueron inter-conectadas, excepto KRT8, con un clúster central compuesto por proteínas de choque térmico, PKM2, ENO1 y VCP como se observa en la red de la Figura 1-7 A. De acuerdo a la herramienta de Enriquecimiento de STRING, todas las proteínas son expresadas por la Placenta (n=10, p-value=4,019 x10-15, genome background, False Discovery Rate Filter, high confidence). Las vías de señalización celular y metabólicas vinculadas con las proteínas identificadas fueron visualizadas con el software PCViz (Cerami et al., 2011a). Se construyó una red con las proteínas identificadas y enriquecida con adición de nodos background. La Figura 1-7 B muestra la red generada y como diferentes vías de transducción de señal están conectadas, vinculándose con la regulación por depleción de suero. La depleción de suero regula a la baja proteínas como HSPA8, HSP90AA1, HSPD1 y VCP que están conectadas con proteínas G monoméricas como Ras y Rho, y transductores de las vías Akt, MAPK y SMAD3, lo cual correlaciona con las funciones mitogénicas del SFB y los factores de crecimiento que contiene, los cuales activan estás vías de señalización. Por otro lado, proteínas reguladas al alza por la depleción de suero como PKM2, ENO1, IMPDH2 y VIM, están relacionadas con quinasas dependientes de ciclina (proteínas CDK). Interesantemente, PKM2 interactua con desmina, proteína de los filamentos intermedios, y con el transductor de señal y activador transcripcional STAT3. El set de proteínas al alza y a la baja (proteínas de choque térmico) están inter-conectados por el factor inducible de hipoxia 1 (HIF1A), Fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), el factor de crecimiento epidermal EGF/EGFR y el factor transcripcional Myc, y están relacionadas con procesos de reparación de ADN a través de VCP, ATM y tp53 (Figura 1-7 B).

Capítulo 1 25

Figura 1-7: Análisis de redes para las proteínas diferencialmente expresadas por células de HTR8/SVneo ante la depleción de suero; A) STRING network B) PCViz network.

A) Red generada con STRING 9.05: vista tipo confianza; parametros: score de confianza medio (0.400) sin nodos adicionales. Las asociaciones más fuertes se muestran con líneas más gruesas. B) Red enriquecida generada con PCViz: red de asociación de las proteínas identificadas enriquecida con 36 nodos background. Azul: control del cambio de estado, verde: control de la expresión, purpura: catálisis.

Validación de resultados proteómicos por Western Blot

Para confirmar los resultados proteómicos frente a la depleción de suero, se evaluó los niveles de la proteína Vimentina mediante Western Blot. De forma similar a los experimentos anteriores, células de HTR-8/SVneo se cultivaron con o sin SFB al 10% por 24 h. 30 μg de extracto proteico total, de triplicados experimentales independientes, fueron separados por SDS-PAGE y los niveles de Vimentina fueron analizados por Western Blot (ver Anexo A 10). La cuantificación densitométrica de la banda esperada para Vimentina (54 kDa) se realizó con el software Quantity One (BioRad) por triplicado para cada film. En la Figura 1-8 se observan los resultados para el análisis de la expresión de Vimentina, con los que se confirman los resultados derivados del análisis 2DE comparativo, al ser sobre-expresada en respuesta a la depleción de suero. Una banda delgada a 54kDa corresponde con el peso molecular predicho para esta proteína, la cual solo fue detectada en las muestras de las células cultivadas en ausencia de suero. Está proteína es bien conocida por su rol clave en el fenotipo, y ser un marcado mesenquimal y de relevancia durante la transición Epitelial – Mesenquimal (EMT). Se evaluó también la expresión de E-caderina, ya que es un marcador epitelial al igual que la citoqueratina 8; sin embargo, no se obtuvo señal alguna en ninguna de las muestras de HTR-8/SVneo evaluadas.

26 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 1-8: Validación de la expresión de Vimentina por Western Blot.

A) Films de Western blot obtenidos. B) Cuantificación densitométrica; SFB 10% ND: no

detectable. MW: marcador de peso molecular (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific).

1.1.4 Discusión de resultados influencia del suero En esta sección se encontró que la depleción de suero y una dosis baja como 0,5% afectan diferencialmente la proliferación y los niveles de proteínas de células inmortalizadas de trofoblasto HTR-8/SVneo. Las proteínas identificadas incluyen proteínas del citoesqueleto, enzimas metabólicas y proteínas de choque térmico, con interacciones predichas entre ellas, como muestran las redes STRING y PCViz, todo lo cual correlaciona con tasas de crecimiento diferenciales entre suero al 0% y 0,5%. Este análisis proteómico exploratorio demuestra un cambio profundo en las células en respuesta a la depleción de suero, ésta última una práctica común en estudios in vitro, a la que no se le presta importancia, pero que ofrece nuevas proteínas blancos para ser estudiadas más a fondo. Dentro de las prácticas de cultivo celular es usual cultivar las células con SFB al 10%. A pesar de que su composición difiere de la del suero humano, éste contiene muchos nutrientes y moléculas señalizadoras para las cuales las células humanas pueden responder por su homología; siendo así usado para similar las condiciones fisiológicas in vitro. Mientras que el SFB suplementa el medio de cultivo y promueve el crecimiento celular, la estimulación y los tratamientos se hacen indiferentemente con distintas dosis de suero o sin él. A pesar que el medio de cultivo sin suero no provee unas condiciones adecuadas de crecimiento, las células de HTR-8/SVneo exhibieron un auge en su crecimiento a las 24 horas para luego presentar una fuerte caída en su viabilidad; mientras que el medio con 0,5% de SFB se comportó como un medio de soporte o mantenimiento en donde no hay aparente proliferación celular pero el cultivo es viable durante más días (Figura 1-1).

Vimentina 54 kDa

1 2 31

10

100

1000

10000

10000010% SFB0% SFB

WB

Volu

men

pro

med

io (I

nt*m

m2)

+ -

WB 1 WB 2

58 kDa54 kDa

WB 3

MW

55 kDa

A

B

SFB+ - + -

ND ND ND

Capítulo 1 27

El análisis proteómico comparativo de células HTR-8/SVneo mostró que el porcentaje de proteínas expresadas diferencialmente en respuesta a la depleción de suero es mayor que el expresado en respuesta a 0,5%, usualmente considerado una dosis baja de suero. Más aún, proteínas claves relacionadas con el metabolismo – PKM1/2 y ENO1 – y Vimentina fueron expresadas diferencialmente por la depleción de suero pero no por los cultivos con 0,5% de suero (Figura 1-5, Tabla 1-1, Tabla 1-2 y Tabla 1-3). Estos resultados están indicando fenómenos diferentes y adicionales, los cuales pueden incluir, entre otros mecanismos, una reprogramación transcripcional en respuesta a las condiciones micro-ambientales. VIM es una proteína de filamentos intermedios clase III encontrada en células mesenquimales, cuya transcripción está altamente regulada por el suero y está involucrada en la motilidad celular; usualmente se usa como marcador mesenquimal, mientras que la KRT8 es un marcador epitelial (Kim & Coulombe, 2007). Cambios en estas proteínas correlacionan con una transición Epitelial – Mesenquimal (EMT), siendo VIM sobre-expresada y KRT8 sub-expresada (Thiery & Sleeman, 2006). Suficiente evidencia sugiere un rol crítico de EMT en la progresión maligna, siendo clave en los procesos de invasión y metástasis (Geiger & Peeper, 2009; Voulgari & Pintzas, 2009). Interesantemente, los resultados proteómicos en respuesta a la depleción de suero muestran un comportamiento similar de estas proteínas: aumento de VIM y KTR8 mermada. Así se revela un carácter mesenquimal de las células de HTR-8/SVneo estudiadas, propio del fenotipo invasivo original, pero reteniendo un carácter epitelial, visto como un crecimiento adherente en monocapa y expresión de KRT8, que podría representar su adaptabilidad y regulación. La depleción de suero induce también cambios en la expresión de las enzimas ENO1, PKM2 e IMPDH2. ENO1 es una enzima multifuncional que, además de su rol en glicólisis, toma parte en diversos procesos como control del crecimiento, tolerancia a hipoxia y represión de la transcripción a través de su unión al promotor de c-myc (Feo et al., 2000). PKM2 también juega varios roles. Piruvato quinasa (PK) es la enzima del paso limitante de la glicólisis y tiene dos productos de splicing alternativo: PKM1, en adultos, y PKM2, en embriones/tumores. PKM2, pero no PKM1, participa en un loop de retroalimentación positivo que promueve la transactivación de HIF-1 y reprograma el metabolismo de la glucosa en células cancerosas, contribuyendo a la tumorogéneisis (W. Luo et al., 2011). En las últimas décadas, la investigación que vincula el metabolismo alterado y la promoción del crecimiento tumoral se ha acelerado (Vander Heiden, 2011). El conocido efecto Warburg describe como las células de cáncer exhiben una alta tasa de glicólisis y consumo de glucosa aún en presencia de oxígeno (R. J. Shaw, 2006). Vander Heiden et. al. han argumentado que la función principal de la glicólisis aeróbica es la de mantener altos niveles de intermediarios glicolíticos que soporten las reacciones anabólicas celulares (S. Y. Lunt & Vander Heiden, 2011), y ha descrito como la señalización de factores de crecimiento induce el consumo de nutrientes como glucosa y glutamina que alimentan las vías bioenergéticas y biosintéticas celulares (Metallo & Vander Heiden, 2010). Adicionalmente, mediante un abordaje fosfoproteómico se encontró que la fosforilación en tirosina regula la actividad de PKM2 para proveer una ventaja metabólica en las células tumorales, por lo tanto promoviendo el crecimiento tumoral (Hitosugi et al., 2009). En referencia a los resultados en cultivos depletados de suero, una restricción exógena de factores de crecimiento podría inducir alteraciones en la señalización celular que promuevan el efecto Warburg y un perfil proteico relacionado al crecimiento tumoral, vinculando la transducción de señales con el metabolismo. Sumado a esto, IMPDH2 es la enzima del paso limitante de la síntesis de novo de

28 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

nucleótidos de guanina y por lo tanto está involucrada en la regulación del crecimiento celular; es plausible considerar un papel de esta enzima en el desarrollo maligno y en la progresión de algunos tumores (Barnes et al., 2001; Floryk & Huberman, 2006). Los anteriores resultados están en línea con las semejanzas descritas entre el trofoblasto y las células malignas, y sugieren que la ausencia de suero podría promover un switch adaptativo en el trofoblasto, que concuerda con habilidades de células malignas y su respuesta a un microambiente estresante, hipótesis que se desarrollará posteriormente. A pesar de que algunos experimentos in vitro se realizan en ausencia de suero, pocos estudios se han centrado en la influencia de la depleción de suero en la respuesta celular (Shono et al., 2001). En algunos se sugiere que la respuesta a la falta de suero no está simplemente mediada por el arresto del crecimiento celular, sino que puede estar controlada por proteínas reguladoras desconocidas (Tsuneishi et al., 1993). Un efecto sinérgico entre el suero y la insulina o el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) se observó en células de coriocarcinoma (Mandl et al., 2002). En otros modelos biológicos como en decidua basal de placenta humana (denominada PDB-MSCs), un tipo de células stem, las células son resistentes a la hipoxia y la privación de suero (Y. C. Huang et al., 2009). Respecto a la línea HTR-8/SVneo, Weber et. al. mostraron que comparte características con células stem, “probablemente obtenidas a través de la corrupción de redes de factores de transcripción asociadas a stemness-” (Weber et al., 2013), indicando un cierto grado de plasticidad que refuerzan nuestra propuesta del desarrollo de un switch adaptativo, de forma similar a las células malignas. Pocos son los estados biológicos in vivo en el que los niveles séricos son mínimos, como la isquemia (Bonavita et al., 2003; Zhu et al., 2006), estivación y depresión metabólica (Guppy, 2004). Los estudios biológicos in vitro deberían definir claramente su objetivo y el estado biológico que se pretende modelar. Sin embargo, los tratamientos en ausencia de suero son una práctica común en la investigación, sin considerar los efectos inherentes a la depleción de suero. En esta sección, se demostraron cambios proteómicos relevantes en respuesta a la depleción de suero, sugiriendo que podrían representar una estrategia de supervivencia de acuerdo con el papel fisiológico que juegan las células trofoblásticas extravellosas. Como recomendación, en aquellos casos en que sea necesaria una dosis baja de SFB, se propone la utilización de SFB al 0,5%, en lugar de una supresión completa. Aun así, se debe estudiar más a fondo cómo las dosis bajas o nulas de suero afectan modelos biológicos particulares.

1.2 Efectos del factor de crecimiento transformante β – TGF-β

Una de las moléculas que está regulando las funciones del trofoblasto es el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), el cual inhibe la proliferación, invasión y migración del trofoblasto a través de múltiples mecanismos, siendo considerado un supresor tumoral (Jones et al., 2006; Lala et al., 1998).

Sistema de señalización TGF-β

El TGF-β es una glicoproteína homodimérica, con acciones tipo citoquina secretada por diversos tejidos. El sistema de señalización TGF-β involucra tres isoformas de ligando, TGF-β1, -β2 y -β3, los cuales señalizan a través de su unión al complejo hetero-

Capítulo 1 29

tetramérico formado por sus receptores serina/treonina quinasa TβRII/TβRI, interacción que muchas veces es mediada por una unión inicial del ligando al co-receptor β-glicano TβRIII, el cual forma complejos con los receptores TβRII/TβRI y media la presentación del ligando a estos. El TβRI (ALK5) activado fosforila a las proteínas efectoras intracelulares SMAD. Existen tres clases funcionales de SMAD: R-SMAD activadas por el receptor (SMAD1, 2, 3, 5 y 8), co-SMAD o co-mediadora (SMAD4) y las I-SMAD o inhibitorias (SMAD6 y 7). Las R-SMADs son fosforiladas y activadas por el TβRI, y luego de sufrir homodimerización se unen al co-SMAD para ser translocadas al núcleo como un complejo trimérico que va a unirse a co-activadores o co-represores transcripcionales para regular la expresión de genes. Por su parte, las I-SMADs inhiben competitivamente la fosforilación de R-SMADs por TβRI y la unión a la co-SMAD y reclutan fosfatasas que defosforilan e inactivan al complejo del receptor (Pardali & Moustakas, 2007; Shi & Massagué, 2003), (ver Figura 1-9).

Figura 1-9 Vía de señalización TGF-β / SMADs.

Tomado de (Schmierer & Hill, 2007).

Como se ilustra en la Figura 1-9, este sistema pertenece a la superfamilia TGF-β de factores morfogénicos, conformada por las proteínas morfogénicas de hueso (BMPs), factores de diferenciación de crecimiento (GDFs), sustancias inhibitorias mülerianas (MIS), activinas y proteínas de unión al TGF-β latente (LTBPs). Adicionalmente existen otros receptores del TGF-β, clasificándose en tipo I y tipo II: dentro del primer tipo están

30 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

las quinasas similares al receptor de activina (ALK), para un total de siete receptores identificados; en el segundo tipo se han identificado cinco receptores, los cuales en conjunto con los receptores tipo I van a unirse no solo a las tres isoformas del TGF-β, sino también a los BMPs, generando un complejo sistema de señalización. Esta señal se bifurca en dos grupos principales de SMADs: la rama TGF-β de señalización por SMAD (SMAD2 y 3) y la rama BMP de señalización por SMAD (SMAD1, 5 y 8), donde cada una gobierna sistemas distintos (Derynck & Zhang, 2003; Pardali & Moustakas, 2007; Schmierer & Hill, 2007). El TGF-β afecta a una gran variedad de procesos celulares durante el desarrollo embrionario y la homeostasis de tejidos adultos; la investigación actual está enfocada en los mecanismos que regulan la actividad de SMAD para generar programas transcripcionales contexto-dependientes y específicos al tipo celular (Schmierer & Hill, 2007). Se ha visto que el TGF-β inhibe la proliferación e induce apoptosis en varios tipos celulares, actuando como un supresor tumoral en estadios tempranos de tumorogénesis; aunque, por otro lado muchos tumores sobre-expresan TGF-β, cuyas acciones autocrinas promueven la invasión celular y metástasis en células tumorales avanzadas (Pardali & Moustakas, 2007). Sistema TGF-β como regulador del trofoblasto El TGF-β es un potente regulador de las funciones celulares del trofoblasto velloso y extravelloso, producido principalmente por la decidua materna y en menor proporción por la placenta (principalmente el ST) y células Natural Killer uterina (uNK). Fue uno de los primeros reguladores identificados en la diferenciación del trofoblasto invasivo, y además de retardar la diferenciación del trofoblasto velloso, inhibe el proceso invasivo y reduce la proliferación del trofoblasto de primer trimestre de embarazo (Lala et al., 1998). Este factor paracrino es secretado de forma latente por la decidua (Graham & Lala, 1991) y posiblemente activado por plasmina en presencia del activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) secretado por el trofoblasto, para dar un control por retroalimentación contra una invasión excesiva del trofoblasto en el frente de invasión (Lala & Hamilton, 1996). Las subunidades del TGF-β y activina β son abundantemente expresadas por el endometrio, promoviendo la decidualización, y por las glándulas epiteliales siendo secretadas en el fluido uterino, promoviendo el desarrollo embrional pre-y post-implantación. Posterior a la implantación, controlan la invasión del trofoblasto a la decidua: mientras que la activina promueve, el TGF-β inhibe la migración in vitro del trofoblasto, sugiriendo que el balance relativo de miembros de la superfamilia TGF-β participa en la modulación de la extensión de la invasión decidual. De igual forma, activinas y TGF-βs tienen acciones opuestas al regular la producción hormonal (Jones et al., 2006). Adicionalmente, el TGF-β1 es altamente expresado por las vellosidades coriónicas de placentas a término, a diferencia de placentas de primer trimestre (Subhradip Karmakar & Das, 2002). El TGF-β regula negativamente la invasión del trofoblasto a través de múltiples mecanismos, tales como una reducción en la habilidad de degradación de la matriz extracelular (ECM) y reducción de las habilidades migratorias, así como el bloqueo de la diferenciación celular del CT a EVT. El TGF-β causa una inhibición significativa de la secreción y actividad de uPA e induce la sobre-expresión del inhibidor del activador de plasminógeno (PAI)-I y del inhibidor tisular de metaloproteasas (TIMP-1), que inhiben el proceso de degradación de la ECM efectuado por las metaloproteasas de matriz (MMPs).

Capítulo 1 31

También causa una inhibición de la habilidad migratoria al estimular la producción de integrinas y fibronectina, promoviendo de esta forma la adhesión celular del EVT a la ECM. Por último, y adicional al bloqueo de la diferenciación a EVT, este factor estimula la diferenciación del EVT a células multinucleadas, equivalentes a las células gigantes del lecho placentario, las cuales pierden su capacidad invasiva (Irving & Lala, 1995; Lala et al., 1998). En otros estudios más recientes en cultivos primarios de trofoblasto aislado de placenta de primer trimestre y a término, así como en células de la línea JEG-3 de coriocarcinoma, se ha visto que TGF-β regula a la baja la expresión de MMPs, incluyendo MMP-9, la secreción de MMPs y uPA e inhibe su actividad enzimática al promover la expresión de sus inhibidores, TIMPS y del sistema PAI (Subhradip Karmakar & Das, 2002; Lash et al., 2005). Como resultado se da la regulación positiva de la adhesión célula-célula con una reducción en la interacción célula-matriz, junto con un incremento en la expresión de ezrina y E-caderina, que se asocia con una reducción en la invasión (S. Karmakar & Das, 2004), confirmando la reducción en la secreción y actividad de MMP-9 en cultivos primarios de citotrofoblasto de primer trimestre tras estímulo por 4 días (Meisser et al., 1999). Adicionalmente, estudios en una línea celular representativa de trofoblasto humano normal (NPC) mostraron que el TGF-β puede promover la adhesión intercelular, al tiempo que inhibe la invasión celular a través de una represión en la expresión y producción de MMP-9, sin efectos en MMP-2, y un aumento en la expresión de ARNm y proteína de E-caderina y β-catenina, mediado por la fosforilación de SMAD2 (Zhao et al., 2006). Sin embargo, en otros trabajos con cultivos primarios de citotrofoblasto de primer trimestre, el TGF-β estimuló la expresión y secreción de MMP-9 a tiempos más cortos (8 h y 12 h), sin efecto alguno sobre MMP-2 (S Shimonovitz et al., 1996). Respecto a la línea celular HTR-8/SVneo, ésta fue establecida y descrita como un modelo que responde parcialmente a las acciones regulatorias del TGF-β: Graham et al observaron que esta responde al TGF-β con incorporación reducida de timidina-[3H] de forma dosis dependiente, disminuyendo la secreción y actividad de activadores de plasminógeno (PA) sin afectar significativamente la secreción de MMP-2 ni el nivel de invasión (Graham et al., 1993). Estudios adicionales confirmaron la reducción en la actividad de uPA debido a una reducción en la secreción del mismo y un incremento en la expresión y secreción de PA-1 (Graham, 1997; Ma et al., 2002), y una reducción en la migración (Gleeson et al., 2001). Adicionalmente se ha visto que el TGF-β1 estimula la expresión de colágeno XVII en esta línea; dónde Col15, el dominio de migración celular del colágeno XVII, induce la migración de estas células (Huilaja et al., 2008). Sin embargo, trabajos más recientes muestran que el TGF-β promueve la proliferación e invasión de células de HTR-8/SVneo al pasaje 90, involucrando una reducción en la expresión de TβRI, SMAD3 y SMAD4, mientras que incrementa la expresión de SMAD7 (Yanzhen et al., 2014), e induce la expresión de MMP-2 a través de SMAD2, sin involucrar a SMAD4 (Lin et al., 2006). El objetivo general de esta segunda parte, es explorar posibles efectos adicionales del TGF-β sobre células de la línea HTR-8/SVneo, involucrando un análisis molecular y proteómico. Para esto se evaluó el perfil proteico en respuesta a este factor mediante un análisis proteómico comparativo exploratorio y se determinó su efecto en la expresión de algunas proteasas claves en el proceso invasivo como MMP-9 y uPA, mediante PCR cuantitativa (qPCR).

32 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

1.2.1 Determinación de las condiciones de estímulo con TGF-β Como se evidencia en los resultados anteriores, la cantidad de SFB que suplementa el medio, así como su depleción, afectan de forma diferencial la viabilidad celular. Así pues, se evaluó inicialmente mediante ensayos de MTT la proliferación / viabilidad celular en respuesta a 10 ng/mL de TGF-β1, isoforma y dosis usadas de forma clásica en otros trabajos (Graham et al., 1994; Subhradip Karmakar & Das, 2002; Meisser et al., 1999) y cercana a la fisiológica (Anexo B 2). El efecto del TGF-β se evaluó de forma concomitante con dosis de SFB: 0, 0.1 y 0.5%, comparando cada tratamiento con su control para el análisis estadístico. SFB al 10% se empleó como control positivo de proliferación y los resultados se expresan como porcentaje de viabilidad respecto a su medio control 4 (Anexo A 2a, Ecuación 1-1 y 1-2).Inicialmente se evaluaron dosis de SFB al 0, 0.1, 0.5 y 10% a las 0, 24, 40, 48 y 64 horas, observando una codependencia entre el efecto del TGF-β1 y las condiciones de cultivo, representada en la dosis de suero y el tiempo al que se evalúa, así como una diferencia en la capacidad de soporte de cada dosis de suero y la pérdida de viabilidad celular asociada a tiempos largos (Anexo C 1). Figura 1-10 Evaluación del tiempo de estimulación y dosis de TGF-β relativo a las condiciones de cultivo, mediante MTT en células HTR-8/SVneo

A. 10 ng/mL de TGF-β con SFB en diferentes concentraciones; B. Diferentes dosis de TGF-β con

SFB al 0.5%. n=3, test ANOVA de dos vías, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001 con respecto al control

En la Figura 1-10 A se presenta el efecto de 10 ng/ml de TGF-β1 en medio con 0, 0.1 ó 0.5% de SFB a las 0, 6, 24 y 48 horas, observando dos tendencias: una en la que el TGF-β parece promover la viabilidad y supervivencia en casos de bajo soporte nutricional por dosis de suero bajas (con 0,1% SFB a las 24 h, y sin suero a las 48 h); y otra en la que presenta efectos anti-proliferativos (con 0,5% SFB a las 48 h, ** p<0,01) o supresores del metabolismo (con 0,1% a las 6 h, ** p<0,01). A tiempos cortos (6 h, y tiempo cero, es decir, primeras 4 horas tras estimulo de metabolismo del MTT) se pueden observar efectos sobre el metabolismo, mientras que a tiempos superiores a las 24 horas se observan efectos sobre la proliferación. Es importante resaltar la complejidad

4 ej. Tratamiento = 10 ng/ml TGF-β1 en medio con 0,5% SFB, Control = medio con 0,5% SFB Tratamiento = medio con 10% SFB, Control = medio sin SFB.

Efecto TGF-β relativo al suero

6 24 4870

80

90

100

110

120

TGF-β / 0,1% TGF-β / 0,5%TGF-β / 0%

****

Tiempo (h)

% V

iabi

ldad

(T /

Ctrl

)

Efecto dosis TGF-β

0 0.1 1 5 10 20 SFB 10%70

80

90

100

110

120

130

24 h 32 hTGF-β (ng/ml)

*** ***

A B

Capítulo 1 33

en la interpretación de estos resultados, debido principalmente a los efectos duales y diferenciales que presentan las dosis bajas de suero sobre la viabilidad y proliferación a lo largo del tiempo en este modelo. Adicionalmente se evaluaron dosis adicionales de TGF-β (0.1, 1, 5, 10 y 20 ng/ml) concomitante con 0.5% de SFB a las 0, 24, 32 y 48 horas (solo se muestran los resultados a las 24 y 32 h). Como control positivo se empleó SFB al 10%. En la Figura 1-10 B se confirma el efecto anti-proliferativo del TGF-β sobre células HTR-8/SVneo al observar una disminución cercana a un 20% sobre la viabilidad celular, estadísticamente significativa para las dosis de 10 y 20 ng/ml a las 32 horas, tiempo en el que se evidencian efectos sobre la proliferación celular.

1.2.2 Análisis de la expresión de proteasas por células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β

La invasión celular es un proceso multipasos que involucra un cambio en el fenotipo de adhesión, la degradación de la matriz extracelular (ECM) y la subsecuente migración de la célula gracias a cambios en el citoesqueleto. Para que se lleve a cabo la degradación de la ECM se requiere la activación de proteasas extracelulares, pertenecientes principalmente a dos grupos: serinproteasas del sistema activador del plasminógeno a plasmina y metaloproteasas de matriz (MMPs). Las MMPs son un conjunto de endopeptidasas dependientes de zinc que de forma conjunta van a degradar la matriz extracelular, acción regulada por la unión a los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMPs). y cuyo alto índice de expresión y secreción correlaciona con la agresividad y malignización del tumor (Brooks et al., 2010; Friedl & Wolf, 2003); de estas las más importantes en el proceso de invasión del trofoblasto son las gelatinasas MMP-9 y 2 (Cohen et al., 2006; Staun-Ram et al., 2004). La MMP-9, conocida como gelatinasa B, es una proteasa clave expresada por el trofoblasto que degrada gelatina, colágeno tipo IV, V y XIV, agrecano, elastina, entactina y vitronectina. La regulación de la actividad de MMP-9 es compleja y está establecida a diferentes niveles, iniciando con la dependencia de varios elementos cis en el promotor de su gen para su transcripción, y finalizando con la regulación de su actividad en el medio extracelular por diferentes factores solubles que incluye una cascada de activación por proteólisis, estabilización de su forma madura e inhibición mediada por sus inhibidores tisulares (Cohen et al., 2006). Por otro lado, el sistema activador de plasminógeno compuesto por el activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), su receptor (uPAR) y su inhibidor (PAI-1) juega un rol pivotal en la invasión celular, adhesión y migración (Preissner et al., 2000). Se ha demostrado un importante rol del sistema uPA en la regulación de la invasión y migración del trofoblasto (Lala & Chakraborty, 2003), adicional a su función proteolítica e incluyendo a la línea HTR-8/SVneo (Liu et al., 2003). Previamente se ha visto que el IGF-I y la insulina tienen efectos dependientes del suero en la proliferación e invasión de modelos celulares de trofoblasto de primer trimestre (Mandl et al., 2002). Así mismo, se ha visto que una alta concentración de glucosa inhibe la invasión de células HTR8/SVneo al prevenir la activación de uPA (Belkacemi et al., 2005). Considerando lo anterior y en base a los resultados obtenidos previamente, es relevante estudiar los efectos del TGF-β en presencia o ausencia de suero y a través del tiempo

34 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

sobre la expresión de estas proteasas, al ser la regulación temporal de estas enzimas un punto de inflexión en la regulación de la invasión de EVT. Se evaluó la expresión de uPA y MMP-9 a nivel de ARNm en respuesta a diferentes dosis de TGF-β, mediante qPCR cuantitativa en la línea celular HTR8/SVneo, en presencia o ausencia de SFB 0,5% y a lo largo del tiempo. La calidad del ARN extraído fue evaluada por electroforesis en gel de agarosa; posteriormente se hizo una cuantificación relativa del ADNc mediante PCR en tiempo real, normalizando los resultados contra el gen de la unidad ribosomal 18s y el gen β–actina, previo a las normalizaciones específicas de cada análisis. El efecto del TGF-β sobre la expresión de las proteasas se evaluó a las 12 y 24 horas empleando diferentes dosis de esta citoquina (0, 0,1, 1, 5, 10 y 20 ng/mL) en medio sin suero o con 0,5% de SFB, empleando como control células cultivadas por el mismo tiempo en medio libre de suero o con 0,5% de SFB, respectivamente. (Anexo A 9c) (S. Novoa-Herrán et al., 2016). Figura 1-11 Efecto del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 (A.) sin suero o (B.) con 0.5% SFB, y de uPA (C.) sin suero o (D.) con 0.5% SFB.

Expresión evaluada por qPCR y relativa a los genes 18S y β-actina, normalizada al control (TGF-β

0 ng/mL). t-test no pareado de dos colas, comparando al control (n= 3, * p<0.05, ** p>0.01, *** p<0.001).

En general, la naturaleza y magnitud del efecto del TGF-β sobre la expresión de los genes cambia con la dosis, la presencia de suero y según el tiempo al que fue evaluado (Figura 1-11). No se observaron diferencias significativas entre las dosis de TGF-β empleadas, aunque se observaron efectos cualitativos de este factor sobre la expresión de las proteasas, siendo significativo para la expresión de MMP-9 con suero (Figura 1-11 B; 0,1 ng/mL a las 12 y 24 h, 1 y 5 ng/mL a las 12 h) y para la expresión de uPA sin suero (Figura 1-11 C; 10 y 20 ng/mL a las 24 h) y con suero (Figura 1-11 D; 1 y 20 ng/mL a las 12 h). Específicamente el tratamiento del TGF-β concomitante con 0,5% de SFB

Sin SFB

0 1 10 200.1

1

10MMP9, 0% SFB

expr

esió

n re

lativ

a de

MM

P9

Con SFB

0 0.1 1 5 10 200.1

1

10

*

*

* *

MMP9, 0,5% SFB

0 1 10 200.1

1

10

12 h 24 h

***

***

uPA, 0% SFB

Dosis de TGF-β (ng/mL)

expr

esió

n re

lativ

a de

uPA

0 0.1 1 5 10 200.1

1

10

12 h 24 h

* *uPA, 0,5% SFB

Dosis de TGF-β (ng/mL)

A B

C D

Capítulo 1 35

disminuyó entre 2 y 4 veces la expresión de MMP-9 a las 12 horas, dependiendo de la dosis (0 vs 0,1 ng/mL fold -3,57 p=0,0192; vs 1 ng/mL fold -4,17 p=0,0151; vs 5 ng/mL fold -3,23 p=0,0221; vs 10 ng/mL fold -2,63 n.s.), mientras que a las 24 horas se registró una disminución superior a 5 veces con la dosis 0,1 ng/mL (0 vs 0,1 ng/mL fold -5,56 p=0,0490). Para el caso de uPA se registró un aumento en su expresión entre 2 y 3 veces en respuesta al TGF-β con SFB a las 12 horas (0 vs 1 ng/mL fold 3,15 p=0.0306; vs 20 ng/mL fold 2,74 p=0.0323). Opuestamente, cuando el tratamiento se hizo en ausencia de suero la expresión de uPA disminuyó en respuesta al TGF-β, siendo significativo a las 24 horas (0 vs 10 ng/mL fold -2,78 p=0.0005; vs 20 ng/mL fold -1,79 p=0.0062). Figura 1-12 Efecto del TGF-β relativo a la presencia de suero sobre la expresión de MMP-9 (A.) a las 12 (B.) y 24 horas, y de uPA (C.) a las 12 (D.) y 24 horas.

Expresión evaluada por qPCR y relativa a los genes 18S y β-actina, normalizada al control (TGF-β 0 ng/mL). Comparación entre tratamientos con y sin suero por test ANOVA de doble vía (n= 3, *

p<0.05, ** p>0.01, *** p<0.001). El eje de expresión relativa se presenta en escala Log 10. Al evaluar la influencia del suero en el efecto del tratamiento se obtuvo una diferencia significativa en la expresión de estos genes en respuesta a esta citoquina con o sin suero (Figura 1-12). En particular, para uPA se presentó un perfil de expresión en respuesta al TGF-β claramente distintivo entre el tratamiento con o sin suero e independiente de la dosis o el tiempo evaluado. Notablemente se observa que la presencia o ausencia de suero modificó de forma significativa la naturaleza del efecto del TGF-β, cambiando de disminuir la expresión de uPA en ausencia de suero, a aumentarla en presencia de SFB al 0,5%, tanto a las 12 horas (Figura 1-12 C, 1 ng/mL t=3,761 p<0,01; 20 ng/mL t=3,642 p<0,01) como a las 24 horas (Figura 1-12 D, 1 ng/mL t=3,196 p<0,05; 10 ng/mL t=3,255

0 1 10 200.1

1.0

10.0 MMP9, 12 h

expr

esió

n re

lativ

a de

MM

P9

0 1 10 200.1

1.0

10.0** MMP9, 24 h

0 1 10 200.1

1.0

10.0

sin SFB SFB 0,5%

** **uPA, 12 h

Dosis de TGF-β (ng/mL)

expr

esió

n re

lativ

a de

uPA

0 1 10 200.1

1.0

10.0

sin SFB SFB 0,5%

* * **uPA, 24 h

Dosis de TGF-β (ng/mL)

A B

C D

12 h 24 h

36 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

p<0,05; 20 ng/mL t=3,783 p<0,01). Para el caso de MMP-9, a las 12 horas el TGF-β tiene un efecto negativo sobre su expresión, consistente y homogéneo independiente de la presencia o no de suero; pero a las 24 horas el TGF-β promueve su expresión en ausencia de suero mientras que la disminuye con suero (Figura 1-11 A y B, Figura 1-12 B 1 ng/mL t=4,152 p<0,01), observándose una concomitancia entre el tratamiento y el suero como en el caso de uPA, pero con efectos opuestos. Para evaluar la dinámica de expresión de los genes uPA y MMP-9 en el tiempo, tanto de forma basal como en respuesta al TGF-β, se cultivaron células de la línea HTR8/SVneo en medio RPMI con SFB al 0,5% con o sin TGF-β 10 ng/mL, y se extrajo el ARNm cada seis horas para dar lugar a los tiempos 0, 6, 12, 18 y 24 horas. Se trabajó con la dosis 10 ng/mL, ampliamente usada en literatura, empleando como control células cultivadas por el mismo tiempo en medio con 0,5% de SFB. Inicialmente para realizar el análisis estadístico los datos se compararon con su respectivo control en cada tiempo, y se normalizaron a este. Finalmente, la expresión relativa se normalizó al tiempo cero para obtener la cinética en el tiempo. El efecto del TGF-β sobre la expresión de uPA y MMP-9 en el tiempo varió de acuerdo al gen estudiado. Al compararlo con su control en cada tiempo, el TGF-β en general disminuyó la expresión de MMP-9 siendo estadísticamente significativo a las 12 horas (fold -2,63 t=3,136 p<0,05) y 24 horas (fold -3,13 t=6,228 p<0,001). A diferencia de uPA, para el cual el TGF-β disminuyó su expresión a las 6 horas, pero la aumentó a las 12, 18 y 24 horas, siendo estadísticamente significativo en este último tiempo (fold 2,58 t=4,676 p<0,001) (datos no mostrados). Figura 1-13 Cinética del efecto del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 y uPA.

Expresión de MMP-9 y uPA a las 0, 6, 12, 18 y 24 horas tras tratamiento con 10 ng/mL de TGF-β con SFB 0,5%. Expresión evaluada por qPCR y relativa a los genes 18S y β-actina, normalizada a

su control (TGF-β 0 ng/mL) en cada tiempo y luego al tiempo cero: (Tx/Cx) / (Tt=0h/Ct=0h). Análisis ANOVA de dos vías, comparando NRQ del tratamiento (TGF-β) con su Control para cada gen (n=

3, * p<0.05, ** p>0.01, *** p<0.001). Adicionalmente, al normalizar la expresión relativa a lo largo del tiempo con la del tiempo cero, se observó un efecto dual del TGF-β sobre la expresión de las proteasas en el tiempo, siguiendo un patrón sinusoidal, con picos desfasados. Así, mientras que a las 6 horas el TGF-β aumenta la expresión de MMP-9 (fold 2,5) y disminuye la de uPA (fold -

Efecto de TGF- β 10 ng/mL / SFB 0,5%

0 6 12 18 240.01

0.1

1

10

MMP-9 uPA

***

****

Tiempo (h)

Expr

esió

n gé

nica

rela

tiva

Capítulo 1 37

1,74), a las 18 horas aumenta la de uPA (fold 6,61) y disminuye la de MMP-9 (fold -18,34). (Figura 1-13).

Análisis de promotores y regulación por factores de transcripción

La regulación transcripcional diferencial observada por parte del TGF-β para cada gen puede deberse a una activación diferencial de vías de señalización, que se podría dilucidar partiendo de los factores de transcripción que regulan la expresión de cada gen. Se realizó un análisis bioinformático de los promotores de los genes MMP-9 y PLAU (uPA), para determinar los factores de transcripción que se pueden unir a estos y regular su transcripción, con las herramientas computacionales Proscan y Enrich. Los genes MMP-9 y PLAU están ubicados en cromosomas diferentes, 20 y 10, segmentos chr20q12 y chr10q24 respectivamente, y a pesar de que un grupo de factores de transcripción compartido se unen a sus respectivos promotores, existe un set de factores de transcripción diferente y específico para cada gen. En la Figura 1-14 se condensan los resultados del análisis de promotores donde se muestran los factores de transcripción que se unen o tienen sitio de unión probable en el promotor de cada gen. Figura 1-14 Factores de transcripción con sitios de unión en los promotores de los genes MMP-9 y PLAU (uPA).

Lista consenso creada a partir de análisis con Proscan v. 1.7 y Enrich (ChIP ChEA 2015, ENCODE TF ChIP-seq 2015, TRANSFAC y JASPAR PWMs y Genome Browser PWMs).

38 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 1-15 Vía de señalización del TGF-β y factores de transcripción involucrados en la expresión de MMP-9 y PLAU (uPA).

Factores de transcripción inferidos que regulan la expresión de MMP-9 y PLAU (nodos morados), solo de MMP-9 (nodos naranjas) o solo de PLAU (nodos azules), pertenecientes a la Vía de señalización del TGF-β reportada por WikiPathways.

Capítulo 1 39

Parte de los factores de transcripción encontrados deben constituir la etapa final de una activación diferencial de vías de señalización, que en el caso del presente estudio debe partir del ligando TGF-β. Al vincular estos factores de transcripción con la vía del TGF-β reportada por WikiPathway (Figura 1-15), se observan elementos comunes como Fos/Jun, el cual forma un complejo multimérico con Smad2-3/Smad4, así como Myc, EP300, Sp1 y JunD que junto con Smad2 y 3 pueden coordinar la expresión de los dos genes. De los factores de transcripción reportados para PLAU pero no para MMP-9 se encuentran CREBBP, Ets1 y E2F4, resaltando ATF2, ATF3 y MEF2A, quienes son activados por fosforilación por MAPK14. En cuanto a MMP-9, SMAD4, TP53 y JUNB son reportados como reguladores de este pero no de PLAU (Figura 1-14), pudiendo seguir solo la vía canónica de TGF-β /SMADs (Figura 1-15). Se realizó un análisis de vías Pathway Commons con la herramienta PCViz, evaluando la red de interacción entre TGF-β y MMP-9 o uPA, así como la red entre la citoquina y las dos proteasas (Figura 1-16). Se confirma el papel de Jun como un factor de transcripción común a ambas proteasas. Se observa para la red de TGF-β a MMP-9 que SMAD7, quien media la señalización desde el ligando, conecta con CTNNB1 o β-catenina, un componente clave corriente abajo de la vía de señalización canónica de Wnt. En el caso de la red de uPA, se observa una interacción notable de TGF-β con miembros de la vía MAPK como MAPK1 y MAPK3 que van a regular a uPA, reforzando los resultados obtenidos al cruzar los factores de transcripción que regulan de forma exclusiva a uPA con la vía del TGF-β de WikiPathways.

Figura 1-16 Análisis de vías Pathway Commons.

Red obtenida entre los genes TGF-β, MMP-9 y PLAU, obtenida con PCViz y adición de 34 nodos. Conexiones azules: cambios de estado, conexiones verdes: expresión. Cuadros con línea punteada: nodos conectores compartidos entre TGF-β y las dos proteasas. Cuadros con línea continua: nodos conectores exclusivos a MMP-9 o a PLAU.

40 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

La regulación transcripcional diferencial ejercida por el TGF-β sobre cada gen, se explica en parte por el conjunto diferencial de factores de transcripción encontrados para cada gen, especialmente con aquellos reportados pertenecientes a la vía de señalización de TGF-β como Smad4, TP53 y JUNB para MMP-9 y CREBBP, Ets1, E2F4, ATF2, ATF3 y MEF2A para PLAU. Esta diferencia también puede deberse a una activación diferencial de vías de señalización, como lo sugieren los análisis bioinformáticos, y es necesario explorar posibles señalizaciones cruzadas, incluyendo co-activación de la vía MAPK, considerando la regulación temporal que presenta la transcripción de estos genes. El hecho de encontrar factores de transcripción reportados para PLAU pero no para MMP-9 como ATF2, ATF3 y MEF2A, activados por fosforilación por MAPK14, sugiere que la transcripción de PLAU puede estar mediada adicionalmente por un entrecruzamiento de TGF-β con la vía de las MAPK, involucrando una inhibición de BCAR1 (miembro corriente arriba de MAPK14) por el complejo Smad2-3/Smad4 y/o una interacción proteína-proteína del miembro corriente arriba MAPK3K7 con TGFBR1, así como la activación de MAPK1 y MAPK3, como lo sugiere la red de Pathway Commons. En esta última red se observó la conexión entre TGF-β y MMP-9 a través de Smad7 y CTNNB1 o β-catenina, quien es un factor de transcripción de la vía Wnt. SMAD7, además de ser un inhibidor de la señalización por SMAD2/3, puede modular la actividad transcripcional de forma positiva o negativa al unirse a SMAD4 y translocar al núcleo, interactuando con otros factores de transcripción; este hecho es relevante al ser SMAD4 uno de los factores de transcripción reportados para MMP-9 pero no para PLAU, y encontrándose ambas SMADs expresadas por la línea HTR-8/SVneo (Pollheimer & Knöfler, 2005). Estudios en tumores han mostrado que SMAD7 puede adicionalmente promover el crecimiento tumoral al inactivar la proteína de Retinoblastoma, e inducir la expresión del gen de tioredoxina conduciendo al crecimiento acelerado y la resistencia a la apoptosis en células cancerosas; de tal forma que el rol de Smad7 es complejo y dependiente del modelo (Pardali & Moustakas, 2007). Adicionalmente, Myc, factor de transcripción encontrado para ambos genes, es un mediador de la pérdida de la respuesta anti-proliferativa al TGF-β a través de la vía de Wnt/β catenina, y axin, un inhibidor de esta vía, forma complejos con SMAD7 y promueve la degradación de este último (Pardali & Moustakas, 2007). Finalmente, una pérdida de la función de PTEN contribuye al aumento en la motilidad y la invasión celular dependiente de TGF-β/SMAD3 en carcinomas, enfatizando el rol de supresor tumoral de PTEN como un inhibidor de las acciones pro-metastáticas de TGF-β (Pardali & Moustakas, 2007); este puede estar implicado en la estimulación de la invasión a traves de proteasas y dependiente de TGF-β observado por Yanzhen (Yanzhen et al., 2014) y en la expresión de proteasas reportados aquí, permitiendo su relación con el componente nutricional a través de PTEN. No obstante, más allá del análisis bioinformático, y debido a las limitaciones propias de este trabajo, no es posible explicar por completo el comportamiento dual del TGF-β, ni afirmar que las vías de señalización y factores de transcripción inferidos estén actuando realmente de esa forma in vivo. Es por eso que actualmente, en trabajos paralelos del grupo de investigación se está verificando la actividad proteasa extracelular y los mediadores involucrados en la señalización que conduce de TGF-β a la expresión de estas proteasas, para corroborar una posible regulación temporal como la que sugerimos.

Capítulo 1 41

1.2.3 Análisis proteómico de células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β

Teniendo en cuenta los resultados anteriores, es posible que el TGF-β tenga efectos adicionales en este modelo, aún no estudiados. De acuerdo con esto, es interesante realizar un abordaje exploratorio amplio como el que permiten los análisis proteómicos para tratar de determinar efectos adicionales y descubrir nuevas proteínas involucradas en la respuesta al TGF-β. El objetivo de esta sección es identificar proteínas diferencialmente expresadas en respuesta al TGF-β en la línea de trofoblasto HTR-8/SVneo mediante electroforesis bidimensional (E2D) y determinar la relevancia de esta aproximación metodológica para aplicar en estudios posteriores. Se realizó un análisis proteómico diferencial de la estimulación con TGF-β usando geles E2D de 7 cm. A partir de los resultados anteriores, se escogió SFB al 0,5% como suplemento o soporte nutricional para realizar la estimulación en cultivo, el cual se llevó a cabo por 24 horas, tiempo en el cual se realizan la mayoría de los estudios de invasión y a partir del cual son notorios los efectos anti-proliferativos y anti-invasivos del TGF-β. Se procedió de forma similar a los experimentos anteriores; las células HTR-8/SVneo fueron estimuladas con TGF-β1 en dosis de 1 y 10 ng/mL en medio RPMI suplementado con SFB al 0,5%, y cultivadas por 24 horas, empleando medio con SFB al 0,5% como control de la estimulación. El extracto total de proteína fue obtenido y separado por E2D, teñido con Azul de Coomassie Coloidal y el análisis comparativo de las imágenes fue realizado con los programas Melanie y SameSpot (ver Anexos A 5a). Inicialmente se hizo una exploración de la separación, empleando geles de 7 cm y pI 3 a 10, los cuales dieron perfiles proteicos altamente complejos para ser analizados, pero evidentemente diferentes entre los grupos. A pesar de la gran diferencia entre los geles de TGF-β 10,0 ng/mL y su control (SFB 0,5%), los geles de TGF-β 1,0 ng/mL se situaron como un perfil proteómico intermedio entre la dosis 10 ng/mL y el control, muestras que se deciden mantener en los análisis posteriores (Datos e imágenes no mostradas). Con base en esta evaluación, se realizó un zoom en el pI, escogiendo el rango de 4 a 7, zona en la cual se encontraba la mayoría de spots y se realizó un análisis E2D adicional separando mayor cantidad de proteína de acuerdo con la alta complejidad de la muestra y el nuevo rango, más estrecho, de pH. En este, las tiras IPG se saturaron en proteína (200 μg) para lograr visualizar proteínas de menor abundancia en zonas analizables (con buena resolución), las cuales pueden ser de mayor interés que las proteínas más abundantes que usualmente se obtienen. Tabla 1-4: Spots de proteína identificados por MS MALDI ToF.

Gel Tratamiento Spots picados

Proteínas identificadas

Proteínas únicas

G3 Control 14 18 17 G5 TGFβ 1 4 3 3 G7 TGFβ 10 31 34 26 Total 49 55 40

Los spots de proteína con expresión diferencial y algunos invariables pero comunes con los geles “TGF-β 1 ng/mL”, fueron seleccionados y picados en el gel “TGF-β 10” (Figura 1-19); los spots cuya intensidad disminuía en función del TGF-β fueron picados en el gel “Control” (Figura 1-17) o en el gel “TGF-β 1” (Figura 1-18) para contar con una mayor

42 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

cantidad de proteína. La proteína fue identificada por MALDI MS ToF y búsqueda con MASCOT (VHIO, Barcelona), dando lugar a 40 proteínas únicas identificadas entre los tres geles (Tabla 1-4). Ya que los geles “TGF-β 1 ng/mL” (Figura 1-18) se presentan con un patrón intermedio entre el Control (SFB 0,5%) y el “TGF-β 10 ng/mL”, se usaron como una imagen de confrontación para ayudar en el alineamiento y comparación de las imágenes, y se picaron spots en este para confirmar y validar por MS el correcto alineamiento de las imagenes. La identificación obtenida por MS corrobora la alineación realizada, al encontrar correspondencia entre los spots picados (216, 91, 77), como se muestra en la Tabla 1-5. Adicionalmente se corroboro el alineamiento entre el gel Control y “TGF-β 10 ng/mL” por tres spots comúnes (187, 499/502, 150). Figura 1-17: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo control.

Geles representativos para los proteomas Control (SFB 0,5%, G3), TGF-β 1 ng/ml (G5) y TGF-β 10 ng/mL (G7); análisis por triplicado por geles E2D de 7 cm pI 4-7 teñidos con Azul de Coomassie Coloidal. MW: PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder (Thermo). Se señalan los spots picados con el ID del analisis de imágenes con Samespot; no se ubica ID para los spots sin identificación o score muy bajo. Tabla 1-5: Confirmación del alineamiento mediante identificación de spots de proteína.

ID SameSpot ID GIH Nombre proteína Acceso

SwissProt Nombre

gen 216 G5S1 = G3S4 T-complex protein 1 subunit beta TCPB_HUMAN CCT2 91 G5S3 = G7S1 Neutral alpha-glucosidase AB GANAB_HUMAN GANAB 77 G5S4 = G7S8 Vinculin VINC_HUMAN vcl 187 G3S6=G7S29 T-complex protein 1 subunit alpha TCPA_HUMAN TCP1

499=502 G3S7 = G7S31 Actin, cytoplasmic 2 ACTG_HUMAN ACTG1 150 G3S12 = G7S21 Stress-70 protein, mitochondrial GRP75_HUMAN HSPA9

Capítulo 1 43

Figura 1-18: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo estimuladas con TGF-β 1 ng/mL.

Figura 1-19: Patrón de proteínas en gel E2D de las células HTR-8/SVneo estimuladas con TGF-β 10 ng/mL.

44 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Ademas se analizaron clústers o agrupaciones de spots, algunos en forma de rosario, que resultaron corresponder a la misma proteína Tabla 1-6. Los criterios para analizar las imágenes y depurar los datos MS se detallan en Anexos B 4. Tabla 1-6: Clústers de spots de proteína encontrados.

ID SameSpot ID GIH Nombre proteína Acceso

SwissProt Nombre

gen 148=150 G7S20 = G7S21 Stress-70 protein, mitochondrial GRP75_HUMAN HSPA9

91=71=81 G7S1= G7S6 = G7S7 Neutral alpha-glucosidase AB GANAB_HUMAN

GANAB

694=131 G7S18 =G7S17 Eukaryotic translation initiation factor 4B IF4B_HUMAN EIF4B

Figura 1-20: Comparación de secciones de gel con spots de proteínas diferenciales.

En la Tabla 1-7 se resume la razón de cambio en el nivel proteico de las proteínas identificadas y en la Tabla 1-8 se listan estas y sus anotaciones GO más relevantes, extraídas de NextPro y DAVID. En la Figura 1-20 se presentan cuatro secciones

Capítulo 1 45

aumentadas de los geles “TGF-β 10” y “Control”, donde se evidencia la diferencia en la cantidad de proteína para los spots identificados más significativos. (En el material Suplementario Capítulo 1 se puede consultar la razón de cambio en el nivel proteico dada por SameSpot, para proteínas de interés biológico, así como su descripción dada por NextProt). Las proteínas con mayor aumento en respuesta al TGF-β fueron: Factor de iniciación de la traducción eucariote 4B (EIF4B), Anexina A2 (ANXA2), la sub-unidad regulatoria no-ATPasa 14 del proteosoma 26S (PSMD14), Vinculina (VCL), Fosforibosil-formil-glicinamidina sintasa (PFAS), Plastina-3 (PLS3), Proteína de 71kDa relacionada a choque térmico (HSPA8), Proteína dopey 2, alfa glucosidasa-AB neutral (GANAB) la cual se identificó en varios spots, Antígeno 1 de endosoma temprano (EEA1), entre otras. Por otro lado, la proteína con mayor disminución fue el miembro A de la familia de la fosfoproteína nuclear 32 rica en leucina acídica (AN32A). Actina y tubulina se mantuvieron invariables, concordando con su rol estructural (Ver Supl Capítulo1 A y Figura 1-20). Tabla 1-7: Razón de cambio en el nivel proteico de los spots identificados, en respuesta al TGF-β

Proteínas únicas identificadas

Producción disminuida Producción aumentada

<–2,0 –2,0 - –1,5 >2,0 1,5 - 2,0 40 4 2 22 9 6 31

Análisis bioinformático de resultados y generación de redes

Figura 1-21 Agrupación de anotaciones funcionales para proteínas identificadas por células HTR-8/SVneo en respuesta a TGF-β.

Análisis de Proteínas diferencialmente expresadas, más actina y tubulina. Rigor de la clasificación (Classification Stringency): medio. Términos de anotaciones: default (FAT), GO Panther, Reactome and Panther pathways. Dominios proteicos: Panther family and subfamily. E.S.: Puntaje de enriquecimiento (Enrichment Score). Las proteínas actina y tubulina, encontradas como invariables, se incluyeron en los análisis debido a que muchas proteínas identificadas interactuaban con ellas. Con DAVID 6.7. se realizó la agrupación de anotaciones funcionales y la clasificación de genes.

Clusters de anotaciones

0 10 20 30 40 50

Adenyl nucleotide binding, ATP-bindingUnfolded protein binding, Protein metabolism and modification

Protein complex assembly, Tubulin, PrefoldinCytoplasmic membrane-bounded vesicle, Ag processing and presentation

Cell structure and motility, Non-membrane-bounded organelleFocal adhesion, Cytoskeleton, Cell motion

Cell structure, Mitosis, Intracellular protein trafficCalcium ion binding, Actin binding

Microtubule-based movement, Cellular protein complex assemblyInteraction tubulin, Cellular macromolecular complex subunit organization

Rho cell motility signaling pathway, Cell-substrate adherens junctionGTPase regulator activity

Mitotic cell cycleProgrammed cell death

Cation binding, Zinc ion binding

6.914.04

3.943.80

3.00

% Genes

2.061.82

1.531.491.461.44

1.040.420.30

0.11E.S.

Tabla 1-8: Proteínas identificadas en respuesta al TGF-β 10 ng/mL5 ID Fold

TGFβ / Ctrl

Protein name Gene Name pI ~

MW (kDa) MS Score

Pep match (%seq)

Molecular function Biological Process SameSpot

GIH Theor. Observ. app.

701 G3 S11 -6,43 Acidic leucine-rich

nuclear phosphoprotein 32 family member A

ANP32A 3,99 29 32 170 20(61.0) phosphatase inhibitor activity

Intracellular signal transduction,

Nucleocytoplasmic transport

216 G3 S4= G5 S1 -4,31 T-complex protein 1

subunit beta CCT2 6,01 58 54 209 36(71.8) ATP & protein binding protein complex assembly

670 G3 S14 -4,06 Stress-induced-phosphoprotein 1 STIP1 6,4 63 67 75,8 23(36.1) Poly(A) RNA binding protein folding

670 G3 S14 -4,06 WD repeat-containing protein 1 WDR1 6,17 67 67 88,3 16(36) /

(37.0) actin binding cellular component movement

631 G3 S8 -1,84 Heat shock protein HSP 90-alpha

HSP90AA1 4,94 85 98 103 31(41.7) Nucleotide, Poly(A) RNA

& protein binding protein folding

631 G3 S8 -1,84 Heat shock protein HSP 90-beta

HSP90AB1 4,97 84 98 146 37(44.2) Nucleotide, Poly(A) RNA

& protein binding protein folding

675 G3 S10 -1,26 Tubulin beta chain TUBB 4,78 50 75 88,8 17(42.1) structural constituent of cytoskeleton

cellular component organization

499=502

G3 S7 = G7 S31 1,08 Actin, cytoplasmic 2 ACTG1 5,31 42 43 169 27(73.6) structural constituent of

cytoskeleton intracellular protein

transport

502=4 G7 S31 1,08 Actin, cytoplasmic 1 ACTB 5,29 42 41 182 / 31(77.3) structural constituent of intracellular protein

5Fold TGF-β/Ctrl, razón de cambio de la densidad óptica del spot de proteína (nivel proteico) de proteomas con TGF-β 10 ng/mL respecto al proteoma control (0,5% SFB); MW (kDa), peso molecular teórico y experimental en kDaltons; pI~, pI teórico; MS score, score de identificación dado por Mascot. score > 56 es significativo; % Seq, porcentaje de cubrimiento de secuencia; Pep match, número de péptidos asignados por proteína. Términos GO relevantes para Función Molecular y Procesos Biológicos, obtenidos de la base de datos Nextprot y con la herramienta bioinformática DAVID. El peso molecular (MW) observado se determinó directamente con Samespot; el fold de los spots de proteína seleccionados para identificación se confirmó con el programa Quantity One, obteniendo razones similares.

48 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

ID Fold TGFβ / Ctrl

Protein name Gene Name pI ~

MW (kDa) MS Score

Pep match (%seq)

Molecular function Biological Process SameSpot

GIH Theor. Observ. app.

99 = G3 S7 209.0 cytoskeleton transport

187 G7

S29=G3S6

1,53 T-complex protein 1 subunit alpha TCP1 5,8 61 62 89,1 21(49.1) ATP, Poly(A) RNA &

unfolded protein binding Tubulin complex

assembly

493 G3 S5 1,53 T-complex protein 1 subunit epsilon CCT5 5,45 60 61 92 25(48.1)

ATP, unfolded protein & G-protein beta-subunit binding

Response to virus

116 G7 S15 1,56 LIM domain and actin-binding protein 1 LIMA1 6,41 86 91 79,2 22(29.4)

Actin filament binding, sequence-specific

DNA binding transcription factor

activity

Negative regulation of actin filament

depolymerization

479 G3 S13 1,58 Heat shock 70 kDa protein 1A/1B HSPA1 5,4 70 70 56,1 12(27.5)

Double-stranded RNA, Poly(A) RNA, ATP &

protein binding

Negative regulation of cell growth

192 G7 S30 1,76 Serine/threonine-protein kinase PAK 2 PAK2 5,69 58 61 74 /73.9 16(38.4) Protein serine/threonine

kinase activity Signal transduction

72 G7 S10 1,83 Rho GTPase-activating protein 29

ARHGAP29 6,32 144 126 59,4 22 (17.0) Rho GTPase activator

activity Rho protein signal

transduction

72 G7 S10 1,83 SLIT-ROBO Rho

GTPase-activating protein 3

SRGAP3

6,23 125 126 59 27 (23) small GTPase regulator

activity cell adhesion

137 G3 S9 1,88 78 kDa glucose-regulated protein HSPA5 5,07 72 83 161 31(45.1) Chaperone binding

Regulation of protein folding in endoplasmic

reticulum

137 G3 S9 1,88 Tubulin alpha-1A chain TUBA1A 4,94 51 83 94 / 73.0 15(42.4) structural constituent of cytoskeleton

cellular component movement

73 G7 S9 2,10 Coronin-7 CORO7 5,51 102 126 117 25 (27.5) Protein binding Golgi to endosome transport

132 G7 S16 2,16 CTP synthase 1 CTPS 6,02 67 86 57,8 14 (26.2) CTP synthase activity pyrimidine nucleobase

Capítulo 1 49

ID Fold TGFβ / Ctrl

Protein name Gene Name pI ~

MW (kDa) MS Score

Pep match (%seq)

Molecular function Biological Process SameSpot

GIH Theor. Observ. app.

metabolic process

189 G7 S28 2,20 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 PKM2 7,96 58 62 121 24(43.9) Pyruvate kinase activity Glycolytic process

108 G7 S4 2,28 Mitochondrial inner membrane protein IMMT 6,08 84 95 178 33(41.7) Poly(A) RNA & protein

binding Mitochondrial calcium

ion homeostasis

108 G7 S4 2,28 Cold shock domain-containing protein E1 CSDE1 5,88 90 95 62 16(17.9) Poly(A) RNA & DNA

binding

Nuclear-transcribed mRNA catabolic

process, no-go decay

689 G7 S11 2,53 Serrate RNA effector molecule homolog SRRT 5,7 101 135 85,6 30 (31.5) Poly(A) RNA & protein

binding Primary miRNA

processing

689 G7 S11 2,53 Kinesin-like protein KIF11 KIF11 5,47 120 135 61 /74.5 20(18.8) /

23(21.3) microtubule motor

activity vesicle-mediated

transport

22 G7 S26 2,64 Talin-1 TLN1 5,77 272 250 256 61(33.4) actin, vinculin & integrin binding

Cell-cell junction assembly

158 G7 S24 2,85 Leukotriene A-4 hydrolase LTA4H 5,8 70 72 141 22(31.6) metallopeptidase activity fatty acid biosynthetic

process

158 G7 S24 2,85 Intraflagellar transport protein 74 homolog IFT74 5,73 69 72 73 17(31.7) Beta-tubulin &

Chromatin binding Cilium assembly

150 G7S21= G3S12 2,96 Stress-70 protein,

mitochondrial HSPA9 5,87 74 77 206 33(47.1) ATP, Poly(A) RNA & protein binding

Negative regulation of apoptotic process

106 G7 S2 2,96 Gelsolin GSN 5,9 86 95 129 25(38.6) actin & calcium ion binding Cilium morphogenesis

36 G7 S27 3,14 Early endosome antigen 1 EEA1 5,55 163 183 155 46(37.2) 1-phosphatidylinositol

binding Endocytosis

91 G5 S3 = G7S1 3,26 Neutral alpha-

glucosidase AB GANAB 5,74 107 110 259 45(47.8) glucosidase activity polysaccharide metabolic process

693 G7 S19 3,58 Protein dopey-2 DOPEY2 5,9 260 85 62,6 25(12.3)

Golgi to endosome transport

50 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

ID Fold TGFβ / Ctrl

Protein name Gene Name pI ~

MW (kDa) MS Score

Pep match (%seq)

Molecular function Biological Process SameSpot

GIH Theor. Observ. app.

697 G7 S22 3,71 Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8 5,37 71 78 65 15(28.8) Poly(A) RNA & protein

binding

protein complex biogenesis, Regulation

of cell cycle

490 G7 S25 3,80 Plastin-3 PLS3 5,41 71 67 112 23(44.0) actin & calcium ion binding

cellular component morphogenesis

688 G7 S12 4,01 Phosphoribosylformylglycinamidine synthase PFAS 5,5 146 135 203 40(36.7) ligase activity 'de novo' IMP

biosynthetic process

77 G5 S4 = G7S8 4,17 Vinculin VCL 5,5 124 125 275 51(45.5) actin, catenin & cadherin

binding cell-matrix adhesion

355 G3 S1 4,81 26S proteasome non-

ATPase regulatory subunit 14

PSMD14 6,06 35 35 129 19 (66.1) Metallopeptidase activity Regulation of

proteasomal protein catabolic process

355 G3 S1 4,81 Annexin A2 ANXA2 7,57 39 35 59 11(33.9) protein & calcium ion fatty acid metabolic

process, Membrane raft assembly

694=131

G7 S18 =G7 S17

5,07 Eukaryotic translation initiation factor 4B EIF4B 5,55 69 88 191 35 (51.7) translation initiation

factor activity regulation of translation

Tabla 1-8: (Continuación)

Como vías para resaltar están: la vía de señalización de apoptosis (Panther, 10% genes, p=0.0146, clúster 2), el metabolismo de proteínas (Reactoma, 15% genes, p= 0,0071, clúster 3), la regulación del citoesqueleto de actina (KEGG, 12,5% genes, p= 0.0146, clúster 6) y la vía de señalización de motilidad celular Rho (Biocarta, 7,5% genes, p= 0.0159, clúster 11). (Figura 1-21). La clasificación funcional de los genes dió dos grupos: uno con 11 proteínas y términos como “Unión a proteína sin plegar” (81,8%, p= 1,3 x 10-

15) y “Unión a nucleótidos” (100%, p= 2,6 x 10-11), y el otro con 3 proteínas y términos como “Adhesión focal” (100%, p= 6,3 x 10-5) y “Uniones adherentes célula-sustrato” (100%, p= 6,8 x 10-5) y vías de señalización de integrinas (66,7%, p=2,4 x10-2). y de motilidad celular mediada por Rho (66,7%, p=1,7 x10-2) (Tabla 1-9). Tabla 1-9 Clasificación funcional de las proteínas identificadas en respuesta a TGF-β Gene Group 1 Enrichment Score: 6.8759

Gene name Gene Name Terms

HSP90AB1 heat shock protein 90kDa alpha, class B

unfolded protein binding, chaperone, ATP-binding, adenyl

ribonucleotide binding, nucleotide-binding, acetylation, Antigen

processing and presentation

TCP1 T-complex 1 HSPA9 heat shock 70kDa protein 9 (mortalin) HSPA1 heat shock 70kDa protein 1A CCT5 chaperonin containing TCP1, subunit 5 (epsilon)

HSP90AA1 heat shock protein 90kDa alpha, class A ACTB actin, beta

ACTG1 actin, gamma 1

HSPA5 heat shock 70kDa protein 5 (glucose-regulated protein, 78kDa)

CCT2 chaperonin containing TCP1, subunit 2 (beta) HSPA8 heat shock 70kDa protein 8

Other functionally related genes Similarity Score (Kappa)

CTPS CTP synthase 0.37 KIF11 kinesin family member 11 0.35

Gene Group 2 Enrichment Score: 2.3858 Gene name Gene Name Terms

VCL Vinculin focal adhesion, cell-substrate adherens junction, basolateral plasma membrane, Rho cell motility signaling pathway, Integrin Signaling Pathway

TLN1 Talin 1 LIMA1 LIM domain and actin binding 1

Rigor de la clasificación (Classification Stringency): bajo. Mediantre la aplicación CluePedia de Cytoscape, y empleando la base de datos de Acciones de STRING se construyeron redes para las proteínas diferencialmente expresadas al alza y a la baja en respuesta al TGF-β, obteniendo redes altamente interconectadas que revelan las relaciones físicas y funcionales que pueden existir entre ellas. Adicionalmente, al aplicar el layout Cerebral se hace evidente que la gran mayoría de proteínas pueden encontrarse en el espacio extracelular, algunas con acciones también en el núcleo como Chaperonas y Chaperoninas de la familia de Choque Térmico y CCT (Figura 1-22 A). La red obtenida para las proteínas reguladas a la baja revela que las chaperonas HSP90A median una interacción entre CCT2 y STIP1; de forma similar, en la red regulada al alza se observa una sub-red con las chaperonas HSP9, HSPA1A, HSPA5, HSPA8, TCP1 y CCT5, con acciones en el espacio extracelular y en el núcleo, y

52 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

que median la interacción entre proteínas con acción extracelular como PKM, TUBA1A y GSN y proteínas intracelulares y nucleares como EIF4B, SRRT y PAK2. Figura 1-22 Análisis de redes y anotaciones GO CC para las proteínas diferencialmente expresadas por células HTR8/SVneo en respuesta a TGF-β.

Capítulo 1 53

(Anterior) A) Red generada con CluePedia v.1.2.5 y STRING-ACTIONS v.10.0 9606 para las proteínas reguladas al alza y a la baja: layout Cerebral, mostrando la ubicación celular según anotaciones GO-CC. B) Red generada con STRING 9.10 para todas las proteínas identificadas: vista tipo confianza; score de confianza medio (0.400) sin nodos adicionales; nodos rojos: proteínas con anotaciones GO-CC transporte vesicular y exosomas; grosor de la línea: fortaleza de la asociación. Los programas STRING, VisANT y PCViz también fueron usados en la construcción de redes para las proteínas diferencialmente expresadas totales, al alza y a la baja, obteniendo de igual forma redes altamente interconectadas (imágenes no mostradas). La red al alza obtenida con STRING presenta como principales anotaciones procesos de adhesión celular, proteosoma y degradación de proteínas; mientras que la red total presenta como genoma background anotaciones de procesos biológicos como transporte mediado por vesículas, plegamiento de proteínas de novo, establecimiento de localización celular, organización de las proyecciones celulares, componentes celulares de movimiento y reconocimiento célula-célula; y como kinoma background la respuesta a estímulos con 23 de 40 proteínas anotadas. En la Figura 1-22 B se presenta la red total inicial obtenida con STRING, resaltando nodos de proteínas que presentan como anotaciones GO CC los términos transporte vesicular y exosomas. Figura 1-23 Red enriquecida para las proteínas diferencialmente expresadas por células de HTR8/SVneo en respuesta a TGF-β.

Red enriquecida generada con STRING 9.10: red de asociación de las proteínas identificadas al alza y a la baja, incluyendo las proteínas invariables actina y tubulina, enriquecidas con 10 nodos background (nodos blancos); vista tipo confianza; score de confianza medio (0.400). Las redes de STRING y PCViz se enriquecieron con nodos background, aumentando la interconexión entre los nodos iniciales y revelando interacciones relevantes. Al

54 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

enriquecer la red de proteínas reguladas a la baja, esta revela una interacción de Hsp90 con conocidos transductores de señal como Akt y el receptor de estrógeno tipo 1 (ESR1), así como con el factor inducible de hipoxia (HIF1A); por su parte ANP32A, la proteína con mayor disminución, se conecta con la red principal a través de su interacción con ESR1 y PPP2CA a CCT2, este último que media la red (Figura 1-23). La proteína con mayor disminución en respuesta al TGF-β fue el miembro A de la familia de la fosfoproteína nuclear 32 rica en leucina acídica (ANP32A, pp32 o LANP), la cual está implicada en procesos celulares como proliferación, diferenciación, control de la apoptósis, regulación de la actividad fosfatasa, regulación epigenética por modificación y remodelación de cromatina y participa en la represión transcripcional mediada por el factor E4F1( http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P39687). También fueron reguladas a la baja diversas chaperonas moleculares como: la Proteína conteniendo repeticiones WD 1 (WDR1, AIP1, NORI-1), que induce el desensamblaje de los filamentos de actina junto con ADF/Cofilina (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_O75083); la sub unidad beta de la Proteína 1 del complejo T (CCT2), que asiste en el plegamiento de proteínas tras hidrólisis de ATP y es parte del complejo BBS/CCT (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P78371); la Fosforproteína 1 inducida por estrés o Proteína sensible a transformación (STIP1, STI1, Hop), que media la asociación molecular de las chaperonas Hsc70 (identificada al alza) y Hsp90 (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P31948) y las Proteínas de choque térmico Hsp90α y Hsp90β (HSP90AA1, HSP90AB1), que promueven la maduración, mantenimiento estructural y regulación apropiada de proteínas blanco específicas envueltas en ciclo celular y transducción de señales (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P07900 http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P08238). Dentro del set de proteínas aumentadas en respuesta al TGF-β hay proteínas involucradas en la transcripción, traducción y regulación del ARNm por procesos catabólicos y de silenciamiento. El Factor de iniciación de la traducción eucariote 4B (EIF4B) fue la proteína con mayor aumento en respuesta al TGF-β, la cual es requerida para la unión del ARNm a los ribosomas y trabaja en cercana asociación con eIF-4F y eIF-4A, promoviendo su actividad ATPasa y actividad de desenrollado de ARN (Nextprot, http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P23588). Por su parte la proteína de 71 kDa afín a choque térmico Hsc70 (HSPA8, LAP-1) es un componente del espliceosoma, requerido para la activación del splicing de pre-mRNA, pudiendo tener un rol de scaffolding o andamiaje en el ensamblaje del espliceosoma al conectar todos los otros componentes del complejo central; además es una chaperona molecular multifuncional, que regula diferentes factores de transcripción de unión a ADN (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P11142). Y con un cambio menor está el Homólogo de la molécula serrada, efectora del ARN (SRRT), involucrada con el silenciamiento génico mediado por miRNAs (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_Q9BXP5), y la Proteína E1 conteniendo el dominio de choque frío (CSDE1) perteneciente al novedoso proceso catabólico de mRNA transcrito nuclear, No-Go Decay (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_O75534). La siguiente proteína con mayor aumento fue la subunidad regulatoria no ATPasa 14 del proteosoma 26S (PSMD14, POH1), componente metaloproteasa del proteosoma 26S que rompe específicamente las cadenas poliubiquitina Lys-63 ligadas; además juega un rol en la respuesta a rompimientos de doble hebra (double-strand breaks, DSBs), actuando como un regulador de la recombinación no homóloga o unión de extremos

Capítulo 1 55

no homólogos (non-homologous end joining, NHEJ) al clivar poliubiquitina Lys-63 ligadas, promoviendo por lo tanto la retención de JMJD2A/KDM4A en la cromatina y restringiendo la acumulación de p53BP1; también está envuelta en la reparación por recombinación homologa al promover la carga de RAD51 (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_O00487). Y en este mismo spot se detectó a Anexina A2, también conocido como Proteína anticoagulante placental IV (PAP-IV), la cual es una proteína de unión a membrana regulada por calcio que puede entre cruzar fosfolípidos de membrana plasmática con actina y el citoesqueleto y estar envuelta en exocitosis (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P07355). La Alfa Glucosidasa AB neutral (GANAB), fue identificada en un clúster de spots presentes en respuesta al TGF-β. Esta enzima hidroliza secuencialmente las uniones terminales α-1,3-D-glucosídicas en α-1-3-D-glucanos de glicoproteínas inmaduras, estando implicada en el metabolismo de N-glicanos. Además, se encuentra en el lumen del retículo endoplasmático y en exosomas vesiculares extracelulares y tiene funciones en el procesamiento proteico y la transducción de señales (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_Q14697). (La información de otras proteínas reguladas al alza puede consultarse en el Material Suplementario Capítulo 1, A)

1.2.4 Discusión de resultados efecto del TGF-β En esta sección se estudió el comportamiento de la línea HTR-8/SVneo frente al factor TGF-β, incluyendo su nivel de proliferación, evaluado mediante ensayo de MTT, y expresión de MMP-9 y uPA, como proteasas claves del proceso de invasión celular; adicionalmente, se evaluaron cambios en el proteoma de células de HTR-8/SVneo en respuesta a TGF-β. La mayoría de los estudios a la fecha, se han enfocado en los efectos del TGF-β sobre el trofoblasto como supresor tumoral, en base a sus acciones anti-proliferativas, anti-invasivas y anti-migratorias (Chakraborty et al., 2002; Lala et al., 2002), sin considerar su rol dual de acuerdo al contexto biológico en el que actúa y las acciones como factor pro-metastático que se han descrito en modelos malignos (Ikushima & Miyazono, 2010; Pardali & Moustakas, 2007). Teniendo en cuenta las características de la línea HTR-8/SVneo y su origen, así como el papel dual o dicotomía del TGF-β, no es de extrañar los efectos opuestos de este factor sobre la expresión de MMP-9 y uPA, proteasas claves en el proceso invasivo tanto del trofoblasto como de tumores metastáticos, o en la expresión de algunas de las proteínas identificadas en el abordaje proteómico.

El TGF-β afecta diferencialmente la proliferación celular y expresión de MMP-9 y uPA dependiendo del suero

Se comprobó que la presencia de SFB en bajas concentraciones (0,5%) afecta de forma significativa la naturaleza del efecto del TGF-β sobre la proliferación – y quizás supervivencia – y expresión de uPA y MMP-9 en células de la línea de trofoblasto HTR-8/SVneo. El tratamiento de TGF-β concomitante con SFB generó un aumento en la expresión de uPA tanto a las 12 como a las 24 horas, mientras que en ausencia de suero disminuyó su expresión. Para el caso de MMP-9, también se observó una respuesta dependiente de la presencia de suero a las 24 horas, pero de forma inversa: en ausencia de suero el TGF-β aumentó la expresión de MMP-9, mientras que concomitante con

56 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

suero generó disminuciones variables en la expresión de la proteasa. Sin embargo, la expresión de MMP-9 a las 12 horas tras tratamiento con TGF-β fue más homogénea y estable, disminuyendo su expresión tanto con cómo sin suero. Esto sugiere que la expresión de uPA y MMP-9 puede estar gobernada por sistemas transcripcionales diferentes, y que la señalización desencadenada por TGF-β, previa a la regulación transcripcional de uPA puede ser más dependiente de la presencia de suero, y por lo tanto de las condiciones ambientales, que la que conduce a MMP-9. Adicional a la influencia del suero, el efecto del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 y uPA también cambia con el tiempo, observándose un efecto dual del TGF-β con una cinética sinusoidal y un patrón coordinado entre los dos genes, pero con picos desfasados debido a los efectos opuestos del TGF-β: mientras que a las 6 horas este inhibe la expresión de uPA y aumenta la de MMP-9, a tiempos superiores a las 12 horas el efecto es contrario. Este fenómeno también puede explicarse por vías de señalización y mediadores transcripcionales diferentes que actúan con cinéticas propias, sumado a una posible alteración en las condiciones de cultivo, debido a un consumo de nutrientes y condicionamiento del medio con factores autocrinos, que van a alterar las características del medio de cultivo. Estudios de la expresión de estos genes en el tiempo en respuesta al TGF-β no se habían llevado a cabo, ni la influencia del suero durante el tratamiento. En este trabajo encontramos una respuesta diferencial al TGF-β en función del tiempo, tanto para el gen uPA como para MMP-9, exhibiendo una cinética dual, que concuerda en parte con lo reportado en la literatura. En general, se ha visto que el TGF-β disminuye la secreción y actividad de uPA en la línea HTR-8/SVneo (48 h, medio libre de suero ExCell) (Graham et al., 1993) y en explantes de placenta de primer trimestre (24 h, medio libre de suero ExCell 300) (Lash et al., 2005), disminuyendo a su vez la secreción y actividad de MMP-9 en cultivos primarios de citotrofoblasto de primer trimestre (4 días, medio DMEM libre de suero) (Meisser et al., 1999), y en explantes de placenta (24 h, medio libre de suero ExCell 300) (Lash et al., 2005), y confirmando la reducción en la expresión y actividad de uPA y MMP-9 en la línea de coriocarcinoma JEG-3 (10 ng/mL, 24 h) (Subhradip Karmakar & Das, 2002). Sin embargo, en cultivos primarios de citotrofoblasto de primer trimestre se observó un aumento en la expresión de MMP-9 a las 8 horas, y en su actividad a las 12 horas, en respuesta a TGF-β1 (10 y 20 ng/ml, medio RPMI 1640 libre de suero) (S Shimonovitz et al., 1996); de igual forma un aumento en MMP-9 y 2 en respuesta a TGF-β1 fue observado en cultivos de citotrofoblasto temprano y en la línea de coriocarcinoma BeWo (Yudate et al., 1996). Esto concuerda con el aumento en la expresión de MMP-9 a las 6 horas en medio con SFB al 0,5% o a las 24 horas en medio libre de suero, resaltando la dualidad del TGF-β y sus acciones contexto-dependientes. En adición, recientemente se vió que los efectos opuestos, contexto dependientes del TGF-β en cáncer son modulados por una sinergía entre SMAD3 y el epigenoma, donde patrones específicos al tipo celular de modificaciones de ADN e histonas brindan un mecanismo de modulación a la regulación por TGF-β /SMAD3 (Tufegdzic Vidakovic et al., 2015). El gen de MMP-9 es asociado con la metilación de histona H3K4me1 observada en placenta (ENCODE Histone Modifications 2015) y en el cultivo celular derivado de trofoblasto H1 BMP4 (Epigenomics Roadmap HM ChIP-seq) mientras que PLAU (uPA) es asociado con la metilación H3K4me2 vista en placenta ((ENCODE Histone Modifications 2015) y en el cultivo celular derivado de trofoblasto H1 BMP4 (Epigenomics Roadmap HM ChIP-seq), de tal forma que la modulación epigenómica del efecto del TGF-β sobre la expresión de estos genes es plausible. De igual modo se ha

Capítulo 1 57

visto la hipometilación de CpG como un activador de la expresión de genes asociados con el TGF-β en placentas pre-eclámpticas (Martin et al., 2015). Así mismo, factores específicos al contexto celular como scaffolds de señalización, co-activadores y represores, cuya acción depende de condiciones ambientales, pueden generar dinámicas de señalización y regulaciones espacio-temporales (Kholodenko et al., 2010) y un estudio general de estos además de la activación de la vías de señalización MAPK y TGF-β/SMADs puede explicar los fenómenos observados aquí, confirmando las hipótesis e inferencias bioinformáticas realizadas.

El TGF-β altera el proteoma, involucrando nuevas proteínas

A partir de las proteínas identificadas como reguladas por el TGF-β en la línea HTR-8/SVneo se pueden inferir efectos adicionales a los reportados para el TGF-β en esta línea. Diversas proteínas vinculadas a la vía de señalización Rho-Rac/MAPK fueron reguladas al alza. La proteína GTPasa 29 activadora de Rho (ARHGAP29) y la proteína GTPasa 3 activadora de SLIT-ROBO Rho (SRGAP3) son GTPasas activadoras de Rho y RAC1 (y tal vez Cdc42), respectivamente; mientras que la serina/treonina proteína quinasa PAK2 es un efector corriente abajo de Rac1 y Cdc42 que conecta con la vía de señalización MAPK al fosforilar a MAPK4 y a MAPK6 y activar los blancos corriente abajo MAPK-APK5, un regulador de la polimerización de F-actina y migración celular (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), Nextprot, 2014-09-19, ver Supl. Capítulo 1 A). Lo anterior muestra una regulación sobre transductores de la vía de señalización de las proteínas G monoméricas que podría implicar un feedback o retroalimentación positiva a través de la señal que va por MAPK, en vez de la vía canónica de las Smad. En la red de proteínas reguladas a la baja obtenida con STRING (Figura 1-23), ANP32A muestra una interacción con Akt, a traves de Hsp90 y el receptor de estrogeno 1 ESR1. Las proteínas ANP32 han sido propuestas como importantes reguladores celulares, generando un crosstalk molecular entre la expresión génica, supervivencia celular y vías de señalización y encontrándose desreguladas en diversos cánceres; sin embargo, su rol específico es objeto de discusión. ANP32A ha sido descrita tanto como supresora tumoral como promotora tumoral, dependiento del contexto celular y genético, y se hipotetiza que las proteínas de esta familia son una “espada de doble filo” en la progresión maligna, promoviendo la proliferación por expresión génica selectiva en células cancerosas que tienen el programa apoptótico alterado, mientras que su sobre-expresión en células cancerosas con las vías apoptóticas intactas puede reducir el crecimiento del tumor (Reilly et al., 2014). A la luz de la literatura, la reducción de ANP32A debida al TGF-β resulta de valioso interes, teniendo en cuenta la dicotomía que presentan las acciones tanto de ANP32A como del TGF-β y sus efectos contexto-dependientes. Respecto a nuestro modelo, hasta el momento no hay estudios del papel de ANP32A en trofoblasto ni su regulación por el TGF-β; pero considerando al TGF-β como un supresor tumoral en este modelo, y que tanto el trofoblasto como la línea HTR-8/SVneo comparten características con células tumorales, incluyendo una resistencia a la apoptosis (Fest et al., 2008), es probable que ANP32A se comporte como un promotor tumoral, sustentado en su reducción en respuesta al TGF-β en células HTR-8/SVneo, con implicaciones a nivel de la

58 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

transcripción génica. Un estudio del presente año encontró a ANP32A incrementado en carcinomas celulares escamosos orales, que correlaciona con el estadío y nivel de malignización, y su inhibición (knockdown) causó una disminución significativa en la habilidad migratoria e invasiva, concomitante con un incremento en la expresión in vitro de E-caderina y una disminución de Slug, Claudina-1 y Vimentina (Velmurugan et al., 2016). Si ANP32A llegará a jugar un rol como promotor tumoral en trofoblasto a través de la regulación de estos procesos, su reducción en respuesta al TGF-β sería otro posible flanco mediante el cual el TGF-β ejerce sus acciones anti-migratorias y anti-invasivas. No obstante, esta reducción puede tener múltiples signifcados y el rol que ANP32A juega in vivo debe ser evaluado con estudios adicionales puntuales, incluyendo su silenciamiento y sobre-expresión en células HTR-8/SVneo y otros modelos de trofoblasto. Sumado a esto, otras proteínas de carácter oncogénico relacionadas con la familia ANP32, como ANP32C y ANP32D se han encontrado asociadas en complejos con la proteína chaperona Hsp90 (Yuzefovych et al., 2015), cuyos miembros Hsp90AA1 y AB1 también fueron encontrados disminuidos en respuesta al TGF-β. Las chaperonas Hsp90 son esenciales para mantener la homeostasis del proteoma a través de un correcto plegamiento, estabilidad y actividad funcional, distribución intracelular y restitución proteica bajo condiciones normales e inducidas por estrés, siendo quinasas, ubiquitina E3 ligasas y factores de transcripción los principales clientes de Hsp90 (Taipale et al., 2012). Para el caso de ANP32C y ANP32D se ha visto que su unión a Hsp90 las protege de la degradación vía proteosoma a tiempos cortos, pero a tiempos largos juega un rol en su degradación, de tal forma que mantiene balanceados los niveles estacionarios de sus proteínas clientes (Yuzefovych et al., 2015). Adicional a la estabilización conformacional y degradación proteosómica, también tiene un rol central en la maduración y actividad de proteínas clientes lábiles como p53, ErbB2, Bcr-Abl, Akt, Her-2, Cdk4, Cdk6, Raf-1 y v-Src en células transformadas (Haque et al., 2016). Así, Hsp90 interactua y soporta proteínas que promueven oncogénesis, asociandose con cada hallmark o “sello distintivo” del cáncer a través de su interactoma, y se considera esencial para la transformación y progresión maligna, tanto que se emplea como blanco terapéutico (Zuehlke et al., 2015). Hsp90α, codificada por el gen HSP90AA1, es la isoforma inducible por estrés, es diferencialmente regulada y tiene funciones biológicas diferentes a la isoforma constitutiva Hsp90β. Además de sus funciones intracelulares, Hsp90α es secretada y actua extracelularmente en la cicatrización de heridas y la inflamación, procesos involucrados en la progresión maligna. En tumores se han visto cambios en la expresión de la proteína Hsp90α, pero su gen HSP90AA1 no se ha visto alterado (The Cancer Genome Atlas, TCGA) (Zuehlke et al., 2015). Más aún, Hsp90α solo es secretado por células normales bajo estrés, pero es secretado de forma permante por células tumorales, siendo la proteína secretada un factor pro motilidad inusual, idenpendiente de ATPasa (W. Li et al., 2012). Miembros de la familia de proteínas de choque térmico 70 como la proteína mitocondrial de estrés 70 (HSPA9), también conocida como proteína regulada por glucosa de 75 kDa (GRP-75), mortalina y mt-HSP70; y la proteína regulada por glucosa de 78 kDa (HSPA5, GRP-78) con acciones en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi (ver Supl. Capítulo 1) fueron reguladas al alza. GRP-75 (HSPA9) media la asociación de chaperonas moleculares como Hsc70 y Hsp90 y está implicada en el control de la proliferación celular y el envejecimiento celular

Capítulo 1 59

(http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P38646, 2014-09-19). Se ha propuesto un rol como regulador negativo de la apoptosis de células endoteliales de cordón umbilical (HUVECs) (Bruneel et al., 2005) al interactuar con p53 e inactivar su activación transcripcional y funciones apoptóticas. Si este es el rol que está cumpliendo en las células de HTR8/SVneo estimuladas con TGF-β, podría representar la generación de un estado de supervivencia y mantenimiento de las células de citotrofoblasto extravelloso, las cuales, in vivo, tras invadir el endometrio materno, sobreviven y se diferencian en diferentes subtipos en respuesta al TGF-β, y terminan residiendo en el tejido como células gigantes, endoteliales, vasculares o intersticiales. GRP-75, ademas de su rol promoviendo la proliferación celular y supervivencia a través de la supresión de la vía Raf/MEK/ERK y de la expresión de p21(CIP1) (P.-K. Wu et al., 2013), se ha encontrado sobre-expresada en diferentes tumores y líneas células derivadas de tumores e inmortalizadas in vitro, generando un aumento en la migración e invasión (Na et al., 2016) y características como independencia de anclaje y formación de tumores en ratones desnudos (Wadhwa et al., 2006). La posible implicación de este rol en nuestro modelo es objeto de discusión. Por otro lado, en estudios empleando 17-AAG, un compuesto inhibidor de Hsp90, se ha visto que este induce la expresión de GRP-75, el cual atenua los efectos anti-crecimiento que genera la inhibición de Hsp90 en células cancerosas; y 17-AAG aumentó la unión de GRP-75 y p53, generando la retención de p53 en el citoplasma e impidiendo la expresión de genes relacionados con apoptosis (Guo et al., 2014), lo que sugiere que Hsp90 inhibe la expresión de GRP-75, pero que ambos contribuyen al crecimiento tumoral. Por otro lado, a pesar de la baja conectividad que presentó GANAB en las redes de interacción, se le ha asignado el papel de supresora tumoral. En una línea murina de linfoma resistente a los efectos citotóxicos de la fitohemaglutinina, se había descrito una disminución en la glucosidasa II, que explicaba esta resistencia, la cual es propuesta como homóloga de la GANAB, y se encontró una marcada disminución en la actividad de GANAB, relacionándola con la resistencia (Martiniuk et al., 1985). Recientemente, esta enzima fue encontrada regulada a la baja en cáncer de cabeza y cuello, jugando un rol negativo en la regulación de la migración e invasión celular y proponiéndola como un marcador pronóstico (Chiu et al., 2011). El aumento de GANAB en respuesta al TGF-β concuerda con el papel descrito de supresora tumoral, e implica que puede llegar a ser un punto que diferencia la fisiología del trofoblasto con respecto a la fisiopatología del coriocarcinoma. Por otro lado, en procesos fisiológicos normales GANAB se ha encontrado incrementada en osteoblastos en respuesta al factor de crecimiento fibroblástico 2 FGF2, relacionándola con procesos de supervivencia y reparación de fracturas (Park et al.). Este rol, junto con el de GRP-75, pueden explicar los aparentes efectos tipo supervivencia que ejerció el TGF-β sobre células cultivadas sin suero y observados durante los ensayos de MTT a tiempos largos, en el que las células de los pozos con TGF-β permanecían adheridas y metabolizando el MTT a diferencia de los pozos control, en el que las células empezaban a despegarse y quizás, sufrir apoptosis (Figura 1-10). No obstante, se desconoce como actua GANAB, su implicación funcional y los procesos biológicos que puede regular, resultando interesante estudiar su función en los procesos de malignización del trofoblasto. Adicionalmente, el TGF-β podría estar estabilizando los complejos de adhesión focal, mediante una regulación al alza de Talina 1 (TLN1), Vinculina (VCL), y Anexina 2 (ANXA2), y podría estar evitando el desensamble y reciclaje de los filamentos de actina al reducir a WDR1, e incrementar a la proteína de unión a actina 1 con dominio LIM (LIMA1), y tal vez Plastina 3, fenómeno que impidiría la generación de nuevos lamelipodios necesarios durante el proceso de migración celular, lo que conduciría a una

60 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

reducción de la invasión y un aumento en la adhesión y las interacciones célula-matriz. La disminución de WDR1 en respuesta al TGF-β se puede relacionar con una estabilización de las fibras de actina, previniendo su desensamblaje y reciclaje durante los procesos de reorganización del citoesqueleto, necesarios para la motilidad celular, acorde con el rol del TGF-β. La plastina, quien fue regulada al alza, es una proteína de agrupación de actina (actin-bundling) y LIMA1 incrementa el número y tamaño de fibras de estrés de actina e inhibe el plegamiento de la membrana y la despolimerización de los filamentos de actina. (Nextprot, ver Supl. Capítulo 1 A); se ha propuesto que la expresión reducida de LIMA1 (EPLIN) puede contribuir a la motilidad de células tumorales invasivas (Maul et al., 2003), de tal forma que este es otro mecanismo pro el cual TGF-β podría regular de forma negativa la invasión. El papel de estas proteínas resalta en la Figuar 1 del material suplementario, donde se esquematiza la vía de adhesión focal (Supl. Capítulo 1, A Figura 1). Así, la regulación de proteínas relacionadas con adhesión celular por parte del TGF-β en células de HTR-8/SVneo, podrían estar aportando a los efectos anti-invasivos reportados del TGF-β, en el que no solo se están inhibiendo procesos, sino que a través de un proceso activo como el aumento de la adhesión celular y los contactos célula-célula y célula-sustrato, como lo muestra la agrupación de anotaciones funcionales (Figura 1-21) y el segundo grupo de la clasificación funcional génica (Tabla 1-9), se estaría regulando su capacidad de interacción con el microambiente y evitando la migración involucrando al citoesqueleto y a los contactos adherentes. Los contactos intercelulares son de vital importancia para la supervivencia y crecimiento celular, además de regular la apoptosis (Bates et al., 2000), pero las implicaciones de estos resultados en la biología tumoral y la capacidad migratoria deben ser elucidados mediante estudios adicionales. Se sugieren ensayos funcionales adicionales de adhesión y migración y la evaluación de proteínas como integrinas, FAK y ezrina y de las vías Rho, MAPK y PI3K/Akt (Supl. Capítulo 1, A Figura 1). Por último, el TGF-β reguló proteínas involucradas en Ciliogénesis, regulación del ensamblaje del BBSome y control del transporte de vesículas al Cilio. El BBSoma es un un complejo molecular, componente del cuerpo basal y está involucrado en la formación del Cilio primario o Ciliogénesis. Por su parte, el Cilio primario es un organelo celular basado en microtubulos que provée una estructura y facilita el movimiento de vesículas y organelos a lo largo de su axonema por medio de transporte intraflagelar, siendo propuesto recientemente como la “antena celular sensora” (Ishikawa & Marshall, 2011) y un centro de señalización compleja (Berbari et al., 2009). Dentro de las proteínas reguladas al alza están: Gelsolina (GSN), el Homólogo a la proteína 74 de transporte intraflagelar (IFT74), la Proteína similar a quinesina 11 (KIF11) y sub unidades de la Proteína 1 del complejo T (CCT5 y TCP1). Gelsolina puede promover el ensamblaje de monómeros de tubulina en filamentos (nucleación) así como cortar filamentos ya formados (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P06396 2014-09-19), mientras que IFT74 es un componente del complejo B de transporte intraflagelar (IFT), que forma un modulo de unión a tubulina que media específicamente el transporte de tubulina al cilio (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_Q96LB3) y KIF11 es un motor molecular involucrado en el transporte mediado por vesículas a lo largo de microtubulos (http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P52732 2014-09-19). Las subunidades de la proteína 1 del complejo T son chaperoninas que hacen parte del complejo BBS/CCT y están involucradas en el el ensamblaje del BBSoma, regulando el transporte de vesículas al cilio. Las subunidades alfa ó TCP1 y épsilon ó CCT5 solo se observaron ligeramente aumentadas, mientras que la subunidad beta ó CCT2 se observó con una disminución

Capítulo 1 61

mayor. La información actual es limitada y no se conocen otras funciones específicas para cada una de estas sub-unidades, sin embargo un trabajo en levaduras mostró que mutaciones equivalentes en cada sub-unidad produjeron diferentes fenotipos celulares y de expresión génica: en el caso de CCT2, su cepa mutada exhibió sensibilidad al calor y al frío para el crecimiento, un exceso de parches de actina y fue la única cepa generada pseudo-diploide ((Amit et al., 2010); así, la regulación diferencial observada gracias a los resultados proteómicos podría sugerir una regulación transcripcional o post-traduccional diferencial entre las sub-unidades de la chaperonina CCT, y posibles funciones específicas aún no descritas. Finalmente, el rol del cilio en trofoblasto es desconocido, pero puede involucrar procesos de transduccuión de señales extracelulares y comunicación con el microambiente. En relación con lo anterior, se encontraron proteínas reguladas al alza relacionadas con tráfico vesicular y procesamiento de proteínas, como Dopey 2, quien media el tráfico endosomal, el antígeno 1 de endosoma temprano Coronina 7 (CORO7), envuelto en el transporte anterogrado de Golgi a endosoma, y la proteína regulada por glucosa de 78 kDa Grp-78 (HSPA5), envuelta en el procesamiento proteico en el Retículo Endoplasmático y la exportación de proteínas. Finalmente, se observaron proteínas reguladas al alza relacionadas con el metabolismo de glutamina y síntesis de novo de IMP como la Fosforibosil-formil-glicinamidina sintasa (PFAS), y síntesis de novo de CTP por la CTP sintasa 1 (CTPS1), siendo la Glutamina una elemento clave del metabolismo del cáncer, el cual participa en bioenergética, soporta la defensa celular contra el estrés oxidativo y complementa el metabolismo de glucosa en la producción de macromoléculas, pero también participa en oncogénesis a través de su interacción con vías de señalización (Daye & Wellen, 2012; Hensley et al., 2013; Wise & Thompson, 2010). Adicionalmente, previamente se encontró otra enzima relacionada con la síntesis de novo de IMP, la IMPDH2, regulada en respuesta a la depleción de suero (sección 1.1.3), (ver Anexo C 2).

Las chaperonas reguladas por el TGF-β pueden modular su vía de señalización

Por los resultados proteómicos es evidente la regulación de chaperonas y scaffolds de señalización en respuesta al TGF-β, pero no la regulación de la señalización de TGF-β por parte de estas chaperonas, lo cual puede constituir un mecanismo de regulación por feedback o retroalimentación. En este estudio se encontraron dos familias de chaperonas reguladas de forma opuesta en respuesta al TGF-β: Hsp90 y Hsc70 (HSPA8). Incluso, se encontró disminuida a STIP1 (conocido como Hop), el cual es una co-chaperona de Hsp90, scaffold o andamiaje de la interacción Hsp90/Hsc70 y está involucrada en la maduración de proteínas clientes y en la inhibición de la actividad ATPasa de Hsp90 (J. Li et al., 2012). La chaperona Hsp90 está involucrada en la regulación de vías de señalización mitogénicas y progresión del ciclo celular, siendo la mayoría de sus sustratos conocidos proteínas transductoras de señal (Young et al., 2001). Adicionalmente, la forma secretada de Hsp90α, además de ser un factor pro-motilidad, trabaja contra la inhibición del TGF-β (W. Li et al., 2012). La disminución en la expresión de Hsp90 como efecto del TGF-β puede generar el silenciamiento de diversas vías de señalización mitogénicas, siendo un mecanismo indirecto por el cual el TGF-β podría ejercer sus acciones anti-

62 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

proliferativas y posiblemente consituyendo una vía de retroalimentación negativa para si mismo. Por su parte, la proteína Hsc70 (HSPA8), y quien fue aumentada en respuesta al TGF-β, presenta múltiples puntos en los que puede regular o alterar la señalización del TGF-β. Este actúa como un represor de la activación transcripcional e inhibe la actividad tipo co-activador transcripcional de CITED1 en la transcripción mediada por Smad; Hsc70 se une a la proteína nuclear MSG1 e inhibe la unión de este a los co-activadores transcripcionales p300/CBP in vivo, de tal forma que suprime el aumento que genera MSG1 en la transcripción de genes mediada por Smad (Yahata et al., 2000). Así, la sobre-expresión de Hsc70 puede redirigir la posible expresión de genes en respuesta al TGF-β a través de MSG1 Smad, como una forma de feedback negativa. Sumado a esto, Hsc70 y Hsp90 presentan roles opuestos en la regulación de la señalización de TGF-β mediada por CHIP, una E3 ubiquitin ligasa también conocida como Stub1 y que modula los niveles basales de Smad3 a traves de degradación con ubiquitina. Mientras que Hsp70 promueve, Hsp90 bloquea la formación del complejo Smad3/CHIP; y la ubiquitinación y degradación de Smad3 mediada por CHIP está aumentada por Hsp70 e inhibida por Hsp90 (Shang et al., 2014). Esto suma argumentos para resaltar una regulación de la señalización del TGF-β por retroalimentación negativa a través de Hsp90 y Hsp70. La proteína regulada por glucosa de 78 kDa Grp-78 (HSPA5), aumentada en respuesta al TGF-β, es otra chaperona que probablemente juega un rol al facilitar el ensamblaje de complejos de proteína multiméricos dentro del retículo endoplasmático y puede estar involucrada en la regulación negativa de la vía de señalización del receptor de TGF-β (IEA, Ortholog Compara, http://www.nextprot.org/db/entry/NX_P11021 2014-09-19), lo que puede contribuir a la hipótesis de una retroalimentación negativa. Sintenizando, la estimulación de células HTR-8/SVneo con TGF-β generó cambios en la expresión de chaperonas reguladoras de vías de señalización y de proteínas relacionadas con el tráfico endosomal y el transporte de proteínas mediado por vesículas. La interacción de proteínas identificadas como reguladas, con transductores de señal de otras vías de señalización como Akt y el receptor de estrógeno, junto con la regulación de las vías de señalización a través de Rho o RAC1/PAK por parte del TGF-β, puede revelar un nuevo cross-talk entre vías. Y es posible la existencia de una retroalimentación negativa por parte del TGF-β, generada a través de la regulación protéica de Chaperonas moleculares que controlan el estado de transductores de señal. Los resultados proteómicos revelaron redes especfícias de proteínas relacionadas con malignización, resaltando proteínas bien estudiadas como Hsp90 - considerada una facilitadora del cáncer, y revelando proteínas novedosas como ANP32A y las chaperoninas del complejo CCT, entre otras relacionadas con procesos celulares como la organización del citoesqueleto, involucrando formación de cilios primarios, complejos de adhesión focal, transporte vesicular y formación de endosomas y exosomas, que el TGF-β podría estar regulando en células de HTR8/SVneo. En conclusión, en esta segunda sección se comprobó que existe una co-dependencia entre el efecto del TGF-β y las condiciones de cultivo, específicamente la presencia de SFB al 0,5%, en células de la línea derivada de trofoblasto HTR-8/SVneo. El TGF-β reguló el crecimiento celular, teniendo efectos anti-proliferativos o supresores del metabolismo en células cultivadas con 0,5% SFB, pero parece promover la viabilidad y

Capítulo 1 63

supervivencia en casos de bajo soporte nutricional. El TGF-β reguló la expresión de MMP-9 y uPA, proteasas claves del proceso invasivo del trofoblasto, de una forma dual en el tiempo y dependiente del suero. Finalmente, el TGF-β reguló la expresión de proteínas no descritas anteriormente, sugiriendo nuevos efectos regulatorios como estabilización de adhesión focal, contactos adherentes célula-célula y ciliogénesis, en adición a los procesos clásicos ya descritos. No obstante, las implicaciones de estos cambios proteicos y los procesos biológicos sugeridos deben ser comprobados mediante estudios adicionales, parte de los cuales se están llevando a cabo actualmente en el Grupo de Investigación en Hormonas.

1.3 Análisis general de resultados Los resultados obtenidos en el presente capítulo, tanto producto de los estudios proteómicos como de los ensayos de proliferación y respuesta molecular al factor TGF-β y a la depleción de suero, permiten proponer a la línea celular derivada de trofoblasto HTR-8/SVneo como un modelo para estudiar estrategias y procesos biológicos desarrollados por células malignas. El tejido trofoblástico es considerado “pseudo-maligno” o “fisiológicamente metastático”; más aún, la línea celular HTR-8/SVneo al ser inmortalizada por transfección con el antígeno T largo del virus SV40, puede presentar características adicionales como las que se proponen a continuación. De modo interesante, en general se encontró una fuerte influencia del microambiente en la respuesta celular, vista a través del cultivo celular con diferentes dosis de SFB, a tal grado que se puede hablar de una concomitancia del TGF-β con la presencia de suero (0,5% SFB) en el medio de cultivo, poniendo de manifiesto los efectos contexto-dependientes de este factor de crecimiento. Igualmente, las proteínas encontradas reguladas por el TGF-β están involucradas en procesos y estructuras celulares de interacción con el microambiente y recepción de señales externas, que le permitirían a las células sensar y adaptarse a su entorno, con cambios en el fenotipo y su programa transcripcional, vislumbrando una capacidad de adaptación y flexibiliad en el fenotipo de las células HTR-8/SVneo. Por otro lado, las células de la línea HTR-8/SVneo presentaron cambios en proteínas y comportamientos que sugieren que responde a los efectos supresores tumorales de moléculas con roles duales y contexto-dependientes como el TGF-β y ANP32A, pudiendo presentarse como un modelo pre-maligno que aún mantiene intacta la capacidad de respuesta a reguladores externos. Dentro de las diferentes características y habilidades detectadas o inferidas en las células HTR-8/SVneo que pueden compartir o no con los crecimientos malignos, están:

Hallazgos Propuesta Implicación Aumento en la proliferación/supervivencia

en respuesta a la depleción de suero, comparado con dosis bajas de suero

Autofagia Fenotipo flexible, switch o

reprogramación metabólica a la

depleción de suero: habilidades de

células malignas

Cambio en el proteoma, en respuesta a la

depleción de suero, comparado con dosis

bajas de suero

Enzimas glicolíticas (ENO1,

PKM1/2) Efecto Warbug

Marcador mesenquimal

(Vim) y epitelial (KRT8)

Transición epitelial mesenquimal

64 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

El TGF-β regula diferencialmente la proliferación/supervivencia, de acuerdo a

las condiciones de cultivo y dosis de suero

Respuesta anti-proliferativa

Efectos contexto-dependientes del

TGF-β e influencia del microambiente

¿Supervivencia / Inhibición de la

apoptosis? El TGF-β,

concomitante con suero, regula

diferencialmente la expresión de MMP9

y uPA

Regulación negativa de la

expresión

Respuesta anti-invasiva al TGF-β

Regulación positiva de la

expresión

¿Supervivencia, invasión?

Identificación de nuevas proteínas reguladas por el

TGF-β

Aumento de GANAB y Grp75 ¿Supervivencia? Diversos efectos

simultaneos Disminución de STIP1, Hsp90.

Aumento de Hsc70, Grp75 y Grp78

Regulación de la señalización a

través de chaperonas Complejos circuitos

moleculares regulan la vía de señalización

TGF-β

Aumento de ARHGAP29,

SRGAP3, Pak2, Grp78, Hsc70;

Disminución de ANP32A, Hsp90

Crosstalk con otras vías y

retroalimentación negativa de la vía

TGF-β Disminución de ANP32A, WDR1. Aumento de Tln,

Vcl, ANXA2, LIMA1 y PLN3

Reducción de la capacidad

migratoria por aumento de

adhesión

Regulación de la invasión por

procesos alternativos antagonistas

Aumento de ANXA2, GANAB,

Gsn, IFT74, KIF11, TCP1, CCT5,

Dopey, Coro7 y Grp78.

Disminución de CCT2?

Promoción de ciliogénesis, tráfico

vesicular y exocitosis

Aumento de la capacidad para

sensar y comunicarse a

distancia con otras células/tejidos

Las anteriores estrategias y habilidades son nuevas propuestas que se suman a las características compartidas entre el trofoblasto y las células malignas, previamente descritas por Ferreti (Ferretti et al., 2007) y Holtan (Holtan et al., 2009), que incluyen proliferación, migración, invasión y modulación del sistema inmune. La alteración en la respuesta a proteínas claves, que exhiben una dicotomía en sus acciones como TGF-β y ANP32A, así como de chaperonas que controlan el estado de importantes transductores de señal, puede constituir una de las claves para entender la progresión maligna y cómo señales regulatorias que en principio pueden ser supresoras tumorales se pueden tornar en promotoras tumorales.

Capítulo 1 65

1.3.1 Paralelo microambiente tumoral y microambiente uterino y estrategias de supervivencia

Los tumores sólidos en etapas tempranas de desarrollo están expuestos frecuentemente a estresores ambientales tales como hipoxia, acidosis y deprivación nutricional. En general, las células tumorales se sobreponen a estas condiciones, ganando un fenotipo más maligno (Izuishi et al., 2000; Rofstad, 2000). In vivo, factores sistémicos o extrínsecos como una baja vascularización tumoral genera un microambiente estresante, el cual afecta directa o indirectamente la expresión génica, alterando el proteoma, incluyendo un incremento en la transcripción de citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento, y una actividad elevada de enzimas reparadoras de ADN, proteasas y otras proteínas relacionadas, así como cambios en las moléculas de adhesión y componentes del sistema inmune innato y adaptativo (Witz, 2008). Así pues, el microambiente pato-fisiológico de los tumores se ha vinculado con un fenotipo más agresivo, jugando un rol en la progresión tumoral y la metástasis (S. J. Lunt et al., 2009). El microambiente intrauterino en las primeras semanas de gestación se asemeja a un microambiente tumoral y modula el desarrollo de la placenta y la función del trofoblasto. Este se desarrolla en condiciones bajas de oxígeno, y parece que el metabolismo es mayoritariamente anaeróbico durante el periodo de organogénesis, soportado solamente por las secreciones de las glándulas endometriales (G. Burton et al., 2010; G. J. Burton et al., 2007) , al igual que por varias citoquinas y factores de crecimiento, donde el producto de la concepción, el trofoblasto y las glándulas endometriales establecen una red de señalización paracrina y/o autocrina (Ferretti et al., 2007; Fitzgerald et al., 2005; Lunghi et al., 2007). Una invasión inadecuada del trofoblasto a las arterias espirales maternas correlaciona tanto con pre-eclampsia como con restricción del crecimiento fetal (L. K. Harris, 2010), y diversos resultados muestran las implicaciones de la hipoxia en el funcionamiento del trofoblasto, con un efecto dual de acuerdo a la semana de gestación: un bajo metabolismo y niveles de oxígeno durante el desarrollo inicial del blastocisto son benéficos para el desarrollo del embarazo (G. Burton et al., 2003; Leese, 2002), mientras que la hipoxia inhibe la diferenciación e invasión del trofoblasto y ha sido implicada en su apoptosis tras la semana 7ma de gestación (Lunghi et al., 2007; Tuuli et al., 2011). En otro estudio se observó que la exposición a condiciones hipóxicas (2% de O2) durante cultivo libre de suero incrementó la proliferación celular de HTR-8/SVneo y redujo su invasión a matrigel (Kilburn et al., 2000), lo que da soporte al comportamiento alterado de células trofoblásticas en respuesta a las condiciones maternas cambiantes. No obstante, los efectos de dosis de suero nulas o bajas, visto como una restricción nutricional y de factores de crecimiento, se han estudiado poco, menos aún su efecto en el proteoma. Se han desarrollado estudios proteómicos de células trofoblásticas, examinando cambios en el proteoma de células de coriocarcinoma BeWo durante su diferenciación (Nampoothiri et al., 2007) y sincitialización (Hu et al., 2007), pero ninguno referente a la depleción de suero. Sin embargo, un análisis proteómico de respuesta inducida por hipoxia en la línea celular de coriocarcinoma BeWo mostró que dos proteínas implicadas en la ruta glicolítica (malato deshidrogenasa y enolasa) eran aumentadas, mientras que la expresión de dos componentes del citoesqueleto (queratina 1 y beta-actina) se encontraron disminuidos (Hu et al., 2007). Curiosamente, mientras que la glicólisis es estimulada en respuesta a hipoxia en células BeWo, en este estudio con células HTR-8/SVneo, esta vía parece ser estimulada por la depleción de suero

66 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

(Figura 1-5), reforzando aún más la idea de una regulación similar por hipoxia y depleción de suero. Dosis de suero nulas o bajas podrían comportarse como un factor de estrés que puede influir el crecimiento normal de la placenta y su desarrollo en las primeras etapas de embarazo. Aquí, el SFB se utiliza para similar las condiciones fisiológicas de cultivos in vitro, ya que contiene - junto con nutrientes – muchos factores de crecimiento y hormonas que generan un efecto estimulante proliferativo e invasivo en células HTR-8/SVneo (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011a; Vallejo & Sánchez-Gómez, 2010), a pesar de su origen bovino. Adicionalmente, las células HTR-8/SVneo secretan de forma endógena varios factores de crecimiento y hormonas como la gonadotropina coriónica (hCG) que generarán una señalización autocrina sostenida (Graham et al., 1993; Vallejo & Sánchez-Gómez, 2010), lo cual se traduce en una independencia de factores mitogénicos externos, característica que el trofoblasto comparte con las neoplasias. Así, tras 24 horas el medio de cultivo ha sido acondicionado con estos factores solubles. Por otro lado, el aparente incremento en el crecimiento evidenciado por MTT a las 24 horas, aún en ausencia de suero (Figura 1-1, dosis 0% y 0,1% con respecto a 0,5%), puede significar una independencia del requisito de nutrientes para entrar en el ciclo celular. Así pues, el metabolismo sería otra característica en común con el cáncer. Para lograr esta independencia exógena de nutrientes, las células de cáncer recurren a autofagia como estrategia de supervivencia durante periodos de estrés metabólico y restricción en factores de crecimiento (Mathew & White, 2011; Ouyang et al., 2012; Tsuchihara et al., 2009), fenómeno que está bien documentado en el trofoblasto. La autofagia juega un importante rol en la homeostasis celular de la placenta como regulador de la muerte celular del trofoblasto (Gong & Kim, 2014), es vital para la invasión de EVT y la remodelación vascular bajo hipoxia (Saito & Nakashima, 2014) y esencial para el desarrollo pre-implantación y supervivencia embrional, siendo regulado por cambios en el oxígeno y los niveles de glucosa (Hung et al., 2013). Incluso, se ha visto en células de cancer transformadas con el antígeno T SV40 pequeño (ST), que este podría inducir autofagia como una fuente energética alternativa en condiciones de estrés a través de la activación de la quinasa sensora de energía AMPK y la inhibición de mTOR (Kumar & Rangarajan, 2009). Sin embargo, este comportamiento del trofoblasto debe estar mucho más regulado que el del cáncer, especialmente a nivel de supresores tumorales como PTEN. Por tanto, es relevante evalular el estado de PTEN y AMPK y la integridad del checkpoint de nutrientes en el ciclo celular, junto con cambios en la autofagia de estas células de trofoblasto.

1.3.2 Influencia recíproca del microambiente y el TGF-β A partir del análisis de los resultados es posible proponer una influencia recíproca entre el microambiente y el TGF-β, según la cual las condiciones ambientales influencian los efectos del TGF-β en el trofoblasto, al tiempo que el TGF-β genera cambios proteicos que sugieren una mayor interacción celular del trofoblasto con su ambiente. Esta influencia recíproca y los cambios generados en la respuesta al TGF-β por la presencia de suero y en el tiempo son analizados con más detalle en el Capítulo 4. Asimismo, se sugiere un aumento en la sintonía del trofoblasto con su microambiente en respuesta al TGF-β, lo cual se puede deducir de la expresión de proteínas relacionadas

Capítulo 1 67

con organelos y estructuras celulares que facilitan la comunicación extracelular y la interacción de la célula con su entorno. Dentro de los procesos celulares que el TGF-β parece regular en HTR8/SVneo está la organización del citoesqueleto, involucrando formación de cilios primarios, nanotubos, complejos de adhesión focal y transporte vesicular incluyendo endosomas y exosomas. Esto involucra el procesamiento de señales externas tanto físicas como químicas; el primer caso, a través de los complejos de adhesión focal y mediado por integrinas y FAK, y el segundo agrupando señales como hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, que son sensados y procesados al interior de la célula. El papel que juegan estas estructuras en malignización es discutido en el Capítulo 4. Por otro lado, se encontraron proteínas reguladas en respuesta al TGF-β que están relacionadas con exosomas, los cuales son considerados como “organelos extracelulares” importantes en la comunicación intercelular (Mathivanan et al., 2010).y se les ha dado un rol en la respuesta adaptativa de células tumorales al estrés microambiental (Kucharzewska & Belting, 2013). Respecto al trofoblasto, estos están involucrados dentro del proceso de deportación o shedding (Askelund & Chamley, 2011; Pantham et al., 2011), y se han desarrollado diversos estudios entorno a estos (Sargent et al., 2014), considerando tanto su perfil de miRNAs (Bullerdiek & Flor, 2012; S. Ospina-Prieto et al., 2015) como de proteínas (Safinur Atay et al., 2011; Salomon et al., 2014), y relacionándolos con fusión celular (Record, 2014), respuesta a hipoxia (Salomon et al., 2013), pre-eclampsia (Tannetta et al., 2013), y reclutamiento y diferenciación de monocitos (S. Atay et al., 2011). Por lo que son importantes en la comunicación feto-materna, y un mecanismo que tiene el trofoblasto para modular el microambiente. En todos estos procesos el tráfico vesicular y los endosomas cobran relevancia, tanto con el transporte de moléculas al cilio primario seguida de la endocitosis dependiente de clatrina, como durante la generación de los cuerpos multivesiculados que contienen los exosomas antes de ser liberados. Diversas proteínas relacionadas con tráfico vesicular y procesamiento de proteínas fueron identificadas (Tabla 1-9), así como su ubicación tanto en el espacio extracelular como en el núcleo (Figura 1-22). En relación con la adhesión celular, los endosomas también están involucrados: estos se han propuesto como plataformas emergentes para la señalización por FAK mediada por integrinas, donde las integrinas señalizan no solo desde la membrana plasmática, sino también desde endosomas, soportando el crecimiento libre de anclaje y suprimiendo la anoikis; en esta situación se ha visto que FAK recluta al endosoma proteínas adicionales a las reclutadas en adhesión focal, estando involucradas Rab21, EEA1 y talina, siendo la activación de pFAK-Y397, pAkt-S473 y pErk1/2 parcialmente dependiente de la endocitosis de integrinas; estos endosomas están enriquecidos en proteínas de unión a actina y microtúbulos, GEFs y GAPs y ubiquitin ligasas, pudiendo la señalización de “endoadhesomas” conteniendo integrinas soportar la metástasis del cáncer (Alanko & Ivaska, 2016; Alanko et al., 2015). Varias de estas proteínas fueron encontradas en respuesta al TGF-β, reforzando la idea de que el TGF-β está regulando procesos de interacción con el microambiente, comunicación intercelular y procesos de señalización novedosos en células de HTR-8/SVneo. Finalmente propongo que las células trofoblásticas, así como las células malignas, tienen que sufrir un switch o cambio adaptativo, que les permitan superar estas condiciones de estrés y cumplir sus funciones fisiológicas. Así como el microambiente tumoral puede influenciar la función y el desarrollo de células tumorales, del mismo modo un microambiente intrauterino extremo - o depleción de suero como en el caso de este

68 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

estudio - induce una respuesta adaptativa de las células trofoblásticas, que implica EMT y un ajuste metabólico flexible con un incremento en la glicólisis. Las proteínas identificadas son una primera evidencia de una respuesta en expresión de proteínas a diferentes dosis de suero en un modelo derivado de trofoblasto humano de primer trimestre. Por último, estos resultados sugieren un cambio de fenotipo relacionado con la progresión maligna, en respuesta a la depleción de suero. Sin embargo, se requieren estudios adicionales para determinar si estos cambios se deben a la falta de nutrientes o moléculas de señalización, así como validar estos resultados en un cultivo primario de trofoblasto extravelloso de primer trimestre. Conclusiones En este estudio, se identificaron cambios diferenciales de proteínas en respuesta a diferentes dosis de suero y tratamiento con TGF-β, utilizando E2D, DIGE y espectrometría de masas. En conclusión: La depleción de suero afectó la proliferación y el perfil proteómico de células HTR-

8/SVneo de forma específica y diferente a la obtenida con SFB al 0,5%, con cambios en proteínas que implican una transcición epitelial mesenquimal y aumento de la glicólisis, similar a un crecimiento tumoral.

El TGF-β afectó la viabilidad celular y la expresión de las proteasas MMP-9 y PLAU en células de HTR-8/SVneo, de forma dependiente de la dosis de suero y tiempo de estimulación.

El TGF-β regula proteínas relacionadas con adhesión celular en la línea HTR-8/SVneo.

Los presentes resultados, se suman a la similararidad descrita entre el trofoblasto y las células malignas, y soportan el uso propuesto de la línea inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo como un modelo biológico para comprender los procesos malignos.

2. Capítulo 2: Estudio comparativo del trofoblasto y el coriocarcinoma

A pesar que las células trofoblásticas comparten muchas características con células tumorales y metastáticas (Ferretti et al., 2007), sus procesos celulares se encuentran estrechamente controlados: a diferencia de las células malignas que son transformadas y exhiben signos de desregularización y baja diferenciación, las células trofoblásticas se mantienen en un estado de diferenciación que corresponde a su rol fisiológico, de tal forma que se obtiene un bajo crecimiento después de la diferenciación del EVT de proliferante a invasivo. Adicionalmente, la capacidad migratoria e invasiva del trofoblasto está regulada espacial y temporalmente, restringiéndose al endometrio del primer trimestre de embarazo; de tal forma que en placenta a término las células trofoblásticas tengan una capacidad proliferativa e invasiva reducida (Paul Bischof & Irminger-Finger, 2005; P. Bischof et al., 2001; Fitzgerald et al., 2005). La comparación de células trofoblásticas con tumores y células cancerosas invasivas ofrece un atractivo modelo para comprender el origen y desarrollo del crecimiento maligno. Esta regulación espacial y temporal de la invasión trofoblástica se cree que es mediada de forma autocrina por factores trofoblásticos y de forma paracrina por factores deciduales. Diferentes tipos de reguladores han sido investigados, dentro de los cuales se encuentran hormonas, glicoproteínas de la matriz extracelular, citoquinas y factores de crecimiento (P. Bischof et al., 2001; Fitzgerald et al., 2005). Dentro de estos factores resalta el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), el cual inhibe la proliferación, invasión y migración del trofoblasto a través de multiples mecanismos (Jones et al., 2006; S. Karmakar & Das, 2004; Lala et al., 1998; G. Xu et al., 2002). Cuando la regulación del trofoblasto se pierde, se desarrolla la enfermedad trofoblástica gestacional (ETG). Esta es una patología caracterizada por una proliferación excesiva, que incluye mola hidatidiforme parcial, completa o invasiva y coriocarcinoma, siendo esta última la forma maligna más agresiva de la enfermedad. El coriocarcinoma es un tumor metastático que se puede producir de trofoblasto de cualquier evento gestacional, pero principalmente de mola hidatidiforme completa (Matsuda & Wake, 2003; Ngan et al., 2006). El coriocarcinoma es la única lesión trofoblástica que es altamente agresiva y fatal, y es uno de los tumores malignos más rápidamente invasor, debido a su alta afinidad y capacidad de invasión de las arterias espirales (angioinvasión), que conduce a metástasis más extensas; siendo las más frecuentes a nivel de pulmones (50%), vagina (30 a 40%) y en orden de frecuencia: en cerebro, hígado, riñones y tracto gastro-intestinal. Pertenece al reducido grupo de tumores cuyo primario puede involucionar espontáneamente; sin embargo, las primeras y únicas manifestaciones clínicas del coriocarcinoma gestacional pueden corresponder a metástasis (Cheung, 2003; Diaz et al., 2007). Por otro lado, esta neoplasia es única entre las patologías malignas humanas, ya que segrega un marcador tumoral fiable: la gonadotropina coriónica humana (hCG)

70 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

(Cole et al., 2006); por lo que se hace necesario contar con marcadores tumorales adicionales, intrínsecos para esta transformación maligna y que la diferencien de su tejido de origen. Con el fin de estudiar in vitro la fisiología y patología de la placenta y función del trofoblasto se han establecido varias líneas celulares, que se pueden agrupar en derivadas de coriocarcinoma y establecidas por transfección/inmortalización a partir de EVT. En los últimos años se han desarrollado diversos análisis comparativos de los diferentes modelos actualmente en uso, entre los que se encuentran: firmas de expresión génica por microarrays (Bilban et al., 2010), patrónes de expresión de genes relacionados con invasión (P. Suman & Gupta, 2012) y el perfil de expresión de microRNAs (Morales-Prieto et al., 2012), confirmando su relación y cercanía con células de trofoblasto primario, a pesar de concluir que cada modelo presenta características que lo alejan del trofoblasto primario, y el uso de una única línea celular como modelo de trofoblasto puede generar hipótesis erróneas. La línea celular JEG-3 es un derivado clonal de coriocarcinoma de placenta humana, (Kohler & Bridson, 1971), aislado de metastasis cerebrales que fueron adaptadas a cultivo en la bolsa de la mejilla de hámster por Hertz, conocida antiguamente como la cepa Woods del tumor Erwin-Turner (Hertz, 1967). JEG-3 retiene algunas de las propiedades de células trofoblásticas humanas inmaduras, incluyendo la secreción de gonadotropina coriónica (hCG), hCG hiperglicosilada, somatomamotropina coriónica humana (lactógeno placental) y progesterona, por lo que ha sido propuesta como un modelo de trofoblasto productor de hormonas (Kohler & Bridson, 1971). Esta es una línea celular hipertriploide humana: el número de cromosomas modal es de 71, encontrándose en un 34%, y poliploide en un 2,6%, lo cual es concordante con las características genéticas del coriocarcinoma; adicionalmente se ha detectado un único cromosoma Y por análisis Q-band. Hace parte del catalogo de líneas de ATCC bajo el número ATCC: HTB-36 (ATCC, 2016). A diferencia de la línea celular HTR-8/SVneo, la línea JEG-3 ha mostrado resistencia a los efectos regulatorios del TGF-β (Graham et al., 1994). Por otro lado, a pesar del proceso de transformación con el antígeno Tag del virus SV40, las células de HTR-8/SVneo son incapaces de formar colonias en agar (crecimiento independiente de anclaje) o tumorogenicidad en ratones desnudos, y responde a los efectos anti-proliferativos y anti-invasivos del TGF-β, indicando una ausencia de fenotipo transformado y sugiriendo que estas células no han entrado en la progresión tumoral trofoblástica (Graham et al., 1993; Lala et al., 2002). Adicional a esto, mientras que HTR-8/SVneo podría representar un progenitor trofoblástico o stem cell, JEG-3 expresa un perfil de marcadores propio de su derivación metastática (Weber et al., 2013). Así, estas líneas celulares permiten estudiar los mecanismos moleculares responsables de la progresión tumoral trofoblástica. TGF-β y malignización del trofoblasto El TGF-β es uno de los factores que diferencia el comportamiento regulado del trofoblasto frente al maligno del coriocarcinoma. Se ha visto que el control ejercido por el TGF-β sobre la proliferación e invasión del trofoblasto se pierde en ciertas líneas celulares derivadas de coriocarcinoma como JAR y JEG-3, cuya invasión y proliferación no se ve inhibida por la presencia del TGF-β, lo cual sugiere que las células de coriocarcinoma pueden volverse refractarias a los mecanismos que controlan la proliferación e invasión del trofoblasto normal, y una resistencia concurrente a moléculas

Capítulo 2 71

anti-proliferativas y anti-invasivas como el TGF-β puede ser altamente relevante en la progresión tumoral (Graham et al., 1994). Por su parte, las células de HTR-8/SVneo a pesar de ser inmortal y un poco más proliferativa que su línea parental, ha retenido la respuesta normal a las acciones anti-proliferativas, anti-invasivas y anti-migratorias del TGF-β (Graham et al., 1993; Lala et al., 2002). A pesar de que, a mi conocimiento, la expresión y función de proteínas SMAD no ha sido investigada en cultivos primarios de trofoblasto ni en la línea HTR-8/SVneo, sí se ha estudiado en la línea normal HTR8, la pre-maligna RSVT2/C y las malignas JAR y JEG-3. Se ha visto que, aunque todas las líneas expresan SMAD2, SMAD4 y SMAD7, las células de coriocarcinoma no expresan SMAD3 ni la isoforma TGF-β2 endógena, y presentan una baja expresión de SMAD4. De tal forma que la pérdida de SMAD3, posiblemente en combinación con los niveles reducidos de SMAD4, puede participar en la disrupción de la señal de TGF-β en coriocarcinoma (G. Xu et al., 2001b). No obstante, cuando se induce la expresión ectópica de genes SMAD3 en células JAR deficientes en SMAD3, se restaura la expresión de PAI-1 y TIMP-1 dependiente de TGF-β pero este falla en reducir la invasión in vitro (G. Xu et al., 2003). Según esto, también pueden existir defectos adicionales a la pérdida de SMAD3 en coriocarcinoma; y, teniendo en cuenta la complejidad de la vía de señalización del TGF-β es posible que otros mecanismos y proteínas contribuyan a la desregulación en la respuesta al TGF-β que exhibe el trofoblasto pre-maligno y maligno. En todo caso, otros estudios muestran que la línea JEG-3 tiene la capacidad de responder a algunos de los efectos ejercidos por el TGF-β sobre el trofoblasto: se ha visto que el TGF-β disminuye la producción y secreción de hCG tanto en células de trofoblasto temprano y a término como en células de JEG-3, sin alteración de sus niveles de ARNm; adicionalmente, disminuye los niveles de la proteína ciclina E en células BeWo, y en células JEG-3 disminuye en un 45% los niveles promedio de ARNm de ciclina E a las 72 horas, sin significancia estadística, ni afectar su proliferación (Richard et al., 2008). En ensayos con el colorante vital Alamar Blue (AB), el tratamiento con TGF-β causó una disminución modesta en la reducción de AB en células BeWo y JEG-3, que correlaciona con una disminución en el número celular y viabilidad, así como una dsiminución en la migración de células BeWo, pero no de células JEG-3 (Al-Nasiry et al., 2007). En adición, Karmakar y Das observaron tanto en cultivos primarios de primer trimestre y a término como en células JEG-3 que el TGF-β regula a la baja la expresión de MMPs e inhibe su actividad enzimática al promover la expresión de sus inhibidores, TIMP-1 y -2 y PAI-1 y -2 (Subhradip Karmakar & Das, 2002); y media una regulación positiva de la adhesion célula-célula con una reducción en la interacción célula-matriz, junto con un incremento en la expresión de ezrina y E-caderina, que se asocia con una reducción en la invasión, así como con una morfología celular alterada en células JEG-3 (S. Karmakar & Das, 2004). En relación con la activación de la vía, Zhou et. al. detectaron la expresión de SMAD3 a un nivel muy bajo en células JEG-3, y vieron que el TGF-β1 induce en estas la fosforilación de SMAD2 y una evidente acumulación nuclear, así como la activación de SMAD3, siendo pSMAD3 detectado solo de forma débil (Zhou et al., 2009). Sin embargo, resultados diametralmente opuestos fueron obtenidos en estudios realizados por el grupo de Li, con JEG-3 cultivado indistintamente en medio DMEM o RPMI 1640: observaron que el TGF-β1 promueve la invasión de células JEG-3 a través de una reducción de TβR I, TβR II, SMAD4 y un aumento de MMP-9 y TIMP-1 (DMEM, dosis TGF-β1 de 5, 50, 10y 200 ng/mL) (Y. Li et al., 2012); que JEG-3 expresa SMAD3 y

72 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

el tratamiento con TGF-β1 induce la activación y translocación nuclear de pSMAD3 y p38, existiendo un crosstalk de la vía de señalización TGF-β/SMAD con la vía p38 MAPK, la cual está involucrada en la expresión de SMAD3 y su activación inducida por el TGF-β1 (RPMI 1640, 5 ng/mL TGF-β) (Q. Xu et al., 2013), así como en la expression de los receptores TβRI, TβRII en estas células. Adicionalmente TGF-β aumenta la viabilidad (actividad metabólica) a partir de las 6 horas, la cual fue evaluada hasta las 24 horas (RPMI 1640, 5 ng/mL TGF-β) (Tan et al., 2014). Todos estos resultados muestran un complejo panorama en relación a la regulación del trofoblasto por el TGF-β, especialmente en los modelos malignos. Efectos duales del TGF-β El TGF-β al regular varias funciones celulares, tiene un rol clave en el desarrollo y carcinogénesis. Se ha visto que el TGF-β se comporta como un factor dual, ejerciendo efectos opuestos de acuerdo al tejido que este regulando, actuando como supresor tumoral en estadíos tempranos del desarrollo tumoral, y como factor pro-metastático en estadíos avanzados (Pardali & Moustakas, 2007). El mecanismo celular de la acción supresora tumoral del TGF-β afecta a los programas citostático y apoptótico y genera una supresión de la inmortalización y un mantenimiento de la estabilidad genómica. En el primero genera un arresto del ciclo celular en la fase G1, control citostático generado por las SMADs al regular varios genes, y junto con efectores adicionales como Erk1/2 y la GTPasa RhoA, van a orquestar una red celular global que está dirigida al bloqueo preciso del ciclo celular anterior al punto de restricción G1. En cuanto al programa apoptótico, este es complejo e incorpora tanto vías de señalización pro-supervivencia como pro-apoptóticas y una serie de efectores citoplasmáticos y nucleares, muchos de los cuales son quinasas. Aunque este es ejercido por las SMADs de una forma específica al tipo celular, existen otras vías involucradas que van a ejercer una acción apoptótica o pueden favorecer supervivencia dependiendo de señales de entrada alternativas que reciba la célula, adicionales a la del TGF-β. Más aún, se ha visto una inactivación de la señalización del TGF-β por oncogenes, dentro de los cuales se cuenta a Myc, Ras, Ski y SnoN (Pardali & Moustakas, 2007). En contraste, se ha visto que la regulación ejercida por el TGF-β se pierde en ciertos carcinomas, transformándolo en un promotor tumoral o factor pro-metastático en casos avanzados de cáncer. La evidencia genética recogida de tumores humanos en los últimos años señala un rol claro de los dos receptores TGF-β, SMAD4 y SMAD2 en menor frecuecia, como supresores tumorales implicados en la progresión de varios tipos de cáncer. Aunque todas las mutaciones tumorales reportadas en la vía de señalización del TGF-β involucran a los receptores y a las SMADs, se ha visto que también se puede presentar una desregulación del ligando en cáncer. Adicionalmente, el receptor β-glicano es silenciado en varios tumores, y contribuye a una relativa pero no absoluta insensibilidad a la acción inhibitoria del crecimiento del TGF-β. Tumores en estadíos malignos avanzados secretan altos niveles de TGF-β, cuyas acciones autocrina y paracrina promueven el crecimiento tumoral, EMT, invasión y metástasis: al actuar sobre fibroblastos estromales, remodela la matriz tumoral e induce la expresión de señales mitogénicas que estimulan el crecimiento tumoral; mientras que regula la angiogénesis actuando sobre células endoteliales y pericitos. Finalmente suprime la proliferación y diferenciación de linfocitos, incluyendo células T citotóxicas, natural killer y macrófagos,

Capítulo 2 73

previniendo de esta forma la vigilancia inmune del tumor en desarrollo (Ikushima & Miyazono, 2010; Pardali & Moustakas, 2007). De tal forma que la señalización del TGF-β en cáncer presenta roles temporal- y contexto-dependientes, y la respuesta celular a este está determinada por este contexto. Se han descrito tres tipos de determinantes contextuales: transductores de señal, transcripcionales y el estatus epigenético. Dentro del primer grupo hay isoformas de ligando, trampas de ligando, co-receptores, subunidades de receptores, proteínas SMAD inhibitorias y crosstalk con otras señales de entrada. El segundo grupo comprende factores de pluripotencia, reguladores de linaje, cofactores de unión al DNA, Histona acetil transferasas (HATs) e Histona deacetilasas (HDACs), el complejo remodelador del nucleosoma Switch/Sucrosa no-fermentable (SWI/SNF) y lectores de cromatina. El tercer grupo determina cuales genes estarán activos o silenciados, resaltando como determinantes la heterocromatina y marcadores de pluripotencia, de linaje, de EMT, de stem cell pluripotente inducidas (iPS) y oncogénicos.(Massague, 2012). En esta línea, recientemente se ha resaltado el papel del epigenoma en la modulación de los efectos contexto-específicos de la vía TGF-β/SMAD3 en cáncer de seno, al dirigir los programas transcripcionales (Tufegdzic Vidakovic et al., 2015). Sin embargo, a pesar de la plétora de evidencia recogida, aún permanece mucho por ser descubierto acerca de la vía de señalización del TGF-β. Diversas vías celulares que dirigen mitogénesis y tumorogénesis tienen como blanco a la vía del TGF-β, y aún es necesario explicar plenamente cómo las células tumorales manipulan la señalización del TGF-β con el fin de convertirlo de un supresor tumoral en un promotor tumoral. Finalmente, el estudio de cambios en el proteoma del trofoblasto en respuesta al TGF-β puede brindar nuevas claves acerca de la regulación del trofoblasto y su desarrollo maligno. En el presente capítulo, se considera a la línea celular HTR-8/SVneo como un modelo de trofoblasto regulado, en base a su fenotipo y respuesta a factores regulatorios para los que el coriocarcinoma es resistente, tales como el TGF-β. Teniendo en cuenta que la expresión de proteínas es la base para el desarrollo de procesos biológicos, la hipótesis es que la pérdida de la regulación de la proliferación e invasión que caracteriza al coriocarcinoma en comparación con el trofoblasto se refleja en cambios de los perfiles de expresión de proteínas entre un modelo celular de coriocarcinoma y uno de trofoblasto en condiciones fisiológicas y en respuesta al factor TGF-β. El objetivo general es estudiar de forma comparativa el proteoma de células HTR-8/SVneo y JEG-3 en condiciones fisiológicas o basales y en respuesta al TGF-β. El papel de las proteínas identificadas se discutirá en relación con procesos celulares característicos de células malignas y redes biológicas. Para esto se desarrollaron diversos análisis proteómicos comparativos, incluyendo un análisis proteómico cuantitativo mediante la marcación con isótopos estables en cultivo SILAC. El análisis molecular se complementa con ensayos funcionales, como formación de esferoides, y de caracterización celular en condiciones fisiológicas (SFB al 10%), diversas condiciones de cultivo y en respuesta al TGF-β. Los análisis de caracterización celular y ensayos funcionales fueron desarrollados en el Laboratorio de Hormonas de la Universidad Nacional de Colombia, y en el Laboratorio de Placenta, asociado al Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania, durante el desarrollo de una estancia de investigación. Los análisis proteómicos preliminares fueron desarrollados en el laboratorio de la Dra. Patricia Cuervo en el Instituto Oswaldo Cruz –

74 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

FIOCURZ y en el Servicio Proteómico de la Universidad FUNDAO en Rio de Janeiro, Brasil. Los análisis proteómicos DIGE y SILAC fueron desarrollados en el Laboratorio de Proteómica del Instituto de Oncología Vall d’Hebron VHIO, de Barcelona, España, durante el desarrollo de una estancia de investigación, bajo la dirección del Dr. Francesc Canals y el acompañamiento de la Dra. Marta Monge.

2.1 Caracterizacion celular y análisis funcional Los objetivos específicos de esta sección son caracterizar a las líneas celulares inmortalizada de trofoblasto, HTR8/SVneo, y derivada de coriocarcinoma, JEG-3 y determinar su capacidad de respuesta al TGF-β, a nivel de proliferación celular y capacidad de supervivencia, mediante ensayo de MTT y de formación de esferoides.

2.1.1 Características de las líneas empleadas La línea celular HTR-8/SVneo morfológicamente tiene una identidad epitelial, que corresponde a su origen trofoblástico. Esta línea expresa hCG, y secreta tanto la MMP-2 como la MMP-9. También expresa la proteína del complejo mayor de histocompatibilidad específica de trofoblasto, HLA-G e integrinas como α1 y α6 cuando las células se encuentran en contacto con ciertos componentes de la matriz extracelular, lo cual se debe a la habilidad del trofoblasto de alterar su perfil de proteínas de adhesión en respuesta a cambios en el microambiente materno (Kilburn et al., 2000). Por su parte, la línea celular JEG-3 representa a células trofoblásticas inmaduras y secreta hCG, hCG hiperglicosilada, lactógeno placental y progesterona (Kohler & Bridson, 1971). A pesar de que JEG-3 es de origen maligno, las células de HTR-8/SVneo presentan una capacidad invasiva mayor que JEG-3, debido a que su origen es EVT invasivo. Numerosos estudios han comprobado esto (Chaiwangyen et al., 2014; Diaz et al., 2007; Salomon et al., 2014), así como la regulación del proceso invasivo desarrollado por las células HTR-8/SVneo (Graham et al., 1993; Lala et al., 2002); es por esto que la migración e invasión exhibida por HTR-8/SVneo se considera fisiológica, y no es tenida en cuenta dentro de los ensayos funcionales. En búsqueda de otras propiedades que correlacionen con malignización, se considera el nivel de proliferación, viabilidad celular y actividad metabólica como una característica interesante para la comparación de los modelos.

Morfología celular

Mediante observación con microscopio óptico invertido se determinó que durante el cultivo las células HTR-8/SVneo exhiben características morfológicas más cercanas a células mesenquimales que a epiteliales, creciendo de forma dispersa, pero estableciendo contactos celulares y prolongaciones con una posible formación de nanotubos (ver Figura 2-1, 24 horas flechas rojas). Cuando el cultivo llega a confluencia se aprecia una morfología más epitelial y densa (Figura 2-1, 2 días). Esta característica morfológica concuerda con la expresión de vimentina y la falta de detección de e-caderina, analizada por western blot (Sección 1.1.3).

Capítulo 2 75

Figura 2-1 Células HTR-8/SVneo en cultivo con 10% de SFB en RPMI 1640

Figura 2-2 Células JEG-3 en cultivo con 10% de SFB en F-12

Imágenes representativas de las células, adquiridas con un microscopio de contraste de fases y

adquisición con el programa ZEN (Carl Zeiss Microscopy GmbH).

76 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

A diferencia de estás, las células JEG-3 se caracterizan por su crecimiento en clústers densos de morfología más epitelial, pero con un bajo contacto entre un clúster y otro (ver Figura 2-2); adicionalmente, en algunos cultivos se ha visto que clústers celulares sufren procesos de fusión espontaneos (observaciones personales), recordando el proceso de formación del sincitio in vivo. La adhesión intercelular de estos clústers es tan alta que durante los procesos de tripsinación estos se mantienen, dificultando la dispersión celular (ver agregados a 5 h en Figura 2-2). A modo de comparación y como referente biológico, se estableció un cultivo primario de células trofoblásticas aisladas de placenta a término mediante gradiente de Percoll (ver Anexos A 14). En la Figura 2-3 se aprecian las diversas morfologías celulares obtenidas, esto debido a la heterogeneidad trofoblástica presente en placenta a término. Se reconocen morfologías como las exhibidas por células HTR-/SVneo (cuadrante superior), así como clústers celulares como los presentados por células JEG-3 (cuadrante inferior), incluyendo la formación de proyecciones y posibles conctactos entre células (flecha roja). Luego, los dos modelos celulares pueden captar características morfológicas diferentes presentes al mismo tiempo en un cultivo primario de trofoblasto. Figura 2-3 Cultivo primario de trofoblasto aislado de placenta a término

Imágenes representativas de las células a las 64 horas de cultivo, adquiridas con un microscopio

de contraste de fases y adquisición con el programa ZEN (Carl Zeiss Microscopy GmbH).

Secreción de gonadotropina coriónica humana

Este análisis se realizó en el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, al cual esta asociado el laboratorio de Placenta, con la colaboración de Christin Bär. Se analizó cuantitativamente

Capítulo 2 77

la gonadotropina coriónica humana (hCG) secretada por células HTR-8/SVneo y JEG-3. Para esto, 200.000 células por pozo fueron sembradas por triplicado en una placa de 12 pozos, deprivadas por 12 horas y cultivadas con SFB al 10% por 24 horas, tiempo en el cual el medio condicionado fue recolectado, centrifugado y analizado su contenido de hCG mediante ensayo clínico cuantitativo (ensayo de ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay). Como se observa en la Figura 2-4, las células de JEG-3 secretaron una gran cantidad de hCG, y se detectaron bajos niveles para HTR-8/SVneo. El alto nivel de secreción de hCG presentado por JEG-3, comparado con HTR-8/SVneo, correlaciona con sus características malignas, siendo el alto nivel de secreción de hCG un marcador tumoral de la Enfermedad Trofoblástica Gestacional.

Figura 2-4 Gonadotropina coriónica secretada por células HTR-8/SVneo y JEG-3

Ensayo de ELISA de la hCG secretada por células HTR-8/SVneo y JEG-3 tras 24 horas de cultivo

en su respectivo medio suplementado con SFB al 10%. n=3, Promedio ± SEM

Expresión del receptor del TGF-β (TβRII)

Mediante PCR cuantitativa se determinó el nivel basal de expresión del receptor TβRII en las dos líneas, análisis que fue realizado con la orientación de la Dra. Diana Morales. El análisis de la expresión del receptor TβRII permite evaluar la capacidad de respuesta inicial de las dos líneas a TGF-β, con miras a estudiar el efecto del TGF-β sobre diversas funciones celulares en los dos modelos. El ARN de células cultivadas con SFB al 10% fue extraído con Trizol y analizado mediante RT- qPCR, utilizando el gen GAPDH como referencia y normalizando la expresión a HTR-8/SVneo (ver Anexos A 9d). Como se observa en la Figura 2-5 A, a pesar de que ambas líneas expresan el receptor, se encontró una menor expresión de este receptor en células de JEG-3, cercana a la mitad del nivel de expresión exhibido por células de HTR-8/SVneo. Adicionalmente se evaluó la expresión de E-caderina, observando que JEG-3 expresa cerca de 20.000 veces más el gen debido a un nivel mínimo de expresión en HTR-8/SVneo (Figura 2-5 B). El mínimo nivel de expresión de e-caderina en HTR-8/SVneo correlaciona con lo observado mediante análisis con Western Blot en el Capítulo 1, y con las diferencias observadas en la morfología celular entre células HTR-8/SVneo y JEG-3.

4±0 N=3

hCG

JEG-3 HTR-8/SVneo02468

1080

100120140160

116.0 ± 13.05 N=3

b-HC

G (m

IU/m

l)

78 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 2-5 Expresión basal del receptor TBRII y E-caderina

Expresión basal de A. el receptor de TGF-β (TβRII) y B. E-caderina, determinada por qPCR normalizado a HTR-8/SVneo (n biológico = 3, n técnico = 2, gen de referencia: GAPDH).

2.1.2 Influencia del suero en la proliferación y metabolismo celular

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el capítulo 1, se comparó la proliferación y metabolismo de células HTR-8/SVneo y JEG-3 frente a diferentes dosis de suero, mediante conteo celular, MTS y medición de los niveles de glucosa y lactato en el medio condicionado. 200.000 células por pozo fueron sembradas en una placa de 12 pozos y deprivadas por 12 horas, previo a los tratamientos que se realizaron por triplicado. Se cultivaron las células en su respectivo medio de cultivo con diferentes concentraciones de SFB: 10%, 0,5% ó 0% y empleando un SFB depletado en vesículas extracelulares (EVs) (Exo-free) al 0,5% (utilizado en el capítulo 3). Este medio con 0,5% de SFB Exo-free, a pesar de presentar niveles de nutrientes similares al SFB 0,5% normal, puede tener una reducción en señales y estímulos provenientes de EVs como exosomas (Eitan et al., 2015). A las 24 horas de cultivo se determinó la proliferación por conteo celular con azul de tripan, y se recolectó el medio condicionado (ver Anexo A 2c). Este medio se analizó en un analizador de gases en sangre ABL90 FLEX (Radiometer) y se determinó el consumo de glucosa y producción de lactato, como la diferencia entre el valor registrado de la concentración en el medio condicionado y el registrado en el medio de cultivo original o control (RPMI 1640 para HTR-8/SVneo y F-12 para JEG-3). Para el conteo celular, las 24 horas de ensayo no fueron suficientes para diferenciar el número de células entre las diferentes condiciones de cultivo (datos no mostrados). A pesar de esto se obtuvieron diferencias a nivel metabólico. Como se observa en la Figura 2-6, JEG-3 presenta una producción basal de lactato y consumo de glucosa siginficativo en ausencia de suero, cuyos niveles se mantienen casi constantes independientemente del porcentaje de suero, a diferencia de HTR-8/SVneo para la cual el consumo de glucosa / producción de lactato es proporcional al porcentaje de suero, incrementándose significativamente con porcentajes bajos como 0,5%, pero mucho menor al registrado para JEG-3. Se evaluó la proliferación como viabilidad celular o actividad metabólica mediante MTS, una variación del MTT que emplea un derivado de tetrazolio generando una forma soluble en agua de formazán (Anexo A 2b). Se ensayaron dosis de SFB al 0%, 0,5% y

TβRII

HTR-8/SVneoJEG-30.0

0.5

1.0

1.5

Raz

ón d

e la

exp

resi

ón a

HTR

8/SV

neo E-caderina

HTR-8/SVneoJEG-30.00.51.01.52.0

15 000

20 000

25 000A. B.

Capítulo 2 79

10% a las 24, 48 y 72 horas, para las dos líneas celulares, y los cambios en la morfología y densidad celular fueron monitoreados por microscopía de contraste de fase. Figura 2-6: Efecto del SFB en el metabolismo de células HTR-8/SVneo y JEG-3

Comparación de la influencia de diferentes dosis de SFB a las 24 horas de cultivo en el consumo de glucosa y produccion de lactato determinado como la diferencia entre la concentracion en la muestra y en el medio original ([Muestra] – [Ctrl]). Test ANOVA de una vía y pos-test para comparaciones múltiples de Bonferroni, n=3, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001 para cada pareja comparada Figura 2-7 Viabilidad y proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 con varias dosis de suero

Actividad metabólica normalizada al control al tiempo cero, evaluada por MTS a las 24, 48 y 72 horas. Test ANOVA de dos vías, post-test de Bonferroni comparando con cultivo con SFB 10% al mismo tiempo (n=3, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001). Como se observa en la Figura 2-7, JEG-3 presenta en general un alto nivel de proliferación cuando es cultivado con SFB al 10%, comparado con el nivel registrado para HTR-8/SVneo, siendo evidente a tiempos superiores a 24 horas y especialmente tras tres días de ensayo. Por otro lado, para HTR-8/SVneo se confirmó el resultado obtenido en el MTT del Capítulo 1 (Figura 1-1), presentando a las 24 horas un nivel de proliferación mayor con 0% de SFB que con 0,5%, el cual cae a tiempos superiores mientras que con 0,5% de SFB mantiene una tasa intermedia de proliferación. Este fenómeno no se observó en células de JEG-3, el cual a las 24 horas presenta una proliferación proporcional a la dosis de SFB, pero ninguna de las dosis bajas de suero le

HTR-8/SVneo

0% 0,5% EV-f 0,5% 10%-2

-1

0

1

2

3

***

***

SFB

[Mue

stra

]-[M

edio

] (m

mol

/L)

JEG-3

0% 0,5% EV-f 0,5% 10%-2

-1

0

1

2

3 GlucosaLactato

*

*

Consumo de Glucosa / Producción de Lactato

HTR-8/SVneo en medio RPMI

0 24 48 720

1

2

3

4

5

Tiempo (h)

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

JEG-3 en medio F12

0 24 48 720

1

2

3

4

5

0% 0.5% 10%dosis SFB

***

*********

** ******************

80 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

permitió sobrevivir a tiempos superiores, presentándose una tasa elevada de apoptosis y desprendimiento celular, como se evidenció por microscopía óptica, a diferencia de las células HTR-8/SVneo que se mantienen adheridas y con morfología típica a las 24 horas, incluso en ausencia de suero (Figura 2-8). Figura 2-8 Morfología celular del ensayo de viabilidad de células HTR-8/SVneo y JEG-3 con varias dosis de suero

Fotografías representativas de las células cultivadas por 24 horas en sus respectivos medios,

suplementado con diferentes concentraciones de SFB, adquiridas con un microscopio de contraste de fases y cámara fotográfica.

Efecto del TGF-β en la viabilidad celular y actividad metabólica

Figura 2-9 Efecto del TGF-β en la viabilidad y proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 en sus respectivos medios

Actividad metabólica normalizada al control en el tiempo cero (medio sin SFB) de células HTR-8/SVneo y JEG-3 cultivadas en RPMI 1640 o F-12, respectivamente, con SFB al 0,5% (Ctrl) o con TGF-β 10 ng/mL y SFB al 0,5% (Tratamiento), y evaluadas a las 24 y 48 horas por ensayo de MTS. t-test no pareado, n=3.

HTR-8/SVneo en RPMI

24 h 48 h0.0

0.5

1.0

1.5

Ctrl (SFB 0,5%) TGF-β (SFB 0,5%)

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

JEG-3 en F-12

24 h 48 h0.0

0.5

1.0

1.5

Capítulo 2 81

En conjunto con el ensayo de MTS anterior, se evaluó el efecto del TGF-β 10 ng/mL en la proliferación/actividad metabólica de las células HTR-8/SVneo y JEG-3, realizando el tratamiento en el medio de cultivo respectivo de cada línea celular suplementado con 0,5% de SFB, y empleando como control este mismo medio con SFB al 0,5%. A pesar de que el análisis estadístico no arrojó ninguna diferencia significativa, en la Figura 2-9 se pueden observar las tendencias comparativas en la actividad metabólica evaluadas a las 24 y 48 horas de tratamiento con TGF-β. Para la línea HTR-8/SVneo es posible evalular el efecto del TGF-β a tiempos superiores a 48 horas, en búsqueda de cambios más pronunciados y por ende significativos; sin embargo, como se ve en la Figura 2-7 a estos tiempos la viabilidad de las células JEG-3 puede decrecer, perdiendo significado biológico.

2.1.3 Capacidad de formación de esferoides como rasgo stem cell

Una de las características de las células progenitoras pluripotentes y de las células madre de cáncer o cancer stem cells es su capacidad de auto-renovación, incluyendo la capacidad de propagarse como esferoides, la cual involucra adhesión intercelular y proliferación independiente de anclaje. El cultivo de esferoides, a diferencia de los sistemas de cultivo celular tradicionales, permite recapitular aspectos de la homeostasis celular y reflejar mejor la biología tumoral in vivo (Bates et al., 2000). Comparado con los cultivos en monocapa, los modelos de esferoides multicelulares representan los tejidos tumorales en términos de propiedades estructurales y funcionales, incluyendo la formación de gradientes de nutrientes, oxígeno, acumulación de lactato y apoptosis/necrosis, siendo adecuados para el estudio de procesos de invasión y metástasis, y evaluación terapéutica de drogas (Hirschhaeuser et al., 2010). El ensayo de formación de esferoides se llevó a cabo como se describe en Anexos A 12, con la asesoría de la investigadora Karolin Fröhlich. Los esferoides en suspensión fueron generados por el método de la gota colgante, con o sin aditivos como metilcelulosa, cultivando cada línea celular en su medio de cultivo tradicional suplementado con 10% de SFB. Debido a los resultados proteómicos obtenidos en el capítulo anterior que sugieren efectos del TGF-β a nivel de la adhesión celular y regulación de la dinámica del citoesqueleto en células HTR-8/SVneo, fue relevante evaluar el efecto del TGF-β en la formación y evolución de esferoides de células HTR-8/SVneo y JEG-3. Para esto se sembraron los esferoides con 10 ng/mL de TGF-β en medio con SFB al 10%, en pararelo con su control (medio con SFB al 10%) y se evaluo su formación. Por otro lado, se generaron esferoides con SFB al 10% y se traspasaron a una placa de 96 pozos para evaluar la capacidad de migración (diseminación) y adherencia de estas células en presencia o ausencia de TGF-β 10 ng/mL, como mímica del proceso de colonización de un nicho secundario. Se sembraron 20.000 células por gota, llevando a cabo 50 experimentos de gotas colgantes por tratamiento y línea celular, y se registraron de 9 a 16 esferoides por tratamiento y línea celular a lo largo del tiempo. Como se observa en la Figura 2-10, las células de HTR-8/SVneo fueron capaces de formar esferoides mecánicamente robustos, aún en ausencia de aditivos como metilcelulosa, a diferencia de JEG-3 que requirió 25% de metilcelulosa y con el cual nunca se pudieron obtener esferoides maduros, esto implicó que el ensayo de migración celular a partir de esferoides no pudiera ser llevado a cabo para JEG-3. Para los esferoides formados por HTR-8/SVneo con 10% de metilcelulosa, se encontró que en

82 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

presencia de TGF-β el 40% de los esferoides formaban varios centros necróticos, no limitados al centro del esferoide, debido a una rápida agregación alrededor de múltiples centros (datos no mostrados). Figura 2-10 Efecto del TGF-β en la formación de esferoides de células HTR-8/SVneo y JEG-3 por el método de gota colgante

Imágenes representativas para cada tratamiento, adquiridas con un microscopio de campo claro y adquisición con el programa ZEN (Carl Zeiss Microscopy GmbH). a) Formación de esferoides de HTR-8/SVneo en ausencia de aditivos. b) Formación de esferoides de JEG-3 con metilcelulosa al 25%. En ausencia de aditivos se encontraron diferencias apreciables en la formación del 100% de los esferoides de HTR-8/SVneo entre tratamiento con TGF-β y el control, para los

Capítulo 2 83

cuales el TGF-β parece promover las uniones célula-célula iniciales de HTR-8/SVneo, lo que conduce a la formación de clústers o agregados celulares más rápidamente que en el control, proceso de agregación necesario para la formación del esferoide; sin embargo, estos múltiples centros de agregación condujeron a múltiples centros necróticos, impidiendo la generación de un esferoide homogéneo con un único centro; adicionalmente, la proliferación celular y evolución del esferoide aparentemente se vió afectada, al no crecer y compactarse como en el caso del control (Figura 2-10 a). Estas observaciones fueron confirmadas tras ensayo de migración y adherencia de los esferoides formados con TGF-β en placa de 96 pozos, evidenciando un menor número de células viables y móviles comparado con esferoides control, probablemente debido a un bajo número de células proliferativas y viables en la superficie del esferoide formados con TGF-β (datos no mostrados). Adicionalmente, el TGF-β aparentemente influyó positivamente en la migración y adhesión de células HTR-8/SVneo del esferoide control hacia la placa de cultivo, sugiriendo la regulación del proceso de migración y adhesión célula-sustrato; sin embargo, se requiere de un mayor número de observaciones y experimentos adicionales para poder tener resultados concluyentes al respecto (ver Anexos D3). En el caso de la formación de esferoides de JEG-3, el TGF-β parece inhibir la formación de clústers a tiempos largos y la agregación de las células en general (Figura 2-10 b), sugiriendo efectos regulatorios distintos a nivel de la adhesión celular, comparado con HTR-8/SVneo.

2.1.4 Homogenización de condiciones de cultivo En general, cada línea celular derivada de trofoblasto se puede cultivar en un amplio rango de medios de cultivo como F-12, DMEM y RPMI 1640, cada uno con diferentes porcentajes de glucosa, aminoácidos, nutrientes y estimulantes celulares (ver Anexo B1), y la escogencia de cada uno depende de la tradición de cultivo y el protocolo del laboratorio. La línea HTR-8/SVneo es cultivada en medio RPMI 1640, mientras que JEG-3 es cultivada en medio DMEM alto en glucosa (laboratorio GIH, Unal-Bogotá) o en mezcla nutritiva F-12 (Placenta-Lab, FSU Jena), condiciones con las que generan el fenotipo característico reportado en la literatura. Ya que cada una de las líneas celulares empleadas es cultivada de forma tradicional en medios diferentes, en el presente trabajo se evaluaron diversas aproximaciones para el cultivo de estas líneas, trabajando finalmente cada cultivo celular en su medio original y evaluando una adaptación de las células a un medio compuesto por la mezcla F12: RPMI 1640 en proporción 1:1. En abordajes preliminares en el Laboratorio de Hormonas, se realizó una adaptación progresiva de células JEG-3 de DMEM alto en glucosa a RPMI 1640, dando como resultado un cambio en el comportamiento celular y tipo de crecimiento en cultivo, con la aparente secreción de fibras tipo matriz extracelular y cambio del crecimiento de monocapa a agregados 3D (ver Anexo D 1). Por lo anterior, se rechaza este abordaje, debido al cambio de identidad y problemas asociados al cultivo. Por otro lado, se intentó una adaptación progresiva de células HTR-8/SVneo de RPMI a F-12, la cual no fue exitosa debido presuntamente al estrés nutricional generado, evidenciado en la pérdida progresiva de células en cultivo por falta de adhesión y aparente anoikis, o apoptosis debida a la falta de adhesión, mientras que en el bajo número de células que permanecieron adheridas se observaron cambios en su

84 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

morfología, pudiendo ser seleccionas sobre las otras y constituyendo una sub-población resistente a las nuevas condiciones de cultivo (ver Anexo D 2). Por lo anterior se decide general una adaptación celular de los dos modelos a una mezcla de medio RPMI 1640 / F-12 en proporción 1 a 1, condiciones evaluadas en el Laboratorio de Placenta, FSU, trabajando de dos formas: con cambio de medio y sin adaptación previa (adaptación aguda) y adaptando las células de forma gradual o progresiva. Una adaptación aguda a un medio diferente sobre células adheridas, es decir en un solo paso mediante cambio de medio, fue exitosa, pudiendo realizarse de esta forma ensayos de MTS de células HTR-8/SVneo y JEG-3 cultivadas en diferentes medios, incluyendo la mezcla de medio RPMI 1640: F-12 1:1.

Efecto del TGF-β y dependencia con el suero y las condiciones de cultivo

En el capítulo anterior se había visto que la cantidad de SFB que está suplementando el medio de cultivo afecta de forma diferencial la respuesta celular de la línea HTR-8/SVneo al TGF-β tanto a nivel de proliferación (Sección 1.2.1) como de expresión de proteasas (Sección 1.2.2). Debido a estas observaciones se evaluó la influencia de las condiciones de cultivo, incluyendo el tipo de medio empleado, en el crecimiento celular y respuesta al TGF-β mediante ensayo de MTS (Anexo A 2b). Figura 2-11 Efecto del TGF-β en la proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3 sin adaptar, en diferentes condiciones de cultivo.

Actividad metabólica normalizada al control en el tiempo cero (medio sin SFB) de células HTR-8/SVneo y JEG-3 cultivadas en diferentes medios suplementados con A. SFB al 10% (Ctrl) o B. SFB al 0,5% (Ctrl), y tratadas con TGF-β 10 ng/mL en su respectivo medio control, evaluadas a las 72 horas por ensayo de MTS. t-test no pareado (n=3, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001 con respecto al control).

HTR-8/SVneo

F12 RPMI/F12 RPMI0

2

4

6

8

10

12 ***

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

JEG-3

F12 RPMI/F12 RPMI0

2

4

6

8

HTR-8/SVneo

F12 RPMI/F12 RPMI0

2

4

6

8

Ctrl TGF-β

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

JEG-3

F12 RPMI/F12 RPMI0

2

4

6

**

SFB al 10%

SFB al 0,5%

A.

B.

Capítulo 2 85

En este primer ensayo, la influencia del medio de cultivo en la proliferación fue evaluada en células sin adaptación, es decir, el medio de cultivo fue cambiado durante el ensayo de MTS sobre las células adheridas, tras la sincronización del cultivo por depleción de suero, adicionando el medio a evaluar a los pozos respectivos. Se evaluó el efecto del TGF-β 10 ng/mL en células de HTR-8/SVneo y JEG-3 en medio F-12, RPMI o RPMI: F12 1:1, suplementado con 0,5% o con 10% de SFB a las 72 horas. Para el ensayo con SFB al 10% (Figura 2-11 A), el TGF-β 10 ng/mL tiene un efecto anti-proliferativo únicamente en células HTR-8/SVneo cultivadas en RPMI con SFB al 10%, su medio tradicional de cultivo, sin afectar a las células JEG-3. Esto concuerda con los reportes previos de la literatura, y muestra que en otros medios de cultivo este efecto se pierde, sugiriendo que las condiciones de cultivo afectan la capacidad de las células de responder a los efectos anti-proliferativos del TGF-β. Por otro lado, el ensayo con SFB al 0,5% no arrojó resultados significativos para la línea HTR-8/SVneo; sin embargo, cuando las células JEG-3 fueron cultivadas en RPMI suplementado con 0,5% de SFB, medio tradicional de la línea HTR-8/SVneo, se observó una respuesta al TGF-β similar a la observada para HTR-8/SVneo previamente (Figura 2-9). Esto sugiere que la capacidad de respuesta a un factor como el TGF-β puede estar influenciada por las condiciones de cultivo, de tal forma que cuando estas se uniformizan es posible generar el mismo tipo de respuesta entre líneas que aparentemente responden de forma diferente como HTR-8/SVneo y JEG-3.

Adptación celular a cultivo en medio RPMI: F-12 1:1

Adicionalmente, las líneas celulares fueron adaptadas a una mezcla RPMI 1640 / F-12 (1:1) de forma secuencial en un proceso de 8 días (0:100, 25:75, 50:50), comenzando a un 60% de confluencia, cambiando el medio cada dos días y abriendo el cultivo a un 80%–90% de confluencia con una razón de apertura de 1:2. Las células adaptadas de esta forma fueron cultivadas en esta mezcla por un pase adicional antes de un nuevo ensayo de MTS, para el cual fueron sembradas en una placa de 96 pozos, sincronizadas por deprivación de suero y analizadas en el medio de ensayo, tal como se especifica en la Tabla 2-1, evaluando la viabilidad celular en medio RPMI, F12 o RPMI/F12, suplementado con SFB al 0,5, 1, 5 ó 10%, por MTS a las 0, 24, 48 y 72 horas de cultivo. Adicionalmente, se evaluó el efecto del TGF-β 10 ng/mL sobre la proliferación de estas células, en medio RPMI, F12 o RPMI/F12, suplementado con 0,5% ó 10% de SFB, a las 48 y 72. Tabla 2-1 Diseño experimental adaptación celular

Línea celular Medio original Medio de adaptación Medio de ensayo

HTR-8/ SVneo RPMI RPMI/F-12 1:1 F-12

RPMI/F-12 RPMI

JEG-3 F-12 RPMI/F-12 1:1 F-12

RPMI/F-12 RPMI

Cuando las células fueron adaptadas al medio RPMI/F12 y estudiadas en este o en F12, se observó un comportamiento similar entre las dos líneas, tanto a dosis altas como bajas de suero (Figura 2-12 A y B). En general, las células JEG-3 mantienen el mayor

86 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

nivel de actividad metabólica y proliferación, comparado con HTR-8/SVneo, a excepción del medio F-12 donde las dos líneas presentan sorprendentemente tasas de crecimiento y niveles similares, sugiriendo una homogenización de su metabolismo y/o proliferación. Adicionalmente se observó que la adaptación celular y las condiciones de cultivo influenciaron la respuesta de estas células al tratamiento con TGF-β, presentándose una aparente homogenización en la respuesta de los dos modelos al TGF-β. Mientras que con SFB al 1% no se presentaron diferencias apreciables entre el control y el tratamiento, cuando las células fueron evaluadas con 0,5% de SFB se observó una aparente disminución de la proliferación en respuesta al TGF-β, para ambas líneas evaluadas en los tres medios, sin llegar a ser estadísticamente significativo (datos no mostrados). Con la dosis de SFB al 5% se obtuvo un comportamiento similar al obtenido con SFB 10%, tanto a las 48 como a las 72 horas, registrándose un aumento estadísticamente significativo en la proliferación de HTR-8/SVneo cultivada en RPMI con SFB al 5% y en respuesta al TGF-β (72 h, p<0,01). De igual forma para la dosis de SFB 10% se obtuvieron resultados similares tanto a las 48 como a las 72 horas, y se presentan en la Figura 2-13 únicamente los resultados a las 72 horas, ya que el cambio registrado fue más pronunciado y se obtuvo una significancia estadística mayor. Figura 2-12: Efecto de las condiciones de cultivo en la proliferación y viabilidad de células HTR-8/SVneo y JEG-3 adaptadas a RPMI/F12

Actividad metabólica de las líneas celulares evaluado por MTS en el medio de adaptación o ensayo, suuplementado con concentraciones diferentes de SFB. Test ANOVA de dos vías y post-test Bonferroni, comparando al cultivo con SFB 10% en cada tiempo, cultivos paralelos n=3 * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001.

F12/RPMI

0 24 48 720

2

4

6

8

Tiempo (h)

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

F12/RPMI

0 48 720

2

4

6

8

10

12

Tiempo (h)

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

F12

0 24 48 720

2

4

6

8

F12

0 48 720

2

4

6

8

10

RPMI

0 24 48 720

1

2

3

4

5

RPMI

0 48 720

2

4

6

8

10

12

HTR-8/SVneo JEG-3

Dosis altas SFB

0.5 % 1 %

A.

B.

Dosis bajas SFB

5 % 10 %

***

***

***

****

******

******

****

***

***

******

Células adaptadas a F12/RPMI

Capítulo 2 87

Para HTR-8/SVneo evaluada en RPMI se obtuvo un incremento en su actividad metabólica que correlaciona con un aumento en su proliferación en respuesta al TGF-β, respecto al control, verificada mediante microscopía óptica, fenómeno que también se observa cuando es evaluada en F-12 (Figura 2-13 B y C). De forma similar, JEG-3 presentó un aumento en su proliferación/actividad metabólica en respuesta al TGF-β cuando fue evaluada en el medio F-12 (Figura 2-13 B). Por otro lado, las células evaluadas en el medio RPMI /F-12 no presentaron cambios significativos como respuesta al TGF-β, aunque JEG-3 continúa exhibiendo una tasa de proliferación mayor que HTR-8/SVneo (Figura 2-13 A).

Figura 2-13 Efecto del TGF-β en células adaptadas e influencia del medio de cultivo

Efecto del TGF-β 10 ng/mL sobre la proliferación, evaluada como actividad metabólica vía MTS a las 72 horas de estimulación, de células HTR-8/SVneo y JEG-3 adaptadas a la mezcla F-12/RPMI 1640 1:1 y cultivadas en A. mezcla RPMI/F12, B. medio F-12 o C. medio RPMI 1640, suplementado con SFB al 10%. T-test comparando con respecto a su control (n=3, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001).

2.1.5 Discusión de la caracterización celular En la presente sección se caracterizaron las dos líneas celulares empleadas, peresentandose HTR-8/SVneo como una línea que responde al TGF-β como se reporta en la literatura, pero es cambiante de acuerdo a las condiciones de cultivo, mientras que JEG-3 concuerda con coriocarcinoma, teniendo en cuenta su alto nivel de proliferación y secreción de hCG, la secreción basal y a un mayor nivel de lactato, así como el elevado consumo de glucosa, en comparación con HTR-8/SVneo. Tanto células de la línea HTR-8/SVneo como de JEG-3 expresan el receptor del TGF-β (TβRII) y están en capacidad de responder al TGF-β, de acuerdo a las condiciones de cultivo, como se determinó vía ensayo de MTS. Adicionalmente, y de forma paralela al objetivo principal de esta sección, se observó una fuerte influencia de las condiciones de cultivo – específicamente del tipo de medio y dosis de suero empleada – sobre el comportamiento celular, visto como la respuesta de las células HTR-8/SVneo y JEG-3 al tratamiento con TGF-β.

células adaptadas a F12/RPMI

HTR-8/SVneo JEG-30

2

4

6

8

10

12

Activ

idad

met

aból

ica

rela

tiva

células adaptadas en F12

HTR-8/SVneo JEG-30

2

4

6

8

10

12*

***

células adaptadas en RPMI

HTR-8/SVneo JEG-30

2

4

6

8

10

12

***

A. B. C.

Ctrl TGF-β

88 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Caracterización celular de las líneas JEG-3 y HTR-8/SVneo en sus condiciones tradicionales de cultivo

Las células JEG-3 presentaron una mayor producción de lactato y consumo de glucosa, en comparación con las células HTR-8/SVneo (Figura 2-6); esto, como un indicativo del efecto Warburg, demuestra el carácter maligno de la línea de coriocarcinoma a diferencia de la línea de trofoblasto. Adicionalmente, las células JEG-3 presentaron una alta tasa proliferativa, que junto con una posible independencia de los factores mitogénicos del suero hace que mantenga esta tasa aún a bajas concetraciones de suero, lo que hace que agote los recursos energéticos y nutrientes más rápidamente que las células HTR-8/SVneo, cuando son cultivadas con SFB al 0,5% (Figura 2-7); esta aparente independencia frente a las señales mitogénicas del suero podría representar en JEG-3 unas tasas de crecimiento y metabolismo constantes, mientras que HTR-8/SVneo es más sensible y dependiente de las señales de su microambiente, adaptando su metabolismo y proliferación en respuesta a cambios en el nivel de suero, tanto el componente nutricional de este como los de señalización presentes en las EVs bovinas, si se consideran las diferencias registradas entre SFB 0,5% y SFB EV-free 0,5%. En relación con los resultados obtenidos en el capítulo 1, el análisis proteómico sugiere una adaptación metabólica frente a la depleción de suero, a diferencia de SFB al 0,5% y 10%, situación en la cual podría haber un aumento de la glicólisis, lo que implicaría una mayor producción de lactato. Sin embargo, al evalular esto se evidencia que no hay cambio metabólico y el consumo de glucosa y producción de lactato es proporcional al porcentaje de SFB (Figura 2-6). Sin embargo, el resultado del ensayo de MTS (Figura 2-7) reproduce lo observado previamente para HTR-8/SVneo, sugiriendo que un mecanismo adicional puede existir que explique este comportamiento y las diferencias proteómicas encontradas frente a la depleción de suero. A pesar de que los resultados de MTS para HTR-8/SVneo correlacionan con los obtenidos previamente, los resultados obtenidos con JEG-3 lo diferencian de esta, para el cual su alta tasa de crecimiento (Figura 2-7) va de la mano con un alto consumo de nutrientes del medio, como se ve con el consumo de glucosa (Figura 2-6). Esto sugiere que los requerimientos energéticos de las células JEG-3 debido a una tasa de proliferación mayor lo hacen consumir los nutrientes del medio mucho más rápido, de tal forma que su supervivencia con 0,5% de SFB se ve comprometida a tiempos iguales o superiores a 48 horas. Por otro lado, células JEG-3 cultivadas con 10% de SFB registraron un bajo consumo de glucosa con una baja producción de lactato en comparación con dosis menores de suero (Figura 2-6), lo que podría significar que las células JEG-3 utilizaron una fuente energética diferente y alternativa a la glucosa, que puede correlacionar con una menor producción de lactato. En otros estudios se ha visto que células cancerosas cultivadas bajo condiciones hipóxicas convierten glucosa a lactato, extruyendolo, mientras que las células cancerosas aeróbicas captan el lactato mediante el transportador 1 monocarboxilato (monocarboxylate transporter 1, MCT1) y lo utilizan en la fosforilación oxidativa a través de su conversión a piruvato por la lactato dehidrogenasa (ej. LDHB), demostrando la existencia de una “simbiósis metabólica” entre las células cancerosas hipóxicas y aeróbicas (Sonveaux et al., 2008). Aunque a partir de los resultados obtenidos no es posible evaluar esta hipótesis, este es un escenario posible que podría explicar la disminución en la producción de lactato con suero al 10%, a pesar de exhibir una tasa de proliferación/actividad metabólica alta; esta discusión se complementará a la luz de las proteínas identificadas en los análisis proteómicos. Así, JEG-3 se presenta con una alta tasa proliferativa y de actividad metabólica, parcialmente

Capítulo 2 89

independiente de las condiciones nutricionales y las señales dadas por el suero; a diferencia de HTR-8/SVneo que se mantiene sensible al microambiente y cuyo comportamiento es dependiente de las condiciones de cultivo y de la concentración de suero empleada.

El TGF-β afecta la formación de esferoides, con efectos sobre la adhesión celular

Gracias a los resultados del estudio de esferoides, se sugiere el importante papel de la adhesión intercelular en la dirección del destino celular. Se sabe que para el crecimiento celular por esferoides se requieren de moléculas de adhesión como integrinas y caderinas, así como componentes de las vías de señalizacion que controlan la proliferación celular y pueden influenciar en la decisión celular de “vivir o morir” (Bates et al., 2000); un nivel de complejidad mayor lo dan los factores solubles, com EGF, y quizás vesículas extracelulares como exosomas, que permiten una comunicación intercelular. La capacidad de formación de esferoides por células HTR-8/SVneo permite confirmar las habilidades tipo stem cells, descritas previamente por Weber (Weber et al., 2013), revelando un alto nivel de adhesión célula-célula y supervivencia libre de anclaje. Por otro lado, las células JEG-3 parecen requerir de un sustrato para su propagación vía esferoides, lo que implicaría una necesidad de adhesiones célula-sustrato. Esta hipótesis correlaciona con las observaciones realizadas durante la adaptación de células JEG-3 al medio RPMI, en la cual estas células alteraron su forma de crecimiento de monocapa a tridimensional, aparentemente secretando una fibra extracelular a la cual se adherían y les permitía proliferar de forma independiente a la superficie de la placa de cultivo (ver Anexos D 1) El cambio en la formación de esferoides de células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β permite confirmar los procesos inferidos en el capítulo 1 (Sección 1.2.4), con respecto a un posible aumento de la adhesión celular y los contactos célula-célula y célula-sustrato por parte de estas células en respuesta al TGF-β, que correlacionan con el efecto anti-migratorio y anti-invasivo reportado para el TGF-β. El tratamiento con TGF-β aparentemente aumento la adhesión de las células HTR-8/SVneo durante la agregación inicial previa a la formación del esferoide (Figura 2-10), y generó una diseminación celular del esferoide a la placa de cultivo relativamente más rápida con respecto al control, lo que implica procesos de migración y adhesión similares al ensayo de curación de herida (Anexo D3 Figura 5-11). Sin embargo, los esferoides formados con TGF-β presentaron defectos en su evolución y múltiples centros necróticos, siendo principalmente agregados celulares amorfos; de igual forma, al evaluar la capacidad de migración de las células en los esferoides formados con TGF-β, se evidenció una tasa baja de migración y adherencia, posiblemente debido a un bajo número de células proliferativas durante la evolución del esferoide, sustentado en los efectos anti-proliferativos del TGF-β en estas condiciones (Figura 2-11), y quizás también por una pérdida de viabilidad de las células superficiales del esferoide. Otros estudios ya se habían llevado a cabo con esferoides de trofoblasto, encontrando que líneas celulares de coriocarcinoma pueden formar esferoides multicelulares mecánicamente robustos bajo condiciones adecuadas de cultivo en suspensión (Grümmer et al., 1990). A pesar de que las células de trofoblasto normal no forman fidedignamente esferoides multicelulares estables, se han estudiado esferoides de células de coriocarcinoma BeWo, Jeg-3 y JAr, empleándose en sistemas que modelan el

90 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

cultivo de órganos, diseñados para imitar los pasos iniciales de la implantación de embriones, así como en estudios de confrontación, en los cuales los esferoides se ponen en contacto con el epitelio de explantes de endometrio humano (Grummer et al., 1994). A pesar de la necesidad de un alto número de observaciones y réplicas para tener resultados concluyentes, el empleo de esferoides es una herramienta valiosa para el estudio de procesos a nivel de órganos, incluyendo propiedades típicas de las células maglinas y metastáticas como procesos de adhesión, migración y supervivencia celular.

Las condiciones de cultivo influencian el comportamiento celular y la respuesta a TGF-β

Se determinó que el porcentaje de suero y el medio de cultivo afectan de forma diferencial el crecimiento de células de HTR-8/SVneo y JEG-3. En su medio original, JEG-3 exhibe una mayor tasa de crecimiento que HTR-8/SVneo, propio de su carácter neoplásico; no obstante, no es capaz de sobrevivir a bajas dosis de suero, como lo muestra HTR-8SVneo a las 24 horas, exhibiendo una disminución en su viabilidad (Figura 2-7), que correlaciona con una morfología anormal (Figura 2-8). Para la línea HTR-8/SVneo se había establecido el SFB al 0.5% como un medio de mantenimiento en el cual puede sobrevivir sin un incremento significativo en su nivel de proliferación, mientras que cuando se cultiva en ausencia de suero presenta un auge a las 24 horas, para luego caer, presentando pérdida de adhesión celular y aparente apoptosis, como se observó en la Figura 2-7, debido a la falta de soporte nutricional del medio sin suero. La falta de supervivencia exhibida por JEG-3, incluso con una dosis baja de suero (0,5%) se puede explicar suponiendo una rápida depleción de nutrientes debida a la mayor tasa de crecimiento que presenta JEG-3 en comparación con HTR-8/SVneo. Previamente se había visto que concentraciones altas de glucosa inhiben la invasividad de células HTR-8/SVneo, previniendo la activación de uPA; de tal forma que la glucosa puede ser un regulador importante de los procesos desarrollados por el trofoblasto durante la implantación (Belkacemi et al., 2005), así como otros factores nutricionales. Las diferencias en la proliferación de las células en función del tipo de medio se pueden explicar si se consideran las composiciones de los medios de cultivo. Particularmente los medios RPMI 1640 y F-12 tienen diferencias considerables en su composición como se analiza en el Anexo B 1: mientras que RPMI es un medio en general más nutritivo que F-12 debido a su alta concentración de glucosa, algunas vitaminas y aminoácidos, F-12 contiene más minerales como hierro, cobre y zinc, una concentración mayor de vitaminas como colina, B12 y pantotenato y una amplia variedad de componentes como piruvato de sodio, putrescina, hipoxantina y timidina, los cuales parecen actuar como factores de crecimiento necesarios para la división celular, intermediarios de la síntesis de ADN y sustratos y fuente de nitrógeno (Ham, 1965; G. E. Moore et al., 1967). Adicionalmente, la mezcla nutritiva F-12 fue desarrollada para plaqueos de una sola célula libres de suero de células de ovario de hámster chino (CHO), empleándose también suplementado con suero para el crecimiento de otras células de mamífero, incluyendo condrocitos y células epiteliales de próstata de rata (Thermo). Así que, a pesar de que el medio F-12 tiene una calidad nutritiva comparativamente menor que RPMI 1640, presenta sustancias que estimulan la proliferación y metabolismo similar al suero. Considerando lo anterior, JEG-3 alcanza las tasas de crecimiento más altas en medios que contienen RPMI (incluyendo F-12/RPMI) con SFB al 5 y 10%, probablemente debido a que RPMI es más nutritivo y soporta de forma adecuada su crecimiento (Figura 2-12 B). Por otro lado, el cultivo original de JEG-3 en F-12, presenta una pérdida fuerte de viabilidad cuando se trabaja

Capítulo 2 91

con dosis bajas o ausencia de suero, situación puede ser debida en parte a la calidad nutricional menor de F-12, sumado a una inercia proliferativa de JEG-3 que es estimulada por los componentes del medio F-12 (Figura 2-7). Por otro lado, el tipo de medio de cultivo y la dosis de suero empleadas influyó en el efecto del TGF-β sobre la proliferación y actividad metabólica de células HTR-8/SVneo y JEG-3, ya sea ensayadas directamente en este (Figura 2-11) o adaptadas a la mezcla de medios RPMI 1640 / F-12, y evaluadas con diferentes dosis de suero y medios (Figura 2-13). Esto sugiere que el microambiente, visto como las condiciones de cultivo celular, podría estar afectando a los determinantes contextuales del TGF-β, ya sean transductores de señal, reguladores transcripcionales o el estatus epigenético (Massague, 2012).

La adaptación celular al mismo medio homogeniza el cultivo y altera la respuesta celular al TGF-β

Una alteración celular y posible homogenización tras la adaptación de los cultivos a la mezcla de medios RPMI 1640/F-12 es sugerida a partir de los resultados de MTS (Figura 2-12), alteración que se comprueba cuando las células adaptadas son cultivadas nuevamente en sus medios originales sin obtener los resultados de las células sin adaptar (Figura 2-7). Por otra parte, la aparente homogenización de la respuesta de los dos modelos tras la adaptación a la mezcla RPMI/F12 es evidente cuando se evalúan en F-12, tanto a nivel de su proliferación con diferentes dosis de suero (Figura 2-12), como al estudiar el efecto del TGF-β en estas (Figura 2-13 B), observando resultados similares a nivel de proliferación para las dos líneas. En su medio original, HTR-8/SVneo mostró una reducción significativa de su crecimiento en respuesta al TGF-β, y las células JEG-3 permanecieron insensibles a este tratamiento (Figura 2-11), tal como se ha reportado previamente (Lala et al., 2002). Sin embargo, cuando las células fueron adaptadas a la mezcla de medios RPMI 1640/F-12 y evaluadas en este, en F-12 o en RPMI, la respuesta al TGF-β cambió de forma inusual: HTR-8/SVneo evaluada en RPMI pasó de responder a los efectos anti-proliferativos del TGF-β a presentar un aumento en su proliferación en respuesta a este factor, tanto en el medio RPMI como en el medio F-12 (Figura 2-13 B y C); por su parte, JEG-3 empezó a responder al TGF-β de la misma forma que HTR-8/SVneo, incrementando su proliferación en respuesta a este tras ser adaptado al medio RPMI/F-12 y evaluado nuevamente en F-12 (Figura 2-13 B). Se ha visto que los cultivos en medios diferentes y las adaptaciones celulares pueden alterar la fisiología celular y el fenotipo. Roth et. al. encontró que la composición del medio y la fuente celular pueden afectar significativamente las características funcionales y la expresión de ARNm de células Caco‐2, respecto a la función de transportadores de fármacos y enzimas metabolizantes de drogas (DMEs) (Roth et al., 2012). El mismo grupo había visto que las células HT-29 exhiben características de crecimiento en monocapa y perfiles genotípicos/fenotípicos que difieren entre si cuando son cultivadas en diferentes medios (Lindley et al., 2012). Anaka et. al. analizaron las propiedades de crecimiento, perfil transcripcional y genotipo de células de melanoma creciendo de novo en medio de células stem (SCM) en comparación con líneas celulares con suero, encontrando un perfil de expresión génica diferente y sugiriendo que el fenotipo observado es específico al medio empleado (Anaka et al., 2012).

92 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Como se había mencionado anteriormente, algunos resultados reportados en la literatura en relación a la regulación del trofoblasto por el TGF-β eran contradictorios, especialmente en los modelos malignos, presentando un panorama complejo. En este estudio se revela el papel contexto-dependiente del TGF-β y la influencia de las condiciones de cultivo sobre los efectos de este factor en células derivadas de trofoblasto HTR-8/SVneo y JEG-3. Se ha establecido el efecto anti-proliferativo y anti-invasivo del TGF-β sobre cultivos primarios de trofoblasto y sobre la línea HTR-8/SVneo, y la insensibilidad de líneas de coriocarcinoma como JEG-3 a este factor (Lala et al., 2002). Graham et. al observaron que el TGF-β inhibe la invasión y proliferación del trofoblasto normal de primer trimestre, pero no de las células de coriocarcinoma JAR ni JEG-3; (Graham et al., 1994). No obstante, en los últimos años Yanzhen et al. encontraron que el TGF-β promueve la proliferación e invasión de células HTR-8/SVneo despues del pase 90 (Yanzhen et al., 2014). Paralelamente, estudios recientes muestran que JEG-3 responde al TGF-β aunque con diversos efectos: algunos estudios muestran una capacidad de respuesta limitada a los efectos anti-proliferativos del TGF-β, con una aparente disminución de los niveles de ARNm de la ciclina E a las 72 horas (Richard et al., 2008) y una disminución modesta en el número celular y la viabilidad medida como reducción de Azul de Alamar (Al-Nasiry et al., 2007); así como una reducción en la invasión de células de JEG-3 en respuesta al TGF-β (S. Karmakar & Das, 2004). Sin embargo, en otros trabajos con células JEG-3 cultivadas en RPMI 1640 se observó que el TGF-β aumentó la viabilidad y actividad metabólica de estas (Tan et al., 2014), promovió su capacidad invasiva mediante la disminución de la expresión de TβR I, TβR II y Smad4 y el aumento de MMP-9 y TIMP-1 (Y. Li et al., 2012), e indujo la fosforilación y translocación nuclear de Smad3 (Q. Xu et al., 2013). Considerando los presentes resultados, esta discrepancia puede ser debida a condiciones específicas de crecimiento, adicional al fenotipo celular inherente en cada caso. Así pues, las condiciones de cultivo estarían afectando la capacidad de respuesta celular, adicional al pase y las características propias de cada línea en cada laboratorio alrededor del mundo. Más aún, estos resultados ponen en evidencia un rol que presenta el TGF-β en algunos modelos de cáncer: el de factor pro-metastático (Pardali & Moustakas, 2007); así, la dicotomía del papel regulador del TGF-β observada en estos modelos puede ser explicada si se considera su papel dual previamente descrito. A pesar de ser descrito como supresor tumoral en el trofoblasto, en la hipótesis de este estudio consideramos un posible efecto de tipo pro-metastático aún no descrito en coriocarcinoma. Durante la caracterización celular y la homogenización de las condiciones de cultivo observamos una estimulación de la proliferación por parte del TGF-β, no solo sobre las células JEG-3, sino sorprendentemente también sobre las células HTR-8/SVneo. Así pues, el efecto del TGF-β en el crecimiento celular depende de las condiciones de cultivo y dan cuenta de una plasticidad celular, especialmente en el caso de la línea HTR-8/SVneo que pasó de responder a los efectos anti-proliferativos del TGF-β, a exhibir un aumento en su proliferación en respuesta a este. A la luz de estos resultados, las células HTR-8/SVneo parecen presentar importantes habilidades adaptativas y un comportamiento plástico, comparado con JEG-3. Estas células son dependientes del estímulo de crecimiento que otorga el medio F-12, mostrando una mayor tasa de proliferación que en RPMI, presentandose de cierta forma como un modelo sensible a su entorno y a las señales externas. En contraste, JEG-3 exhibe un impulso o inercia proliferativa – en consonancia con su origen neoplásico –

Capítulo 2 93

logrando altas tasas de crecimiento en un medio con RPMI en comparación con F-12, si se considera la calidad nutricional del RPMI frente al F-12. Adicionalmente, la línea HTR-8/SVneo presenta una mezcla de características, una parte debidas a su origen como citotrofoblasto extravelloso invasivo, y otra al proceso de inmortalización, lo que la convierte en un modelo biológico de alta plasticidad y camaleónico, en comparación con la línea JEG-3. Esto se evidencia en su capacidad de responder al TGF-β, observándose efectos tanto positivos como negativos sobre la proliferación, así como efectos complejos a nivel de adherencia y migración. Por otro lado, JEG-3 presenta en general una respuesta más homogénea al TGF-β, aunque sin dejar de lado el comportamiento similar a HTR-8/SVneo que presentó en las situaciones en las que se igualaron sus condiciones de cultivo. Así, al cultivar las células en su medio original (HTR-8/SVneo en RPMI 1640 y JEG-3 en F12 o DMEM), se mantienen las características originales con las que se han descrito y caracterizado y se presenta el comportamiento típico con resultados esperados según literatura (Graham et al., 1994; Lala et al., 1998; Lala et al., 2002), como lo es el efecto anti proliferativo del TGF-β sobre las células HTR-8/SVneo, y la refractancia de las células JEG-3, comprobado en el presente trabajo (Figura 2-9 y Figura 2-11). Sin embargo, un cambio en las condiciones de cultivo alteraría esta respuesta. Ya que el fenotipo reportado en la literatura es el que buscamos en el abordaje de este trabajo, las células HTR-8/SVneo y JEG-3 se cultivaron en medio RPMI 1640 y DMEM, respectivamente, esperando el fenotipo descrito para HTR-8/SVneo como una línea inmortalizada de trofoblasto con capacidades propias de una stem cells pero sensible a los reguladores del trofoblasto, y JEG-3 como una línea derivada de coriocarcinoma y modelo maligno que no responde a la regulación negativa ejercida por el TGF-β. Teniendo en cuenta que las condiciones de cultivo influencian la respuesta celular a TGF-β, tanto en células JEG-3 como en HTR-8/SVneo, y ya que para el análisis proteómico comparativo de HTR-8/SVneo y JEG-3 nos interesan las características fenotípicas reportadas en la literatura, las líneas celulares fueron cultivados en sus respectivos medios tradicionales. Sin embargo, para la obtención de las vesículas extracelulares (EV) del capítulo 3, las células HTR-8/SVneo y JEG-3 fueron cultivadas en el medio RPMI / F12 1:1, sin adaptación previa, para tener las mismas condiciones nutricionales y de estimulación, con el fin de disminuir la influencia del medio y normalizar la producción de micro-vesículas y exosomas. Al ser estas EVs “no vitales”, su producción depende del estado nutricional celular, el cual puede variar según el medio de cultivo; en adición, algunas células malignas y el trofoblasto son capaces de realizar autofagia (Gong & Kim, 2014; Ouyang et al., 2012), lo cual podría alterar el tráfico vesicular intracelular y la secreción de EVs ante diferencias nutricionales debidas al medio de cultivo de cada línea. Finalmente, y como conclusiones se observó que el TGF-β afecta la proliferación y viabilidad celular de los dos modelos de trofoblasto, de forma dependiente del suero y el medio de cultivo empleado. Gracias a los resultados obtenidos se evidenció la notable influencia del microambiente, representado en el medio de cultivo y el suero, sobre la fisiología y el fenotipo de las células, al registrarse cambios en la respuesta al tratamiento con TGF-β.

94 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

2.2 Análisis proteómico en condiciones fisiológicas En esta sección se estudiaron y compararon los perfiles de expresión de proteínas en condiciones fisiológicas y en respuesta al TGF-β, en la línea celular de trofoblasto HTR8/SVneo, y en la línea celular de coriocarcinoma JEG-3, a través de la perspectiva de un análisis proteómico diferencial de tipo exploratorio. Los objetivos específicos de esta sección son identificar proteínas expresadas de forma diferencial por células HTR-8/SVneo y JEG-3, en condiciones fisiológicas o basales, y en respuesta al TGF-β, mediante abordajes proteómicos comparativos; y relacionar las proteínas identificadas con procesos biológicos y vías alteradas en células malignas mediante análisis bioinformático. A partir de las proteínas identificadas se espera establecer una posible relación de estas con la progresión al fenotipo maligno.

Análisis preliminar de proteomas

En trabajos previos se evaluó mediante electroforesis bidimensional el perfil proteómico de células HTR-8/SVneo y JEG-3, cultivadas en sus respectivos medios con SFB al 10%, obteniendo geles de 7 cm y pI de 3 a 10 y 4 a 7. Inicialmente se observó una alta complejidad y una gran diferencia entre las imágenes E2D de los dos proteomas resueltos con pH de 3 a 10, lo que dificultaba el análisis de imagenes. Se realizó un zoom del pI de 4 a 7, zona donde se encuentra concentrada el mayor porcentaje de spots de proteínas, obteniendo una mayor resolución y evidenciando posibles sptos de proteína comunes a las dos líneas, que servirían como punto de anclaje o landmark durante el apareamiento de las imágenes, así como un gran número de zonas con spots diferentes (S. S. Novoa-Herrán, 2010). En base a los resultados anteriores, se decidió emplear un zoom de 4 a 7 para el análisis proteómico de las dos líneas celulares mediante electroforesis bidimensional en geles de gran formato. Los proteomas totales fueron analizados por MS-MALDI ToF/ToF, en el laboratorio de la Dra. Patricia Cuervo en el Instituto Oswaldo Cruz – FIOCURZ en Rio de Janeiro, Brasil, con la colaboración de Monica Losada. El sub-proteoma de citoplasma de JEG-3 fue analizado por LC-ESI-MS/MS en el Servicio Proteómico de la Universidad FUNDAO en Rio de Janeiro, Brasil. Adicionalmente, un número menor de spots fue analizado por MS-MALDI ToF/ToF en el Karolinska Biomics Center (KBC) en Estocolmo, Suecia con la colaboración del Dr. Leopold Ilag, para corroborar la identificación como especie de validación cruzada de la identificación en otro laboratorio.

2.2.1 Análisis de proteomas totales Para la comparación de proteomas totales en condiciones fisiológicas, se procedió como se indica en los Anexos A 1; en resumen, 2,5 millones de células HTR-8/SVneo o JEG-3 fueron sembradas por triplicado en platos de 100 mm, cultivadas hasta aproximadamente el 70% de confluencia, sincronizadas por depleción de suero por 13 horas, y cultivadas nuevamente con SFB al 10% durante 24 horas. El extracto proteico fue obtenido y trabajado como se indica en Anexos A 4 y 5 y separado en geles E2D de 18 cm al 12%, con pI de 4 a 7. Se trabajó con medio suplementado con SFB al 10% como modelo de condición fisiológica, tal como se explicó en el Capítulo 1.

Capítulo 2 95

Como se observa en la Figura 2-14, a pesar de que el perfil proteómico obtenido para cada línea celular en geles de 18 cm y con el zoom de 4 a 7 tiene una buena resolución, las imágenes presentan una alta diferencia entre sí, con pocos spots comunes que puedan servir como landmark/benchmark o punto de comparación durante el apareamiento de las imágenes. Se hizo un alineamiento preliminar de las imágenes, y los spots aparentemente comunes o equivalentes, candidatos a landmark entre los geles, fueron picados para confirmar el apareamiento de las imagenes, así como spots claramente diferentes. 10 spots de proteína de cada grupo fueron picados e identificados por espectrometría de masas en tándem (MALDI-MS/MS ToF/ToF) y búsqueda en base de datos (Anexos A 7d). Solo uno de estos spots es equivalente entre los dos geles, correspondiendo a la proteína de choque térmico HSPB1; mientras que los otros spots son diferentes entre los dos geles (ver Figura 2-14 círculo azul y líneas rojas, respectivamente). Figura 2-14 Comparación proteomas totales de células HTR-8/SVneo y JEG-3

Proteomas totales de células HTR-8/SVneo y JEG-3, cultivadas con SFB al 10% por 24 horas. Imágenes representativas de triplicados de geles E2D de 18 cm al 12%, rango de pI 4-7, tinción Azul de Coomassie coloidal. Líneas negras: spots picados sin identificación positiva, línea roja: spots identificados de forma diferencial, circulo y línea azul: spots candidato a landmark. Debido a las grandes diferencias que se observan entre los geles y a la complejidad del alineamiento de las imágenes, no se continuó con este enfoque, prefiriendo un análisis sobre sub-proteomas en geles E2D que puedan presentar menor complejidad y análisis comparativo del proteoma total mediante marcación diferencial. A pesar de lo anterior, las proteínas identificadas diferencialmente entre los dos geles dan una idea inicial de las diferencias a nivel proteómico de la línea HTR-8/SVneo y JEG-3 (ver Tabla 2-2). Para la línea HTR8/SVneo se identificaron 6 proteínas únicas: Mucina-19 (MUC19), Estatmina (STMN1), Nucleósido-difosfato quinasa A (NME1), proteína Rab-3B relacionada a Ras y la cadena alfa-3 de tropomiosina (TPM3), las cuales son principalmente proteínas estructurales, scaffolds de señalización y chaperonas, requeridas en el ensamblaje y localización de complejos de macromoléculas, resaltando las proteínas de unión relacionadas con regulación biológica. Para la línea JEG-3 se identificaron 11 proteínas únicas, como las enzimas peptidil glicina monooxigenasa-alfa-

96 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

amidación (PAM) y las peroxiredoxinas 2 y 6 (PRDX2 y 6), Anexina A5, la proteína scaffold 14-3-3 sub unidad alfa y zeta (YWAB y YWHAZ), la proteína asociada a centrosoma CEP250, la proteína Rab32 relacionada a Ras, la proteína AHNAK2, y la proteína con repeticiones ankirina y armadillo (ANKAR). En este grupo de proteínas resaltan PAM y las PRDX por su actividad oxidoreductasa, y las proteínas adaptadoras 14-3-3 que se unen a transductores de señal y regulan diferentes vías de señalización. Tabla 2-2 Proteínas identificadas en proteomas totales de HTR-8/SVneo y JEG-3.

Gene Name Score Pep

(Uniq) RMS (ppm) Pathways Keywords & GO B.P. M.F.

Landmark HSPB1 54 2(2) 19 MAPK and VEGF signaling pathway Stress response; Chaperone

HTR-8/SVneo STMN1 74 1(1) 31 MAPK signaling pathway Signal transducer activity, Tubulin binding,

cell communication

NME1 105 3(2) 41 Purine and Pyrimidine metabolism Differentiation, Endocytosis, Nucleotide metabolism; Kinase, Transferase

MUC19 30 1(1) 29 Metabolism of proteins extracellular matrix glycoprotein, cell adhesion molecule

RAB3B 42 1(1) 9 Tight junction Protein transport TPM3 87 3(3) 8 Pathways in cancer, Thyroid cancer Actin binding, motor activity

JEG-3 PRDX6 62 1(1) 27 Phenylalanine metabolism Lipid degradation; Antioxidant Hydrolase,

Oxidoreductase, Peroxidase PRDX2 263 3(3) 14 Antioxidant, Oxidoreductase, Peroxidase RAB32 29 1(1) 2 Small GTPase mediated signal transduction GTP binding

ANXA5 385 6(5) 23 Gonadotropin releasing hormone receptor pathway

Calcium-dependent phospholipid binding, Signal transduction

YWHAB 71 1(1) 33

Cell cycle, Neurotrophin signaling pathway, Apoptosis, Gene Expression, Membrane Trafficking, Metabolism of RNA, Signal Transduction, FGF and EGF receptor

signaling pathway

Histone deacetylase binding, Phosphoprotein binding

YWHAZ 243 3(3) 30

Cell cycle, Neurotrophin signaling pathway, Apoptosis, Gene Expression, Membrane

Trafficking, Metabolism of RNA, FGF, EGF receptor and PI3 kinase signaling pathway

Protein kinase binding, Transcription factor binding

CEP250 40 1(1) 60 Cell Cycle Protein C-terminus binding, Protein kinase binding

PAM 57 1(1) 47 Vasopressin synthesis Lyase, Monooxygenase, Oxidoreductase

ANKAR 56 1(1) 5 storage protein; signaling molecule; cell

adhesion molecule ALB 54 2(1) 30 transfer/carrier protein Identificación por búsqueda con MASCOT en la base de datos de Swiss Prot (2014_02), score dado por MASCOT, RMS error (ppm). Términos obtenidos con DAVID 6.7 y complementados con Nexprot; Keywords y términos GO para procesos biológicos y función molecular, más relevante. Estas se analizaron mediante herramientas bioinformáticas y. se construyeron redes de interacción física y funcional con VisANT 4.11, STRING 9.1 y Pathway Commons. Para la red de las proteínas identificadas en HTR-8/SVneo, aunque la conexión inicial de las proteínas encontradas es nula, cuando la red es enriquecida en nodos background, HSPB1, NME1, TPM3 y RAB3B se relacionan entre si a través de ubiquitina C (UBC) y STMN1 por HSPA8 y UBC. Para el caso de JEG-3, gracias al análisis de redes se evidencia una conexión inicial entre las proteínas 14-3-3 con las PRDX a través de la vía de las MAPKs; esta red inicial es integrada además por HSPB1 y CEP250; la red de VisANT está compuesta por YWHAB, PRDX2 y 6, HSPB1 y CEP250 con YWHAZ como nodo; en la red de STRING, ANXA5 y ALB están conectadas entre sí, y YWHAB, HSPB1 y PRDX2 están conectadas a YWHAZ; y en la red de Pathways Commons, PRDX6 y

Capítulo 2 97

YWHA están relacionadas a traves de MAPK1 (Supl. Capítulo 2, A - Red) (S. S. Novoa-Herran et al., 2014).

2.2.2 Análisis de sub-proteomas de citoplasma En el análisis anterior se evidencia la alta heterogeneidad entre los proteomas de la línea de trofoblasto HTR8/SVneo y la línea de coriocarcinoma JEG-3, siendo necesario un fraccionamiento sub-celular, con el fin de reducir la complejidad de la muestra y analizar mejor las imágenes, centrándonos en un grupo de proteínas de interes. Con el fin de identificar proteínas de citoplasma dentro de las que pueden encontrarse transductores de señal y otros reguladores tipo oncogen presentes en el citoplasma celular, se obtuvo un extracto proteico enriquecido en proteínas de citoplasma, llamado sub-proteoma de citoplasma, mediante fraccionamiento diferencial con detergentes, implementación que se describe en (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b)(Anexos A 4a). Estas proteínas citoplasmáticas pueden correlacionar con las características intrínsecas de cada línea estudiada, y brindar una base para la capacidad de respuesta y transducción de señal a estímulos como el SFB o el TGF-β. Para esto, las células fueron trabajadas en condiciones basales: cultivos al 90% de confluencia fueron sincronización por deprivación de suero por 12 horas, momento en el cual el sub-proteoma fue obtenido, de tal forma que se obviaban los efectos proliferativos y estimulantes debidos al cultivo con SFB, y se mantenía el nivel basal de expresión de proteínas. El sub-proteoma de citoplasma fue analizado por E2D empleando geles SDS-PAGE al 10% de 18 cm y tiras IPG con rango de pI de 4 a 7 para lograr una mayor resolución en la zona media y con esto un mejor análisis de imágenes; se sembraron 500 μg de proteína que fueron teñidos con Azul de Coomassie Coloidal y las imágenes fueron analizadas con Melanie 7.0 (Anexos A 5a). Figura 2-15 Comparación sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3

Análisis de imágenes de los geles obtenidos para HTR-8/SVneo (izquierda) y JEG-3 (derecha), realizado con Melanie 7.0. Spots englobados en rojo: únicos, en verde: compartidos; los dos spots utilizados como landmarks en el análisis se indican con números. Como se observa en Figura 2-15 se obtuvieron perfiles proteómicos comparables con un gran número de spots de proteína comunes o apareados y un porcentaje menor de spots de proteína únicos a un modelo. Así, se obtuvieron 74 spots de proteína coincidentes entre los dos grupos de geles, 43 spots de proteína presentes únicamente en JEG-3 y 61 spots únicos para HTR-8/SVneo.

98 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

En un análisis inicial se exploró la coincidencia entre estos spots, así como se verificó la robustez y capacidad de identificación de los análisis MS/MS realizando la identificación en diferentes laboratorios de proteómica, seleccionando spots tanto comunes como únicos. Así, se tienen tres grupos de spots analizados: spots de proteína comunes a los dos modelos, pero con diferencias en su nivel de proteína (C#); spots únicos a HTR-8/SVneo (H#) y spots únicos a JEG-3 (J#). Spots de cada grupo fueron analizados por MALDI MS/MS ToF/ToF en el Instituto Fiocruz de Rio de Janerio, Brasil, y en el Karolinska Biomics Center (KBC) en Estocolmo, Suecia (Anexos A 7). Las proteínas identificadas se presentan en la Tabla 2-3 mientras que la ubicación de los spots en los geles se indica en la Figura 2-16; estos resultados muestran la correspondencia de las identificaciones obtenidas entre diferentes laboratorios, y validan el apareamiento de las imágenes, al obtener la misma proteína en spots apareados de geles diferentes, tanto para el landmark (C2) como para otros spots apareados (C4 y C11). Luego se realizó un análisis más extenso seleccionando 20 spots de proteína únicos para JEG-3 y 28 spots compartidos con HTR-8/SVneo pero con nivel de proteína diferencial (ver Figura 2-16), esperando encontrar proteínas que puedan corresponder a oncogenes. Estas fueron analizadas por nHPLC-ESI-MS/MS Q/ToF en la Universidad Federal de Rio de Janeiro FUNDAO en Brasil (Anexos A 7e), identificando en total 54 proteínas en los spots únicos de JEG-3. A pesar de que muchos hits de proteínas pasaban el umbral de detección, se seleccionaron solo aquellos hits superiores, con score diferencial del resto del rank, rechazando los hits con score más bajo a pesar de ser reportados como verdaderos positivos por Mascot (ver criterios de selección en anexos B 4b). En total se identificaron 38 proteínas en spots comunes, 41 proteínas en spots únicos a JEG-3 y 20 proteínas en spots únicos a HTR-8/SVneo, resultados que se muestran en en la Tabla 2-3 (los puntajes de las identificaciones están disponibles en Supl. Capítulo 2 Analisis Cito E2D MS). Mediante bioinformática se analizaron todas las proteínas identificadas, tanto las compartidas como las únicas respecto a las vías y anotaciones GO para procesos biológicos, así como su ubicación sub-celular. Todas las proteínas identificadas presentaban anotaciones a parte intracelular y un 35,7% anotaciones a sitio mutagénico, lo que sugiere que la estrategia implementada puede ser adecuada para el estudio de proteínas de citoplasma relacionadas con oncogénesis. Se realizó un análisis de redes usando Cytoscape v. 3.4.0 (Shannon et al., 2003) y la aplicacion ClueGO v. 2.2.6 (Bindea et al., 2009) para analizar las anotaciones funcionales y términos biológicos (ver Anexos A 8). Así, los roles biológicos de las proteínas del interactoma fueron identificados con ClueGO; como se observa en la Figura 2-17, las proteínas identificadas están vinculadas a procesos de expresión génica, regulación de la estabilidad de ARNm, factores de traducción, ciclo celular y apoptosis, respuesta a estrés y detoxificación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y procesos metabólicos de biomoléculas, principalmente.

Capítulo 2 99

Figura 2-16 Sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3

Geles E2D representativos del sub-proteoma de citoplasma obtenido de HTR-8/SVneo y JEG-3. SDS-PAGE al 10%, pI 4-7, tinción Coomassie Coloidal. Los spots analizados se señalan con líneas, en rojo spots únicos a HTR-8/SVneo o a JEG-3, y en azul spots apareados entre JEG-3 y HTR-8/SVneo. Se identifican unicamente los spots identificados por MS/MS.

100 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Tabla 2-3 Spots de proteína identificados en los sub-proteomas de citoplasma # Spot Protein name Gene name Lab.

J1 Prostaglandin E synthase 3 PTGES3 K J1 Barrier-to-autointegration factor BANF1 F J1 Thioredoxin TXN F J2 Programmed cell death protein 6 PDCD6 F K J3 Triosephosphate isomerase TPI1 F J4 Peroxiredoxin-6 PRDX6 F K J4 Proteasome subunit alpha type-6 PSMA6 F J4 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase HPRT1 F J4 Proteasome subunit beta type-3 PSMB3 F J5 Heat shock protein beta-1 HSPB1 F J6 Protein DJ-1 PARK7 F J7 Proteasome subunit beta type-4 PSMB4 F J8 Glutathione S-transferase P GSTP1 F J9 Peroxiredoxin-2 PRDX2 F J9 UMP-CMP kinase CMPK1 F

J10 Inosine triphosphate pyrophosphatase ITPA F J11 Inorganic pyrophosphatase PPA1 F J11 L-lactate dehydrogenase B chain LDHB F J12 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5 UCHL5 F J12 Spermidine synthase SRM F J12 Serine/arginine-rich splicing factor 1 SRSF1 F J13 Ran-specific GTPase-activating protein RANBP1 F J14 Tumor protein D54 TPD52L2 F J14 Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A ANP32A F J14 EF-hand domain-containing protein D2 EFHD2 F J14 Chloride intracellular channel protein 1 CLIC1 F J15 Proliferating cell nuclear antigen PCNA F J16 Annexin A1 ANXA1 F J16 Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 AKR7A2 F J16 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH F J17 Rab GDP dissociation inhibitor beta GDI2 F J17 Annexin A7 ANXA7 F J17 Elongation factor 1-gamma EEF1G F J17 Elongation factor 1-alpha 1 EEF1A1 F J17 S-adenosylmethionine synthase isoform type-2 MAT2A F J18 Adenosylhomocysteinase AHCY F J19 Leukocyte elastase inhibitor SERPINB1 F J19 Synaptic vesicle membrane protein VAT-1 homolog VAT1 F J20 Actin, cytoplasmic 1 ACTB F J20 NSFL1 cofactor p47 NSFL1C F J20 Beta-actin-like protein 2 ACTBL2 F H2 S-phase kinase-associated protein 1 SKP1 Z K H2 Protein Jade-2 PHF15 K H3 Glutathione S-transferase P GSTP1 Z K H3 Peroxiredoxin-1 PRDX1 K H5 Heat shock protein beta-1 HSPB1 K H8 Thioredoxin TXN Z H8 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit K EIF3K Z H9 Peroxiredoxin-6 PRDX6 Z H9 Heat shock protein beta-1 HSPB1 Z

H10 Eukaryotic translation initiation factor 6 EIF6 Z H10 60S acidic ribosomal protein P2 RPLP2 Z H11 Rho GTPase-activating protein 10 ARHGAP10 Z H13 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH Z H13 Annexin A2 ANXA2 Z H14 Nucleophosmin NPM1 Z H16 Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8 Z

Capítulo 2 101

# Spot Protein name Gene name Lab. H18 Pyruvate kinase PKM Z H19 Nucleosome assembly protein 1-like 1 NAP1L1 Z H19 Calreticulin CALR Z H19 NUAK family SNF1-like kinase 1 NUAK1 Z C1 SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein SH3BGRL Z K C1 Coactosin-like protein COTL1 Z K C1 Solute carrier family 25 member 45 SLC25A45 Z

C2H Galectin-1 LGALS1 Z K C2 Galectin-1 LGALS1 Z C2 Thioredoxin domain-containing protein 17 TXNDC17 Z C3 Thioredoxin TXN Z C4 Stathmin STMN1 Z

C4H Stathmin STMN1 Z K C4H Septin-5 SEP5 K C5 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 EIF5A Z K C6 60S acidic ribosomal protein P2 RPLP2 Z C6 Myosin light polypeptide 6 MYL6 Z C7 Heat shock protein beta-1 HSPB1 Z C7 Peroxiredoxin-6 PRDX6 Z C9 Peroxiredoxin-2 PRDX2 Z C9 Pannexin-2 PANX2 Z

C10 Proteasome subunit beta type-6 PSMB6 Z C10 Neurexin-2 NRXN2 Z C11 Prostaglandin E synthase 3 PTGES3 Z

C11H Prostaglandin E synthase 3 PTGES3 Z C12 Peroxiredoxin-2 PRDX2 Z C12 NUAK family SNF1-like kinase 1 NUAK1 Z C14 Chloride intracellular channel protein 1 CLIC1 Z C14 EF-hand domain-containing protein D2 EFHD2 Z C14 Coatomer subunit epsilon COPE Z C15 14-3-3 protein beta/alpha YWHAB Z C16 14-3-3 protein zeta/delta YWHAZ Z C17 14-3-3 protein theta YWHAQ Z C17 14-3-3 protein epsilon YWHAE Z C18 14-3-3 protein epsilon YWHAE Z C19 Elongation factor 1-beta EEF1B2 Z C19 14-3-3 protein epsilon YWHAE Z C20 14-3-3 protein epsilon YWHAE Z C20 Elongation factor 1-beta EEF1B2 Z C21 Tropomyosin alpha-3 chain TPM3 Z C21 Putative tropomyosin alpha-3 chain-like protein Z C22 Tropomyosin alpha-4 chain TPM4 Z C22 14-3-3 protein epsilon YWHAE Z C23 Proliferating cell nuclear antigen PCNA Z C23 Clathrin heavy chain linker domain-containing protein 1 CLHC1 Z C24 Nucleophosmin NPM1 Z C25 Hepatoma-derived growth factor HDGF Z C25 Nucleophosmin NPM1 Z C26 L-lactate dehydrogenase B chain LDHB Z C27 T-complex protein 1 subunit theta CCT8 Z C27 T-box transcription factor TBX4 TBX4 Z C28 Nucleoside diphosphate kinase A NME1 Z

Proteínas identificadas por MS/MS en diferentes laboratorios: Lab. F: ESI FUNDAO, K: MALDI Karolinska, Z: MALDI Fiocruz. J#: spots únicos para JEG-3, H#: spots únicos para HTR-8/SVneo, C#: spots compartidos picados en el gel de JEG-3, CH#: spots picados en el gel de HTR-8/SVneo. Sombreado en gris: spots correspondientes entre diferentes geles, incluyendo el landmark usado.

102 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 2-17 Análisis de redes de anotaciones para las proteínas identificadas en sub-proteoma de citoplasma de células HTR-8/SVneo y JEG-3.

Análisis ClueGO Red de términos agrupados funcionalmente. Los nodos representan los términos GO y de vías (GO BP, KEGG, Reactome, WikiPathways), el tamaño representa la significancia del enriquecimiento (valor p), colores iguales definen la pertenencia al grupo y el término líder es el más significativo. Nivel de término GO de 2 a 5. Anotaciones para todas las evidencias excepto las inferidas electrónicamente (IEA), p-value < 0,05, min. 3 genes de pertenencia al clúster y 60% específico. Puntaje de conectividad Kappa 0,55. En cuanto a las proteínas identificadas en los spots únicos a JEG-3, estas se encuentran altamente interconectadas como se puede observar en la red de interacciones funcionales STRING de la Figura 2-18. De las proteínas identificadas en JEG-3, el 79,2% eran proteínas de unión, el 50,9% presentó anotaciones para actividad catalítica, un 13,2% para actividad oxidoreductasa y un 5,7% para actividad peroxiredoxina; se identificaron proteínas involucradas al metabolismo de β-alanina, cisteína y metionina, proteosoma y glicólisis/gluconeogénesis y expresadas en respuesta a la vía de señalización ER. En cuanto a la funcionalidad, el 22,6% clasificó para sitio de mutagénesis, como la proteína de muerte celular programada 6 (PDCD6), el canal intracelular de cloro 1 (CLIC1), la peroxiredoxina 2 y 6 (PRDX2 y PRDX6), el pseudogen 2G4 asociado a proliferación (PA2G4) y la tioredoxina (THIO) entre otros (Resultados socializados en ACBB2 2012 y Seprot 2013) Es necesario mencionar que dentro de los grupos de spots únicos (H y J) se identificaron proteínas coincidentes para HTR-8/SVneo y JEG-3 como GAPDH, GSTP1, HSPB1, PRDX6 y TXN. Esto se da ya que los spots no representan una proteína única al gel sino una isoforma, modificación postraduccional o estado particular y específico de la proteína

Capítulo 2 103

para cada modelo en el que se ha hallado. Para el caso de TXN o tioredoxina, esta fue identificada en los spots cercanos C3 y J1, los cuales concuerdan con su peso molecular de 11,5 kDa, siendo la intensidad de C3 similar entre JEG-3 y HTR-8/SVneo, mientras que el spot H8 (en el que también fue identificada TXN) es muy tenue y tiene un peso molecular mayor a 20 kDa pudiendo corresponder a una forma más pesada. De igual forma, la peroxiredoxina PRDX6 fue detectada en los spots cercanos J4 y C7 con masa cercana a la teórica, aunque con un pI aproximado a 5 siendo 6 el pI teórico, mientras que el spot H9, más cercano al pI 6, presenta una masa molecular menor, así como una intensidad baja, pudiendo ser producto de la degradación o procesamiento. Es por esto que se considera que estas enzimas antioxidantes se expresan predominantemente en JEG-3 (ver Figura 2-16 y Tabla 2-3). No obstante, lo anterior implica posibles cambios estructurales de las proteínas identificadas en los spots únicos a cada modelo que deben ser evaluados con otras técnicas de análisis como cuantificación por SILAC. Figura 2-18 Red de interacción de proteínas identificadas en spots únicos a JEG-3.

Relaciones funcionales obtenidas con STRING 9.0. Los nodos corresponden a datos experimentales, sin adición de nodos background.

104 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

2.2.3 Análisis cuantitativo de proteomas totales mediante SILAC

Se realizó un análisis proteómico comparativo del proteoma total de las líneas HTR-8/SVneo y JEG-3, empleando como estrategia la marcación con isótopos estables en cultivo celular - SILAC (Ong et al., 2002), la cual permite mezclar el extracto proteico de la línea de trofoblasto con el de la línea de coriocarcinoma y realizar una separación y análisis conjunto, obteniendo la razón de cambio en el nivel proteico de cada péptido en base a sus masas isotópicas registradas en cada espectro MS/MS obtenido. Esto permite un tratamiento en conjunto de las muestras, evitando las variaciones debidas al procesamiento, de tal forma que es posible cuantificar cada proteína analizada de forma relativa a una de las líneas celulares, determinando el cambio en el nivel de expresión de las proteínas de coriocarcinoma con respecto a trofoblasto. Figura 2-19 Esquema experimental para el análisis proteómico comparativo SILAC

A. Diagrama del flujo de trabajo experimental realizado para el análisis proteómico comparativo de

células HTR-8/SVneo y JEG-3 por SILAC. La muestra corresponde a un pool de tres platos de cultivo. B. Perfil proteico obtenido por SDS-PAGE al 12% de la mezcla SILAC analizada, y

posición de las bandas en las que se fraccionó. dSFB: suero fetal bovino dializado. MW: marcador de peso molecular, WC: extracto celular total, mezcla 1:1.

Para esto, las células HTR-8/SVneo fuero marcadas en cultivo con Lisina 6C13 pesada (denominada K6) en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB dializado, mientras que las células JEG-3 se trabajaron con Lisina 6C12 normal en medio DMEM suplementado con 10% de SFB dializado, tal como se específica en Anexos A 6. Al cabo del tiempo de marcación, las células fueron sembradas por triplicado en platos de cultivo de 100 mm y sincronizadas mediante depleción de suero por 13 horas, siguiendo las

Capítulo 2 105

condiciones previamente descritas para sub-proteoma de citoplasma, de tal forma que se obtuvo un proteoma basal. Los extractos totales fueron obtenidos y cuantificados como se describe en Anexos A 4. Una fracción del proteoma de HTR-8/SVneo pesado fue separado por SDS-PAGE y la banda más intensa fue analizada por MS/MS en un instrumento ESI-TRAP de Bruker, para verificar la incorporación del isótopo pesado en la Lisina 6C13 ó K(6); en Anexos D4 se presenta la confirmación de esta marcación. Cada extracto proteico fue cuantificado por triplicado mediante kit Pierce 660 (THERMO), y mezclado en proporciones equitativas para obtener una mezcla HTR-8/SVneo / JEG-3 pesada: liviana 1:1, que fue procesada y separada por SDS-PAGE, seccionada en 15 bandas y analizada como 1D – nLC ESI MS/MS en un instrumento MaXis Impact ESI Q-ToF de Bruker, tal como se especifica en Anexos A 7f (ver Figura 2-19). Las proteínas fueron identificadas a partir de un compilado de todas las bandas; la cuantificación y el análisis estadístico se realizaron con los programas DataAnalysis y WarpLC como se describe en Anexos A 7f, normalizando los datos respecto a la mediana de los péptidos cuantificados y obteniendo el coeficiente de variación (C.V.) para cada proteína. Figura 2-20 Distribución de frecuencia de la cuantificación de péptidos (datos crudos).

Número de péptidos cuantificados respecto al log H/L. H: pesado o heavy, L: liviano o light.

Se obtuvieron de 200 a 300 proteínas por banda, para un total de 1.200 proteínas. En la Figura 2-20 se presenta el histograma de la distribución de frecuencia de los péptidos previa a la corrección de los datos, donde se puede observar que la razón de cambio de estos tiene una distribución normal y se encuentra centrada en -0,160 (log H/L) muy cerca de 0,0, demostrando la distribución equitativa de los péptidos cuantificados; adicionalmente se observa un pequeño porcentaje de datos con una razón de cambio extrema, lo cual se espera teniendo en cuenta que las dos líneas corresponden a modelos celulares diferentes pero representativas de trofoblasto. La normalización se realizó en base a péptidos, previa a la cuantificación final, corrigiendo la desviación del centro del histograma a cero. Para las cuantificaciones con un coeficiente de variación CV superior a 20% se realizó una verificación manual de cada una como se describe en Anexos B 5.

106 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Finalmente se lograron cuantificar 356 proteínas con un C.V menor al 30%, tal como se tabula en la Tabla 2-4. Aunque varias de las proteínas cuantificadas fueron invariantes (32%, 114 proteínas con F.C L/H 1,3 a -1,3), JEG-3 presentó un número considerable de proteínas sobre-expresadas en relación a HTR-8/SVneo (55% para JEG-3 vs 13% para HTR-8/SVneo; F.C L/H >1,3 vs < -1,3). Es necesario resaltar que 237 proteínas (35% del total cuantificado) fueron cuantificadas solo con un péptido, por lo que fueron rechazadas, dentro de las cuales se encontraron muchas proteínas cuantificadas como sobre-expresadas en HTR-8/SVneo. Tabla 2-4 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas mediante análisis SILAC

Análisis SILAC Total Total proteínas identificadas 1.200 Total proteínas cuantificadas 680 Cuantificadas Pep.≥ 2 443

Proteínas significativas C.V. <40% 381 C.V. < 30% 356

Proteínas reguladas significativamente

Sobre-expresadas en HTR-8/SVneo F.C.< -1,3 46 F.C.< -1,5 27 F.C.< -2,0 12

Sobre-expresadas en JEG-3

F.C.> 1,3 196 F.C.> 1,5 174 F.C.> 2,0 61 F.C.> 7,0 5

Proteínas diferencialmente reguladas en células HTR-8/SVneo y JEG-3, estadísticamente significativas (C.V. <30%, fold change >1,5 y <-1,5). *razon de cambio en el nivel de la proteína expresada como Fold Change L/H o JEG-3/HTR-8/SVneo. En la Tabla 2-5 y Tabla 2-6 se presentan las primeras 30 proteínas con mayor variación en su nivel de expresión, cuantificadas mediante SILAC; el listado completo de las proteínas cuantificadas está disponible en el material suplementario (Capítulo 2 Análisis SILAC). En la Figura 2-21 se presenta un ejemplo de la cuantificación para la proteína 4 del canal intracelular de cloruros (CLIC4) y el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), cada una encontrada sobre-expresada en células HTR-8/SVneo y JEG-3, respectivamente. Para ilustrar los diferentes escenarios de cuantificación, se presentan péptidos con carga +3 y +2 y marcadas con 1K6 o 2K6, mostrando el cromatograma con las señales de los precursores livianos y pesados o Extracted Ion Chromatogram y los clústers isotópicos de cada precursor en los espectros MS, indicando la carga del péptido y las diferencias m/z entre cada uno.

Capítulo 2 107

Figura 2-21 Ejemplo de la cuantificación de las proteínas CLIC4 y PCNA.

Señales del EIC (Extracted Ion Chromatogram) del péptido de la muestra marcada con lisina liviana 12C(6) (línea fucsia) y del péptido con la forma pesada 13C(6) K6 (línea azul). Espectros mostrando los clústers isotópicos y las relaciones m/z de un péptido marcado con la forma ligera y la pesada de lisina. A. Péptido 841,38 asignado a la proteína CLIC4, aumentada en HTR-8/SVneo (F.C. L/H -4.85); B. Péptido 647,32 asignado a la proteína PCNA, aumentado en JEG-3 (F.C L/H 1.71). Señales con rombo rojo indican los precursores que fueron fragmentados.

Tabla 2-5 Proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3, cuantificadas mediante SILAC Gene name Protein Score #

Pep SC [%]

F.C. J3/H8

# Pep

CV [%] GO molecular function / Pathway

CLIC4 Chloride intracellular channel protein 4 363 8 37 -4,35 2 24,6 chloride channel activity; voltage-gated ion channel activity / angiogenesis; apoptotic process

ACTN2 Alpha-actinin-2 252 5 5 -3,85 2 0,0 cytoskeletal protein, FATZ, integrin, titin, PI-4,5-bisphosphate binding; protein dimerization activity; Ras GEF activity; thyroid hormone receptor coactivator activity

ACTN4 Alpha-actinin-4 479 11 11 -3,85 2 0,0 ligand-dependent nuclear receptor transcription coactivator activity; actin, chromatin DNA,

integrin, ion channel, nucleoside, poly(A) RNA, retinoic acid receptor, nuclear hormone receptor and RNA poly II regulatory region sequence-specific DNA binding

CYR61 Protein CYR61 139 4 12 -3,85 2 2,8 extracellular matrix, heparin and integrin binding

ACTN1 Alpha-actinin-1 741 14 14 -3,85 5 16,4 actin filament, double-stranded RNA, integrin, ion channel and vinculin binding; ligand-dependent nuclear receptor transcription coactivator activity; protein homodimerization activity

VIM Vimentin 3080 61 66 -3,70 21 15,6 double-stranded RNA, glycoprotein, keratin filament, protein C-terminus and scaffold protein binding; structural constituent of cytoskeleton

RTN4 Reticulon-4 209 4 3 -2,50 2 13,1 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; poly(A) RNA binding LGALS1 Galectin-1 136 3 28 -2,22 2 3,6 glycoprotein, lactose and poly(A) RNA binding; signal transducer activity

TCEA1 Transcription elongation factor A protein 1 464 10 30 -2,17 2 2,7 DNA and zinc ion binding

HMGA1 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y 240 6 23 -2,08 3 7,7

5'-deoxyribose-5-phosphate and DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase activity; ligand-dependent nuclear receptor transcription coactivator activity; TF activity; AT DNA,

chromatin, enzyme, peroxisome proliferator activated receptor, retinoic acid receptor, retinoid X receptor, sequence-specific DNA and TF binding; transcriptional activator activity, RNA poly

II distal enhancer sequence-specific binding

KPNB1 Importin subunit beta-1 840 19 23 -2,04 6 23,3 enzyme, zinc ion, nuclear localization sequence, poly(A) RNA and protein domain specific binding; protein transporter activity

RPS5 40S ribosomal protein S5 347 8 18 -2,00 2 19,5 mRNA, poly(A) RNA and rRNA binding; structural constituent of ribosome

HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha 1919 37 38 -1,89 10 23,0 ATPase activity; NOS regulator activity; protein tyrosine kinase activity; ATP, CTP, GTP, UTP,

dATP, glycoprotein, GTPase, histone deacetylase, MHC class II protein complex, TPR domain, mRNA, nucleotide and poly(A) RNA binding; protein homodimerization activity;

ACTG1 Actin, cytoplasmic 2 2229 43 67 -1,85 28 10,5 structural constituent of cytoskeleton; ATP and ubiquitin protein ligase binding SERPINH1 Serpin H1 236 5 16 -1,85 3 22,0 collagen and poly(A) RNA binding; serine-type endopeptidase inhibitor activity

TMPO Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha 390 9 16 -1,75 3 25,1 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; DNA and lamin binding

STMN1 Stathmin 826 18 66 -1,72 12 15,3 signal transducer activity; tubulin binding

PTGES3 Prostaglandin E synthase 3 142 3 19 -1,72 2 17,9 prostaglandin-E synthase activity; telomerase activity; unfolded protein binding / Lipid metabolism; prostaglandin biosynthesis.

HN1L Hematological and neurological expressed 1-like protein 379 8 51 -1,67 3 25,0

RUVBL1 RuvB-like 1 353 8 14 -1,64 4 12,4 ATPase activity; ATP-dependent 5'-3' DNA helicase activity; cadherin binding involved in cell-cell adhesion

RAP1B Ras-related protein Rap-1b 165 4 15 -1,61 2 10,2 GTPase activity; GDP, GTP and protein complex binding

CLIC1 Chloride intracellular channel protein 1 557 14 60 -1,59 8 12,3 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; chloride channel activity; voltage-gated ion

channel activity

110 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

ITGB1 Integrin beta-1 406 10 14 -1,59 5 15,8 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; collagen binding involved in cell-matrix

adhesion; coreceptor activity; actin, cell adhesion molecule, fibronectin, metal ion, protease, and protein complex binding; protein heterodimerization activity; virus receptor activity

DNAJC9 DnaJ homolog subfamily C member 9 164 4 15 -1,56 2 3,3 heat shock protein binding

PSME2 Proteasome activator complex subunit 2 455 10 25 -1,52 2 16,4 endopeptidase activator activity

PFN1 Profilin-1 697 16 64 -1,52 10 17,5 adenyl-NEF activity; cadherin binding involved in cell-cell adhesion; actin, actin monomer, PI-4,5-bisphosphate, poly(A) RNA, and proline-rich region binding

ANXA2 Annexin A2 1112 25 53 -1,52 14 22,1 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; phospholipase A2 inhibitor activity; calcium-

dependent phospholipid and protein binding, Ca2+, PI-4,5-bisphosphate, poly(A) RNA, protease and S100 protein binding

ILF2 Interleukin enhancer-binding factor 2 272 6 18 -1,47 2 1,7 ATP, DNA, dsRNA and poly(A) RNA binding; transferase activity

ANXA1 Annexin A1 699 14 42 -1,47 6 5,1

annealing helicase activity; cadherin binding involved in cell-cell adhesion; calcium-dependent phospholipid binding; calcium-dependent protein binding; calcium ion binding; double-stranded DNA-dependent ATPase activity; helicase activity; phospholipase A2 inhibitor

activity; phospholipid binding; protein binding, bridging; receptor binding; single-stranded DNA binding; single-stranded RNA binding; structural molecule activity

TMED10 Transmembrane emp24 domain-containing protein 10 236 6 15 -1,47 3 26,6 syntaxin binding

Tabla 2-6 Proteínas sobre-expresadas en JEG-3 con respecto a HTR-8/SVneo, cuantificadas mediante SILAC

Gene name Protein Score #

Pep SC [%]

F.C. J3/H8

# Pep

CV [%] GO molecular function / Pathway

PPP1R2 Protein phosphatase inhibitor 2 243 4 17 16,91 2 15,4 protein serine/threonine phosphatase inhibitor activity /glycogen metabolic process; regulation of signal transduction

CD55 Complement decay-accelerating factor 200 6 18 13,20 3 20,4

lipid binding; virus receptor activity; CD4+, α-β T cell cytokine production; complement activation, classical pathway; ER to Golgi vesicle-mediated transport; innate immune

response

S100A4 Protein S100-A4 136 4 29 8,11 2 2,9 Ca2+, poly(A) RNA and RAGE receptor binding; EMT; positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling

HMGN5 High mobility group nucleosome-binding domain-containing protein

5 493 9 27 8,03 7 21,8

chromatin, DNA and poly(A) RNA binding; chromatin modification; glutathione metabolic process; negative regulation of apoptotic process and cell cycle arrest; positive

regulation of cell proliferation and gene expression

HBA1 Hemoglobin subunit alpha 115 3 22 7,33 2 0,5 heme, Fe2+, and O2 binding; oxygen transporter activity; cellular oxidant detoxification; hydrogen peroxide catabolic process

BASP1 Brain acid soluble protein 1 1785 31 89 5,82 28 14,0 transcription corepressor activity; protein domain specific and transcription regulatory region DNA binding / gonad development; MET; negative regulation of transcription, DNA-templated

IL18 Interleukin-18 147 4 20 4,97 2 18,4 cytokine activity

HNRNPC Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 663 14 38 4,94 7 9,5

identical protein, mRNA 3'-UTR, N6-methyladenosine-containing RNA, nucleosomal DNA, nucleotide, poly(A) RNA, poly(U) RNA, RNA poly II core promoter proximal region sequence-

specific DNA, RNA poly II distal enhancer sequence-specific DNA and telomerase RNA binding

Capítulo 2 111

EIF2A Eukaryotic translation initiation factor 2A 115 3 9 4,79 2 1,2 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; translation initiation factor activity; ribosome

and tRNA binding VN1R5 Vomeronasal type-1 receptor 5 75 2 2 4,69 2 21,3 pheromone receptor activity

MRRF Ribosome-recycling factor, mitochondrial 433 9 26 4,52 4 7,3 ribosomal large subunit binding

SNCA Alpha-synuclein 319 7 51 4,50 6 23,6 cysteine-type endopeptidase inhibitor activity involved in apoptotic process; oxidoreductase activity; dynein, α-tubulin, Ca2+, Cu2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, histone, Hsp70 protein, kinesin, phospholipid, phosphoprotein, tau protein, and transcription regulatory region DNA binding

SFN 14-3-3 protein sigma 548 11 32 4,42 4 15,3 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; protein kinase C inhibitor activity

GSTM3 Glutathione S-transferase Mu 3 231 6 24 4,19 4 11,4 enzyme and glutathione binding; glutathione transferase activity; protein homodimerization activity

HSD17B10 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 642 11 40 3,96 3 4,1 3-hydroxy-2-methylbutyryl-CoA, 3-hydroxyacyl-CoA and cholate 7-alpha-dehydrogenase

activity; testosterone dehydrogenase [NAD(P)] activity; poly(A) RNA binding

PRPS1 Ribose-phosphate pyrophosphokinase 1 226 4 15 3,64 2 5,1

ADP, AMP, ATP, carbohydrate, GDP and Mg2+ binding; kinase activity; protein homodimerization activity; ribose phosphate diphosphokinase activity / 5-phospho-α-D-ribose

1-diphosphate biosynthesis PPA1 Inorganic pyrophosphatase 146 3 16 3,61 2 17,8 inorganic diphosphatase activity; magnesium ion binding

SLC25A5 ADP/ATP translocase 2 244 6 21 3,61 3 29,3 adenine transmembrane transporter activity; structural constituent of ribosome; poly(A) RNA and ubiquitin protein ligase binding

MDH2 Malate dehydrogenase, mitochondrial 659 13 47 3,52 6 6,2 L-malate dehydrogenase (NADP+) activity; poly(A) RNA binding

RCN1 Reticulocalbin-1 162 4 14 3,52 2 15,2 calcium ion binding

CHTOP Chromatin target of PRMT1 protein 294 5 15 3,43 3 14,4 methyl-CpG and poly(A) RNA binding

TXN Thioredoxin 201 5 41 3,32 3 24,1 oxidoreductase activity, acting on a sulfur group of donors, disulfide as acceptor; protein and peptide disulfide oxidoreductase activity; poly(A) RNA binding;

TPD52 Tumor protein D52 335 8 34 3,31 6 13,0 Ca2+ binding; protein heterodimerization and homodimerization activity

HIBADH 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase, mitochondrial 121 3 14 3,26 2 12,6 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase activity; NAD binding; phosphogluconate

dehydrogenase (decarboxylating) activity / L-valine degradation

S100A11 Protein S100-A11 253 4 33 3,11 2 3,9 cadherin binding involved in cell-cell adhesion; calcium-dependent protein binding; protein homodimerization activity; Ca2+ and S100 protein binding

PPIA Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A 568 12 49 3,11 6 25,8 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity; peptide, poly(A) RNA, unfolded protein and virion

binding HIST1H4A Histone H4 239 5 46 3,08 2 20,6 DNA, histone, poly(A) RNA and protein domain specific binding

RBMX RNA-binding motif protein, X chromosome 462 11 25 2,88 4 27,3 chromatin, core promoter, identical protein, mRNA, nucleotide and poly(A) RNA binding;

BTF3 Transcription factor BTF3 196 3 17 2,85 2 10,4 poly(A) RNA binding PRDX2 Peroxiredoxin-2 380 9 27 2,80 3 7,5 antioxidant and thioredoxin peroxidase activity

30 primeras proteínas cuantificadas como sobre-expresadas. Score, puntaje de identificación en Mascot; # Pep., número de péptidos asignados por proteína; SC [%], porcentaje de cubrimiento de secuencia; F.C. J3/H8, razón de cambio JEG-3/HTR-8/SVneo; # Pep: número de péptidos usados en la cuantificación de la proteína; CV [%], coeficiente de variación. Términos GO relevantes para Función Molecular y Pathway ó Procesos Biológicos, obtenidos de Uniprot release 2016_10.

Se realizó un análisis de las anotaciones funcionales con DAVID 6.8. Para el caso de las proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo (F.C. >1,3) se analizaron 45 proteínas (excepto vimentina que no fue mapeada); las principales vías a las que pertenecen son regulación del citoesqueleto de actina (10 proteínas, 22,2%, p-value= 1,7x10-8) y migración transendotelial de leucocitos (9 proteínas, 20,0%, p-value = 3,3x10-9), seguido de adhesión focal y uniones estrechas. La clasificación funcional de proteínas generó 5 clústers (rigor de clasificación más bajo) dejando 21 proteínas sin clasificar, resaltando vías metabólicas en el primero (2 proteínas, p-value= 0,177), la vía de señalización del VEGFR (2 proteínas, p-value= 0,00856) y la vía de señalización Rap1 (2 proteínas, p-value= 0,05986) para el segundo, términos relacionados con adhesión y migración en el tercero, transporte de cloruro (2 proteínas, p-value= 0,021247) y procesos metabólicos de glutatión (2 proteínas, p-value= 0,029633) en el cuarto, y procesos basados en microtúbulos (2 proteínas, p-value= 0,00428), uniones Gap (2 proteínas, p-value= 0,02531) y fagosoma (2 proteínas, p-value= 0,0438) en el quinto. En la Tabla 2-7 se presenta el cuarto clúster con sus términos asociados. (Ver Supl. Capítulo 2, SILAC). Tabla 2-7 Clúster de interes producto de la clasificación funcional de proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo

Gene Group 4 E.S.: 3.84 UNIPROT_ID Gene Name ILF2_HUMAN interleukin enhancer binding factor 2(ILF2)

CLIC1_HUMAN chloride intracellular channel 1(CLIC1) LRC59_HUMAN leucine rich repeat containing 59(LRRC59) TCEA1_HUMAN transcription elongation factor A1(TCEA1) HN1L_HUMAN hematological and neurological expressed 1 like(HN1L) CLIC4_HUMAN chloride intracellular channel 4(CLIC4) RTN4_HUMAN reticulon 4(RTN4)

HMGA1_HUMAN high mobility group AT-hook 1(HMGA1) LAP2A_HUMAN thymopoietin(TMPO) DNJC9_HUMAN DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member C9 TMEDA_HUMAN transmembrane p24 trafficking protein 10(TMED10)

Count P Value Term 3 0,0087 cell-cell adhesion 2 0,0212 chloride transport 2 0,0296 glutathione metabolic process 2 0,0488 chloride transmembrane transport 2 0,0580 regulation of ion transmembrane transport 2 0,2450 positive regulation of transcription, DNA-templated 2 0,2454 transcription from RNA polymerase II promoter 2 0,2665 apoptotic process

Clasificación funcional de 45 proteínas analizadas con DAVID 6.8., rigor de la clasificación más bajo. Se muestran los términos más significativos para procesos biológicos GO y vías BBID, Biocarta y KEGG; y número de proteínas en el clúster vinculadas al término y significancia del término (p-value). E.S., Enrichment Score. Para JEG-3 se analizaron 190 proteínas, excepto el receptor VN1R5, las proteínas asociadas a vesículas VAPA y VAPB, y las proteínas de canales iónicos VDAC1, 2 y 3 que no fueron mapeadas. El análisis funcional de las proteínas identificadas reveló procesos y vías relacionadas con la regulación transcripcional, traduccional y pos-traduccional, incluyendo componentes del spliceosoma y ribosoma y proteínas ribosomales mitocondriales. Resaltan las vías metabólicas de la glicólisis / gluconeogénesis (9 proteínas, p-value= 1,24x10-5), el metabolismo del piruvato (4 proteínas, p-value=0,02776) y el metabolismo de propanoato (3 proteínas, p-value= 0,0772) con proteínas como la lactato dehidrogenasa A y B (LDHA y LDHB), la malato dehidrogenasa 2 (MDH2), la dihidrolipoamida dehidrogenasa (DLD); adicionalmente esta

Capítulo 2 113

la vía de las pentosas fosfato (4 proteínas, p-value= 0,01169), la fosforilación oxidativa (6 proteínas, p-value= 0,068) con proteínas como ATP sintasas transportadoras de H+ del complejo F0 y F1 y pirofosfatasa (PPA1) y el metabolismo de valina, leucina e isoleucina (5 proteínas, p-value= 0,00726). Ademas del metabolismo está el ciclo celular con las proteínas adaptadoras 14-3-3 y antígeno nuclear de células proliferativas PCNA (6 proteínas, p-value= 0,05368), y el procesamiento de proteínas en el retículo endoplasmático (9 proteínas, p-value= 0,00662). La clasificación funcional de las proteínas cuantificadas generó 18 clústers (rigor de clasificación bajo), dejando 76 proteínas sin clasificar. En la Tabla 2-8 se presentan los clústers de interés, resaltando el clúster 6 (azul) con las proteínas adaptadoras 14-3-3, el 8 (lila) con enzimas antioxidantes, el 10 (naranja) con vías asociadas a glicólisis, y el 18 (rojo) con vías asociadas al metabolismo del lactato y el piruvato y procesos de oxido-reducción. (Ver Supl. Capítulo 2, SILAC). Tabla 2-8 Clústers de interes producto de la clasificación funcional de proteínas sobre-expresadas en JEG-3

Gene Group 4 E.S.: 17.76 UNIPROT_ID Gene Name BTF3_HUMAN basic transcription factor 3(BTF3)

NACA_HUMAN nascent polypeptide-associated complex alpha subunit(NACA)

H2B1H_HUMAN histone cluster 1 H2B family member h(HIST1H2BH)

H4_HUMAN histone cluster 4 H4(HIST4H4)

HMGN5_HUMAN high mobility group nucleosome binding domain 5(HMGN5)

CHTOP_HUMAN chromatin target of PRMT1(CHTOP)

PYM1_HUMAN PYM homolog 1, exon junction complex associated factor(PYM1)

LRRF1_HUMAN LRR binding FLII interacting protein 1(LRRFIP1)

AN32B_HUMAN acidic nuclear phosphoprotein 32 family member B(ANP32B)

AN32E_HUMAN acidic nuclear phosphoprotein 32 family member E(ANP32E)

PAIRB_HUMAN SERPINE1 mRNA binding protein 1(SERBP1)

SARNP_HUMAN SAP domain containing ribonucleoprotein(SARNP)

AN32A_HUMAN acidic nuclear phosphoprotein 32 family member A(ANP32A)

CN166_HUMAN chromosome 14 open reading frame 166(C14orf166)

SET_HUMAN SET nuclear proto-oncogene(SET)

PTRF_HUMAN polymerase I and transcript release factor(PTRF) Count P Value Term

6 4,67E-08 nucleosome assembly 3 4,08E-05 histone exchange 8 1,59E-04 regulation of transcription, DNA-templated 3 2,39E-04 nucleocytoplasmic transport 3 0,0037 regulation of mRNA stability 2 0,0068 h_setPathway:Granzyme A mediated Apoptosis Pathway 3 0,0152 regulation of apoptotic process 3 0,0340 viral process 2 0,0438 mRNA 3'-end processing 2 0,0481 RNA export from nucleus 2 0,0557 termination of RNA polymerase II transcription 2 0,0585 hsa05203:Viral carcinogenesis 2 0,0633 negative regulation of catalytic activity 2 0,0858 mRNA export from nucleus 5 0,0874 transcription, DNA-templated 2 0,0939 covalent chromatin modification 2 0,2174 cell-cell adhesion 2 0,3024 protein transport 2 0,3269 regulation of transcription from RNA polymerase II promoter 2 0,3535 positive regulation of cell proliferation 2 0,3642 negative regulation of transcription, DNA-templated

114 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Gene Group 6 E.S.: 13.07 UNIPROT_ID Gene Name

PAIRB_HUMAN SERPINE1 mRNA binding protein 1(SERBP1) 1433Z_HUMAN tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta(YWHAZ) 1433F_HUMAN tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein eta(YWHAH) 1433G_HUMAN tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gamma(YWHAG) 1433B_HUMAN tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta(YWHAB) 1433S_HUMAN stratifin(SFN)

Count PValue Term 5 4,14E-11 positive regulation of protein insertion into mitochondrial membrane involved in

apoptotic signaling pathway 5 5,43E-11 membrane organization 5 9,88E-08 hsa04110:Cell cycle 4 1,51E-05 hsa04114:Oocyte meiosis 4 4,03E-05 hsa04390:Hippo signaling pathway 4 4,11E-05 cell-cell adhesion 3 5,24E-05 protein targeting 4 8,02E-05 hsa05169:Epstein-Barr virus infection 4 1,01E-04 hsa05203:Viral carcinogenesis 3 3,68E-04 regulation of mRNA stability 4 4,75E-04 hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway 2 0,0056 negative regulation of protein serine/threonine kinase activity 2 0,0062 regulation of neuron differentiation 2 0,0092 regulation of synaptic plasticity 2 0,0294 negative regulation of protein kinase activity 2 0,0813 hsa05161:Hepatitis B 2 0,3016 signal transduction

Gene Group 8 E.S.: 10.84 UNIPROT_ID Gene Name PRDX6_HUMAN peroxiredoxin 6(PRDX6)

PRDX2_HUMAN peroxiredoxin 2(PRDX2)

PRDX1_HUMAN peroxiredoxin 1(PRDX1)

THIO_HUMAN thioredoxin(TXN) Count PValue Term

4 1,16E-08 response to reactive oxygen species 4 8,92E-08 cell redox homeostasis 3 4,04E-06 hydrogen peroxide catabolic process 4 4,32E-05 oxidation-reduction process 2 0,00214 removal of superoxide radicals 2 0,04783 cell-cell adhesion 2 0,06417 cell proliferation

Gene Group 10 E.S.: 10.60 UNIPROT_ID Gene Name ENOA_HUMAN enolase 1(ENO1)

ALDOA_HUMAN aldolase, fructose-bisphosphate A(ALDOA)

PGK1_HUMAN phosphoglycerate kinase 1(PGK1)

G6PI_HUMAN glucose-6-phosphate isomerase(GPI)

ENOB_HUMAN enolase 3(ENO3) Count PValue Term

5 4,52E-12 canonical glycolysis 5 1,40E-11 glycolytic process 5 4,10E-11 gluconeogenesis 5 8,08E-09 hsa00010:Glycolysis / Gluconeogenesis 5 6,78E-08 hsa01200:Carbon metabolism 5 8,62E-07 hsa01130:Biosynthesis of antibiotics 4 4,68E-06 hsa01230:Biosynthesis of amino acids

Capítulo 2 115

3 1,02E-04 h_glycolysisPathway:Glycolysis Pathway 5 9,93E-04 hsa01100:Metabolic pathways 2 0,0167 hsa00030:Pentose phosphate pathway 2 0,0438 hsa03018:RNA degradation 2 0,0441 in utero embryonic development 2 0,0555 hsa04066:HIF-1 signaling pathway 2 0,0633 cell-cell adhesion

Gene Group 13 E.S.: 8.87 UNIPROT_ID Gene Name LDHB_HUMAN lactate dehydrogenase B(LDHB)

HCD2_HUMAN hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 10(HSD17B10)

3HIDH_HUMAN 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase(HIBADH)

LDHA_HUMAN lactate dehydrogenase A(LDHA)

MDHM_HUMAN malate dehydrogenase 2(MDH2) Count PValue Term

4 1,11E-04 hsa01130:Biosynthesis of antibiotics 4 1,68E-04 oxidation-reduction process 3 1,75E-04 hsa00270:Cysteine and methionine metabolism 3 1,95E-04 hsa00620:Pyruvate metabolism 3 6,47E-04 carbohydrate metabolic process 5 9,93E-04 hsa01100:Metabolic pathways 2 0,0012 lactate metabolic process 2 0,0026 NAD metabolic process 2 0,0031 carboxylic acid metabolic process 2 0,0045 branched-chain amino acid catabolic process 2 0,0050 pyruvate metabolic process 2 0,0062 h_SARSpathway:SARS Coronavirus Protease 2 0,0161 hsa00640:Propanoate metabolism 2 0,0269 hsa00280:Valine, leucine and isoleucine degradation 2 0,0382 hsa00010:Glycolysis / Gluconeogenesis 2 0,0561 hsa04922:Glucagon signaling pathway

Gene Group 18 E.S.: 4.55 UNIPROT_ID Gene Name RAB5B_HUMAN RAB5B, member RAS oncogene family(RAB5B)

ARF4_HUMAN ADP ribosylation factor 4(ARF4)

ARF3_HUMAN ADP ribosylation factor 3(ARF3)

RAB10_HUMAN RAB10, member RAS oncogene family(RAB10) Count PValue Term

4 3,19E-06 small GTPase mediated signal transduction 3 0,0014 hsa04144:Endocytosis 3 0,0017 protein transport 2 0,0082 antigen processing and presentation 2 0,0141 retrograde vesicle-mediated transport, Golgi to ER

Clasificación funcional de 190 proteínas analizadas con DAVID 6.8., rigor de la clasificación bajo. Se muestran los términos más significativos para procesos biológicos GO y vías BBID, Biocarta y KEGG; y número de proteínas en el clúster vinculadas al término y significancia del término (p-value). E.S., Enrichment Score. Se realizó un análisis de redes comparativo usando Cytoscape v. 3.4.0 (Shannon et al., 2003) con las aplicaciones ClueGO v. 2.2.6 (Bindea et al., 2009) para analizar anotaciones funcionales, comparar clústers de proteínas y visualizar sus diferencias funcionales, y CluePedia v. 1.2.6 (Bindea et al., 2013) para la construcción de redes de proteínas o interactómica (ver Anexos A 8). El análisis de redes comparativo por ClueGO se realizó teniendo en cuenta las proteínas con una razón de cambio superior a 1,3 y a 1,5, en este resaltan anotaciones en el clúster de JEG-3 relacionadas con carcinogénesis

116 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

viral, ciclo de vida viral, degradación de Cdh1 multiubiquitinado, docking del complejo TAP:EJC con el NPC y metabolismo de nucleótidos; se obtuvieron términos enriquecidos en el clúster de HTR-8/SVneo como homeostasis iónica y relacionados con la unión de ligandos NODAL a su receptor (ver Supl. Capítulo 2 SILAC Redes ClueGO). Figura 2-22 Sub red de acciones para 14-3-3 y Hsp

Análisis de redes realizado con CluePedia, mostrando las acciones reportadas por STRING (2016_10) y los primeros vecinos de las proteínas 14-3-3, HspB1, Hsp90AA1 y Hspa8. Los nodos correspondientes a los clúster HTR-8/SVneo, JEG-3 e invariantes (-1.3 a 1-3) se muestran en verde, rojo y azul, respectivamente. Las conexiones representan activación (verde), unión (azul), catálisis (morado), expresión (amarillo), inhibición (rojo), ptmod (rosado) y reacción (negro) Mediante la aplicación CluePedia de Cytoscape se generó una red de interacción física proteína-proteína en base a las acciones reportadas en STRING, para las proteínas sobre-expresadas en HTR-8/SVneo, en JEG-3 e invariantes (ver Anexo A 8). Esta

Capítulo 2 117

muestra la alta interconexión de las proteínas identificadas, presentando como nodos a las proteínas ribosomales y los factores de elongación (CluePedia all, nodos rojos: JEG-3, nodos verdes: HTR-8; nodos azules: invariantes). Se realizó una nueva red eliminando a las proteínas ribosomales y los factores de elongación, obteniendo nuevamente una red altamente interconectada, aunque con algunas proteínas aisladas (CluePedia all- R y EF); en esta resaltan como nodos hubs las proteínas de choque térmico Hsp, proteínas del complejo T, llama la atención una sub red relacionada por activación (edge verde) en la cual las proteínas 14-3-3 (SFN y YWH) (clúster JEG-3, nodos rojos) y Hsp (HSPB1 y HSP90AA1) (clúster HTR-8/SVneo,nodos verdes) son los nodos principales y conectan principalmente con las proteínas RaN, RhoA, Rad, ElaVL1, NME1, Bag2, PPR2R1A, entre otras del clúster invariante (nodos azules). Esto puede representar una activación diferencial de proteínas mediada por Hsp y 14-3-3 sobre proteínas relacionadas con señalización y que se expresan de forma invariante entre las dos. La discución de estas implicaciones se realiza en el Capítulo 4 (Supl. Capítulo 2 CluePedia, Redes de Interactómica para las proteínas cuantificadas, sobre-expresadas en HTR-8/SVneo y en JEG-3). Figura 2-23 Red enriquecida en base a las proteínas 14-3-3 sobre-expresadas en JEG-3

Análisis de redes realizado con CluePedia, mostrando las acciones reportadas por STRING (2016_10) para la red enriquecida a partir de las proteínas 14-3-3 sobre-expresadasen JEG-3. Los nodos input se presentan en círculos grises, los nodos enriquecidos en rombos amarillos. Las conexiones representan activación (verde), unión (azul), catálisis (morado), expresión (amarillo), inhibición (rojo), ptmod (rosado) y reacción (negro)

118 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Se construyó una sub-red a partir de las proteínas 14-3-3 y las Hsp HspB1, Hsp90AA1 y Hspa8, con los primeros vecinos de estas, la cual se presenta en la Figura 2-22 y donde se puede observar el carácter de nodo hub de estas proteínas. En la Figura 2-23 se presenta la red de acciones reportadas en STRING únicamente para las proteínas 14-3-3 sobre-expresadas en JEG-3, enriquecida en los 15 primeros nodos según todas las acciones reportadas para cada proteína evaluada; en esta se puede observa la interacción y activación de proteínas importantes en vías de señalización relacionadas con carcinogénesis como IGF-IR, HRas, Akt, mTor, Jak2, FOXO1 y 3 y CSNK1A1, entre otras. El posible significado de las proteínas identificadas, las redes hipotéticas construidas y los procesos en los que participan potencialmente serán discutidos más adelante, en relación con los otros análisis proteómicos desarrollados.

2.2.4 Análisis proteómico del efecto del TGF-β Los análisis proteómicos para evaluar el efecto del TGF-β se trabajaron a las 24 horas, en medio suplementado con SFB al 0,5%, dosis y momento en el cual las dos líneas eran viables y activas metabólicamente, evitando los efectos debidos a la proliferación y el cambio en el número de células, como se evaluó mediante ensayo de MTS (Figura 2-9). El tratamiento con TGF-β se trabaja en estas condiciones pese a que el ensayo de MTS no permitió evaluar un efecto estadísticamente significativo del TGF-β sobre HTR-8/SVneo cultivada a este tiempo, a diferencia de tiempos más largos como 72 horas (Figura 2-11). Para trabajar a tiempos largos se requiere suplementación con SFB al 10%; sin embargo, esto generaría señales adicionales dadas por un alto contenido de SFB, las cuales se quieren evitar para evaluar el efecto del TGF-β sobre el proteoma celular. Mientras que el ensayo de MTT requiere de cambios pronunciados que superen el error asociado a la técnica, los cambios a nivel de proteoma se pueden evaluar en tiempos más cortos, de tal forma que a las 24 horas es posible que se den las modificaciones en el proteoma que se están buscando, tal como sucedió en el capítulo 1. Siguiendo el esquema experimental DIGE del capítulo 1 (sección 1.1.2) se realizó un análisis proteómico comparativo de la respuesta de las líneas HTR-8/SVneo y JEG-3 al TGF-β a las 24 horas (ver Anexos A 5b, las imágenes de los geles están disponibles en Supl. Capítulo 2 DIGE). Los spots seleccionados fueron identificados por MALDI MS/MS en el Instituto VHIO como se describe en Anexos A 7f. Los geles DIGE y las tablas con los resultados de la identificación se encuentran disponibles en el material suplementario (Supl. Capítulo 2). A pesar de no observar un efecto del TGF-β sobre la viabilidad celular de JEG-3 a las 24 horas y en esas condiciones de cultivo (ver Figura 2-9 y Figura 2-11), las células respondieron al tratamiento con cambios en su proteoma, el cual presentó un porcentaje de spots de proteína diferencialmente expresados (38%) mayor que el presentado en HTR-8/SVneo (25,4%), gran parte de los cuales (71%) eran sobre-expresados en JEG-3 (ver Figura 2-24). Esto podría indicar procesos transcripcionales regulados por el TGF-β en células JEG-3 y que aún no han sido descritos. Un total de 123 proteínas fueron identificadas entre JEG-3 y HTR-8/SVneo, correspondiendo a 70 proteínas únicas tanto en HTR-8/SVneo como en JEG-3 En la Tabla 2-9, Tabla 2-12 y Tabla 2-10 se muestran las proteínas identificadas con razón de cambio mayor a 1,5 o menor a -1,5 y p-value menor a 0,05.

Tabla 2-9 Proteínas diferencialmente expresadas por TGF-β en células HTR-8/SVneo Fold Identificación Gene

Name Th. MW

Obs. MW Score Pep %SQ Molecular Function Biological procces Pathways

-1,9 Nitrilase homolog 1 NIT1 35,9 68 60,9 8 33,3 Nitrilase activity Nitrogen compound metabolic process

-1,9 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 PKM2 57,9 68 158 16 34,7

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and poly(A)

RNA binding Phosphorylation, Programmed cell death Glycolysis / Gluconeogenesis,

Purine metabolism

-1,7 Annexin A2 ANXA2 38,6 36 103 11 36,6

Phospholipase A2 inhibitor activity, Calcium-dependent

phospholipid and protein binding, Contributes to receptor

activator activity

Positive regulation of receptor activity, Angiogenesis, Membrane budding, Membrane raft assembly, Negative

regulation of receptor internalization, Positive regulation of vesicle fusion

Dissolution of Fibrin Clot, Orphan transporters

-1,5 Annexin A1 ANXA1 38,9 37 71 10 32 Annealing helicase activity, Calcium ion binding

1,5 Stress-70 protein, mitochondrial HSPA9 73,92 34 56 10 27 ATP, unfolded protein and poly(A)

RNA binding Negative regulation of apoptotic process RNA degradation, mitochondrial protein import

1,5 Heat shock 70 kDa protein 1A/1B HSPA1A 70 69/68 92,8 19 37 ATP, Poly(A) RNA and protein

binding

Cellular response to heat, Cellular response to oxidative stress, mRNA catabolic process, Protein refolding,

Negative regulation of cell death and cell growth

Endocytosis, MAPK signaling pathway, Protein processing in

endoplasmic reticulum, Spliceosome

1,5 Heat shock 70 kDa protein 1-like HSPA1L 70,3 69/68 60,1 14 31,5 ATP and unfolded protein

binding Positive regulation of protein targeting to

mitochondrion, Protein refolding

Endocytosis, MAPK signaling pathway, Protein processing in

endoplasmic reticulum, Spliceosome

1,5 Heat shock 70 kDa protein 6 HSPA6 71 69/68 67,1 16 29,2 ATP and unfolded protein binding Cellular response to heat, Protein

refolding

Endocytosis, MAPK signaling pathway, Protein processing in

endoplasmic reticulum, Spliceosome

1,5 Condensin-2 complex subunit G2 NCAPG2 132 59 61 10 9 Methylated histone binding Cell division, Chromosome

condensation Condensation of Prophase

Chromosomes

1,5 Protein disulfide-isomerase P4HB 57,1 59 78 12 27

Protein disulfide isomerase activity, Protein and poly(A) RNA

binding, Contributes to procollagen-proline 4-

dioxygenase activity

Cellular response to hypoxia, Regulation of oxidative stress-induced intrinsic apoptotic signaling pathway,

Response to endoplasmic reticulum stress

Protein processing in endoplasmic reticulum, Chylomicron-mediated

lipid transport

1,5 Mitogen-activated

protein kinase kinase kinase 2

MAP3K2 69,7 41 59,4 7 18,7 MAP kinase kinase activity,

Protein serine/threonine kinase activity

Activation of JUN kinase and MAPK activity, Cellular response to

mechanical stimulus, Positive regulation of transcription, DNA-templated

Gap junction, GnRH and MAPK signaling pathway

1,6 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 PKM2 57,9 58 160 20 39,5

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and poly(A)

RNA binding Phosphorylation, Programmed cell death Glycolysis / Gluconeogenesis,

Purine metabolism

1,6 ATP-dependent RNA helicase DDX3Y 73,1 89 56,3 10 18,9 ATP-dependent RNA helicase

activity Regulation of gene expression, RNA

secondary structure unwinding RIG-I-like receptor signaling

pathway

1,6 Heat shock protein HSP 90-alpha HSP90AA1 84,6 89 86,1 21 33,7

Nitric-oxide synthase regulator activity, Protein homodimerization

activity, ATP, Poly(A) RNA and protein binding

Signal transduction, Chaperone-mediated protein complex assembly,

Mitochondrial transport, Positive regulation of nitric oxide biosynthetic

process

Pathways in cancer, Protein processing in endoplasmic

reticulum

120 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Fold Identificación Gene Name

Th. MW

Obs. MW Score Pep %SQ Molecular Function Biological procces Pathways

1,6 Heat shock protein HSP 90-beta HSP90AB1 83,2 89 117 20 29

Nitric-oxide synthase regulator activity, ATP, Poly(A) RNA, kinase and protein binding

Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process, Negative regulation

of proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process, Regulation of interferon-gamma-mediated signaling

pathway

Pathways in cancer, Protein processing in endoplasmic

reticulum

1,9 Tubulin beta chain TUBB 49,6 54 158 19 42,6 GTP and protein binding, Structural molecule activity

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular transport, Movement of cell or

subcellular component

Gap junction, Phagosome, Anchoring of the basal body to the

plasma membrane

1,9 Tubulin beta-2A chain TUBB2A 49,9 54 103 15 33,5 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium,

Microtubule-dependent trafficking of connexons from Golgi to the

plasma membrane

1,9 Tubulin beta-3 chain TUBB3 50,4 54 86,1 11 24,9 GTP and protein binding Axon guidance

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium,

Microtubule-dependent trafficking of connexons from Golgi to the

plasma membrane

1,9 Tubulin beta-4B chain TUBB4B 49,8 54 120 18 38,4

Structural constituent of cytoskeleton; double-stranded RNA, GTP and MHC class I

protein binding

Movement of cell or subcellular component, Spindle assembly

Gap junction, Assembly of the primary cilium

1,9 Tubulin beta-6 chain TUBB6 49,8 54 72,2 8 20,4 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium, Microtubule-dependent trafficking

of connexons from Golgi to the plasma membrane

2,0 Actin, cytoplasmic 1 ACTB 41,7 43 136 16 45,9 Structural constituent of

cytoskeleton; ATP, nitric-oxide synthase and protein kinase

binding

Movement of cell or subcellular component, ATP-dependent chromatin

remodeling

Adherens junction, Focal adhesion, Regulation of actin

cytoskeleton

2,0 Actin, cytoplasmic 2 ACTG1 41,8 43 146 17 51,7 Structural constituent of

cytoskeleton; ATP and protein binding

Movement of cell or subcellular component

Adherens junction, Focal adhesion, VEGFA-VEGFR2

Pathway

2,0 Keratin, type I cytoskeletal 18 KRT18 48 43 75,8 15 31,2

Scaffold protein binding, Structural molecule activity,

Poly(A) RNA binding

Intermediate filament cytoskeleton organization, Negative regulation of

apoptotic process, Cell cycle

Pathogenic Escherichia coli infection

2,1 Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8 70,9 71/70 198 25 42,3

ATP, G-protein coupled receptor, C3HC4-type RING finger domain, Poly(A) RNA, Unfolded protein

binding

Negative regulation of transcription, DNA-templated, Negative regulation of fibril

organization

Endocytosis, MAPK signaling pathway, Protein processing in

endoplasmic reticulum, Spliceosome

Análisis proteómico diferencial DIGE del efecto del TGF-β en la línea derivada de trofoblasto HTR-8/SVneo. Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta a TGF-β, identificadas en HTR-8/SVneo por MALDI MS TOF y búsqueda en bases de datos (SwissProt 2013_01, Taxonomy: Human, Score >56). Términos GO (Nextprot y PANTHER). Fold: razón de cambio en el nivel de la proteína como TGF-β / Ctrl. Th. MW: masa molecular teórica en kDa; Obs. MW (kDa): masa molecular observada en geles G4/G2.

Capítulo 2 121

Tabla 2-10 Proteínas diferencialmente expresadas por TGF-β en células JEG-3 Fold Identificación Gene

Name Th. MW

Obs. MW Score #Pep %SQ Molecular Function Biological procces Pathways

1,5 Annexin A2 ANXA2 38,6 36 96,7 16 47,8 Phospholipase A2 inhibitor activity, Calcium-dependent phospholipid and protein binding, Contributes

to receptor activator activity

Positive regulation of receptor activity, Angiogenesis, Membrane budding, Membrane raft assembly, Negative

regulation of receptor internalization, Positive regulation of vesicle fusion

Dissolution of Fibrin Clot, Orphan transporters

1,5 Polypyrimidine tract-binding protein 1 PTBP1 57,2 55 65,3 7 13,6 Poly(A) RNA and pre-mRNA

binding Negative regulation of mRNA splicing,

via spliceosome mRNA Splicing - Major Pathway,

Processing of Capped Intron-Containing Pre-mRNA

1,5 Putative double homeobox protein 2 DUX2 9,2 78 71,4 5 77,5 DNA binding

1,5 Tropomyosin alpha-4 chain TPM4 28,5 31 199 27 68,1 Actin and Calcium ion binding Movement of cell or subcellular

component Cardiac muscle contraction

1,5 Actin, cytoplasmic 1 ACTB 41,7 45 61,4 9 37,1 Structural constituent of

cytoskeleton; ATP, nitric-oxide synthase and protein kinase

binding

Movement of cell or subcellular component, ATP-dependent chromatin

remodeling

Adherens junction, Focal adhesion, Regulation of actin

cytoskeleton

1,5 Keratin, type I cytoskeletal 18 KRT18 48 45 249 25 56,3

Scaffold protein binding, Structural molecule activity, Poly(A) RNA

binding

Intermediate filament cytoskeleton organization, Negative regulation of

apoptotic process, Cell cycle

Pathogenic Escherichia coli infection

1,5 Annexin A1 ANXA1 38,7 37 90,1 11 39,3 Annealing helicase activity, Calcium ion binding

1,5 Protein FAM208A FAM208A 188,9 37 60,8 9 5,8 Poly(A) RNA binding

1,6 Keratin, type II cytoskeletal 1 KRT1 66 47 63,7 13 28,7 Carbohydrate and protein binding,

Receptor activity

Complement activation, lectin pathway, Regulation of angiogenesis, Response to

oxidative stress

1,6 Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8 70,9 71/70 198 25 42,3

ATP, G-protein coupled receptor, C3HC4-type RING finger domain, Poly(A) RNA, Unfolded protein

binding

Negative regulation of transcription, DNA-templated, Negative regulation of fibril

organization

Endocytosis, MAPK signaling pathway, Protein processing in

endoplasmic reticulum, Spliceosome

1,6 Tubulin alpha-1B chain TUBA1B 50,1 56 99,6 17 52,1 GTP, protein and double-stranded

RNA binding

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular transport, Microtubule-based

process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium

1,6 Tubulin alpha-1C chain TUBA1C 49,9 56 110 18 55,7 Structural molecule activity, GTP

and protein binding

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular transport, Microtubule-based

process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium

1,6 Vimentin VIM 53,6 56 274 37 86,9 Structural constituent of

cytoskeleton, Protein and double-stranded RNA binding

Movement of cell or subcellular component

Caspase-mediated cleavage of cytoskeletal proteins

1,8 Tubulin beta chain TUBB 49,6 54 158 19 42,6 GTP and protein binding, Structural molecule activity

Cell division, Cytoskeleton-dependent intracellular transport, Movement of cell or

subcellular component

Gap junction, Phagosome, Anchoring of the basal body to the

plasma membrane

1,8 Tubulin beta-2A chain TUBB2A 49,9 54 103 15 33,5 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium,

Microtubule-dependent trafficking of connexons from Golgi to the

plasma membrane

122 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Fold Identificación Gene Name

Th. MW

Obs. MW Score #Pep %SQ Molecular Function Biological procces Pathways

1,8 Tubulin beta-3 chain TUBB3 50,4 54 86,1 11 24,9 GTP and protein binding Axon guidance

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium, Microtubule-dependent trafficking

of connexons from Golgi to the plasma membrane

1,8 Tubulin beta-4B chain TUBB4B 49,8 54 120 18 38,4

Structural constituent of cytoskeleton; double-stranded RNA, GTP and MHC class I

protein bindin

Movement of cell or subcellular component, Spindle assembly

Gap junction, Assembly of the primary cilium

1,8 Tubulin beta-6 chain TUBB6 49,8 54 72,2 8 20,4 GTP binding Microtubule-based process

Gap junction, Phagosome, Assembly of the primary cilium, Microtubule-dependent trafficking

of connexons from Golgi to the plasma membrane

1,8 Stress-70 protein, mitochondrial HSPA9 73,92 34 56 10 27 ATP, unfolded protein and poly(A)

RNA binding Negative regulation of apoptotic process RNA degradation, mitochondrial protein import

1,9 Alpha-enolase ENO1 47,1 47 91,8 13 31,6 Phosphopyruvate hydratase

activity, Transcription corepressor activity

Negative regulation of cell growth, Negative regulation of transcription from

RNA polymerase II promoter

Glycolysis / Gluconeogenesis, RNA degradation

1,9 Neurogenin-2 NEUROG2 28,6 47 56,1 8 28,3 E-box binding, Protein dimerization activity

Positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription

factor activity

2,0 Annexin A5 ANXA5 35,9 38/32 169 16 45,9 Calcium-dependent phospholipid binding, Phospholipase inhibitor

activity

Negative regulation of apoptotic process, Signal transduction, Negative regulation

of catalytic activity

2,0 Keratin, type II cytoskeletal 8 KRT8 53 50 221 33 64 Scaffold protein binding

Extrinsic apoptotic signaling pathway, Cell differentiation involved in embryonic

placenta development

2,0 Mitogen-activated

protein kinase kinase kinase 2

MAP3K2 69,7 41 59,4 7 18,7 MAP kinase kinase activity,

Protein serine/threonine kinase activity

Activation of JUN kinase and MAPK activity, Cellular response to

mechanical stimulus, Positive regulation of transcription, DNA-templated

Gap junction, GnRH and MAPK signaling pathway

2,0 60 kDa heat shock

protein, mitochondrial

HSPD1 61 60 116 20 38,9 p53, ATP, chaperone, DNA

replication origin, unfolded protein and poly(A) RNA binding

de novo' protein folding, Activation of cysteine-type endopeptidase activity

involved in apoptotic process

RNA degradation, Mitochondrial protein import

2,1 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 PKM2 58 53 96 14 30

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and poly(A)

RNA binding Phosphorylation, Programmed cell death Glycolysis / Gluconeogenesis,

Purine metabolism

2,2 Polypyrimidine tract-binding protein 1 PTBP1 57,2 55/56 102 11 28 Poly(A) RNA and pre-mRNA

binding Negative regulation of mRNA splicing,

via spliceosome mRNA Splicing - Major Pathway,

Processing of Capped Intron-Containing Pre-mRNA

2,2 Protein phosphatase 1 regulatory subunit

21 PPP1R21 88,3 44 71,3 16 19,7 Phosphatase binding

2,2 Epithelial cell adhesion molecule EPCAM 34,9 36 59,7 9 31,5 Protein complex binding

Negative regulation of cell-cell adhesion mediated by cadherin, Positive

regulation of cell proliferation, Signal transduction involved in regulation of gene

expression

Capítulo 2 123

Fold Identificación Gene Name

Th. MW

Obs. MW Score #Pep %SQ Molecular Function Biological procces Pathways

2,2 Tyrosine-protein kinase Tec TEC 73,5 36 68,3 11 19,5 Non-membrane spanning

protein tyrosine kinase activity Cell differentiation, Integrin-mediated

signaling pathway, Intracellular signal transduction

FCERI mediated Ca+2 mobilization, Interleukin-3, 5 and GM-CSF signaling, Signaling by

SCF-KIT

2,4 26S proteasome

non-ATPase regulatory subunit 11

PSMD11 47,4 37 56,5 7 19,9 Protein binding Proteasome assembly, Stem cell

differentiation, Ubiquitin-dependent protein catabolic process

Proteasome

3,6 Nitrilase homolog 1 NIT1 35,9 68 60,9 8 33,3 Nitrilase activity Nitrogen compound metabolic process

3,6 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 PKM2 57,9 68 158 16 34,7

Pyruvate kinase activity; ATP, Mg and K ion, protein and poly(A)

RNA binding Phosphorylation, Programmed cell death Glycolysis / Gluconeogenesis,

Purine metabolism

3,8 ATP synthase subunit beta, mitochondrial

ATP5B 56,5 50 168 19 42 Proton-transporting ATPase activity, rotational mechanism

Angiogenesis, Mitochondrial ATP synthesis coupled proton transport,

Regulation of intracellular pH

Oxidative phosphorylation, Formation of ATP by

chemiosmotic coupling, Transcriptional activation of

mitochondrial biogenesis

4,8 Zinc finger protein 498 ZSCAN25 61,4 26 59,4 13 27,9

Sequence-specific DNA binding transcription factor activity, DNA

and metal-ion binding

Regulation of transcription, DNA-templated Generic Transcription Pathway

Análisis proteómico diferencial DIGE del efecto del TGF-β en la línea derivada de coriocarcinoma JEG-3. Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta a TGF-β, identificadas en JEG-3 por MALDI MS TOF y búsqueda en bases de datos (SwissProt 2013_01, Taxonomy: Human, Score >56). Términos GO (Nextprot y PANTHER). Th. MW. Masa molecular teórica en kDa; Obs. MW (kDa): masa molecular observada en geles G4/G2.

Figura 2-24 Estadística de spots de proteína diferencialmente expresados en respuesta al TGF-β por células HTR-8/SVneo y JEG-3

Análisis estadístico de los spots detectados en los geles DIGE en respuesta al TGF-β en cada línea celular. n=3, test ANOVA, p<0.05. *, porcentaje de spots total analizados; **, porcentaje de spots diferencialmente expresados. Según análisis de vías KEGG obtenido con STRING 10, las proteínas de HTR-8/SVneo reguladas por el TGF-β anotan para procesos biológicos como movimiento celular, locomoción y quimiotaxis, así como las proteínas reguladas en JEG-3, que anotan para procesos como movimiento celular y curación de heridas. Cabe resaltar proteínas como la homóloga a la nitrilasa 1 (NIT1) y la Anexina A1, las cuales fueron reguladas al alza en JEG-3 y a la baja en HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β (ver Tabla 2-12 y Tabla 2-14 y Supl. Capítulo 2, Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta al TGF-β). Se realizó un análisis de redes comparativo usando Cytoscape v. 3.4.0 (Shannon et al., 2003) con las aplicaciones ClueGO v. 2.2.6 (Bindea et al., 2009) para analizar anotaciones funcionales y comparar clústers de proteínas y CluePedia v. 1.2.6 (Bindea et al., 2013) para la construcción de redes de proteínas o interactómica (ver Anexos A 8). El rol biológico (procesos biológicos GO BP y vías KEGG, Reactome y Wikipathways) de las proteínas reguladas al alza en respuesta al TGF-β fueron identificados y visualizados mediante análisis de redes ClueGO, como se muestra en la Figura 2-25; en este los términos GO son representados como nodos, y el tamaño de cada nodo es proporcional al número de proteínas en el set investigado con ese término. En el análisis comparativo (Figura 2-25 B) los nodos rojos y verdes representan términos con enriquecimiento significativo para JEG-3 o HTR-8/SVneo, respectivamente. Dentro de las vías específicas a JEG-3 resaltan varias de interés que fueron analizadas con CluePedia, creando redes de acciones o interacciones físicas con STRING que muestran las interacciones entre los miembros pertenecientes a la vía y las proteínas identificadas (redes no mostradas). Las anexinas pertenecen a la vía de síntesis y regulación de prostaglandinas y la red de STRING muestra que ANXA2 se une a S100A10 y a PLA2G4Ae y ANXA1 reacciona con EDN1, PTGFR, EDNRA, PTGER1 y PTGER3. En la “red relacionada a apoptosis debido a Notch3 alterado en cáncer de ovario” se encuentra ANXA5, HSPD1 y Vim: Vim se une a RIPK2, NFKB1, HDAC1 y PKN1, es activado por CASP7 e inhibido por MAPK1; HSPD1 se une a CUL1, HDAC1, ABL1, APP y MAPK1 y se une, reacciona y es catalizado por HSPA5. En “importación de proteína mitocondrial” figura ATP5B, HSPA9 y HSPD1: ATP5B es mutuamente catalizado

Figura 2-25 Análisis de redes de anotaciones para las proteínas identificadas al alza en respuesta al TGF-β en células HTR-8/SVneo y JEG-3. A B

Análisis ClueGO A. Red de grupos, colores iguales definen la pertenencia al grupo y el término líder es el más significativo. B. Red

de distribución de los clústers, los términos con proteínas reguladas al alza en JEG-3 y en HTR8/SVneo se muestran en rojo y verde, respectivamente. El gradiente de color muestra la proporción de genes de cada clúster asociado con el término; proporciones equivalentes de los dos clústers son representadas en gris. Kappa score 0,4, nivel de término GO de 3 a 5, anotaciones para todas las evidencias excepto las inferidas electrónicamente (IEA), p-value < 0,05, min, 3 genes de pertenencia al clúster y 60% específico.

…por ATP5A1 y ATP5G1, y se une a TOMM22; HSPA9 cataliza mutuamente a múltiples miembros de la vía tipo GRPEL, TIMM, PMPC, PAM, DNAJC19, SLC25A y ATP5G1, además de unirse a FXN, HSCB y HSPD1; este último se une a VDAC1 y con menor puntaje a múltiples parejas de HSPA9 tipo TIMM, GRPEL y PMPC. La vía de “uniones Gap”, con MAP3K2 y varias tubulinas, resultó específica para JEG-3, aunque en HTR-8/SVneo también se encontró MAP3K2 y un número menor de tubulinas. Para HTR-8/SVneo resalta la vía “regulación de la dinámica de actina para la formación de la copa de fagocitosis” y “fagocitosis dependiente del receptor Fcγ” con HSP90AA1 y AB1, ACTB, ACTG1, las cuales interactúan con múltiples miembros a través de uniones, catálisis y activación; HSP90AA1 es activado por MAPK1, y la proteína tirosin quinasa SYK activa de forma reciproca a HSP90AA1 y HSPAB1. La “vía de señalización de estrógenos” presenta a HSP90AA1, HSP90AB1, HSPA1A, HSPA1L, HSPA6 y HSPA8, esta última también presente en JEG-3. HSPA8 interactúa con EGFR, ESR1, Raf1, SHC1, Grb2, PIK3R2, Akt1, MAP2K1 y FKBP4, así como con las otras chaperonas. La vía “procesamiento de proteína en el retículo endoplasmático” figura con las proteínas P4HB y las anteriores proteínas de choque térmico. Por otro lado, se encontraron procesos comunes a las dos líneas que pueden representar una respuesta homogénea a la regulación ejercida por el TGF-β en el trofoblasto, como “citotoxicidad mediada por células Natural Killer” en la que participan las tubulinas identificadas. Y la vía del sistema Proteosomal Parkin-Ubiquitina con HSPA1A, HSPA1L, HSPA6, HSPA8, HSPA9 y PSMD11 ademas de tubulinas. Respecto al análisis ClueGO de las proteínas reguladas a la baja en HTR-8/SVneo, este análisis solo proporcionó anotaciones para las anexinas 1 y 2, sin vincular algún término para NIT1 y PKM2 (p-value < 0,05), a pesar de los diferentes parámetros ensayados. Dentro de las anotaciones reportadas para las anexinas figuran regulación positiva de la fusión de vesículas, endocitosis, síntesis y regulación de prostaglandinas, regulación negativa de procesos catabólicos del receptor de partículas de lipoproteínas de baja densidad, entre otros (redes no mostradas). Así, se encontró que el TGF-β modula el proteoma de las dos líneas celulares estudiadas, con diferentes funciones biológicas impactadas por los cambios en la expresión de proteínas.

2.2.5 Discusión de los resultados proteómicos En esta sección se emplearon diversos abordajes proteómicos para comparar el proteoma de la línea celular inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo y la línea celular derivada de coriocarcinoma JEG-3 en búsqueda de proteínas diferencialmente expresadas que ayuden a caracterizar a estos dos modelos en relación con sus características malignas. A pesar de ser modelos de trofoblasto humano de primer trimestre, se obtuvo una gran diferencia inicial evidenciada en los proteomas totales, lo cual dificultó su comparación vía E2D. Sin embargo, gracias al fraccionamiento subcelular y enfoques comparativos como SILAC y DIGE, se logró una mejor comparación de las dos líneas celulares.

Capítulo 2 127

Discusión de análisis SILAC

Se comparó de forma cuantitativa los proteomas de células HTR8/SVneo y JEG-3 mediante SILAC, encontrando un gran número de proteínas sobre-expresadas en JEG-3 respecto a HTR-8/SVneo. Un porcentaje de las proteínas cuantificadas no cambia significativamente (32%, F.C), ya que sus niveles se mantienen alrededor de 1 ±0,3; esto es coherente teniendo en cuenta la similaridad entre las dos líneas y su origen trofoblástico y demuestra el balance del experimento de marcación. No obstante, se obtuvo un porcentaje importante de proteínas cuyos niveles de expresión varían significativamente entre los dos modelos, siendo un 55% sobre-expresado en JEG-3 y un 13% en HTR-8/SVneo (F. C >1,3) (Tabla 2-4). La cuantificación SILAC está basada en la incorporación del isótopo pesado en cultivo través del consumo de lisina y esto depende de la tasa de recambio de cada proteína, la cual es diferente según su tipo y la función molecular que desempeña al interior de la célula. Así, esta tasa es más baja en proteínas tipo housekeeping, las cuales permanecen inmutables más tiempo, mientras que las proteínas inducibles cuya expresión es de novo, son sintetizadas y degradadas según la necesidad de la célula. Esto hace que la incorporación del isótopo pesado sea menor en proteínas estructurales, como actina y queratinas encontradas en la banda analizada al verificar la marcación (ver Anexos D4), y mayor en proteínas inducibles que son de interés y para las cuales una total incorporación del isótopo es vital. La incorporación del isótopo pesado en proteínas de tipo estructural representa una marcación eficiente y completa de las células y se asegura una incorporación de la lisina pesada en proteínas con una alta tasa de recambio como las involucradas en procesos regulatorios. En cuanto a la cuantificación y la verificación de esta, para el caso de proteínas muy abundantes como actina, tubulina y algunas proteínas de choque térmico, la elución de los péptidos ocurre en un rango de tiempo muy amplio debido a su abundancia, mezclándose con otros péptidos y señales interferentes y dificultando su cuantificación. A modo de ejemplo, para α-actinina-4 (ACTN4), la dupla de señales 874,4160 / 871,4074 aparece en la banda B15 pero co eluye con un alto número de péptidos más intensos y no fue fragmentada ni pudo ser usada en la cuantificación; sin embargo, este mismo péptido aparece en la banda B2 donde fue identificado y cuantificado. La presencia de esta proteína de 104,8 kDa en una banda situada por debajo de 20 kDa se explica como un posible producto de proteólisis; la razón L/H para el péptido 874,4160 / 871,4074 es cercana a 1 y dista mucho de lo cuantificado en la banda B15, así que se rechaza este valor por pertenecer a un posible producto de proteólisis para el cual no es claro su significado, cuantificándose la proteína con otros péptidos cuyas señales son más claras. La proteína B1 del grupo de alta movilidad (High mobility group protein B1, HMGB1) de 24,9 kDa se identificó en las bandas B3 (~20-25 kDa) y B4 (~25 kDa), cada una de ellas con razones opuestas: la razón J3/ H8 fue de -3,70 (2 péptidos, 0% C.V.) para B3 y 1,58 (2 péptidos, 22% C.V.) para B4, la cual corresponde con el peso esperado de la proteína y se toma como canónica. Esta proteína puede ser proteolíticamente clivada por un complejo trombina : trombomodulina, reduciendo la unión a heparina y su actividad proinflamatoria. Es una proteína sensora redox multifuncional con diversas funciones en diferentes compartimentos celulares y se ha propuesto que contribuye a la patogénesis de varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas, y en cáncer. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016)(UniProt release 2016_10, neXtProt release 2016-08-25),

128 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

por lo que es de interés su análisis con otras técnicas que permitan evaluar mejor su expresión y función.

Correlación de los análisis proteómicos

Al correlacionar los resultados obtenidos en cada aproximación proteómica, es posible resaltar las proteínas identificadas y reguladas de forma común o similar. En el proteoma total obtenido por E2D se identificó la Estatmina 1 / oncoproteína 18 (STMNN1) como un spot de proteína único de HTR-8/SVneo y como un spot común diferencialmente expresado en el sub-proteoma de citoplasma (spot C4), lo cual correlaciona con la cuantificación realizada por SILAC al ser sobre-expresada 1,72 veces en HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3. Otra proteína encontrada en los dos análisis pero discrepante fue la cadena α3 de la tropomiosina (TPM3), cuantificada mediante SILAC con valores diferentes según la banda en la que fue identificada: en la banda B5 (acorde con su peso molecular de 32,8 kDa) la razón de cambio fue de 1,32, mientras que una forma pesada hallada en las bandas B13 y B15 (100 a 250 kDa) presentó una razón de cambio J3/H8 de -1,25; en adición, en los geles E2D del proteoma total fue encontrada en un spot único a HTR-8/SVneo, cercano a su peso molecular. A la fecha no existen reportes de formas pesadas de la TPM3, y aunque esta divergencia en los resultados podría deberse a diferentes isoformas y estados de la proteína, la expresión de esta proteína en cada modelo no es clara y debe ser verificada con otras técnicas como PCR y Western blot. Respecto a JEG-3, tanto en el análisis SILAC como en spots de geles E2D del proteoma total y sub-proteoma de citoplasma se observó un aumento en la expresión de enzimas antioxidantes como PRDX2, 6 y THIO (J9/C9, J4/C7 y J1/C3, respectivamente) con razones de cambio de 2,8, 1,7 y 3,32, respectivamente. Así mismo, se cuantificaron las proteínas adaptadoras 14-3-3 β/α y ζ/δ y (C15 y C16, respectivamente), con incrementos de 1.54 y 1.38, respectivamente. En la Tabla 2-11 se presentan otras proteínas identificadas en spots únicos al sub-proteoma de citoplasma de JEG-3 ó HTR-8/SVneo y cuyo resultado fue confirmado y concordante con la cuantificación realizada mediante SILAC: Tabla 2-11 Correlación resultados proteómicos entre E2D comparativo y SILAC 1D-LC

Protein Gene # Spot cito F.C J3/H8 SILAC Thioredoxin TXN J1 3.32

Peroxiredoxin-2 PRDX2 J9 2.8 Peroxiredoxin-6 PRDX6 J4 1.7

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase HPRT1 J4 1.58

Protein DJ-1 PARK7 J6 1.95 Proteasome subunit beta type-4 PSMB4 J7 1.4

UMP-CMP kinase CMPK1 J9 1.4 Inorganic pyrophosphatase PPA1 J11 3.61

L-lactate dehydrogenase B chain LDHB J11 1.68 Serine/arginine-rich splicing factor 1 SRSF1 J12 1.38

Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A ANP32A J14 1.57

EF-hand domain-containing protein D2 EFHD2 J14 1.86

Capítulo 2 129

Protein Gene # Spot cito F.C J3/H8 SILAC Proliferating cell nuclear antigen PCNA J15 1.71

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH J16 1.66 NSFL1 cofactor p47 NSFL1C J20 1.47

Heat shock protein beta-1 HSPB1 H5, H9 -1.3 Annexin A2 ANXA2 H13 -1.52

Pyruvate kinase PKM H18 -1.45 Es necesario resaltar que la peroxiredoxina 1 (PRDX1) identificada en un spot único al sub-proteoma de HTR-8/SVneo, fue cuantificada mediante SILAC como aumentada 2,44 veces en JEG-3, lo cual concuerda con los resultados obtenidos para las otras peroxiredoxinas. A pesar de las limitaciones de la cuantificación con SILAC también se encontró concordancia con los resultados de baja significancia que fueron rechazados. La triosafosfato isomerasa (TPI1) fue identificada en un un spot único del sub-proteoma de citoplasma de JEG-3 y cuantificada por SILAC con un incremento de 1,79 veces en JEG-3, pero con un CV de 33,6% (13 péptidos), así como AHCY con un F.C de 1,17 pero con un CV de 67,6% (5 péptidos). La subunidad α tipo 6 (PSMA6) y β tipo 3 (PSMB3) del proteosoma y el inhibidor de leucocito elastasa (SERPINB1) estaban aumentadas en JEG-3 1,41, 1,87 y 7,49 veces, respectivamente, pero cuantificadas solo con un péptido. En cuanto a los resultados del sub-proteoma de HTR-8/SVneo, la glutatión S-transferasa P (GSTP1) fue cuantificada con un solo péptido como aumentada 4 veces en HTR-8/SVneo. Sin embargo, se encontraron algunas discrepancias entre los resultados, que demuestran las limitaciones de cada técnica. Considerando los resultados del sub-proteoma de citoplasma, la prostaglandina E sintasa 3 (PTGES3) fue identificada en un spot único del sub-proteoma de JEG-3 y en un spot común a las dos líneas, y fue cuantificada mediante SILAC con un incremento de 1,72 veces en HTR-8/SVneo. PDCD6, SRM, GDI2, ANXA7, EEF1G, MAT2A, EIF3K y NAP1L1, entre otras, fueron identificadas por SILAC sin poder ser cuantificadas. Finalmente, RANBP1 y TPD52L2, CLIC1, ANXA1 y EEF1A1 fueron cuantificadas de forma diferencial a los hallazgos del sub-proteoma de citoplasma (F.C J3/H8 -1.3, -1.4, -1.59, -1.47, -1.02, respectivamente).

Proteínas diferencialmente expresadas en los dos modelos

La STMN1, encontrada sobre-expresada en HTR-8/SVneo en los 3 análisis, es una importante fosfoproteína citosólica que regula la dinámica de los microtúbulos al prevenir la polimerización de tubulina y promover la desestabilización de los microtúbulos a través del secuestro de heterodímeros de α / β-tubulina y del aumento de la “catástrofe de los microtúbulos”; además, participa en la proliferación, invasión, diferenciación y motilidad de las células tumorales (Rubin & Atweh, 2004). En células normales controla la progresión del ciclo celular, la apoptosis y migración y su disfunción puede conducir a un montaje constante de microtúbulos y a una progresión descontrolada del ciclo celular, que puede dar lugar a un crecimiento anormal celular y a la formación de tumores (Belletti & Baldassarre, 2011). Se ha visto que la STMN1 se expresa altamente en citotrofoblasto velloso y extravelloso, pero no en sincitiotrofoblasto de primer trimestre, siendo necesaria para la decidualización pero disminuyendo su expresión tras esta (Tamura et al., 2006) y que la disminución de su expresión inhibe la proliferación y la invasión de trofoblasto, estando asociada con el aborto recurrente (Tian et al., 2015). El

130 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

aumento en la expresión de STMN1 en células de HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3, encontrada mediante análisis E2D (Tabla 2-2) y SILAC (Tabla 2-5), correlaciona con los reportes, considerando que la línea JEG-3 modela más el fenotipo de sincitiotrofoblasto, y la línea HTR-8/SVneo tiene claramente un fenotipo más invasivo que JEG-3 y un carácter mesenquimal que concuerda con las funciones reportadas para STMN1. La proteína NDKA o NME1 (también conocida como gen 23-H1 no metastático, nm23-H1) fue identicada en un spot único a HTR8/SVneo del proteoma estimulado con SFB al 10%, y cuantificada por SILAC con una razón de cambio de 1,18 (J3/H8) en el proteoma basal. Esta es considerada un supresor tumoral para un amplio número de tumores (Ouatas et al., 2003). En trofoblasto, NME1 controla de forma negativa la invasión, estimulando la adhesión celular y reduciendo la expresión de MMPs a través de la vía MAPK/ERK y GTP mediado por NDPK; en adición, controla el ciclo celular y la apoptosis al activar p53 (X.-Y. Wu et al., 2010); se ha visto una disminución de su expresión en molas invasivas, sugiriendo que la reducción en su expresión es un paso temprano en la transformación a embarazo molar, conifiriendole un potencial invasivo al trofoblasto (Balaram et al., 2004). NME1 expresado en células trofoblásticas y estromales de decidua (DSCs) también disminuye la traducción de titin y la capacidad invasiva de células de trofoblasto a través de la vía MAPK (Xie et al., 2010), y en células JEG-3 se ha visto que participa en la regulación negativa de la expresión de TIMP1 (Wang et al., 2012), , y por lo tanto constituye una señal corriente arriba que controla negativamente la invasion inapropiada del trofoblasto de primer trimestre. Adicionalmente, esta proteína juega un papel principal en la síntesis de nucleosidos trifosfato adicionales a ATP, tiene actividad quinasa sobre diferentes blancos específicos, y está envuelta en la proliferación celular, diferenciación, vías de señalización, endocitosis acopladada a proteínas G y expresión génica. El hecho de encontrarse a niveles basales similares entre HTR-8/SVneo y JEG-3, pero identificarse en un spot único al estimular células de HTR-8/SVneo con SFB al 10% por 24 horas puede sugerir la activación de un mecanismo regulatorio en las células HTR-8/SVneo en respuesta al SFB que involucra alguna isoforma específica de NME1, como una especie de feedback negativo a la estimulación con los factores séricos, que podría estar alterada en JEG-3. En relación con lo anterior, en JEG-3 se encontró a la proteína SET aumentada 2,8 veces con respecto a HTR-8/SVneo. Esta es una proteína multifuncional, implicada en apoptosis, transcripción, ensamblaje de nucleosomas y acompañamiento de histonas (nextprot, release 2016-08-25)(Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016). Se ha visto que SET es un inhibidor de NME1, generando de esta forma efectos anti-apoptóticos (Fan et al., 2003), pudiendo ser la razón por la cual no se observo en el proteoma de JEG-3 el spot de NME1 identificado en HTR8/SVneo. Esta relación permite conectar los resultados obtenidos por E2D con la cuantificación por SILAC. Dentro de las proteínas cuantificadas con mayor nivel de expresión en JEG-3 con respecto a HTR-8/SVneo está la interleucina 18 (IL-18), encontrada aumentada 4,97 veces en JEG-3. Esta citoquina aumenta la actividad de células NK en bazo, estimula la producción de IFN-γ en las células Th1 y está involucrada en procesos biológicos como angiogénesis, señalización célula-célula y en la regulación positiva de la respuesta inflamatoria, de la producción de IFN-γ e IL-17 y de la proliferación de células NK (nextprot, release 2016-08-25)(Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016). La subunidad reguladora 2 de la proteína fosfatasa 1 (PPP1R2) es un inhibidor de la Ser/Thr fosfoprotein fosfatasa 1 y fue sobre-expresada en JEG-3 16,9 veces. Aunque es

Capítulo 2 131

poco lo que se conoce acerca de esta proteína debido a que es considerada un pseudogen, se ha visto que estos no son simples espectadores del proceso evolutivo, sino que pueden ser el origen de genes con funciones novedosas (Korrodi-Gregório et al., 2013); en un estudio del estado genético y expresión en cáncer se encontró que la expresión diferencial, mutaciones somáticas y / o polimorfismos genéticos de varios genes de subunidades reguladoras indican la implicación de estos en la carcinogénesis multietapas (Takakura et al., 2001). Es necesario recordar que la proteína PPP2R1A, identificada dentro del set invariante, fue relacionada con las proteínas 14-3-3 (sobre-expresadas en JEG-3) y Hsp (HSPB1 y HSP90AA1 sobrexpresadas en HTR-8/SVneo) mediante activación, según análisis de redes realizado con CluePedia, sugiriendo que a través de proteínas adaptadoras y chaperonas diferencialmente expresadas se puede estar afectando la activación de esta proteína invariante entre los dos modelos. El estudio de estas proteínas puede ser un campo promisorio, teniendo en cuenta la carencia de información al respecto y el gran cambio en su nivel de expresión encontrado para PPP1R2, al igual que determinar si existe la forma correspondiente del gen activo. La siguiente proteína con mayor aumento en JEG-3 fue el factor acelerador de decaimiento del complemento (DAF) / CD55, con un aumento de 13,2 veces en JEG-3. Este hace parte de las proteínas reguladoras del complemento (CRPs), que están presentes en la mayoría de las células y protegen a las células normales del ataque mediado por el complemento durante la activación innata. CD55 está anclado a la membrana celular por glicosil fosfatidilinositol (GPI), pero también se ha visto en la matriz extracelular y como formas solubles en una gama de condiciones patológicas, incluyendo artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria intestinal; adicionalmente, se vió que existe una interacción funcional entre células T que expresan CD97 y monocitos que expresan CD55 y que el CD55 soluble inhibe la proliferación de células T(Spendlove et al., 2006). No obstante, el rol de esta proteína en JEG-3 visto como una posible regulación del sistema inmune no es clara. La proteína S100A4 fue sobre-expresada en JEG-3 8,11 veces y la S100A11 3,11 veces. S100A4 a nivel extracelular interactúa con el EGF, aumentando la actividad del receptor correspondiente, y actúa como un inductor de metástasis, al estimular la supervivencia celular, motilidad e invasión. En cuanto a S100A11, cuando se fosforila por PKC-α, la S100A11 unida a Ca2+ inhibe el crecimiento celular mediante la unión a nucleolina, translocación al núcleo y activación del modulador del ciclo celular p21WAF1 / CIP1; también se une a Rad54B, una ATPasa dependiente del ADN implicada en la reparación recombinante del daño del ADN, y estimula el crecimiento celular al aumentar el nivel de las proteínas de la familia del EGF; la alta expresión de S100A11 en adenocarcinoma pancreático podría ser un marcador tumoral significativo y un marcador pronóstico desfavorable (Donato et al., 2013). La proteína 5 que contiene el dominio de unión a nucleosomas del grupo de alta movilidad (HMGN5) fue aumentada 8,03 veces en JEG-3; esta se une a eucromatina y modula la transcripción celular al contrarrestar la compactación de la cromatina mediada por histonas, participando en la regulación negativa de la apoptosis y el arresto del ciclo celular, y en la regulación positiva de la proliferación y expresión génica (nextprot, release 2016-08-25)(Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016). La proteína tumoral D52 (TPD52) fue cuantificada como aumentada en JEG-3 3,31 veces, mientras que la proteína tumoral D54 (TPD52L2) estaba aumentada en HTR-8/SVneo 1,41 veces. En adición, un péptido de la proteína tumoral D53 (TPD52L1)

132 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

estaba aumentado 6,22 veces en JEG-3, siendo el único cuantificado para esta proteína. Estas son proteínas adaptadoras multifuncionales que influencian numerosos procesos celulares; el papel fisiológico más frecuente identificado para D52 ha sido la regulación del tráfico de vesículas y secreción por exocitosis, procesos comúnmente regulados a través de la unión con proteínas integrales de membrana y asociadas a la membrana, y posiblemente otros factores solubles secretados; la expresión génica de las proteínas tipo D52 también se ha relacionado con la proliferación en cáncer y células transducidas viralmente (Boutros et al., 2004). TPD52 frecuentemente se ha visto sobre-expresado en diferentes tipos de cáncer, generalmente asociado a la amplificación génica sin implicar mutaciones (Byrne et al., 2014). Las diferentes isoformas similares a D52 (52 like, 52L) se dan por splicing alternativo, donde uno de los exones sometidos a splicing codifica un motivo consenso de unión a las proteínas 14-3-3, siendo estas proteínas parejas heterólogas de D53 (Boutros et al., 2004). Por otro lado, la proteína tumoral D54 es un regulador negativo de la adhesión y migración dependiente de matriz extracelular en cáncer escamoso oral (Mukudai et al., 2013). Aunque no son claras las funciones de las diferentes isoformas de estas proteínas, en base a estos reportes y los resultados obtenidos se puede pensar en un rol regulatorio de D54 en células HTR-8/SVneo y maligno de D52 en células JEG-3. En el capítulo 1 ya se había identificado a la proteína AN32A en un spot disminuido en respuesta al TGF-β en células HTR-8/SVneo. Gracias al análisis SILAC se observó un aumento de esta y otras isoformas en las células JEG-3, con respecto a HTR-8/SVneo, observándose aumentos de 1,57, 1,68 y 1,95 veces para AN32A, B y E, respectivamente. Como se había discutido previamente, esta proteína está implicada en procesos celulares como proliferación, diferenciación, control de la apoptósis, regulación de la actividad fosfatasa, regulación epigenética por modificación y remodelación de cromatina y participa en la represión transcripcional mediada por el factor E4F1.

Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta al TGF-β

Gracias al análisis DIGE se observó, de forma interesante, una expresión diferencial de la proteína homóloga a la nitrilasa 1 (NIT1), regulada al alza en JEG-3 pero a la baja en HTR-8/SVneo. La pérdida de expresión de esta nitrilasa promueve el crecimiento celular y la resistencia al estrés por daño al DNA, y tiene propiedades de supresor tumoral que aumenta la respuesta apoptótica de células cancerosas (Sun et al., 2009). A pesar de que la proteína dedos de zinc 498 (ZSCAN25) no fue analizada con ClueGO, esta puede estar envuelta en la regulación transcripcional, sugiriendo que el TGF-β podría modular la transcripción génica en JEG-3 a través de la sobre-expresión de esta proteína. En cuanto a la proteína PKM1/M2, esta fue identificada en diversos spots. Los spots que corresponden a la isoforma típica de la proteína (MW 58 kDa, pI 9, Spots ID: 803, 2547, 2306, 739, 798) se encontraron presentes en HTR-8/SVneo y sobre-expresados en respuesta al TGF-β, pero no se observaron de forma significativa en JEG-3. Spots identificados como PKM1/M2 pero 10 kDa más pesados y con pI más ácido (MW 68, 2365) fueron expresados en los dos modelos de forma exclusiva en respuesta al SFB al 10%, pero presentaron un nivel de expresión mayor en JEG-3 comparado con HTR-8/SVneo (ver Supl Capítulo 2, Imágenes DIGE). Esta isoforma, podría ser una pro enzima sin clivaje, de tal forma que el coriocarcinoma podría expresar una isoforma no

Capítulo 2 133

clásica de PKM en respuesta al SFB al 10%, la cual es expresada también por el HTR-8/SVneo en respuesta a la misma dosis de suero, a través de la cual el coriocarcinoma ejerce la glicólisis, en vez de expresar las formas típicas presentes en HTR-8/SVneo. Al correlacionar con los resultados SILAC se encuentra que la PKM fue cuantificada como aumentada 1,45 veces en HTR-8/SVneo, soportando la idea que HTR-8/SVneo tiene un mayor nivel de expresión de esta enzima que JEG-3. Finalmente, el análisis DIGE reveló un alto número de tubulinas en respuesta a la estimulación con TGF-β. De igual forma estas se encontraron de forma abundante en el análisis SILAC, eluyendo en un rango de tiempo muy amplio y que dificultó su análisis y cuantificación. De las pocas proteínas anotadas para coriocarcinoma en la base de datos de Ingenuity Pathway IPA figuran las tubulinas. La conformación de los microtúbulos y las tubulinas juegan papeles claves en diferentes procesos como control del ciclo celular y citocinesis, proliferación, adhesión, migración, diferenciación, y generación del cilio primario, entre otros (Janke & Chloë Bulinski, 2011), y son reconocidos blancos de drogas anti-tumorales (Kavallaris, 2010), de tal forma que las tubulinas constituyen proteínas interesantes a ser estudiadas, a pesar de las dificultades en su análisis debido a su alta abundancia y ubiquidad.

2.3 Análisis general de resultados Las diferencias que se observan entre la función regulada del trofoblasto y la del coriocarcinoma se pueden deber tanto a la falta de expresión y actividad de ciertas proteínas en el coriocarcinoma con respecto al trofoblasto, como a una expresión y activación anormal en el modelo maligno. Teniendo en cuenta los posibles cambios de expresión de proteínas, podemos considerar proteínas expresadas tras estímulo con TGF-β, dentro de los cuales debe haber mediadores necesarios para regular las funciones celulares, y proteínas constitutivas, expresadas en condiciones fisiológicas y vitales para responder al TGF-β, dentro de los cuales se esperaba obtener transductores de señal y mediadores del proceso de transcripción. A pesar que las líneas de coriocarcinoma son usadas para investigar el comportamiento del trofoblasto, estas se han reportado resistentes a las acciones regulatorias del TGFβ (Graham et al., 1994). Las células JEG-3 adicionalmente difieren de las células trofoblásticas normales en su capacidad de invasion, de tal forma que esta línea celular representa de una forma más cercana el trofoblasto de segundo y tercer trimestre, el cual tiene una baja capacidad de invasión (Fisher et al., 1989; Librach et al., 1991; S. Shimonovitz et al., 1994).

2.3.1 Comparación de la línea HTR-8/SVneo y la línea JEG-3 Comparado con células JEG-3, las células HTR-8/SVneo son más invasivas y tienen un mayor grado de similaridad con el EVT, en base a la expresión de moléculas asociadas a invasión, siendo propuesta como un modelo que imita a EVTs bajo condiciones in vitro (P. Suman & Gupta, 2012). Un estudio de firmas de expresión génica confirmó su origen diferente y mostró características divergentes de CTB primario y EVT, pero proponen a la línea JEG-3 para estudios en biología epitelial, motilidad celular e invasión y a la línea HTR-8/SVneo para modelar la regulación del transporte de ARN y metabolismo de EVT (Bilban et al., 2010). Perfiles de expresión de microARN revelaron que a pesar de

134 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

compartir muchos patrones similares de miARNs, existen diferencias significativas en la expresión de algunos clústers (Morales-Prieto et al., 2012). En general, en los análisis se identificaron spots de proteína diferencialmente expresados entre las dos líneas celulares, resultados que fueron corroborados en la cuantificación por SILAC, como las enzimas vinculadas al metabolismo y antioxidantes, y las proteínas adaptadoras y chaperonas. Como se había analizado previamente, las proteínas identificadas sugieren procesos biológicos diferenciales entre la línea de trofoblasto HTR8/SVneo y la de coriocarcinoma JEG-3, implicando una actividad antioxidante y regulación negativa de la apoptosis en JEG-3, relacionado con la vía MAPK. Como se observó en el análisis de redes del proteoma general de JEG-3 (Supl. Capítulo 2 A; Redes) es evidente una conexión entre las proteínas 14-3-3 con las peroxiredoxinas a través de la vía de las MAPKs, sugiriendo una activación diferencial de estas vías. Por otro lado, el análisis de redes para las proteínas diferencialmente expresadas entre los dos modelos resalta a las proteínas de choque térmico Hsp y a las 14-3-3 como nodos centrales o hubs de una red de activación y catálisis; en esta, las proteínas 14-3-3, sobre-expresadas en JEG-3, y las proteínas HspB1 y Hsp90AA1, sobre-expresadas en HTR-8/SVneo, median relaciones con proteínas vinculadas a vías de señalización, como RhoA, Rad32A, PPP2R1A y NME1, cuya expresión no presentaba cambios significativos entre los dos modelos (Figura 2-22). Esto sugiere que las diferencias entre las células HTR-8/SVneo y JEG-3 se pueden deber a cambios en el nivel de expresión de proteínas adaptadoras y chaperonas que regulan la actividad de transductores de señal. La presencia diferencial de enzimas antioxidantes y metabólicas en las células JEG-3 la vinculan con procesos adaptativos y de supervivencia, adicionales a una regulación negativa de la apoptosis, a diferencia de las células HTR8/SVneo. La expresión diferencial de proteínas scaffold y adaptadoras - que regulan la activación de vías de señalización - sugiere diferencias en los circuitos moleculares activados en cada modelo, que pueden explicar las diferencias de comportamiento y regulación. Estos resultados y las posibles implicaciones se abordarán en el Capítulo 4, donde serán discutidas. Por otro lado, el aumento de la IL-18 en JEG-3 podría estar permitiendo la generación de un nicho pro-inflamatorio al aumentar la producción de IFN-γ y activar células Th1, que conduce a un reclutamiento y activación de macrófagos, remodelación del tejido y angiogénesis (nextprot, release 2016-08-25). Esto sugiere una influencia de las células de trofoblasto sobre el microambiente y el sistema inmune que es abordada en el Capítulo 3. Dentro de las proteínas con mayor aumento en JEG-3 resaltan proteínas vinculadas a cáncer y metástasis como la subunidad reguladora 2 de la proteína fosfatasa 1 (PPP1R2), las proteínas S100A4 y S100A11, la proteína 5 que contiene el dominio de unión a nucleosomas del grupo de alta movilidad (HMGN5) y la proteína tumoral D52 (TPD52), entre muchas otras, cuyo perfil de expresión y funciones descritas concuerdan con las características celulares observadas en JEG-3. Particulamente el estudio de la PPP1R2 puede ser interesante y necesario. Adicionalmente, en base a las proteínas identificadas en HTR-8/SVneo se vinculan procesos biológicos que resaltan la capacidad de adhesión y migración de estas células, incluyendo una alta regulación y dinámica del citoesqueleto de actina, propio del fenotipo invasivo de esta línea celular.

Capítulo 2 135

El resumen de las proteínas identificadas, los procesos biológicos en los cuales pueden potencialmente participar y las implicaciones de esto se condensa en la Tabla 2-12 y Tabla 2-14. Tabla 2-12 Resumen proteínas expresadas diferencialmente en JEG-3 vs. HTR-8/SVneo

Hallazgos Proceso propuesto Implicacación en malignización

NME1¨ S100A11*↑↑↑ PCNA*^↑ SET*↑ ANP32A, B y E*↑

SERBP1*, HMGN5*↑ HMGA1*↓

Aumento replicación, respuesta a daño y reparación de ADN y

modificación de histonas Mayor tasa replicativa,

resistencia a la apoptosis, Supervivencia y

homeostasis celular redox Txn*^¨, PRDX 1*, 2*^¨ y 6*^¨↑↑ DLD*, PDIA3*↑

Mayor capacidad antioxidante intrínseca

PKM*^↓ GPI* ALDOA* GAPDH*^,↑ PGK1*, Eno1* y Eno3*↑ LDHA y B*^↑ MDH2*↑

Aumento de la glicólisis y producción de lactato;

gluconeogénesis

Modificación y reprogramación metabólica

y energética

ECHS1*, DLD*, OXCT1*, HSD17B10*y HIBADH* ↑↑

Metabolismo de estrógenos, andrógenos y ácidos grasos,

degradación de valina, leucina e isoleucina

ALDOA*, TALDO1*, PRPS1*, GPI* ↑

Aumento de la vía de las pentosas fosfato

AK1*, AK2*↑ HPRT1*, APRT* ↑↑

Metabolismo de AMP y adenina salvage

CLIC-1* y CLIC4*↓↓ Metabolismo del glutatión Txn*, PRDX1*, 2*↑

1433Z*, B*, G*, S*, F*↑ LRPPRC*↑ GPI**↑

Regulación de genes metabólicos por p53

14-3-3Z¨*^, B¨*^, F*, G*, S(SFN)* ↑↑ SERBP1*↑↑ HSPB1*^¨↓

Alteración en la estabilidad , degradación y activación de

transductores y efectores claves

Cambio en la activación de vías de señalización, del

programa transcripcional y regulación del ciclo celular

y apoptósis

IL-18*↑↑↑

DAF/CD55↑↑↑

Aumento producción IFNγ e IL-17, proliferación de NK y

activación de Th1 Regulación de la activación del

complemento

Creación de nicho inflamatorio, con aumento

de angiogénesis . Polarización respuesta

hacia Th1.

PPP1R2*↑↑↑ Regulador / inhibidor de la Ser/Thr fosfoprotein fosfatasa 1

Implicado en carcinogénesis multietapas

S100A4 y S100A11*↑↑↑ Aumento de la señal por EGF Inductor de metástasis ¨proteoma total estimulado (E2D, Tabla 2-2), ^sub-proteoma de citoplasma basal (E2D, Tabla 2-3), * cuantificación proteoma total basal (SILAC, Tabla 2-5 y Tabla 2-6) Ver Material Suplementario Capítulo 2 Análisis SILAC.

Correlación con características celulares y habilidades funcionales

Las diferencias observadas en el comportamiento de las células trofoblásticas, modeladas con la línea HTR-8/SVneo, y las células tumorales, modeladas con la línea JEG-3, se pueden explicar en base a las proteínas diferencialmente expresadas entre los dos modelos. En principio, la estimulación con SFB resalta las habilidades compartidas entre el trofoblasto y las células tumorales, como el alto nivel de proliferación, migración,

136 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

invasión y angiogénesis; sin embargo, existen diferencias en la generación de estas respuestas, como se vio al inicio del capítulo, y que se pueden explicar en base a las proteínas identificadas, tanto de forma basal como producto de la estimulación con SFB al 10%, resaltando enzimas vinculadas a procesos metabólicos, proteínas adaptadoras y chaperonas. Como se mencionó durante la discusión de la caracterización celular, las células JEG-3 presentan una mayor tasa metabólica y de proliferación en comparación con células HTR-8/SVneo (Figura 2-7), así como una mayor producción basal de lactosa y consumo de glucosa (Figura 2-6), lo cual concuerda y se explica con el aumento en la expresión de enzimas vinculadas a la vía de la glicólisis y de las pentosas fosfato, como se observó por proteómica (Tabla 2-8 y Tabla 2-12). Adicionalmente, para explicar la disminución en la producción de lactato con suero al 10% a pesar de la alta tasa de proliferación/actividad metabólica de JEG-3, se propuso la captación de lactato a través de transportadores tipo MCT1 para su conversión a piruvato por lactato deshidrogenasa, tal como había observado Sonveaux (Sonveaux et al., 2008). Gracias al análisis SILAC, las lactato deshidrogenasa A y B se encontraron aumentadas en JEG-3, correlacionando con las observaciones metabólicas. Igualmente, el transportador 4 monocarboxilato MCT4 (SLC16A3) se identificó en el análisis SILAC, siendo un catalizador del transporte rápido a través de la membrana plasmática hacia el exterior de la célula de muchos monocarboxilatos como lactato, piruvato, oxoácidos de cadena ramificada derivados de leucina, valina e isoleucina, y los cuerpos cetónicos acetoacetato, β-hidroxibutirato y acetato (nextprot, release 2016-08-25). Aunque esta proteína no se presenta en la lista final ya que fue cuantificada únicamente con un péptido, este estaba aumentado 1,32 veces en las células JEG-3 (ver Tabla 2-13), lo cual concuerda con un aumento en la producción de lactato en JEG-3, a pesar de la falta de certeza estadística. Esta estrategia metabólica propuesta y sus implicaciones serán discutidas en el capítulo 4. Tabla 2-13 Datos identificación y cuantificación del transportador de monocarboxilato 4 Gene name MW [kDa] pI #Alt. Proteins Score #Pep. SC [%] RMS90 [ppm] Median

(L/H) # Pep. SLC16A3 49.4 9.2 1 96.6 (M:96.6) 2 4.5 4.12 1,37 1

Cmpd. Score #Cmpds. Range Sequence L/H AltPep. Rank IntCov. [%]

2013 64.6 (M:64.6) 1 429 - 441 K.LHKPPADSGVDLR.E 1.37 1 1 28 10990 32.0 (M:32.0) 1 217 - 224 R.LLDLSVFR.D 1 1 19

Cmpd. z m/z meas. Mr calc. m/z calc. Δ m/z [Da] RMS90 [ppm] RMS90 [Da] Int. 2013 3 468.9222 1403.7521 468.9246 -0.0024 9.84 0.0047 68948

10990 2 481.7858 961.5597 481.7871 -0.0013 9.04 0.0037 60160 Análisis SILAC: L/H: razón precursor liviano (JEG-3) / precursor pesado (HTR-8/SVneo).

Otros estudios comparativos de trofoblasto

En trabajos previos se compararon los fosfoproteomas de células HTR-8/SVneo y JEG-3 mediante E2D, observando grandes diferencias entre ellos, y evidenciando que a pesar de las posibles similaridades a nivel de la expresión de proteínas, cuando se estudian las modificaciones post-traduccionales como fosforilación los cambios se hacen más extremos (S. S. Novoa-Herrán, 2010). Este trabajo resaltó la necesidad de acudir a

Capítulo 2 137

estrategias metodológicas alternativas para el estudio comparativo de estas dos líneas celulares, como la marcación con isótopos estables en cultivo celular, SILAC. Mediante este abordaje se logró una adecuada comparación de los proteomas de la línea JEG-3 y HTR-8/SVneo que permitió identificar proteínas claves que explican su comportamiento. Se han realizado otros trabajos de enfoque proteómico con líneas celulares derivadas de trofoblasto y coriocarcinoma, como se había mencionado previamente en el capítulo 1, encontrando proteínas similares, aunque ninguno con el enfoque de este trabajo. A modo de ejemplo, al estudiar la respuesta a hipoxia en la línea celular BeWo, se observó que las peroxiredoxinas 1 y 2 y 1-Cys peroxiredoxina fueron inhibidas, mientras que la malato dehidrogenasa y enolasa fueron estimuladas, la expresión de las anexinas A2 y A5 fue incrementada y se encontró una expresión disminuida de la proteína 14-3-3 T en respuesta a la hipoxia (Hu et al., 2007). En un análisis comparativo de los patrones de expresión de genes asociados a invasión se encontró una expresión basal de proteasas, citoquinas pro-invasivas y sus receptores como IL-11, IL-32, IL-8, IL-1b, CSF1, LIFR, IGF1R y IL-4R aumentada en células de HTR-8/SVneo comparado con células de JEG-3. De forma similar a nuestros resultados, en ese estudio se encontró una sobre-expresión en células de HTR-8/SVneo de moléculas asociadas con vías de señalización que promueven la invasión, como la vía de señalización de MAPK y TGF-β, señalización por calcio, adhesión focal, interacciones receptor ECM, mientras que reporta en células JEG-3 una alta representación de moléculas asociadas con vías de señalización como carcinoma renal, cáncer de tiroides, señalización de insulina, p53, uniones estechas, etc. (Pankaj Suman et al., 2012). Respecto al presente trabajo, el análisis SILAC permitió observar un aumento de 4,97 veces en la expresión de la IL-18 en JEG-3, respecto a HTR-8/SVneo; mientras que en células HTR-8/SVneo hay un aumento de 1,47 veces en la expresión del factor de unión 2 potenciador de interleucinas (ILF2), proteínas que no habían sido reportadas previamente. En relación con la proliferación, se realizó un estudio del estado de genes relacionados con ciclo celular en JEG-3, en comparación con cultivos de trofoblasto temprano y a término, el cual reportó una pérdida de p57 en coriocarcinoma, mientras que el citotrofoblasto a término presentaba los niveles más altos de p27, comparado con citotrofoblasto temprano y JEG-3 (Richard et al., 2008). Se ha estudiado la expresión del supresor tumoral p53 en tejidos placentarios mediante inmunohistoquímica, encontrando un incremento en su expresión en citotrofoblasto de primer trimestre, especialmente en areas juxtastromales de las islas y columnas celulares, observando también su expresión en el EVT que invade al miometrio y muy poco en sincitiotrofoblasto (Marzusch et al., 1995). En otras líneas celulares transformadas con el oncogen SV40 se ha visto que este se une e inactiva reguladores del crecimiento celular como p53 y la proteína retinoblastoma pRb, sugiriendo que esta unión puede resultar en una esperanza de vida extendida, inmortalización y predisposición a tumorogenicidad (Khoo et al., 1998). Sin embargo, más alla de la inmortalización, aún no hay estudios que reporten o describan alteraciones en p53 o pRB en la línea HTR-8/SVneo, a nuestro conocimiento. En cuanto al perfil de miRNAs, Morales-Prieto et. al. estudiaron clústers de miRNAs asociados con cáncer como miR-9, el cual fue expresado en líneas celulares trofoblásticas de forma similar pero aumentada respecto a células primarias, debido quizás a la transformación con SV40 en HTR-8/SVneo y reflejando el origen de coriocarcinoma; por otro lado, obtuvieron una baja expresión de let-7g en coriocarcinoma

138 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

pero no en HTR-8/SVneo, lo cual corresponde con el carácter de supresor tumoral sugerido para let-7g. Finalmente los autores confirman la relación cercana entre células de HTR-8/SVneo y células trofoblásticas primarias, pero sugieren que las transformación de las células HTR-8/SVneo puede inducir una amplificación incontrolada y splicing de ADN viral, resultando en un genotipo heterogeneo (Morales-Prieto et al., 2012). Otros estudios del mismo grupo muestran una similaridad entre células de HTR-8/SVneo con cultivos primarios de primer trimestre, y de células JEG-3 con cultivos de segundo y tercer trimestre, basado en la expresión de miembros de C14MC para primer trimestre y HTR-8/SVneo y de los clústers C19MC y miR-371-3 para JEG-3 y tercer trimestre; sin embargo, tanto JEG-3 como HTR-8/SVneo expresan clústers característicos de primer trimestre como miR-941 (Morales-Prieto et al., 2014). Lo anterior brinda soporte a la caracterización de los modelos celulares trabajados y ayuda a explicar las diferencias observadas.

2.3.2 Efecto regulador del TGF-β en los modelos estudiados La respuesta de las líneas HTR-8/SVneo y JEG-3 al factor TGF-β se ha estudiado previamente, evidenciando defectos en la vía de señalización del TGF-β en la línea JEG-3 a nivel de la expresión SMAD3, transductor citoplasmático de la señal, lo cual podría explicar en parte la refractancia del coriocarcinoma a las acciones regulatorias de este factor (G. Xu et al., 2001a). No obstante, la vía de señalización del TGF-β interactúa a partir de sus receptores con otras vías, tales como MAPK, PP2A/p70S6K, RhoA y TAK1/MEKK1; lo que permite una versatilidad de la vía y diversificación de la respuesta al TGF-β, que agrega complejidad al sistema (Derynck & Zhang, 2003). Es por esto que en este trabajo se comprobó la expresión del receptor TβRII en las dos líneas (Figura 2-5), como un requisito inicial para la activación de la cascada de señalización y la generación de efectos funcionales consecuentes al tratamiento con TGF-β. A pesar de que JEG-3 expresa la mitad del nivel de TβRII presentado por HTR-8/SVneo, esto demuestra una capacidad inicial de respuesta al ligando. Dentro de los proyectos del grupo, actualmente se encuentra en evaluación la activación por fosforilación del receptor TβRII y su posible interacción con otras vías como MAPK y PI3K/Akt, como una respuesta alterna y diferencial de las dos líneas al TGF-β. El análisis DIGE del efecto del TGF-β en el proteoma de células HTR-8/SVneo y JEG-3 permitió no solo evaluar la respuesta individual de cada modelo a este factor, sino también comparar esta respuesta en búsqueda de diferencias del efecto del TGF-β en cada uno de estos modelos que puedan correlacionar con el fenotipo del trofoblasto invasivo o del coriocarcinoma y ayudar a explicar sus diferencias a nivel regulatorio. Así, efectos adicionales del TGF-β en esas líneas pueden inferirse a partir de las proteínas encontradas reguladas por este; en la Tabla 2-14 se resumen estos hallazgos y los procesos propuestos. Tabla 2-14 Resumen proteínas expresadas diferencialmente en respuesta al TGF-β

Hallazgos Proceso propuesto Implicación en la regulación HTR-8/SVneo

NIT↓ Metabolismo del nitrógeno Reprogramación metabólica y

trascripcional ANXA1, ANXA2↓ Síntesis y regulación de prostaglandinas

PKM2↓↑ Alteraciones de la glicólisis

Capítulo 2 139

HSPA8↑↑ HSP90AB1 y AA1↑ Procesamiento de proteína en

ER, vía de señalización de estrógenos

JEG-3 NIT↑↑ PKM2↑↑ Metabolismo del nitrógeno

Reprogramación metabólica y trascripcional

ZSCAN25↑↑ PTBP1↑↑ HSPD1↑

Regulación de la transcripción y del ARN

ANXA1, ANXA2↑ Síntesis y regulación de prostaglandinas

ATP5B↑↑ Regulación energética y pH

TEC↑↑ EPCAM↑↑ MAP3K2↑ Crosstalk con vía de

señalización mediada por integrinas y adhesión

TGF-β podría regular la señalización dependiente de integrinas disminuyendo la

adhesión intercelular EPCAM↑↑, Vim↑ Transición epitelial-mesenquimal

Proteoma total estimulado con TGF-β (DIGE, Tabla 2-9 y Tabla 2-10). Ver Material Suplementario Capítulo 2 DIGE

El TGF-β altera la unión intercelular de células HTR-8/SVneo y JEG-3

Adicional a la regulación potencial que podría ejercer el TGF-β sobre los complejos de adhesión focal, como se sugirió en el Capítulo 1, en este capítulo se estudió la formación y evolución de esferoides en respuesta al TGF-β. En cuanto a los resultados proteómicos, estos fueron enriquecidos en procesos como regulación de la dinámica de actina, fagocitosis, adhesión focal, uniones gap y uniones intercelulares, movimiento celular y curación de heridas, entre otras. Como se había mencionado, el trofoblasto tiene la capacidad de alterar su perfil de proteínas de adhesión en respuesta a cambios en el microambiente materno (Kilburn et al., 2000), proceso que puede ser regulado por el TGF-β en base a los presentes resultados. Se sabe que la adhesión celular puede servir como un regulador de apoptosis, de tal forma que las células normales fuera de su microambiente usual sufren de anoikis, o apoptosis inducida por pérdida de adhesión. La anoikis puede dificultar la metástasis a diferentes niveles, desde la transición epitelial-mesenquimal (TEM) inicial, pasando por la intravasación de las células tumorales y su supervivencia durante el transporte por el sistema vascular, hasta su extravasación y crecimiento en el nicho secundario (Geiger & Peeper, 2009). Una de las características de las células progenitoras y cancer stem cells es su capacidad de auto-renovación, incluyendo una propagación como esferoides, la cual involucra adhesión intercelular y proliferación independiente de anclaje (Bates et al., 2000). Weber et. al. habían descrito características de stem cells en la línea célular HTR-8/SVneo (Weber et al., 2013). A pesar de ser inmortalizada a partir de citotrofoblasto normal, esta presenta una plasticidad mayor y habilidades típicas de células malignas, en mayor grado que la línea de coriocarcinoma representativa de citotrofoblasto JEG-3, como se sugiere por los ensayos celulares. En este trabajo, la respuesta dual al TGF-β evidenciada en los resultados de MTS y la disminución de la expresión de NIT1 resalta este carácter de stem cell y permite vislumbrar un efecto adicional del TGF-β que podría ser del tipo pro-metastático y debe ser explorado con estudios adicionales. No obstante, la regulación ejercida por el TGF-β sobre proteínas relacionadas con adhesión celular en células HTR-8/SVneo, podrían estar aportando a los efectos anti-invasivos reportados del TGF-β, en el que no solo se están inhibiendo procesos, sino que a través de un proceso activo como el aumento de la adhesión celular y los contactos

140 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

célula-célula, evidenciados en la formación inicial de esferoides, se estaría regulando su capacidad de interacción con el microambiente. Los contactos intercelulares son de vital importancia para la supervivencia y crecimiento celular, además de regular la apoptosis (Bates et al., 2000), pero las implicaciones de estos resultados en la biología tumoral deben ser elucidados mediante estudios adicionales. Se sugiere ensayos funcionales adicionales de adhesión y la evaluación de proteínas como integrinas, FAK y ezrina y de las vías Rho, MAPK y PI3K/Akt (Supl Capitulo 2 DIGE). En cuanto a las células JEG-3, el aumento de vimentina y de EPCAM en respuesta al TGF-β, combinado con las observaciones en la formación de esferoides, puede indicar una pérdida de adhesión intercelular y una posible transición epitelial-mesenquimal. En adición, el aumento de la protein tirosin quinasa Tec y MAP3K2 podría indicar una sensibilización de la célula a estímulos mecánicos a través de vías de señalización mediadas por integrinas. Los resultados de este capítulo, junto con los del primero muestran que el TGF-β regula la expresión de nuevas proteínas de una forma específica al modelo de trofoblasto estudiado, sugiriendo nuevos efectos regulatorios como estabilización de adhesión focal, contactos adherentes célula-célula y ciliogénesis, en adición a los procesos clásicos ya descritos. El conocido efecto anti-invasivo del TGF-β, podría deberse no solo a una regulación negativa de las vías que conducen a invasión, sino también a una regulación positiva de procesos antagonistas a la invasión como la adhesión y contactos célula-célula, incluyendo interacción con otras vías de señalización.

Relación entre TGF-β y transporte de proteínas

Teniendo en cuenta la relación de las proteínas diferencialmente expresadas en respuesta al TGF-β como la anexina 2 con procesos como gemación de membrana, regulación de la internalización de receptores y fusión de vesículas, así como el enriquecimiento en términos como fagosoma y tráfico vesicular, es lógico penar en una liberación de vesículas extracelulares y exosomas, proceso incluido dentro de la deportación del trofoblasto y el shedding, en el cual el TGF- β puede tener algún efecto regulatorio que vale la pena estudiar. Conclusiones En síntesis, se encontró en células JEG-3 la expresión diferencial de proteínas vinculadas con actividad metabólica, antioxidante, regulación de la expresión génica y degradación proteosómica, relacionadas con procesos celulares, incluyendo el ciclo celular, replicación y respuesta al estrés oxidativo, sobre-expresadas en las células de coriocarcinoma en relación a las de trofoblasto, lo que podría implicar una estrategia de transformación y supervivencia maligna, como se discutira en el capítulo 4. En conclusión, se encontró que: Las líneas celulares HTR-8/SVneo y JEG-3 expresan el receptor del TGF-β (TβRII). La línea celular JEG-3 presenta una tasa metabólica y de proliferación mayor que

HTR-8/SVneo, que correlaciona con una expresión diferencial de proteínas vinculadas a glicólisis / gluconeogénesis, entre otras vías metabólicas.

Capítulo 2 141

La alta tasa de proliferación que exhibe JEG-3 correlaciona con la sobre-expresión de proteínas asocidas a reparación de ADN y actividad antioxidante, que contrarrestan el estrés mitótico asociado.

El TGF-β afecta de forma diferencial la proliferación celular en los dos modelos, y la respuesta a este está influenciada por las condiciones de cultivo.

La homogenización de las condiciones de cultivo disminuye las diferencias a nivel de proliferación entre células HTR-8/SVneo y células JEG-3.

El TGF-β modula de forma diferencial el proteoma de las líneas HTR-8/SVneo y JEG-3.

El TGF-β altera la unión intercelular de células de la línea HTR-8/SVneo, según ensayo de formación de esferoides.

El perfil proteómico comparativo por SILAC muestra para JEG-3 más proteínas reguladas al alza y con incrementos mayores que las registradas para HTR-8/SVneo.

Entre las proteínas sobre-expresadas en células JEG-3 en comparación con células HTR-8/SVneo se destacan PPP1R2, PCNA, tioredoxina, peroxiredoxina 1, 2 y 6, y 14-3-3 sigma, eta, beta/alfa, gama y zeta/delta y S100A4 y A11.

Como perspectivas de este capítulo, el control de la expresión de la proteína NME1 debe ser estudiado a profundidad entre los dos modelos, asi como las funciones moleculares de las proteínas 14-3-3 y PP1R2.

3. Capítulo 3: Estudio de vesículas extracelulares derivadas de trofoblasto

La malignización celular y el desarrollo del cáncer no solo se deben a factores intrínsecos a la célula, como mutaciones y alteraciones en el proteoma, sino también requieren de un microambiente adecuado y permisivo, que incluso favorezca y promueva la tumorogénesis. Así pues, igual de importante a la célula tumoral es el microambiente tumoral, el cual es un complejo conjunto de elementos celulares y estructurales, e incluye moléculas claves como metabolitos y nutrientes, factores solubles y de señalización y componentes de la matriz extracelular, que orquestan el destino de la célula tumoral, promoviendo la plasticidad y los programas de adaptación. En este es destacable un repertorio de células reclutadas ostensiblemente normales, que contribuyen a la adquisición de los rasgos distintivos del cáncer mediante la creación del microambiente tumoral (Hanahan & Weinberg, 2011). Paralelamente, algunas células tumorales, tanto en el tumor primario como en el sitio metastático, aprovechan a las células del microambiente para incrementar su potencial metastático, involucrando fibroblastos residentes y progenitores endoteliales y movilizando células derivadas de médula osea que promueven la progresión tumoral, escape y supervivencia de la célula maligna y crecimiento en el sitio secundario. Los tumores son capaces de reclutar un repertorio de células “normales” como: macrófagos que van a incrementar la angiogénesis y la migración, invasión e intravasación de la célula tumoral; células supresoras derivadas de células mieloides que suprimen la respuesta inmune a antígenos tumorales recién exhibidos; células madre mesenquimales que se diferencian en diferentes tipos celulares y plaquetas que las protegen durante la circulación sanguínea y colaboran en su alojamiento al tejido diana (Joyce & Pollard, 2009). Así como el microambiente tumoral determina la progresión de la célula tumoral, los tejidos del endometrio y la decidua controlan la función del trofoblasto, generando un ambiente adecuado para la implantación, placentación y crecimiento fetal. Esta interacción permite la diferenciación de citotrofoblasto (CT) a sincitiotrofoblasto (ST) y citotrofoblasto extravelloso (EVT), y la invasión de las arterias espirales maternas, generando una óptima oxigenación y nutrición fetal. Un elemento clave de este proceso son las células natural killer (NK) de la pared uterina, caracterizadas por su habilidad de producir citoquinas anti-inflamatorias; habilidad que parece depender de un cambio de fenotipo Th1 hacia Th2 en respuesta a factores maternos y paternos y es vital para el correcto desarrollo del embarazo (Lunghi et al., 2007). En todo caso, cada microambiente regula la función celular mediante una “comunicación molecular” en la cual diferentes moléculas de señalización, como hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, son

144 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

intercambiadas al ser secretadas por una célula y unirse a receptores en células diana vecinas, generando una señalización paracrina entre estas (Fitzgerald et al., 2005). Uno de los procesos celulares que últimamente ha cobrado gran interes es la secreción de vesículas membranales al entorno celular, conocidas en conjunto como Vesículas Extracelulares (EV), y que incluyen microvesículas, nanovesículas, ectosomas y exosomas, entre otros nombres. Estas complejas estructuras han mostrado afectar la fisiología de las células receptoras vecinas de varias formas, desde inducir una señalización intracelular tras su unión a receptores, hasta conferir nuevas propiedades a la célula receptora gracias a la adquisición de nuevos receptores, enzimas e incluso material genético transportado en las vesículas (Thery et al., 2009). Gracias a los estudios realizados en la última década se ha podido establecer que las proteínas transportadas por EV promueven la progresión del cáncer y la metástasis, con efectos en el microambiente tumoral y en sitios distante, a través de la “entrega” de moléculas “carga” activas como proteínas, lípidos, ARNm y miRNAs entre otros ARNs no codificantes (Tkach & Théry, 2016). La liberación de estas vesículas, incluyendo exosomas y ectosomas juega un importante rol en la comunicación intercelular, la modulación fisiológica de las células diana y el remodelamiento del espacio extracelular.

Clasificación de las Vesículas Extracelulares

En general, las EVs son vesículas enmarcadas en una bicapa lipídica, con proteínas transmembranales y conteniendo o “cargando” componentes hidrofílicos solubles derivados del citosol de la célula donora, que son secretadas por esta al entorno extracelular. En estas, la orientación de la membrana, y por ende de sus proteínas, es la misma que la correspondiente en la célula donora, de tal forma que pueden considerarse “versiones miniatura de una célula” (Thery et al., 2009). Las EVs se clasifican de acuerdo a su origen o vía de secreción, tamaño y componentes o marcadores de superficie (Tabla 3-1, Figura 3-1). Típicamente, las proteínas son secretadas por la ruta clásica de secreción de proteínas con péptido señal y procesamiento a través del Retículo Endoplasmático y Aparato de Golgi; pero cuando son secretadas a través de EV existen dos mecanismos de secreción o exocitosis: 1) la vía de secreción que involucra la vía endocítica en la que un endosoma temprano evoluciona a un cuerpo multi-vesicular (MVB), conteniendo vesículas intraluminales (ILV) que constituirán los exosomas (40-100 nm) una vez sean liberados al medio extracelular tras la fusión del MVB con la membrana plasmática; 2) la vía de secreción que inicia en la membrana plasmática y genera vesículas generalmente grandes y heterogeneas (500-1.000 nm) a partir de brotes o gemaciones de la membrana plasmática, tales como oncosomas, ectosomas y microvesículas (György et al., 2011; Simpson et al., 2008; Thery et al., 2009) De todos estos, los exosomas son los más interesantes y estudiados. Los exosomas son propuestos como importantes organelos de comunicación extracelular, ricos en moléculas de señalización (Mathivanan et al., 2010), los cuales pueden mediar una señalización paracrina al ejercer sus funciones biológicas por contacto directo entre moléculas de superficie en la vesícula y células diana, endocitosis de estas o fusión con la membrana celular (György et al., 2011). Los exosomas parecen inducir y modular vías de señalización que controlan destinos celulares tales como las vías Hedgehog (Hh), Wnts, Notch, TGF-β, EGF y FGF, situándolos en un contexto de desarrollo fisiológico,

Tabla 3-1 Características de algunas poblaciones de EV.

Exosomas Microvesículas MV Ectosomas Partículas membranales

Vesículas similares a exosomas

(nanopartículas)

Cuerpos apoptóticos

Rango de tamaño ~50-100 nm 100-1.000 nm 50-200 nm 50-80 nm 20-50 nm 1-5 μm / 50-500

nm Densidad en

sucrosa 1,13-1,19 g/mL ND ND 1,04-1,07 g/mL 1,1 g/mL 1,16-1,28g/mL

Sedimentación 100.000 g 10.000 g 160.000 - 200.000 g

100.000 -200.000 g 175.000 g 1.200 g, 10.000

g o 100.000 g Apariencia por

EM * “forma de copa” * Forma irregular y electrónica/ densa

Estructura bilaminar redonda Redonda Forma irregular Heterogenea

Composición lipídica

Enriquecidas en colesterol,

esfingomielina y ceramida; contienen

balsas lipídicas; exponen

fosfatidiliserina

Exponen fosfatidiliserina

Enriquecidas en colesterol y

diacilglicerol; exponen

fosfatidiliserina

ND No contienen balsas lipídicas ND

Marcadores proteicos

Tetraspaninas (CD81, CD63, CD9), Alix, LAMP1 y Tsg101; unión a Anexina V,

Integrinas, selectinas y ligando CD40; unión a

Anexina V, factores tisulares y marcadores específicos celulares

CR1 y enzimas proteolíticas; no

CD63

CD133, no CD63 TNFRI

Unión a Anexina V,

contenido de ADN

Origen intracelular

Compartimentos internos (endosomas) Membrana plasmática Membrana

plasmática Membrana plasmática

¿Compartimentos internos? ND

Mecanismo de generación Exocitosis de MVBs

Brotación / formación de “ampollas” de la

membrana plasmática

Brotación / formación de

“ampollas” de la membrana plasmática

¿Exocitosis de

MVBs (diferentes tipos de MVE)?

Liberación de vesículas de

células apoptóticas

Secreción Constitutiva e inducida

(dependiendo de la célula)

Regulada (tasa baja), constitutivo en tumores

(oncosomas)

Regulado (neutrófilos)

Regulado (células

apoptóticas) Compendio de características fisicoquímicas, adaptado de: (György et al., 2011; Thery et al., 2009). ND, no determinado.* discusión de la forma

en la sección Microscopía electrónica.

… mantenimiento y homeostasis. Además de ser transportadores de estas señales, la secreción de exosomas puede ser inducida por estas mismas proteínas y señales. Por otro lado, la desregulación de estas vías de señalización está relacionada con muchos tipos de cáncer, y se ha visto que las señales transportadas por exosomas pueden modular y dar forma al microambiente de células tumorales, por lo que se les ha dado un gran valor como determinantes en el diagnóstico y tratamiento dirigido de enfermedades como el cáncer (Wendler et al., 2013). Figura 3-1 Proceso de generación de vesículas y acción extracelular

Novoa-Herrán, 2016. Basado en (Simpson et al., 2008; Thery et al., 2009; Thery et al., 2002).

Adicional a los exosomas, se han descrito los ectosomas como vesículas membranales extracelulares bioactivas que pueden jugar roles en la comunicación intercelular y el remodelamiento del espacio extracelular, a través de la degradación de la matriz extracelular (ECM). En un estudio se observaron ectosomas secretados por el cilio primario actuando como transportadores de proteasas necesarias para la liberación de células hijas tras la mitosis (Wood et al., 2013).

Proceso de deportación del trofoblasto

Particularmente la placenta genera un proceso de deportación de agregados trofoblásticos y pérdidas de material que son vertidos en la circulación sanguínea y pueden llegar a alojarse en diferentes órganos maternos como los pulmones, incluso

Capítulo 3 147

años después del parto, el cual se considera actualmente como un proceso fisiológico normal (Chamley et al., 2014). La deportación del trofoblasto es el proceso de transporte de agregados nucleares sincitiales (SNAs) del sitio placental a los pulmones maternos, pudiendo ser transcripcionalmente activos y viables. En adición a este proceso, un amplio rango de material derivado del trofoblasto es perdido o extruido de la placenta (shedding) y vertido a la circulación sanguínea materna, material denominado en conjunto como residuos trofoblásticos (debris), pero que incluye EVs como exosomas y ácidos nucléicos libres (Askelund & Chamley, 2011) (ver Tabla 3-2). Tabla 3-2 Rango de material trofoblástico perdido de la placenta a la circulación materna

Nombre Tamaño Fragmentos de tamaño

celular

Agregados sincitiales multinucleados ~20-200 μm Citotrofoblastos mononucleares ~25 μm

Fragmentos citoplasmáticos anucleares ~2-10 μm Fragmentos

de tamaño de ácidos

nucléicos

Fragmentos de citoqueratina Microvesículas de sincitiotrofoblasto STBMs ≥ 100 nm

Exosomas de trofoblasto < 100 nm ADN y ARN libre

Adaptado de (Askelund & Chamley, 2011). Las microvesículas de ST (STBMs, denominadas micropartículas por autores como Tannetta y Chamley) pueden originarse de la fragmentación controlada del trofoblasto, anterior a la muerte celular (cuerpos apoptóticos), o derivadas de la pérdida o recambio del ST en las microvellosidades debido a una perturbación mecánica. Por su parte, las nanovesículas pueden originarse vía formación de ampollas de la membrana plasmática (STBMs), o por liberación de exosomas a traves de la vía endosomal, tras la fusión de MVBs con la membrana plasmática (Chamley et al., 2014; Pantham et al., 2011). En relación con los exosomas, parece ser que su tráfico en el microambiente placental se vincula con la organización de la interfase placental, la tolerancia fetal, la protección viral y posiblemente con la comunicación materno-fetal, procesos en los cuales los exosomas no solo están transportando material entre células, sino que pueden tener un rol en el desencadenamiento de la fusión celular, importante proceso requerido durante la formación del ST (Record, 2014). Se ha sugerido que este material deportado del trofoblasto puede jugar un rol en la tolerancia del sistema inmune materno durante embarazos normales, siendo un mecanismo de la placenta para modular su microambiente. A pesar de que este proceso se presenta en todos los embarazos, en casos de pre-eclampsia/eclampsia, la enfermedad más común en mujeres embarazadas, existe un incremento en la tasa de deportación y pérdida de material trofoblástico, donde este es principalmente de tipo necrótico y genera una activación de las células endoteliales pulmonares maternas, lo que contribuye a la patología de la pre-eclampsia (Pantham et al., 2011). Gracias a la evidencia acumulada en la última década es posible plantear que, en un escenario normal, se produce una pérdida “segura” tipo apoptótica de residuos trofoblásticos, en la cual los exosomas pueden suprimir la activación de células T, y los nódulos sincitiales van a ser fagocitados por macrófagos que se polarizan a M2, generando un aumento en citoquinas anti-inflamatorias como IL-10 e IDO, y una

148 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

reducción en citoquinas pro-inflamatorias, como IL-1β, conduciendo en conjunto a la tolerancia inmune materna a los antígenos placentales/fetales. Por el contrario, en casos de pre-eclampsia hay una pérdida “peligrosa” de residuos trofoblásticos, de tipo aponecrótico o necrosis secundaria: la fagocitosis de un mayor número de nódulos sincitiales y STBMs por el endotelio y monocitos genera un aumento de citoquinas pro-inflamatorias, como IL-6 y TGF-β1, de ICAM-1 en células endoteliales, y de TNF-α, IL-12 e IL-18 en monocitos, lo que aumenta la adhesión de monocitos al endotelio, que conduce a una activación celular endotelial; al tiempo que hay formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) con secreción de IL-8, lo que en conjunto puede conducir a una disfunción del endotelio, contribuyendo a la presión alta sistémica de la pre-eclampsia (Pantham et al., 2011). Por consiguiente, el material liberado por el trofoblasto tiene implicaciones tanto en procesos fisiológicos como patológicos, y el estudio de su contenido proteico es prometedor. La hipótesis de este capítulo es que las células de trofoblasto y coriocarcinoma pueden comunicarse y modular su microambiente mediante la liberación de EVs como ectosomas y exosomas, las cuales podrían regular la regulación del microambiente. El estudio del contenido proteico de EVs derivadas de trofoblasto que incluyan exosomas, permitiría inferir la regulación y modulación que puede ejercer el trofoblasto sobre su microambiente, y de ese modo plantear posibles diferencias entre procesos fisiológicos y patológicos. El objetivo de este capítulo es estudiar vesículas extracelulares (EVs) derivadas de trofoblasto, mediante análisis proteómico y bioinformática. El papel de las proteínas identificadas se discutirá en relación con procesos y redes biológicas que puedan ser moduladas por el trofoblasto en células receptoras o diana del microambiente o en sitios distantes. La línea celular inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo (Graham et al., 1993) y la línea celular derivada de coriocarcinoma JEG-3 (Kohler & Bridson, 1971) son usadas como modelos biológicos, estimulandolas con TGF-β, el cual afecta de forma diferencial su función como se ha explicado anteriormente. Este capítulo fue desarrollado en el Laboratorio de Placenta, asociado al Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania, durante el desarrollo de una estancia de investigación bajo la dirección del Prof. Dr. med. Udo Markert y la Dra. Diana Morales. Durante el desarrollo de esta estancia, recibí el premio “ImmunoTools special Award 2015”, otorgado por la compañía alemana ImmunoTools, para el desarrollo del proyecto de esta sección. El método de aislamiento de EVs fue una adaptación del protocolo empleado en el Laboratorio de Placenta, con el fin de obtener un extracto proteico adecuado y suficiente para su posterior análisis proteómico. Las EVs fueron aisladas por utracentrifugación diferencial como dos poblaciones: microvesículas (“MP” a 18.890 g) y nanovesículas incluyendo exosomas (“Exo” a 100.000 g), y caracterizadas por Análisis de seguimiento de nanopartículas (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), Microscopía electrónica, perfil proteico por SDS-PAGE e Inmunoblot. Finalmente, el perfil proteómico de la población de exosomas fue analizado mediante Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en tándem y análisis bioinformático. Este proyecto es una primera aproximación, de tipo exploratorio, para conocer el contenido proteico de las EVs derivadas de trofoblasto, lo cual puede ayudar a comprender la comunicación intercelular e interacción entre las células trofoblásticas y el microambiente materno, estudio que incluye células de coriocarcinoma, y la influencia

Capítulo 3 149

que puede tener el TGF-β sobre el perfil proteico de las EVs derivadas de trofoblasto, considerando el potencial que tienen los exosomas y otras vesículas secretadas por el trofoblasto de modular la fisiología de células vecinas, con la posible generación de un microambiente restrictivo o permisivo en relación con la malignización.

3.1 Aislamiento de vesículas extracelulares En práctica las preparaciones de EV que se obtienen son heterogeneas y los protocolos disponibles solo permiten el enriquecimiento de un tipo sobre otro. Por otro lado, las EVs obtenidas pueden ser clasificadas de acuerdo a la presencia de diferentes, pero no necesariamente todas las características enumerdas en la Tabla 3-1 (Thery et al., 2009). En el caso de los exosomas, algunos autores consideran que no se cuentan con marcadores exclusivos, ya que los exosomas en si mismos pueden tener una composición heterogenea (Yoshioka et al., 2013). Adicionalmente, la resistencia a los detergentes de las diferentes poblaciones de EVs es variable: se ha visto que el Tritón X-100 al 0,1% permite la lisis de EV (específicamente microvesículas MV) sin afectar los agregados de proteína, proponiendo a la lisis diferencial con detergentes como una estrategia para la exclusión de señales no vesiculares que imiten a MV durante la citometría de flujo (György et al., 2012). Por otro lado, los exosomas contienen altas cantidades de colesterol, esfingomielina, gangliósido GM3 y lípidos que están enriquecidos de forma típica en membranas resistentes a detergentes (DRM) y balsas lipídicas (Ikonen, 2001), y la mayoría de las proteínas asociadas a exosomas, como MHC II y tetraspaninas, son insolubles en buffers con CHAPS al 1% y solo ligeramente solubles en Triton X-100 al 1% (a 0°C) (Wubbolts et al., 2003); adicionalmente, las tetraspaninas sufren de palmitoilación y también se asocian con colesterol y gangliosidos, constituyendo microdominios lipídicos en la membrana (microdominios enriquecidos en tetraspaninas, TEM) que difieren de las balsas lipídicas en su resistencia a los detergentes (menor resistencia a CHAPS y mayor solubilidad en Tritón X-100 a bajas temperaturas), composición y funciones específicas (Hemler, 2003). De forma interesante se ha visto que las moléculas de MHC II asociadas a exosomas son insolubles en CHAPS (CHAPS 1% a 0°C), a diferencia de las que residen en la membrana plasmática, pudiendo deberse al hecho de ser incorporadas a una red de tetraspaninas y membranas resistentes a detergentes (DRM) durante la generación del MVB (Buschow et al., 2009). Estas características evidencian el desafío a la hora de lisar los exosomas y solubilizar las proteínas derivadas de exosomas, así como la heterogeneidad de las EVs que se pueden llegar a obtener. Teniendo en cuenta lo anterior, en este trabajo nos enfocamos en obtener una población de EVs enriquecida en exosomas, comprobando la presencia y enriquecimiento en marcadores de exosomas, más que pretender obtener una población exclusiva de estos. Los objetivos específicos de esta sección son: aislar EVs derivadas de cultivos celulares de trofoblasto, que incluyan exosomas mediante ultracentrifugación diferencial, y obtener extractos proteicos de estas EVs adecuadas para el análisis proteómico por nLC ESI MS/MS. Para esto se ajustaron las condiciones de cultivo, incluyendo la producción y uso de Suero Fetal Bovino (SFB) libre de EVs bovinos, y se implementó un procedimiento de aislamiento y lisis de vesículas, partiendo del protocolo “Purificación de Vesículas Extracelulares (EV)” (Aufreinigung extrazelluläre Vesikel (EV)) del Laboratorio de Placenta de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, laboratorio en el que se realizó el cultivo celular, obtención de EVs y extractos proteicos y análisis bioquímico. La

150 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

ultracentrifugación se llevó a cabo en el laboratorio del grupo de Biología Molecular Ginecológica, del mismo Departamento. Durante la implementación del procedimiento para obtener EVs derivadas de trofoblasto adecuadas y suficientes para el análisis proteómico, fue necesario considerar varios factores y realizar diferentes labores y ensayos preliminares, con el fin de asegurar la reproducibilidad, minimizar la presencia de EVs que no son objetivo del trabajo y optimizar la sensibilidad: 1. Remover las EVs bovinas presentes en el SFB, con el fin de reducir la contaminación

y desplazar el rango dinámico, centrándolo en las EVs derivadas del cultivo celular. 2. Determinar la cantidad inicial de células y de medio condicionado a obtener, con el fin

de maximizar la cantidad de EVs obtenidos, minimizando la muerte celular. 3. Definir una estrategia de recolección del medio condicionado y pool durante el

procedimiento, evitando las pérdidas en la cantidad y calidad del material. 4. Optimizar el procedimiento de lavado durante la ultrecentrifugación, para reducir la

contaminación de las EVs con proteínas séricas bovinas. 5. Establecer una estrategia de lisis empleando una mezcla de detergentes, para

obtener un extracto proteico soluble en el menor volumen posible, y con la menor pérdida de material.

En general se empleó PBS de alta calidad (PBS pH 7,4, 1X, Gibco), cuya pureza con respecto a nanopartículas fue evaluada rutinariamente por NTA (Nanosight).

Eliminación de EVs bovinas

Las EVs fueron obtenidas en medio de cultivo con SFB al 10%, condiciones de cultivo similares a las fisiológicas, con el fin de evitar procesos de autofagia debida a la inanición que puedan disminuir el número de MVB y por consiguiente de exosomas. Sin embargo, ya que el SFB presenta EVs bovinas, es necesario realizar una depleción de estas, previo a su empleo en cultivo. Las EVs bovinas fueron removidas por ultracentrifugación como se detalla en el Anexo E1 y se realizaron diferentes ensayos para verificar su remoción. Finalmente, el medio de obtención de exosomas fue una mezcla de F12/RPMI 1:1 con 10% de SFB libre de EVs (EV-libre). Las condiciones de cultivo finales fueron: 5 x 106 células por plato de 100 mm, cultivadas por 5 a 7 horas, deprivadas por 12 a 13 horas, lavadas con PBS (Gibco) por triplicado y cultivadas en 10 mL de medio F12/RPMI 1:1 con SFB EV-libre al 10% por 2 días (48 h). Se trabajaron de 3 a 7 platos correspondientes a réplicas biológicas (cultivos diferentes) para la obtención del medio condicionado que se trabajó como un pool durante la ultracentrifugación (30 ó 70 mL). Paralelamente, se aprovecharon los cultivos celulares de los que se obtuvo el extracto total de proteína con buffer RIPA y el extracto de ARN con Trizol. El cultivo celular fue monitoreado mediante microscopía óptica para verificar que las células estuvieran saludables y viables durante y al final del periodo de producción de exosomas, descartando la presencia de células apoptóticas o con morfología alterada. En adición, las líneas celulares del Laboratorio de Placenta son evaluadas rutinariamente para descartar la contaminación por mycoplasma. Paralelamente, se determinó si la depleción de EVs bovinas del medio de cultivo afectaba la viabilidad celular o su fisiología con respecto a un cultivo tradicional con SFB normal. Se evaluó la morfología celular por microscopía, proliferación mediante MTS a las 24, 48 y 72 horas y conteo celular a las 48 h y se midieron los niveles de hCG,

Capítulo 3 151

glucosa y lactato, sin observar cambios significativos con respecto al cultivo con SFB normal (ver Anexo E 1). Se concluyó que la depleción de EVs bovinos no está afectando los parámetros biológicos analizados en las condiciones estudiadas.

Lavado y recolección de EVs

Se comparó la remoción del sobrenadante por pipeteo o por vertimiento, evaluando cada muestra por NTA, SDS-PAGE y Dot blot, concluyendo que al eliminar por vertimento se perdían parte de los exosomas sedimentados por ultracentrifugación (Anexos D: DotBlot Figura 5-13 Bc y SDS-PAGE Figura 5-14 B). Se ensayaron diferentes buffers de lavado, incluyendo lavados con Tween al 0,05% en PBS, escogiendo un mayor número de ciclos de lavado del pellet con PBS lavado, en base a los resultados de NTA, SDS-PAGE y Dot blot (Anexos D 1). Finalmente se decide acoplar los pasos de transferencia del pellet a un tubo menor (30 mL a 5 mL) con los pasos de lavado de las proteínas contaminantes en cada pellet, implementando dos pasos generales de lavado del pellet con PBS. El protocolo que finalmente se siguió se ilustra en la Figura 3-2. Figura 3-2 Protocolo de ultracentrifugación implementado para la obtención de EVs

En base a las observaciones realizadas y como recomendaciones finales sugiero: Realizar vortex exhaustivo tras el descongelamiento de las muestras y cuando se

cambia la muestra de tubo. La pérdida de exosomas durante el almacenamiento parece ser debida a una adhesión superficial de estos al tubo.

152 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Transferir el sobrenadante mediante pipeteo, en vez de vertir directamente este de un tubo a otro, dejando algo de sobrenadante sin transferir sobre el pellet (para tubos de 33 mL, ½ cm ó ≈ 1 mL; para tubos de 5 mL, 2-5 mm ó 20-60 μL).

Cuando se deba fraccionar la muestra para ultracentrifugarla en más de un tubo, o se deba transferir el pellet a un tubo más pequeño (ej de 35 mL a 5 mL), reunir las fracciones antes del paso de lavado, y emplear las aguas de lavado para lavar el tubo a descartar y realizar una transferencia completa (para tubo de 35 mL, 2 mL PBS x 5; para tubo de 5 mL, 1 mL PBS x 5). Repipetear y realizar vortex; utilizar la formación de espuma como indicativo de la presencia de proteína.

Realizar la lisis en el tubo ultraclear, para evitar la pérdida de material. Se comprobó que los tubos ultraclear de Beckman resisten sonicación y congelamiento en N2 líquido.

Lisis de EV y obtención del extracto proteico

Como se explicó anteriormente, una de las grandes dificultades reportadas por otros investigadores es la lisis de EVs y la solubilización de proteínas transmembranales asociadas a exosomas. Ya que el pellet se obtiene en un pequeño volumen de PBS, se ideó un buffer basado en un buffer RIPA modificado (0,1% SDS), para el cual la concentración de los agentes buffer e iones estuvieran 1X (considerando la presencia de PBS en el que se encuentra la muestra) y con una concentración de detergentes y EDTA 5X (ver Anexo A 4a,Tabla 5-3); de tal forma que al agregar 1/5 de volumen de este a la suspensión de EVs en PBS, se obtenga un buffer de composición final: 150 mM de NaCl, 25 mM de Tris HCl pH 7,5, 10 mM de EDTA, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 0,5% de Na deoxicolato, incluyendo inhibidores de proteasa 1X (Buffer A) (ver Figura 3-3). Adicionalmente se trabajó con un buffer alternativo basado en el anterior, pero con la adición de los caeotropos Urea, a una concentración final de 1 M, y tiourea, a 0,4 M (Buffer B). No obstante, no se obtuvieron diferencias significativas entre los dos buffers empleados (ver Figura 3-4), optando por el buffer más simple.

Figura 3-3 Flujo de análisis físico y bioquímico de los exosomas aislados

3.2 Caracterización de vesículas extracelulares El objetivo de esta sección es caracterizar las EVs aisladas (microvesículas “MP” y exosomas “Exo”), a nivel físico y bioquímico. En la Figura 3-3 se ilustra el flujo final de trabajo a partir de la suspensión de exosomas (en 200 μL de PBS): 1. El análisis físico (Nanosight NTA y microscopía electrónica TEM) se realizó con una alícuota (50 μL) de la suspensión de exosomas, que se diluyó 1:10 con PBS; y 2. el análisis bioquímico (SDS-

Capítulo 3 153

PAGE, Inmunoblot y nLC MS/MS) se realizó tras la lisis de los exosomas con el buffer lisis (30 μL).

3.2.1 Caracterización bioquímica La caracterización bioquímica se realizó en el Laboratorio de Placenta. Mediante SDS-PAGE se comparó el perfil proteico de las EVs aisladas con el procedimiento inicial (Figura 3-4 y Anexo E Figura 5-13 C) y con el final (Figura 3-5), observando para la población de exosomas una efectiva reducción en las bandas contaminantes y un aumento en el número e intensidad de nuevas bandas. En general, el perfil proteico del extracto de exosomas (Exo) difiere del extracto celular completo (WC) y del medio condicionado depletado de EVs (m. EV-depletado), el cual contiene las proteínas secretadas de forma soluble por la célula además de las proteínas bovinas presentes en el suero. Esto indica una composición proteica específica y diferente, acorde a lo esperado para la biogénesis de los exosomas y la incorporación de moléculas carga; en este perfil resalta un alto número de bandas de peso molecular superior a 100 kDa y de 60 a 40 kDa, razón por la cual los análisis subsecuentes se llevaron a cabo en geles de poliacrilamida al 10%. En adición, mientras que el perfil proteico celular (WC) de JEG-3 y HTR-8/SVneo es muy similar, el perfil obtenido para el extracto de exosomas presenta claras diferencias entre un tipo celular y otro, sugiriendo la viabilidad de un análisis proteómico comparativo. Figura 3-4 Perfil proteico de EVs obtenidas con el protocolo inicial

40 uL del extracto obtenido* fueron separados en un gel al 12%, tinción con Azul de Coomassie y posteriormente con Plata. Exo: exosomas, MP: microvesículas. BfA: buffer lisis A; BfB: buffer lisis B. * concentración de Exo JEG-3 y HTR-8/SVneo ≈ 0.03 mg/mL, cantidad de proteína inferida: 6 μg. Por otro lado, el perfil proteico obtenido para las microvesículas (MP) es muy simple, pudiendo ser una combinación del extracto de exosomas con las proteínas solubles contaminantes, tal como se confirma mediante microscopía electronica (ver Figura 3-7).

154 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 3-5 Perfil proteico de EVs obtenidas con el protocolo final

10 µg de proteína fueron separados en un gel al 10% aa, tinción con Plata. MW: Spectra multicolor high range protein

ladder (Thermo, Lituania), Exo: exosomas, MP: microvesículas, WC: extracto celular total (whole

cell), m. EV-deplet: medio condicionado depletado de EVs.

Figura 3-6 Análisis por Dot Blot de marcadores exosomales

WC* lisado celular sin detergentes (PBS más coctel de inhibidores); medio condicionado inicial y precipitado; suspension en 200 μL de Exo y MP sin lisar. Dilución Ab 1 1:500, 2 μl de muestra /

punto. Exposición 5 min. La presencia de exosomas en el extracto obtenido fue confirmada mediante Inmunoblot. Dentro de los marcadores de exosomas se encuentran tetraspaninas, moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad MHC, moléculas de adhesión como ICAM e integrinas, proteínas de choque térmico como Hsp 70 y 90, Alix, Tsg101 y MFGE8, entre otras (Mathivanan et al., 2010). De estas, las más empleadas en la caracterización de exosomas son las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81. Se realizaron diferentes ensayos de WesternBlot contra CD63 y CD9, no obstante no se obtuvo señal debido a la interferencia de detergentes que afectan a la tetraspania y su reconocimiento por el anticuerpo. Por lo tanto, se realizaron ensayos de DotBlot para evalular la presencia de CD9 y CD63 tanto

Capítulo 3 155

en los extractos obtenidos para la población de exosomas, como en la suspensión de estos en PBS, y se comparó con el extracto celular completo, el medio condicionado inicial y el depletado de EVs. Los mejores resultados fueron obtenidos al trabajar directamente con la suspensión de EVs en PBS y con un extracto celular libre de detergentes, obtenido por lisis mecánica (ciclos ultrasonido y congelamiento/descongelamiento en N2) de las células en PBS con coctel de inhibidores. Se confirmó un enriquecimiento de exosomas en la población de EVs obtenida a 100.000 g, con respecto al medio condicionado inicial (incluso tras ser concentrado por precipitación), y sin obtener señal alguna en la suspensión de microvesículas obtenidas a 18.890 g o en el medio condicionado EV-depletado (removido por pipeteo). Cabe la pena resaltar que, mientras la tetraspanina CD-63 fue reconocida en los dos modelos celulares, siendo más intensa la señal en los exosomas derivados de JEG-3, para el caso de la tetraspanina CD-9 esta solo fue expresada por células HTR-8/SVneo, resaltando la importancia de emplear más de un marcador debido a la heterogeneidad de los exosomas.

3.2.2 Caracterización física

Microscopía electrónica

La microscopía electrónica ha sido el estándar ideal para la medición de vesículas, determinando no solo su tamaño sino también su forma o ultraestructura. La microscopía electronica de crio-transmisión (cryo-TEM) es una técnica que permite observar la ultraestructura de las vesículas en un estado cercano a su estado nativo, a diferencia de otros métodos de microscopía electrónica convencional, ya que la muestra se incorpora en hielo amorfo (vitrificación criogénica) gracias a un rápido proceso de enfriamiento y se mantiene durante la observación al vacío por debajo de -135°C, evitando los artefactos de tinción y secado que presentan otros procedimientos (Dubochet et al., 1988). Las imágenes de cryo-TEM fueron obtenidas gracias a la gentil colaboración del Ing. Frank Steiniger y del Dr. Martin Westermann del Centro de Microscopía Electrónica (Elektronenmikroskopisches Zentrum - EMZ), Departamento de Física, de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania. Se trabajó en un microscopio Philips-CM 120, 120 KV, con crio-transferencia Gatan 626-DH, resolución de 0,4 nm y fotodocumentador de imágenes 1k FastScan CCD-Camera. Las preparaciones de exosomas y microvesículas derivadas de cultivos de JEG-3 fueron directamente congeladas y observadas por cryo-TEM sin fijación química ni contrastante. En la Figura 3-7 se observan las diferencias entre la preparación de exosomas y la de microvesículas en las que fueron separadas las EVs. En la preparación de exosomas se observaron EVs concordantes con la ultraestructura y tamaño de exosomas, como vesículas de forma redondeada y bicapa lipídica (vista como una línea de puntos doble) con tamaño que oscilaba entre 150 y 60 nm. Se observaron características variadas que demuestran la heterogeneidad a nivel de EVs: EVs de diferentes tamaños, algunas altamente granuladas o densas y otras de contenido más ligero o suave (cabezas de flecha), así como proteína fija en la membrana de la vesícula; se detectaron vesículas con invaginaciones y pequeñas vesículas encapsuladas dentro de vesículas más grandes, creando EVs multicapas (flechas); en algunos casos las vesículas internas fueron deformadas de acuerdo a la forma de la membrana de la EV exterior.

156 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 3-7 Imágenes cryo-TEM de EVs derivadas de células JEG-3

Preparaciones A. exosomas y B. microvesículas; cabeza de flecha: EV tipo exosomas; flecha: EV multicapa

Capítulo 3 157

Adicionalmente se observó el rompimiento de EVs grandes (tipo microvesícula), con la documentación de posibles fragmentos de membrana y nanovesículas liberadas (imágenes no mostradas), así como nanofibras elongadas, posiblemente hebras de ADN o ARN expulsadas de las EVs rotas, y densos agregados de proteína. Sumado a esto, se observó un alto contenido de proteína libre que dominaba la muestra, probablemente proteínas del SFB que no fueron lavadas, y que atrapaban a la mayoría de las EVs en una especie de red o agregado (imágenes no mostradas). Por otro lado, para el caso de la población de microvesículas, se observaron micropartículas densas o altamente granuladas con tamaño entre 50 y 150 nm, y grandes agregados de proteína y micropartículas que parecen contener pequeñas vesículas similares a las que se observaron en la población de exosomas (cabeza de flecha). Se ha descrito que en el mismo rango de las microvesículas (100 nm a 1 μm) se suelen obsevan agregados de proteínas tales como complejos inmunes insolubles (György et al., 2011). Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para las microvesículas por SDS-PAGE, que muestra un perfil proteico de baja complejidad, ligeramente similar al obtenido para la preparación de exosomas y el medio con SFB. Diversos autores han descrito a los exosomas con morfología “en forma de copa” o cup-shaped, al grado que esta ha sido considerada una característica de los exosomas a diferencia de otras vesículas (Mathivanan et al., 2010) Sin embargo, esto parece ser un artefacto relacionado con la fijación para microscopía electrónica de transmisión (TEM), producto del congelamiento o fijación inadecuada de la muestra (comunicación personal Steiniger, Frank; 2015, oral)(Théry et al., 2006). Gracias a nuevas técnicas como la microscopía crio-electrónica (cryo-TEM) se logra revelar una forma redondeada simétrica, característica de vesículas membranales en su estado nativo.

Análisis de rastreo de nanopartículas (NTA)

A pesar de las ventajas de TEM para el análisis de vesículas, esta es una técnica intensamente laboriosa, cara y no es cuantitativa. A diferencia de esta, el Análisis de Rastreo de Nanopartículas, más conocido como Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) permite el conteo y medición del tamaño de nanopartículas en líquidos y su visualización directa y en tiempo real. Este sistema combina la microscopía de dispersión de luz laser con una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD); en este un rayo laser es incidido a través de la muestra y las partículas son visualizadas mediante dispersión de luz usando el microscopio; se toma un video y el programa NTA identifica cada partícula y rastrea su movimiento browniano. El coeficiente de difusión de las partículas se utiliza para calcular la concentración total y su tamaño, mediante la aplicación de la ecuación de Stokes Einstein a partir de la cual se deriva (Eq. 3.1):

(𝑥𝑥,𝑦𝑦)2��������� =4𝑇𝑇𝑘𝑘𝐵𝐵𝑡𝑡3𝜋𝜋𝜋𝜋𝜋𝜋ℎ

(3.1)

Donde kB es la constante de Boltzmann, t es el periodo de tiempo (dado en 1 cuadro por segundo) y (𝑥𝑥,𝑦𝑦)2��������� es el desplazamiento cuadrático registrado de cada partícula a temperatura T en un medio de viscosidad η, con un diametro hidrodinámico dh. (variable a obtener) (Griffiths et al., 2010). Este, a diferencia de otros métodos de dispersión de luz, permite resolver partículas de diferentes tamaños simultáneamente dentro de la misma solución, presentando la distribución de tamaños en la muestra; lo cual es un requisito previo esencial para el análisis de las EVs en muestras biológicas (Dragovic et al., 2011).

158 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Mediante NTA se midió el tamaño y concentración de las EVs aisladas por ultracentrifugación diferencial, tanto en la preparación de exosomas (Exo, 100.000 g) como en la de microvesículas (MP, 18.890 g). Estos análisis se realizaron con el sistema Nanosight (NanoSight Ltda, Amesbury, UK) del Instituto Leibniz de Tecnología Fotónica (Leibniz-Institutes für Photonische Technologien - IPHT) Jena, Alemania, gracias a la colaboración del Dr. Robert Müller. Las muestras se diluyeron con PBS (Gibco) a una razón de 1:5, para obtener un número de partículas por cuadro adecuado para el análisis. Para cada muestra se grabaron cuatro videos de 60 segundos en sectores diferentes de la zona óptima de la celda, generando cuatro replicas de histogramas que fueron promediados (ver Anexos A 13). Los valores reportados, incluyendo media, moda y desviación estándar de la distribución de tamaños de las nanopartículas son expresados como promedio de los cuatro videos grabados por muestra. Figura 3-8 Análisis de Rastreo de Nanopartículas (NTA) para EVs derivadas de líneas celulares de trofoblasto

A. Distribución de frecuencias del tamaño de EVs derivadas de células HTR-8/SVneo y JEG-3;

dilución 1:5 en PBS. Línea continua: promedio, línea punteada: SEM, n=4; eje izquierdo: exosomas (Exo), eje derecho: microvesículas (MP). B. fotograma de un video representativo de la

dispersión de la luz a partir de partículas sometidas a movimiento browniano.

Capítulo 3 159

Previamente, se probaron diferentes parámetros como el umbral de detección de partículas (threshold) y ganancia de la cámara (gain), determinando valores óptimos según la muestra a analizar. Se determinó que las muestras diluidas permiten un mejor análisis, siempre que se mantenga un mínimo de 10 partículas por imagen para que sea estadísticamente significativo; esto se puede deber a una disgregación de las EVs de la red de proteínas o agregados proteicos observada por microscopía (Figura 3-7), lo que permitiría una mejor resolución y análisis. Tras el ajuste de los parámetros y condiciones de medida se analizaron las poblaciones de microvesículas (MP) y exosomas (Exo) derivados del medio condicionado por células HTR-8/SVneo y JEG-3. Los resultados NTA mostraron una concentración y distribución de tamaños diferente para cada población de EVs aislada (Tabla 3-3). Como se puede apreciar en la Figura 3-8, la población de exosomas presenta una distribución homogénea y centrada por debajo de 150 nm, con tamaño modal cercano a 100 nm que demuestra su enriquecimiento en exosomas y ectosomas y concuerda con los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica cryo-TEM. En cuanto a la población de MPs, su concentración es cerca de diez veces menor que la obtenida para la población de exosomas y el rango de tamaños es mucho más amplio, presentando una distribución de frecuencia con múltiples picos, mayor desviación estándar, media superior a 200 nm y tamaño modal superior a 160 nm, lo que concuerda con las características de las microvesículas. El amplio rango y los picos por debajo de 100 nm posiblemente se deben a la presencia de una mezcla de exosomas y microvesículas con agregados de proteína, como se observó en las imágenes cryo-TEM. Tabla 3-3 Medición de EVs derivadas de líneas celulares de trofoblasto usando NTA

Células Población EV

Distribución de tamaño Recorridos

completados

[Inicial]

Media (nm) Moda (nm) SD (nm) partículas /mL

HTR-8/Svneo

Exo 151 ± 4 135 ± 11 69 ± 4 5.491 ± 363 (6,67 ± 0,48) E9 MP 205 ± 11 160 ± 17 104 ± 7 860 ± 112 (1,43 ± 0,22) E9

JEG-3 Exo 132 ± 3 104 ± 2 68 ± 11 3.328 ± 297 (3,94 ± 0,30) E9 MP 250 ± 15 259 ± 41 122 ± 15 269 ± 19 (4,77 ± 0,13) E8

Medición realizada sobre la dilución 1:5 en PBS. Valores expresados como promedio ± SEM, n= 4. Recorridos completados o recorridos válidos (Valid tracks). Es destacable que la concentración de EVs aisladas de células HTR-8/SVneo fue mayor que la obtenida para JEG-3. Y la distribución de tamaños para la población de exosomas de JEG-3 fue menor que para HTR-8/SVneo; mientras que, para el caso de las microvesículas, estas presentaron un tamaño mayor para JEG-3, comparado con HTR-8/SVneo. Adicionalmente, es importante tener en cuenta que la sedimentación no solo depende del tamaño, sino también de la densidad o “carga” de una partícula y la distancia que viaja cada partícula durante la ultracentrifugación. Así pues, se obtiene un rango de vesículas con tamaños diferentes en cada fracción obtenida por ultracentrifugación, que va a depender del contenido de las EVs aisladas. Finalmente, las EVs obtenidas en la población llamada Exo fueron vesículas redondas distinguiéndose una bicapa como membrana, con tamaño modal cercano a 100 nm y

160 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

media inferior a 150 nm, cuyo perfil proteico difiere del extracto celular y del medio condicionado y que se encuentran enriquecidas en CD63, marcador proteico de exosomas ausente en ectosmas y en partículas membranales, y no reportado en vesículas similares a exosomas. Su forma regular también podría descartar la presencia de microvesículas y vesículas similares a exosomas; no obstante, como ya se mencionó anteriormente, la forma de las vesículas bajo el microscopio electrónico depende de la preparación y forma de fijación. En base a lo anterior, es posible concluir que se obtuvo una preparación de EVs enriquecida en exosomas.

3.3 Análisis proteómico de EVs Los objetivos específicos de esta sección son analizar el perfil proteómico de las EVs enriquecidas en exosomas derivadas de líneas celulares de trofoblasto y determinar si la estimulación/tratamiento con TGF-β modifica diferencialmente el proteoma de EVs derivadas de los dos modelos celulares de trofoblasto. El análisis proteómico se llevó a cabo en el Centro de Investigación Septomic, Beutenberg Campus, grupo de investigación liderado por la Dra. Hortense Slevogt y adscrito al Hospital Universitario de Jena, Alemania, con la colaboración del Dr. André Schmidt del Laboratorio de Placenta en la digestión y preparación de las muestras por eFASP y del Dr. Roland Lehmann del Laboratorio de Septomic en la identificación de las proteínas por nLC ESI MS/MS y el análisis estadístico de los resultados. En general, las muestras fueron digeridas usando el método enhanced FASP (eFASP). La preparación de muestras ayudada por filtro o FASP (filter-aided sample preparation) es un método para preparación de muestras proteómicas que evita muchos de los problemas asociados con los métodos tradicionales de purificación de proteínas, al permitir eliminar contaminantes adicionados durante los procedimientos, adicional a las sales, ácidos nucléicos y lípidos presentes en la muestra. Sin embargo, este se asocia con una pérdida significativa de muestra. La propuesta eFASP incorpora reactivos alternativos a los usados en el FASP tradicional, mejorando la sensibilidad, recuperación y cubrimiento proteómico de la muestra procesada; la sustitución de ácido deoxicólico por urea durante la digestión tríptica incrementa la eficiencia de esta y evita los pasos de limpieza asociados al uso de la sal deoxicolato de sodio (Erde et al., 2014). Las muestras fueron analizadas por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tandem (nanoLC-ESI-MS/MS) usando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Tribid (Thermo Sci.) que combina los analizadores de masas cuadrupolo, trampa de iones y orbitrap en una arquitectura “tríbrida” que permite análisis más profundos al mejorar el cubrimiento del proteoma y las tasas de identificación de péptidos (Senko et al., 2013). Finalmente, se realizó un análisis proteómico cuantitativo libre de marcaje, en base a las intensidades de los precursores o LFQ intensity (label free quantification) para el análisis comparativo de la estimulación con TGF-β.

3.3.1 Análisis proteómico preliminar Inicialmente se realizó un análisis proteómico preliminar de las EVs enriquecidas en exosomas para validar la metodología implementada y determinar la viabilidad de un análisis proteómico comparativo. 5 millones de células JEG-3 fueron sembradas por plato de cultivo, como se indica en el Anexo A 1. Las células se dejaron adherir por 5 a 7

Capítulo 3 161

horas, fueron deprivadas de suero por 12 a 13 horas, lavadas 3 veces con PBS (Gibco) y cultivadas por 48 horas en el medio de obtención de EVs F-12 con 10% de SFB libre de EVs. Las EVs derivadas de JEG-3 fueron aisladas por ultracentrifugación diferencial a partir de un pool de 70 mL de medio condicionado proveniente de 7 platos de cultivo, y lisadas como se describió anteriormente (Anexo A 3 y 4a). 25 μg del extracto proteico de las EVs fue procesado por duplicado usando la técnica eFASP y analizado por nLC ESI MS/MS por triplicado, dando lugar a 6 análisis proteómicos (2 digestiones, 3 corridas LC, ver Anexo A 7g). Para cada proteína identificada se reporta la sumatoria de los puntajes de: cubrimiento, número de proteínas, número de péptidos y péptidos únicos y de PSM (Peptide Spectral Match) de los 6 análisis realizados. El PSM define una interpretación potencialmente correcta para un espectro de fragmento individual al comparar un espectro experimental MS/MS con un espectro teórico derivado de una secuencia de péptidos. 1.785 proteínas fueron identificadas por búsqueda en bases de datos (UniProt, 2015), de las cuales 1.134 corresponden a origen humano, siendo un 63,5% del total de proteínas identificadas, mientras que el restante 36,5% son únicamente bovinas, principalmente séricas y provenientes del SFB. Esto demuestra que a pesar de la contaminación con proteínas séricas bovinas registrada por microscopía electrónica, SDS-PAGE y análisis proteómico, se logró identificar un número elevado de proteínas humanas. Para el análisis bioinformático se eliminaron las proteínas cuyo origen no era humano sino únicamente bovino, ya que estas carecen de relevancia biológica al provenir del suero. Para las proteínas cuyo origen puede ser tanto humano como bovino se verificó la ontología de estas, incluyendo la especificidad de tejido y la localización subcelular reportada, para determinar si eran falsos positivos o no. Se realizó un análisis funcional y de ontología al set de proteínas de origen humano usando las herramientas bioinformáticas de DAVID (DAVID Bioinformatics Resources 6.7, NIAID/NIH) y los recursos de UniProt (UniProt release 2016_07). Las proteínas que presentaban anotaciones de localización subcelular (745 proteínas, 65,8% del total de proteínas humanas) fueron clasificadas como se muestra en la Figura 3-9. Dejando de lado al citoplasma por ser zona de paso de muchas proteínas, es destacable el número de proteínas con anotaciones de núcleo, membrana celular y espacio extracelular, incluyendo exosomas. También se tiene un alto número de proteínas con tránsito a traves de endosomas, retículo endoplasmático y aparato de Golgi, como es de esperarse teniendo en cuenta el proceso de maduración de los cuerpos multivesículares MVB que dan origen a los exosomas. De igual forma, proteínas pertenencientes a vesículas y gránulos citoplasmáticos, incluyendo melanosomas, los cuales pueden correlacionar con procesos de secreción. Por otro lado, se identificaron proteínas pertenecientes a organelos y estructuras como el cuerpo de procesamiento P (P-body), sitio de degradación del ARNm y control traduccional, y proteínas relacionadas con procesos de de señalización a nivel de membrana e intercción célula-célula y célula-matriz, como las de anclaje lipídico, proyección y unión celular. Se identificaron marcadores exosomales como: las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81, la proteína de choque térmico Hsp70, Alix (PDCD6IP), Tsg101, integrinas como ITGA6, ITGAV, ITGB1 y CD47, y moléculas MHC como HLA-C y HLA-G (Anexo E 3, Tabla 5-16 negrilla), así como proteínas de exosomas reportadas en otros estudios. Mathivanan et. al. elaboraron un reporte de proteínas comunes entre los estudios proteómicos de exosomas reportados en ExoCarta (perteneciendo mínimo al 26% de los 19 estudios

162 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

analizados) (Mathivanan 2010); de las proteínas reportadas un 72% (103 proteínas) coinciden con las proteínas identificadas en las EVs derivadas de células JEG-3 (Anexo E 3, Tabla 5-16 resaltado gris). Esto confirma el enriquecimiento en exosomas de la población de EVs aisladas. Figura 3-9 Localización subcelular de proteínas identificadas en EVs de JEG-3

Anotaciones Uniprot Subcellular location [GO CC] (UniProt release 2016_07); proteínas con anotaciones: 745 (65,8% del total de proteínas humanas). # de proteínas en escala logarítmica. Adicionalmente, 271 proteínas presentaron anotaciones a placenta según DAVID (base de datos: Up tissue). Esta lista se complementó con las anotaciones de Uniprot para especificidad de tejido (Tissue specificity), dando lugar a 324 proteínas que anotan a placenta y/o tropfoblasto (Anexos E, Tabla 5-16). Estas incluyen marcadores placentales clásicos, tales como fosfatasa placental alcalina PLAP y HLA-G (Soares & Hunt, 2006), y proteínas reportadas con expresión específica en el trofoblasto y placenta como calpaina-6 (CAPN6), carboxipeptidasa Z (CPZ), supresina (Endogenous retrovirus group 48 member 1, ERVH48-1), el factor de transcripción específico de corión (GCM1) y la glicoproteína trofoblástica (antígeno oncofetal 5T4). Adicional a lo reportado en las bases

Capítulo 3 163

de datos, se detectaron marcadores trofoblásticos como citoqueratina 7 y 18, mientras que otros marcadores como CD10, sincitina, HAI-1 y hCG estaban ausentes. Esto sugiere que, aunque los exosomas representan su célula de origen, no contienen todos los marcadores expresados por la célula, sino una selección de estos. En términos generales, las proteínas identificadas se pueden clasificar en tetraspaninas, chaperonas y proteínas de choque térmico, moléculas de adhesión, transductores de señal y proteínas relacionadas con tráfico endosomal y biogénesis de MVB, entre otras. La anotación funcional realizada con DAVID (796 proteínas analizadas, bases de datos default, vías de Reactome y tejido Up tissue y Unigene EST quartile) reveló que algunas de estas proteínas pertenencen a vías de migración transendotelial de leucocitos (20 proteínas), señalización por Wnt (26 proteínas), señalización por EGFR (10 proteínas), señalización por MAPK ERK1/2 (7 proteínas), adhesión focal (32 proteínas), interacción ECM-receptor (21 proteínas) y hemostasis (46 proteínas). Así mismo están envueltas en procesos biológicos como respuesta inflamatoria (26 proteínas), efectores inmunes (13 proteínas), ciclo celular (75 proteínas), expresión génica (84 proteínas) y en el metabolismo de ARNm y ncRNA (36 y 22 proteínas) y de proteínas (57 proteínas), y pertenecen a componentes como ribosoma (34 proteínas), espleciosoma (24 proteínas), proteosoma (21 proteínas) y nucleosoma (Supl. Capítulo 3 Análisis preliminar JEG3, Functional Annotation). Figura 3-10 Clasificación funcional de proteínas identificadas en EVs de JEG-3

Clasificación funcional de proteínas identificadas en exosomas derivados de células JEG-3. 769 proteínas analizadas con DAVID 6.7., rigor de la clasificación más alto (Highest). Se muestran los términos más significativos y representativos de cada clúster, priorizando Pathway (Biocarta, KEGG) y BP. La clasificación funcional de genes reveló procesos y vías de señalización de interés biológico (Figura 3-10): el grupo de genes 2 agrupa chaperoninas poertenecientes al complejo T en torno a la vía de supervivencia de células B (B Cell Survival Pathway, Biocarta). El grupo de genes 9 agrupa GTPasas pequeñas pertenecientes a las vías: de endocitosis y de señalización MAPK (ambas de KEGG) y a la vía Rab GTPasas marcan objetivos en la maquinaria endocítica (Rab GTPases mark targets in the endocytotic

164 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

machinery, Biocarta), con procesos biológicos como transducción de señales mediada por GTPasas pequeñas y transporte mediado por vesículas. Y el grupo 17 agrupa a inmunoglobulinas en torno al proceso biológico respuesta inmune. La expresión de estas proteínas sugiere un rol potencial de EVs en la regulación de vías de señalización y expresión génica en las células diana. Finalmente, el procedimiento que se siguió y las modificaciones introducidas en la metodología permitieron un análisis proteómico de EVs derivadas de células JEG-3, enriquecidas en exosomas, y posibilita un análisis proteómico comparativo.

3.3.2 Análisis proteómico comparativo Adicional al aislamiento y análisis proteómico de EVs derivadas de trofoblasto, es de interés comparar las EVs enriquecidas en exosomas derivadas de células de coriocarcinoma JEG-3 y de células inmortalizadas de trofoblasto HTR-8/SVneo, y determinar si la estimulación generada por tratamiento con TGF-β altera el proteoma de estas EVs, existiendo alguna diferencia entre las EVs derivadas de células JEG-3 y de células HTR-8/SVneo sometidas a este tratamiento. Como medio de obtención de EVs se trabajó con una mezcla 1:1 de F12/RPMI, suplementado con 10% de SFB libre de EVs, para asegurar las mismas condiciones de cultivo y nutrición entre las dos líneas celulares, y por lo tanto el mismo potencial de producción de MVBs y exosomas. Este constituyó las condiciones control y las EVs obtenidas en estas condiciones se asumieron como producto de un estado de equilibrio. Para el tratamiento se trabajó con 10 ng/mL de TGF-β en el medio de obtención de EVs, realizando cada estímulo en paralelo con su control (ver Homogenización de condiciones de cultivo). Se procedió de forma similar a la sección anterior, sembrando por plato 5 millones de células JEG-3 ó HTR-8/SVneo (ver Anexo A 1.1). Las células fueron cultivadas por 48 horas en el medio de obtención de exosomas con o sin TGF-β 10 ng/mL, trabajando en paralelo o por bloques control y tratamiento para un total de 7 platos de cultivo por tratamiento y tipo celular (ver Tabla 3-4). 70 mL de medio condicionado provenientes de 7 platos de cultivo o réplicas biológicas se trabajaron como pool para cada tratamiento y tipo celular (Anexo A 3 y 4a). Se obtuvieron de 60 a 80 μg de proteína por muestra. Cada muestra fue procesada por duplicado en momentos diferentes: 25 μg del extracto proteico fue llevado a 100 μL con buffer lisis, procesado usando la técnica eFASP y analizado por nLC-ESI-MS/MS por triplicado. Esto da lugar a 6 análisis proteómicos por cada muestra (2 digestiones, 3 corridas LC o inyecciones, trabajadas como n=2 para la cuantificación, ver Anexo A 7g). Tabla 3-4 Esquema experimental para el análisis proteómico comparativo de EVs

Modelo HTR-8/SVneo JEG-3 Control (estado estacionario): medio de obtención (F12/RPMI

1:1 con 10% SFB libre de EVs) HC 1 y 2 JC 1 y 2

Tratamiento: TGF-β en medio de obtención HTβ 1 y 2 JTβ 1 y 2 Pooling de 7 réplicas biológicas, para cada tratamiento y tipo celular. 3 análisis proteómicos. 2

réplicas técnicas, n=2.

Capítulo 3 165

Perfil proteómico común de EVs derivadas de modelos derivados de trofoblasto

Inicialmente se realizó una caracterización general del proteoma común de las EVs derivadas de células JEG-3 y HTR-8/SVneo, tanto en el estado estacionario como producto de la estimulación con TGF-β. Se identificaron 4.269 proteínas como un multiconsenso de los 12 reportes correspondientes a las 4 muestras, cada una analizada tres veces por nLC-MS/MS (búsqueda en bases de datos Uniprot, Septiembre, 2015-10; organismo humano y bovino). Similar al análisis anterior, un 65% de las proteínas identificadas pueden ser de origen humano y un 46% bovino, mientras que un 8% puede corresponder tanto a humano como a bovino (ver Figura 3-11 A.). Figura 3-11 Caracterización general de EVs derivadas de trofoblasto

Origen de las proteínas identificadas y familias de las proteínas más abundantes. Diagramas de Venn ilustrando la distribución del origen para A. el total de proteínas identificadas en las 4 muestras y B. las 100 proteínas más abundantes. C. Gráficos de torta ilustrando las familias de proteínas más representativas entre las 100 proteínas más abundantes identificadas, discriminando entre origen humano y origen bovino.

166 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 3-12 Función molecular general de las proteínas identificadas en EVs derivadas de trofoblasto

Ontología génica para función molecular (GO MF) de 3.245 proteínas anotadas en Uniprot

(UniProt release 2016_08), del multiconsenso correspondiente a las EVs derivadas de células JEG-3 y HTR-8/SVneo, en el estado estacionario y estimuladas con TGF-β.

Varias proteínas bovinas fueron las más abundantes en todas las muestras analizadas, presentándose de forma ubicua en los 12 reportes. Al analizar las 100 proteínas más abundantes (basado en la sumatoria de intensidad de los 12 reportes), la gran mayoría (62%) correspondió a bovina, y un 18% a la intersección entre las dos especies, siendo mayor que en la distribución general de proteínas (ver Figura 3-11 B). Así mismo, las proteínas más abundantes se identificaron en general de forma ubicua entre las 4 muestras (con algunas excepciones como CD9, Gremlin-1, la cadena de colágeno alfa-1 (XVIII), Matrilin-2, CD44, GNB1 y CD9P-1), por lo que su relevancia biológica en el análisis propuesto es baja; sin embargo, su análisis bioinformático es relevante para la caracterización proteómica general de EVs derivadas de células de trofoblasto HTR-8/SVneo y JEG-3, más alla del tratamiento.

Capítulo 3 167

Estas 100 proteínas más abundantes pertenencen a familias de proteínas diferentes, según su origen humano o bovino, cada grupo con diferente participación, a excepción de varias proteínas pertenecien a tubulinas y actinas que se identificaron para las dos especies. Para el caso bovino resaltan familias de histonas H2B y H2A, globinas y ALB/AFP/VDBl dentro de las cuales se encuentran proteínas típicas del suero como hemoglobina, albumina y fetoproteína. Para el origen humano, la mayor proporción, adicional a las tubulinas, correspondió a filamentos intermedios, proteínas de choque térmico 70 y 90, histonas H1/H5 y tetraspaninas, incluyendo CD9, CD81 y CD63. También resaltan miembros de la superfamilia de pequeñas GTPasas, familia Ras y de la superfamilia GTPasa del factor de traducción clase TRAFAC, familia GTPasa del factor de traducción clásico, subfamilia EF-Tu/EF-1A, tanto de origen humano como bovino. Adicionalmente, diferentes familias de histonas se encontraron entre las proteínas más abudantes, aunque con una proporción diferente según la familia en cuestión y especie (Ver Figura 3-11 C). Por otro lado, fue desconcertante encontrar proteínas como subunidades de la hemoglobina de origen humano únicamente (HBA_HUMAN). Claramente está es una proteína sérica que debe provenir del SFB, pero su identificación exclusiva como humana y no bovina lleva a pensar en la ocurrencia de falsos negativos en el grupo bovino y posiblemente el mismo suceso en el grupo humano, por lo que no se descartan completamente las proteínas identificadas como bovinas de los análisis realizados, especialmente para las proteínas identificadas de forma diferencial entre las 4 muestras. Lo anterior pone de manifiesto una vez más la alta contaminación por proteínas séricas que pueden presentar las muestras obtenidas de cultivo celular con SFB, y los desafíos asociados a la identificación de proteínas humanas en secretomas de cultivos celulares. Finalmente, como ya se había observado, la gran parte de las proteínas identificadas de origen humano presentaron una intensidad menor a las bovinas y una distribución diferencial entre las 4 muestras, siendo el objetivo del presente estudio. Se analizó por bioinformática la función molecular de las 4.269 proteínas identificadas entre las 4 muestras, para inferir las funciones principales de las proteínas secretadas mediante EVs. La ontología génica se obtuvo utilizando los recursos de Uniprot (UniProt release 2016_08) y los términos de función molecular fueron clasificados como se muestra en la Figura 3-12. La principal función fue la unión a moléculas como ARN, ADN y ATP (2.450 proteínas), seguida de actividad catalítica (1.254 proteínas) y actividades relacionadas con señalización y transcripción (462 proteínas). En este último grupo resaltan las actividades de receptor (203 proteínas), transductor de señal (60 proteínas), factor de transcripción (90 proteínas) y cofactor transcripcional (148 proteínas entre coactivador, corepresor, cofactor y represor), sugiriendo nuevamente un rol de las EVs derivadas de trofoblasto en la regulación de los procesos de señalización y expresión génica, con una potencial modulación u alteración de estos procesos en las células blanco.

Perfil proteómico de EVs derivadas de HTR-8/SVneo y JEG-3 en el estado estacionario y comparación

Se realizó una caracterización del proteoma de las EVs derivadas de células JEG-3 y HTR-8/SVneo en el estado estacionario y se comparó cualitativamente el perfil de los dos modelos. El análisis proteómico descriptivo se realizó inicialmente con las proteínas de

168 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

origen humano (incluyendo la intersección humana/bovino), usando las herramientas bioinformáticas de DAVID 6.7 para el set de proteínas identificadas en JEG-3 Control y HTR-8/SVneo Control. En general, se identificó un mayor número de proteínas en las EVs derivadas de HTR-8/SVneo, comparado con JEG-3. Así mismo, la cantidad de proteínas únicas, o identificadas únicamente en un modelo, fue mayor para HTR-8/SVneo (Figura 3-13 A). Esto concuerda con los resultados de NTA que muestran una mayor cantidad de partículas aisladas de HTR-8/SVneo, con respecto a JEG-3 ((6,67 ± 0,48) x 109 partículas/mL vs. (3,94 ± 0,30) x 109 partículas/mL). De forma similar se observó en un estudio previo por Salomon et. al., según el cual HTR-8/SVneo liberó 2,6 veces más exosomas que JEG-3 (Salomon et al., 2014), y por Ospina et al., en el cual HTR-8/SVneo liberó 1,18 y 2,56 veces mas exosomas y microvesículas, respectivamente, comparado con JEG-3 (Stephanie Ospina-Prieto et al., 2016). Con respecto a las proteínas de origen humano, en HTR-8/SVneo se identificaron 1.779 (61% del total) y en JEG-3 1.467 (59% del total). Así pues, las células de HTR-8/SVneo no solo estarían generando un mayor número de EVs, sino que también estas son más variadas y ricas en proteínas. Las anotaciones funcionales y de vías de las proteínas identificadas con origen humano se obtuvieron con las herramientas de DAVID 6.7. Con este se reconocieron 1.109 de las 1.467 proteínas identificadas como humanas en JEG-3, y 1.307 de las 1.779 proteínas identificadas en HTR-8/SVneo, las cuales correspondieron a 1.101 y 1.300 DAVID IDs, respectivamente. Se trabajaron con las bases de datos default y las vías de Reactome. En la Figura 3-13 se muestran las vías anotadas según B. Reactome, C. Biocarta y D. KEGG para las proteínas analizadas en HTR-8/SVneo y en JEG-3. El valor p de cada una de las vías se consigna en las tablas suplementarias (Supl. Capítulo 2 Análisis Comparativo H y J; gráficas chart). En general, HTR-8/SVneo y JEG-3 presentan las mismas anotaciones, con un alto procentaje de proteínas vinculadas a expresión génica, ciclo celular y apoptósis, vías relacionadas con el tráfico vesicular como endocitosis e infección por VIH e influenza, metabolismo, hemostasis y procesos de adhesión y migración. Sin embargo, aparecen vías anotadas en HTR-8/SVneo pero no en JEG-3 como diversas vías de señalización, procesos neuronales, metabolismo de nucleótidos, piruvato, glutatión, ácido selenoamino y pentosa fosfato. Por su parte, JEG-3 presenta procesos como ciclo celular, reparación de la excisión de nucleótidos, mantenimiento de telomeros, metabolismo del oxido nítrico y lisosoma. Así mismo, vías relacionadas con el sistema inmune presentan anotaciones diferenciales en HTR-8/SVneo y en JEG-3. Figura 3-13 Vías anotadas para el proteoma de EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo (ver página siguiente) A. Diagrama de Venn ilustrando la distribución del total de las proteínas identificadas en EVs derivadas de células HTR-8/SVneo y JEG-3 en el estado estacionario (control). Anotaciones funcionales de las proteínas de origen humano enriquecidas con DAVID 6.7 de las bases de datos B. Reactome, C. Biocarta y D. KEGG. Vías ordenadas y clasificadas en expresión génica (gris), ciclo celular, reparación ADN y apoptosis (lila), adhesión, migración e invasión (rosado), señalización (azul), endocitosis y transporte intracelular (aguamarina), metabolismo y biosíntesis (naranja), cáncer (rojo), sistema inmune (verde) y procesos neuronales (gris). Para complementar la caracterización de las EVs derivadas de JEG-3 y HTR-8/SVneo se realizó una clasificación funcional de las proteínas con DAVID 6.7. Con un rigor de clasificación medio se obtuvieron 52 agrupaciones para HTR-8/SVneo y 42 para JEG-3 (Supl. Capítulo 2 Análisis Comparativo H y J; Gene Class). .

Entre estas resalta un clúster de interés para el estudio, común a los dos modelos, que agrupa entre otras a proteínas G miembros de la familia de oncogenes RAS en torno a vías relevantes. En la Tabla 3-5 se consignan las proteínas pertenecientes a este clúster, con los puntajes de su identificación por MS/MS.

Tabla 3-5 Clúster de interes producto de la clasificación funcional de proteínas identificadas en EVs derivadas de JEG-3 y HTR-8/SVneo

Clúster Puntaje de enriquecimiento E. S. Genes Términos HTR-8/Svneo 22 17,33 53 928

JEG-3 8 19,72 63 936

Gen Proteína H J Σ SQ Σ# Proteína

Σ# P. únicos

Σ# Péptido

Σ# PSMs

ARF3 ADP-ribosylation factor 3 53,6 10 3 7 371 ARF4 ADP-ribosylation factor 4 55,6 8 5 8 157 ARF5 ADP-ribosylation factor 5 41,7 5 1 5 250 ARF6 ADP-ribosylation factor 6 30,3 5 4 4 108 ARL1 ADP-ribosylation factor-like 1 20,7 7 3 3 7 ARL2 ADP-ribosylation factor-like 2 6,5 2 1 1 2

ARL8B ADP-ribosylation factor-like 8B 30,1 6 4 4 40 ATL3 atlastin GTPase 3 21,1 3 2 5 20

CDC42 cell division cycle 42 15,7 5 2 2 96 DRG1 developmentally regulated GTP binding protein 1 12,0 2 3 3 10 DNM1 dynamin 1 22,0 8 6 15 77 DNM2 dynamin 2 37,9 5 1 26 207

EEF1A1 eukaryotic translation elongation factor 1 α-like 7 26,4 13 2 9 245 EEF1A2 eukaryotic translation elongation factor 1 α 2 23,8 2 1 8 118

EEF2 eukaryotic translation elongation factor 2 30,4 2 2 21 209 TUFM Tu translation elongation factor, mitochondrial 22,8 2 7 7 19 EHD1 EH-domain containing 1 59,9 7 5 24 223 EHD2 EH-domain containing 2 35,9 2 3 13 58 EHD3 EH-domain containing 3 39,8 3 1 16 132 EHD4 EH-domain containing 4 46,8 2 6 18 104

EPS15L1 epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like 1 20,0 11 6 10 25

GNG5 G protein, gamma 5 39,7 2 1 1 9 GMPPA GDP-mannose pyrophosphorylase A 9,8 6 3 3 5 GNAI1 G protein, α inhibiting activity polypeptide 1 26,5 20 4 7 150 GNAI3 G protein, α inhibiting activity polypeptide 3 33,0 17 1 8 110 GNAQ G protein, q polypeptide 30,9 2 5 9 129 GNAS GNAS complex locus 38,2 21 2 10 88 GNAZ G protein, alpha z polypeptide 19,4 2 5 5 8 GNL3 G protein-like 3 (nucleolar) 11,5 3 4 4 15

EIF2S3 eukaryotic translation initiation factor 2, subunit 3 γ 16,1 8 5 5 19 GNL2 G protein-like 2 (nucleolar) 3,1 3 2 2 3

OXSR1 oxidative-stress responsive 1 15,2 2 1 5 19 RAB10 RAB10, member RAS oncogene family 42,0 37 5 7 122 RAB13 RAB13, member RAS oncogene family 26,6 2 3 4 42 RAB14 RAB14, member RAS oncogene family 51,2 35 6 7 122 RAB1A RAB1A, member RAS oncogene family 50,2 40 2 7 276 RAB21 RAB21, member RAS oncogene family 21,3 3 3 3 10 RAB23 RAB23, member RAS oncogene family 18,1 2 3 3 10 RAB2A RAB2A, member RAS oncogene family 44,3 11 7 7 74 RAB34 RAB34, member RAS oncogene family 22,4 11 4 4 15 RAB5A RAB5A, member RAS oncogene family 27,9 11 3 4 40 RAB5B RAB5B, member RAS oncogene family 38,1 11 4 5 45 RAB5C RAB5C, member RAS oncogene family 38,0 13 1 5 56 RAB6B RAB6B, member RAS oncogene family 36,5 41 2 6 82

Capítulo 3 171

Gen Proteína H J Σ SQ Σ# Proteína

Σ# P. únicos

Σ# Péptido

Σ# PSMs

RAB7A RAB7A, member RAS oncogene family 54,1 9 10 10 126 RAB8A RAB8A, member RAS oncogene family 31,9 41 1 6 78 RAB9A RAB9A, member RAS oncogene family 24,9 4 4 4 12 RAP1A RAP1A, member of RAS oncogene family 47,3 6 2 7 467 RAP1B RAP1B, member of RAS oncogene family 61,4 21 1 8 482 RAP2A RAP2A, member of RAS oncogene family 39,3 3 1 6 49 RAP2B RAP2B, member of RAS oncogene family 45,9 2 3 7 50 RAP2C RAP2C, member of RAS oncogene family 45,9 8 2 7 157 NRAS neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog 44,4 7 4 7 90

RAB11A RAB11A, member RAS oncogene family 49,1 7 1 8 196 RAB11B RAB11B, member RAS oncogene family 48,6 7 2 9 222 RAB22A RAB22A, member RAS oncogene family 40,7 2 5 5 13 RAB27A RAB27A, member RAS oncogene family 39,0 9 5 7 34 RHOC ras homolog gene family, member C 12,4 10 1 1 12 RHOG ras homolog gene family, member G (Rho G) 31,9 2 4 4 33 RND3 Rho family GTPase 3 (Rho E) 5,3 2 1 1 10 RRAS related RAS viral (r-ras) oncogene homolog 36,2 4 4 6 38

RRAS2 related RAS viral (r-ras) oncogene homolog 2 25,5 9 2 4 59 SAR1A GTP-binding protein SAR1a 23,2 8 2 3 24 SEP10 septin 10 13,5 14 4 4 26 SEP14 septin 14 6,94 1 1 2 7 SEP7 septin 7 16,5 8 5 6 63 SEP9 septin 9 13,0 28 5 5 16

TUBA1A tubulin, alpha 1a 42,1 20 6 12 570 TUBA4A tubulin, alpha 4a 44,4 14 6 12 478 TUBAL3 tubulin, alpha-like 3 4,2 2 1 1 12 TUBB1 tubulin, beta 1 17,7 1 1 5 89

TUBB2A tubulin, beta 2A 44,3 12 3 13 485 TUBB3 Tubulin beta-3 chain 46,0 10 3 14 492 TUBB tubulin, beta 47,1 13 4 14 665

TUBB6 tubulin, beta 6 55,2 15 1 16 199 TPX2 Targeting protein for Xklp2 2,8 2 1 1 1

Proteínas identificadas en EVs derivadas de células HTR-8/SVneo (H) y JEG-3 (J) en el estado estacionario (control), rigor de clasificación medio. Sumatoria del cubrimiento de secuencia (SQ), número de proteínas, péptidos, péptidos únicos y suma de interpretaciones correctas para un espectro individual (Peptide-Spectrum Match, PSMs), generada del multiconsenso de 12 reportes

Tabla 3-6 Términos vinculados al clúster de interes DB Término HTR-8/Svneo JEG-3

# p-value # p-value

BP

Small GTPase mediated signal transduction 37 4,7E-48 32 1,2E-35 Intracellular signaling cascade 41 1,9E-31 36 2,3E-21 Vesicle-mediated transport 19 1,8E-12 23 1,5E-15

BBID Integrin affinity modulation 2 4,1E-02 2 4,1E-02

Bio

cart

a Rab GTPases Mark Targets in The Endocytotic Machinery 8 6,0E-12 8 3,6E-12 Signaling Pathway from G-Protein Families 3 2,4E-02 Phospholipase C-epsilon pathway 2 8,0E-02 Thrombin signaling and protease-activated receptors 2 1,8E-01 Signaling of Hepatocyte Growth Factor Receptor 2 3,4E-01 2 3,2E-01

KEG

G

Gap junction 7 1,1E-06 11 3,6E-11 Endocytosis 8 5,5E-06 13 1,7E-10 Long-term depression 6 6,8E-06 3 6,2E-02 Tight junction 7 1,2E-05 7 1,1E-04 Melanogenesis 5 6,3E-04 4 2,0E-02 Chemokine signaling pathway 6 8,0E-04 7 6,5E-04 Leukocyte transendothelial migration 5 1,2E-03 5 4,7E-03

172 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

DB Término HTR-8/Svneo JEG-3 # p-value # p-value

Long-term potentiation 4 2,6E-03 3 6,0E-02 Renal cell carcinoma 4 2,8E-03 4 7,8E-03 Fc gamma R-mediated phagocytosis 2 3,3E-01 4 1,8E-02 MAPK signaling pathway 6 3,9E-03 6 1,9E-02 GnRH signaling pathway 4 7,2E-03 2 4,4E-01 Neurotrophin signaling pathway 4 1,4E-02 4 3,6E-02 Axon guidance 4 1,5E-02 4 3,9E-02 Pathogenic Escherichia coli infection 3 2,3E-02 9 7,3E-10 Regulation of actin cytoskeleton 4 5,7E-02 4 1,3E-01 Focal adhesion 3 2,0E-01 3 3,3E-01 VEGF signaling pathway 2 2,7E-01 2 3,6E-01 Progesterone-mediated oocyte maturation 2 3,0E-01 2 4,0E-01 T cell receptor signaling pathway 2 3,6E-01 2 4,8E-01 Pathways in cancer 2 7,5E-01 2 8,7E-01 Vascular smooth muscle contraction 2 3,7E-01 Calcium signaling pathway 2 5,2E-01

Términos relacionados al clúster estudiado, derivados de la ontología génica de procesos biológicos (GO BP) y las bases de datos de vías BBID, Biocarta, Reactome y KEGG. #: número de proteínas en el clúster vinculadas al término y significancia de la pertenecia al clúster (p-value). Vías catalogadas en señalización (azul), adhesión, endocitosis y transporte intracelular (naranja), cáncer (rojo), sistema inmune (verde) y procesos neuronales (gris).

Figura 3-14 Vía de migración transendotelial de leucocitos

Proteínas identificadas pertenecientes a la vía de migración transendotelial de leucocitos de KEGG (cajas rojas), obtenida con DAVID y modificada.

Capítulo 3 173

Dentro de los términos vinculados a este grupo resaltan vías de transducción de señal asociadas a proteínas G pequeñas, procesos de transporte mediado por vesículas y de adhesión, así como vías relacionadas con la señalización y procesos de migración de células inmunes, modificaciones neuronales y cáncer (ver Tabla 3-6). Estas últimas pueden tener un sentido in vivo al suponer que el trofoblasto, a través de sus EVs, puede estar regulando y alterando procesos en células del sistema inmune y neuronal, sistemas que se sabe son modificados durante el embarazo en parte por la placenta. En la Figura 3-14 y Figura 3-15 se ilustran las vías KEGG para la migración transendotelial de leucocitosy la vía de señalización de Ras, resaltando en rojo a las proteínas identificadas en las EVs, muchas de las cuales son miembros de la familia Ras y Rac y están involucradas en procesos biológicos como adhesión, cambios en el citoesqueleto y migración.

Figura 3-15 Vía de señalización Ras de KEGG

Proteínas identificadas pertenecientes a la vía de señalización Ras de KEGG (cajas rojas), obtenida con DAVID y modificada. Adicionalmente, se realizó una comparación cualitativa basada en la identificación de una proteína específica únicamente en uno de los dos modelos en condiciones control, teniendo en cuenta su identificación en alguno de los 3 análisis realizados por cada modelo celular. 594 proteínas se identificaron únicamente en JEG-3 (24% del total), de las cuales 412 eran de origen humano y 182 de origen exclusivamente bovino. Para HTR-8/SVneo, 1.018 proteínas fueron identificadas únicamente en este modelo (35% del total), de las cuales 724 eran de origen humano y 294 de origen exclusivamente bovino. Al considerar las proteínas más abundantes (en base a la sumatoria de intensidad LFQ), identificadas únicamente en HTR-8/SVneo, resaltan la tetraspanina CD9 y gremlin-1

174 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

(GREM1) (ver Tabla 3-7 y Supl. Capítulo 2 Análisis Comparativo H y J). CD9 está envuelta en la adhesión celular, motilidad y metástasis y en la internalización de receptores. Por su parte, Gremlin-1 es una citoquina involucrada en carcinogénesis, es un antagonista de BMP y actua como un inhibidor de la quimiotaxis de monocitos. Otras proteínas abundantes son: el antígeno CD44 involucrado en la vía de señalización IFN-gamma, la migración de leucocitos, la regulación positiva de la agregación de monocitos y la regulación negativa de la vía de señalización apoptótica intrínseca en respuesta a daño a ADN por mediadores clase p53; la proteína de choque térmico beta-1 (HSPB1) invoucrada en la regulación positiva de la angiogénesis, producción de IL-1 beta y procesos biosinteticos de TNF y regulación de la autofagia; la proteína-1 secretada relacionada con rizado (SFRP1) involucrada en la regulación negativa de muchos procesos y vías de señalización relevantes a la malignización y en la diferenciación de células madre hematopoiéticas y de neuronas dopaminérgicas; y la 5’-nucleotidasa (NT5E) involucrada en la regulación negativa de la respuesta inflamatoria. Respecto a JEG-3, sus EVs presentaron un alto número de proteínas bovinas dentro de las más intensas (ver Tabla 3-7 y Supl. Capítulo 2 Análisis Comparativo H y J). Adicional a estas, están proteínas de origen humano como la proteína homóloga CTR9 asociada a la polimerasa ARN (CTR9) involucrada en la regulación negativa de la diferenciación de células mieloides y el imprinting genómico a través de la metilación y ubiquitinación de histonas; el factor de transcripción AP-2 gama (TFAP2C) en la regulación epigenética de la expresión; la molécula de adhesión epitelial celular (EpCAM) involucrada en la regulación negativa de la apoptosis y la adhesión celular mientras que promueve la proliferación y motilidad celular, así como la caderina-1 (CDH1) en la regulación negativa de la adhesión; Serpin B9 conocida como antiproteinasa 3 citoplasmática (SERPINB9) que protege contra la citotoxicidad mediada por células NK; el factor de crecimiento/diferenciación 15 (GDF15) perteneciente a la vía de señalización TGF-β; y el factor de transcripción específico de células T actuando en trans (GATA3) involucrado en la regulación negativa de la producción de IFN-gamma e IL-2 y con la regulación positiva de la migración endotelial, la acetilación de las histonas H3-K14 y H3-K9, la producción de citoquinas Th2 y secreción de IL-4, IL-5 e IL-13 y procesos de transcripción, así como en la regulación de la diferenciación de células T αβ CD4+. Tabla 3-7 Proteínas humanas más intensas identificadas unicamente en un modelo

Proteínas identificadas únicamente en EVs derivados de JEG-3 (estado estacionario) Organism Gene Gene ontology (biological process) Σ Int

Human PHLPP2 3,9E8

Human CTR9 trophectodermal cell differentiation; blastocyst growth ; Wnt and IL-6-mediated signaling pathway ; JAK-

STAT cascade; negative regulation of mRNA polyadenylation; negative regulation of myeloid cell differentiation; regulation of transcription from RNA polymerase II promoter ; positive regulation of histone

H2B ubiquitination and histone H3-K4 & H3-K79 methylation; stem cell population maintenance 2,7E8

Human CCDC178 2,6E8 Human ARHGAP11A signal transduction 1,7E8

Human EPCAM negative regulation of apoptotic process and cellcell adhesion mediated by cadherin; positive

regulation of cell motility, cell proliferation, stem cell proliferation, transcription from RNA polymerase II promoter; signal transduction involved in regulation of gene expression; stem cell differentiation

1,7E8

Human TFAP2C cell-cell signaling ; positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter; regulation of cell proliferation and gene expression (epigenetic) 1,6E8

Human ITIH5 hyaluronan metabolic process 1,1E8 Human HIC2 negative regulation of transcription, DNA-templated 9,8E7 Human, Bovine SNRPE histone mRNA metabolic process; mRNA splicing, via spliceosome; nuclear import; spliceosomal complex

assembly 8,5E7

Human CDH1 negative regulation of cell-cell adhesion; neuron projection development ; pituitary gland development ; positive regulation of transcription factor import into nucleus; protein localization to plasma membrane 7,2E7

Human CACTIN-AS1 7,2E7 Human FAM208B 6,5E7 Human TINAGL1 cell adhesion; endosomal transport; immune response 6,5E7 Human CLIC3 chloride transport ; signal transduction 6,3E7

Capítulo 3 175

Human GPC4 anatomical structure morphogenesis ; cell proliferation; glycosaminoglycan metabolic process; retinoid metabolic process 5,8E7

Human NAALAD2 cellular amino acid biosynthetic process ; neurotransmitter catabolic process ; proteolysis 5,7E7 Human CAPN6 microtubule bundle formation ; regulation of cytoskeleton organization 5,5E7

Proteínas únicas identificadas en EVs derivados de HTR-8/SVneo (estado estacionario) Organism Gene Gene ontology (biological process) Σ Int Human CD9 5,3E9

Human, Bovine GREM1

negative regulation of apoptotic process, BMP signaling pathway, canonical Wnt signaling pathway, cell growth, monocyte chemotaxis, pathway-restricted SMAD protein phosphorylation and transcription (DNA-templated); positive regulation of angiogenesis, cell proliferation, NF-kappaB import into nucleus, NF-kappaB transcription factor activity, peptidyl-tyrosine autophosphorylation, receptor activity, receptor internalization, telomerase activity and transcription from RNA polymerase II promoter ; regulation of epithelial to mesenchymal transition ; regulation of focal adhesion assembly ; signal transduction; cell migration involved in sprouting angiogenesis

2,5E9

Human COL18A1 angiogenesis; cell adhesion; collagen catabolic process ; extracellular matrix organization; negative regulation of cell proliferation; positive regulation of cell migration, cell proliferation and endothelial cell apoptotic process; response to drug ; response to hydrostatic pressure

1,6E9

Human MATN2 axon guidance; dendrite regeneration; glial cell migration; response to axon injury 8,7E8 Human PTGFRN lipid particle organization 7,3E8

Human, Bovine GNB1

adenylate cyclase-activating dopamine receptor signaling pathway ; cell proliferation ; cellular response to catecholamine stimulus, glucagon stimulus, hypoxia, prostaglandin E stimulus; G-protein coupled acetylcholine receptor signaling pathway; phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway; platelet activation; positive regulation of cytosolic Ca2+ concentration; protein folding; Ras protein signal transduction; rhodopsin mediated signaling pathway; Wnt signaling pathway, calcium modulating pathway

6,6E8

Human CD44

cell-matrix adhesion ; cellular response to FGF stimulus ; extracellular matrix disassembly ; hyaluronan catabolic process ; IFN-gamma-mediated signaling pathway; leukocyte migration; negative regulation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process, intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage by p53 class mediator; positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade, heterotypic cell-cell adhesion, monocyte aggregation, peptidyl-serine and tyrosine phosphorylation

6,6E8

Human NUP98

DNA replication ; gene silencing by RNA ; intracellular transport of virus ; mitotic nuclear envelope disassembly ; tRNA and mRNA export from nucleus ; nuclear pore complex assembly; posttranscriptional tethering of RNA polymerase II gene DNA at nuclear periphery; protein import into nucleus, docking ; protein sumoylation; regulation of cellular response to heat and glucose transport ; sister chromatid cohesion; telomere tethering at nuclear periphery

5,8E8

Human GPRC5A negative regulation of EGF-activated receptor activity ; signal transduction 5,3E8 Human CD151 4,9E8 Human CEP55 cell separation after cytokinesis ; establishment of protein localization ; mitotic cytokinesis 4,8E8 Human EDIL3 positive regulation of cell-substrate adhesion 4,3E8 Human NME2P1 CTP and GTP biosynthetic process; purine and pyrimidine nucleotide metabolic process; regulation of apoptotic

process ; UTP biosynthetic process 4,0E8 Human GJC1 atrial cardiac muscle cell action potential ; cardiac muscle tissue development ; cell-cell junction assembly ; cell

development ; chemical synaptic transmission ; gap junction assembly 3,9E8 Human MARCKS 3,8E8 Human CYR61 regulation of cell growth 3,8E8 Human, Bovine S100A10

establishment of protein localization to plasma membrane ; membrane budding ; membrane raft assembly ; positive regulation of binding, focal adhesion assembly, GTPase activity, stress fiber assembly and substrate adhesion-dependent cell spreading ; protein heterotetramerization

3,4E8

Human SRI 2,8E8 Human THY1 cell adhesion ; regulation of cell migration 2,7E8

Human CSPG4 activation of MAPK activity ; angiogenesis ; cell migration ; cell proliferation ; chondroitin sulfate biosynthetic and catabolic process ; dermatan sulfate biosynthetic process ; glial cell migration ; glycosaminoglycan metabolic process ; positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation; transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway

2,6E8

Human S100A11 negative regulation of cell proliferation ; negative regulation of DNA replication ; signal transduction 2,5E8 Primeras 25 proteínas identificadas de acuerdo a la sumatoria de intensidad LFQ (∑ Int) para los tres análisis nLC MS/MS correspondientes a las condiciones estacionarias. Se realizó un análisis de redes comparativo usando Cytoscape v. 3.4.0 (Shannon et al., 2003) con las aplicaciones ClueGO v. 2.2.6 (Bindea et al., 2009) para analizar anotaciones funcionales, comparar clústers de proteínas y visualizar sus diferencias funcionales, y CluePedia v. 1.2.6 (Bindea et al., 2013) para la construcción de redes de proteínas o interactómica (ver Anexos A 8). Ya que dentro de las proteínas identificadas únicamente en un modelo se detectaron proteínas de origen exclusivamente bovino, para el análisis comparativo del set único de proteínas se hizo un analisis de redes adicional considerando también a las proteínas bovinas. Estas podrían no corresponder a un falso positivo sistemático debido a la contaminación con proteínas del SFB, sino ser proteínas relevantes al ser detectadas de forma diferencial y consistente entre las muestras. Es decir, pueden ser potenciales falsos negativos de origen humano como se había considerado anteriormente, o proteínas efectivamente bovinas pero con relevancia biológica, que pudieron ser incorporadas por la célula desde el medio, seleccionadas y

176 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

cargadas en EVs y secretadas, de tal forma que se presentan de forma diferencial entre los modelos biológicos analizados. Figura 3-16 Análisis de redes para las proteínas humanas diferencialmente identificadas en EVs de células JEG-3 y HTR-8/SVneo

Análisis ClueGO A. Red de términos agrupados funcionalmente. Los nodos representan los términos GO y de vías (GO BP, KEGG, Reactome, WikiPathways), el tamaño representa la significancia del enriquecimiento (valor p), colores iguales definen la pertenencia al grupo y el término líder es el más significativo. Los términos pertenecientes al clúster JEG-3 o HTR-8/SVneo se muestran en rojo o verde, respectivamente, y los términos no agrupados se muestran en gris. El gradiente de color muestra la proporción de proteínas de cada clúster asociado con el término. B. Gráficas de torta con los grupos de términos específicos de cada clúster y los términos comunes. Análisis CluePedia C. Red de proteínas relacionadas con la Acetilación de Histonas H4, identificadas en JEG-3 (nombre en rojo) o en HTR-8/SVneo (nombre en azul):

Capítulo 3 177

Para el subset de proteínas de origen humano se usaron las bases de datos GO Biological Process (GOA_20.09.2016, 14.518 genes), GO Immune System Process (GOA_20.09.2016, 1.962 genes), WikiPathways (21.09.2016, 5.184 genes), KEGG (21.09.2016, 7.088 genes) y REACTOME (21.09.2016, 9.317 genes), con todos los códigos de evidencia exceptuando inferencias de anotaciones electrónicas (IEA) (nivel GO min.=5; max.=8). Se encontraron 352 genes del clúster inicial de JEG-3 (86,3%) y 667 genes del clúster inicial de HTR-8/SVneo (92,5%). Los términos GO con un valor p menor a 0,05 se consideraron significativamente sobrerrepresentados y fueron agrupados con un umbral de puntaje Kappa de 0,4 (Kappa Score Threshold). Después de la selección se trabajaron con 841 genes de los dos clústers (74,49%), 24 grupos finales al agrupamiento Kappa; 8 términos específicos al clúster JEG-3, 49 al clúster HTR-8/SVneo y 30 términos inespecíficos, para 87 términos en total y 132 conecciones Para la comparación de los clústers de proteínas identificados en JEG-3 o HTR-8/SVneo, el número y porcentaje de genes por término fue de 3 / 3%, y se consideró un término como específico para un clúster si el porcentaje de genes asociados a este era mayor a 60%. Para la construcción de redes de proteínas se usó CluePedia STRING ACTIONS y COEXPRESSION-SCORE (v10.0, 9606, 28.09.2016). La Figura 3-16 ilustra los resultados del análisis de redes. Dentro de los términos diferencialmente enriquecidos para HTR-8/SVneo está el splicing y transporte de ARN a través del núcleo, la regulación de procesos metabólicos y el tráfico mediado por vesículas y a través de la membrana, los cuales hacen parte de los procesos previamente relacionados y que pueden ser alterados por la secreción de EVs; más aún, resalta la vía de señalización TGF-β, procesos de adhesión y extensión celular dependiente del sustrato de adhesión y términos dentro del grupo de migración celular como regulación negativa de la motilidad celular y de los componentes celulares. De forma interesante para JEG-3 se obtuvieron términos como terminación de la transcripción, procesos metabólicos de snRNA y modificación de Histonas, resaltando la Acetilación de Histonas H4. A esta vía pertenecen las proteínas identificadas en JEG-3 O-N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa (OGT), proteína microesferula 1 (MCRS1), proteína de susceptibilidad a cáncer de seno tipo 2 (BRCA2), histona acetiltransferasa p300 (EP300), proteína de unión a E1A p400 (EP400), proteína asociada al dominio de transformación/transcripción (TRRAP), proteína 1 asociada a ADN metiltransferasa 1 (DMAP1), homólogo letal específico masculino 1 (MSL1), proteína 8 conteniendo bromodominio (BRD8), β arrestina 1 (ARRB1) y proteína 3 conteniendo dominio BEN (BEND3). Para HTR-8/SVneo solo tres proteínas se relacionaban con este proceso: la subunidad catalítica de histona acetiltransfersasa tipo B (HAT1), proteína 1 similar al factor de mortalidad 4 (MORF4L1) y proteína 1 de unión de C-terminal (CTBP1). Para el subset de origen bovino se usaron todos los códigos de evidencia, debido al bajo número de anotaciones obtenidas (nivel de término min. = 1; max. = 15), filtrando términos con valor p menor a 0,5. A pesar de encontrar un alto número de proteínas de origen bovino diferenciales entre los dos modelos, estas están relacionadas con términos comunes a los dos clústers, como: regulación de la replicación de ADN, señalización mediada por fosfatidilinositol, cascada del complemento, nucleación de actina, regulación negativa de la producción de TNF, metabolismo de triptófano y regulación positiva de transporte iónico transmembranal. Unicamente resalta la vía de señalización del receptor de insulina, enriquecida específicamente para HTR-8/SVneo. Con esta vía se relacionan las siguientes proteínas identificadas en HTR-8/SVneo: la fosfatasa protein-tirosin tipo receptor (PTPRA), ENPP1, la proteína APPL1, la proteína conteniendo SH2 inducible por citoquinas (CISH) y la caseína ubicua nuclear y sustrato 1 de quinasa dependiente de

178 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

ciclina (NUCKS1); a excepción de PTPRA todas estas están presentes a nivel intracelular, con APPL1 actuando también en el núcleo. Las únicas proteínas identificadas en JEG-3 y relacionadas con esta vía fueron: PHIP, NCOA5 y un probable transportador de cobalamina lisosomal (LMBRD1), todos intracelulares.

Comparación cuantitativa del perfil proteómico de EVs derivadas de HTR-8/SVneo y JEG-3 inducidas por la estimulación con TGF-β

Se determinó el efecto del tratamiento con TGF-β sobre el perfil proteómico de las EVs derivadas de cada línea celular y se comparó el proteoma de las EVs inducidas por la estimulación con TGF-β entre los dos modelos. Para esto, se realizó una cuantificación relativa libre de marcaje (Label Free Quantification - LFQ) basada en la intensidad de los precursores asignados a cada proteína. Mediante el programa MaxQuant, los datos espectrales fueron transformados, normalizados y cuantificados determinando el efecto del TGF-β con respecto a su control en cada línea celular y cada tanda de procesamiento eFASP. La identificación se realizó a partir de un multiconsenso de los 24 reportes LC-MS/MS (normalización que incluye las 4 muestras, 2 procesamientos y 3 corridas nLC, según Tabla 3-4); para cada proteína cuantificada se reporta la intesidad, score, conteo MS/MS, porcentaje de cubrimiento de secuencia y de secuencia única + razor y única, número de péptidos, péptidos razor + únicos y péptidos únicos, y Q-value (FDR), como un multiconsenso de todos los reportes tras la normalización. Por medio del programa Perseus, los datos proteómicos derivados de MaxQuant fueron analizados estadísticamente considerando los duplicados del procesamiento por eFASP (n=2) y aplicando un t-test de dos colas para cada modelo. La razón de cambio en el nivel de la proteína fue reportada como el promedio aritmético del logaritmo en base dos (log 2 fold change) para cada duplicado en cada modelo:

log2 𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝜋𝜋 𝑐𝑐ℎ𝑎𝑎𝑛𝑛𝑎𝑎𝑎𝑎𝑙𝑙í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 𝑛𝑛 = log2(𝐿𝐿𝐹𝐹𝐿𝐿 𝐼𝐼𝑛𝑛𝑡𝑡.𝑇𝑇𝑇𝑇𝐹𝐹𝑇𝑇)𝑙𝑙í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛,𝑛𝑛(𝐿𝐿𝐹𝐹𝐿𝐿 𝐼𝐼𝑛𝑛𝑡𝑡.𝐶𝐶𝑡𝑡𝐶𝐶𝐹𝐹)𝑙𝑙í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛,𝑛𝑛

y se reporta el valor p asociado a la razón de cambio TGF-β / Ctrl para cada modelo biológico. Para el caso en que la intensidad fue cero debido a la falta de detección en alguna de las muestras, los valores que fueron imputados fueron sustituidos con “NaN” (not a number, not found). (ver Anexos B 4b y Supl. Capítulo 2 Análisis efecto TGFB comparativo H y J). Tras el análisis cuantitativo se obtuvieron 2.436 identificaciones. 2.140 eran de origen humano, de las cuales 614 podrían ser tanto de origen humano como bovino o no pueden ser distingidas entre las dos especies. Debido a las pérdidas de datos durante la identificación, un número menor de proteínas fue cuantificado en cada modelo. Considerando un p de 0,05 como valor de corte, y aumentos/disminuciones mínimas de proteína de la mitad del valor, se obtuvieron 23 proteínas significativas diferencialmente reguladas por el TGF-β en HTR-8/SVneo y 12 en JEG-3 (ver Tabla 3-8 y Figura 3-17). De estas, dos proteínas comunes a los dos modelos fueron reguladas por el TGF-β, aunque con un sentido contrario: la proteína 1 asociada a Adenilil cicalsa (CAP1), con una dsiminución de 1,82 veces (log2 F.C. -0,86) en JEG-3 y un aumento de 1,54 (log2 F.C. 0,62) en HTR-8/SVneo; y la proteína 2A cargada del cuerpo multivesicular (CHMP2A), con un aumento de 1,41 (log2 F.C. 0,5) en JEG-3 y una disminución de 2,19 (log2 F.C. -1,13) en HTR-8/SVneo. CAP1 regula directamente la dinámica de los filamentos de actina y ha sido implicada en un número de procesos morfológicos y de desarrollo complejos, incluyendo localización

Capítulo 3 179

de ARNm y el establecimiento de la polarización celular. Por su parte, la proteína 2A del cuerpo multivesicular cargado (CHMP2A), también conocida como proteína 2-1 asociada a clasificación de proteína vacuolar (Vps2-1), está implicada en la formación de cuerpos multivesiculares (MVBs) y la clasificación de las proteínas de carga endosomal en MVBs (neXtProt 14-10-2016). Estas dos proteínas se relacionan tanto con la endocitosis y la formación de exosomas como con procesos de migración celular, citocinesis y señalización. Tabla 3-8 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en cada modelo

Multiconsenso 24 reportes Total Humana (excl.)

Humana / Bovina

Bovina (excl.)

Total proteínas identificadas 2.436 1.526 666 244 Modelo biológico HTR-8/SVneo JEG-3 Origen según ID Total Humana Total Humana

Total proteínas cuantificadas 1.337 1.201 1.098 968

Proteínas significativas p <0,20 190 172 127 113 p < 0,05 49 43 27 25

Proteínas diferenciales significativas 23 21 12 12

Reguladas a la baja < -0,5* 9 9 10 10 < -1,0* 3 3 2 2

Reguladas al alza > 0,5* 14 12 2 2 > 1,0* 6 5 1 1

Proteínas diferencialmente reguladas estadísticamente significativas (p-value<0,05, log2 fold change >0,5 y <-0,5). *razón de cambio en el nivel de la proteína expresada como log2 Fold Change; excl.: identificadas de forma exclusiva en un organismo. Figura 3-17 Diagrama de Vulcano de proteínas cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en cada modelo

Significancia estadística (-log T-test p-value) vs. significancia biológica (razón de cambio en el nivel proteico, log 2 fold change) de las proteínas cuantificadas. Las proteínas diferencialmente reguladas estadísticamente significativas (p<0,05, log2 fold change >0,5 o <-0,5) se muestran como puntos rojos.

Tabla 3-9 Proteínas cuantificadas significativamente en EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo, inducidas por TGF-β Gene

names Protein Name Org. log2 FCh

p-value Int. Score Pep

/Uniq S.Q. [%]

Pathway / Protein families Keywords / BP / MF

HTR-8 Nucleosome

SET Protein SET HUM 1,09 0,009 3,E+08 13,1 4/4 20 Nucleosome assembly protein (NAP) family

Negative regulation of histone acetylation and transcription; regulation of mRNA stability; protein

phosphatase inhibitor activity

NAP1L1 Nucleosome assembly protein 1-like 1 HUM 0,81 0,010 2,E+09 45,4 6/5 25,6 Nucleosome assembly

protein (NAP) family DNA replication; nucleosome assembly; positive

regulation of cell proliferation

Proteasome and ubiquitination related

UBR4 E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 HUM 0,43 0,036 1,E+08 60,3 16/16 6,1 Protein ubiquitination Ligase; Ubl conjugation; Protein modification

PSMD6 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6 HUM 0,53 0,037 3,E+08 6,7 5/5 15,4 Proteasome subunit

S10 family Proteasome-mediated ubiquitin-dependent protein

catabolic process

PSMD2 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2 HUM 0,33 0,043 6,E+08 86,2 12/12 20,2 Proteasome subunit S2

family Proteasome-mediated ubiquitin-dependent protein

catabolic process

DNA repair DDB1 DNA damage-binding protein

1 HUM -0,77 0,016 7,E+07 26,0 4/4 5,4 Protein ubiquitination DNA repair; Ubl conjugation; regulation of mitotic cell cycle phase transition; Protein modification

Regulation of transcription SND1 Staphylococcal nuclease

domain-containing protein 1 HUM -1,34 0,013 1,E+08 16,7 8/8 13,6 Gene silencing by RNA; regulation of transcription

EEF1D Elongation factor 1-delta HUM -0,55 0,015 8,E+08 102,8 6/4 38,8 EF-1-beta/EF-1-delta family

Positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling ; regulation of cell death and transcription

KHSRP Far upstream element-binding protein 2 HUM -0,53 0,042 3,E+08 10,2 7/7 13,8 KHSRP family DNA- and RNA-binding; Transcription regulation;

mRNA splicing and transport

EIF4A2 Eukaryotic initiation factor 4A-II HUM -0,32 0,040 3,E+08 6,8 12/5 37,1 DEAD box helicase

family, eIF4A subfamily Negative regulation of RNA-directed RNA

polymerase activity; Initiation factor Regulation of proliferation and apoptosis

HP1BP3 Heterochromatin protein 1-binding protein 3 HUM 0,76 0,016 4,E+08 9,5 7/7 24,2

Regulation of cell proliferation, nucleus size and transcription

TPD52L2 Tumor protein D54 HUM 0,73 0,024 2,E+08 115,0 6/6 39,2 TPD52 family Regulation of cell proliferation

TGM2 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 HUM -0,37 0,044 1,E+09 73,4 10/7 23,9 Transglutaminase

family Positive regulation of apoptotic process, cell

adhesion and mitochondrial calcium concentration Metabolism

ASS1 Argininosuccinate synthase HUM 1,53 0,015 5,E+08 11,5 7/7 29,6 L-arginine biosynthesis;

urea cycle Cellular response to several stimulus, negative

regulation of leukocyte cell-cell adhesion

XYLB Xylulose kinase HUM 1,11 0,011 5,E+07 10,3 3/3 10,4 FGGY kinase family Carbohydrate metabolism; Xylose metabolism; ATP- and Nucleotide-binding

SULT1A1 Sulfotransferase 1A1 0,45 0,010 3,E+08 8,7 2/2 10,8 Sulfotransferase 1 family

Catecholamine metabolism; Lipid metabolism; Steroid metabolism; Transferase

PKM Pyruvate kinase PKM HUM 0,35 0,035 2,E+10 241,8 19/18 39,9 Glycolysis Response to hypoxia, insulin and nutrient; pyruvate from D-glyceraldehyde 3-phosphate

AKR1B1 Aldose reductase HUM -0,72 0,001 2,E+08 10,7 4/4 20 Aldo/keto reductase family

C21-steroid hormone biosynthetic process; oxidoreductase

Capítulo 3 181

Adhesion and migration

TENM3 Teneurin-3 HUM 0,75 0,017 8,E+08 36,5 20/20 12,9 Tenascin family, Teneurin subfamily

Cell adhesion and projection; Positive regulation of neuron projection development; self proteolysis

CAP1 Adenylyl cyclase-associated protein 1 HUM 0,62 0,035 4,E+08 73,4 10/1 33,9 CAP family Activation of adenylate cyclase activity; cell

migration; actin polymerization or depolymerization

ANXA3 Annexin A3 HUM -0,33 0,028 4,E+08 22,7 8/7 32,2 Annexin family Positive regulation of angiogenesis, cell migration and sequence-specific DNA binding TF activity;

JUP Junction plakoglobin HUM -0,36 0,033 7,E+08 88,7 10/10 19,5 Beta-catenin family Cell adhesion; regulation of protein import into nucleus and sequence-specific DNA binding

POSTN Periostin HUM -0,60 0,044 2,E+09 49,3 15/15 26,6 Cellular response to TGF-beta stimulus; negative regulation of cell-matrix adhesion; Heparin- and cell adhesion molecule binding;

Protein transport GOLGA7 Golgin subfamily A

member 7 HUM 1,19 0,023 1,E+08 4,8 2/2 19 ERF4 family Golgi to plasma membrane protein transport; Lipoprotein

CLTC Clathrin heavy chain 1 HUM -0,41 0,031 1,E+11 323,3 56/56 48,5 Clathrin heavy chain family

receptor-mediated endocytosis; retrograde transport, endosome to Golgi; antigen processing and

presentation via MHC class I

LLGL1 Lethal(2) giant larvae protein homolog 1 HUM -0,46 0,046 4,E+07 6,5 3/3 5,5 WD repeat L(2)GL

family Cell projection; Golgi to plasma membrane transport

CHMP2A Charged multivesicular body protein 2a HUM -1,13 0,011 1,E+09 25,0 3/3 12,6 SNF7 family Autophagy; cell separation after cytokinesis; positive

regulation of exosomal secretion

Others KRT16 Keratin, type I cytoskeletal

16 HUM 1,91 0,046 2,E+09 190,6 15/8 41,2 Intermediate filament family

Inflammatory and innate immune response; morphogenesis of epithelium; regulation of migration

CSN3 Kappa-casein 1,16 0,012 3,E+08 27,6 4/4 30 Kappa-casein family Response to 11-deoxycorticosterone, dehydroepiandrosterone, estradiol and progesterone

PPIA Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A HUM 0,58 0,046 4,E+09 54,2 3/1 21,8 Cyclophilin-type PPIase

family Leukocyte migration; positive regulation of protein

secretion and viral genome replication

MBL Mannose-binding protein C 0,60 0,037 2,E+08 32,1 2/2 12 Complement activation lectin pathway

Innate immunity; positive regulation of phagocytosis; calcium ion and mannose binding

TTYH3 Protein tweety homolog 3 HUM 0,35 0,039 7,E+08 6,8 1/1 4 Tweety family Chloride channel; Ion transport

IGF2R Cation-independent mannose-6-phosphate receptor -0,42 0,024 3,E+08 13,7 8/7 4,3 MRL1/IGF2R family IGF binding; Lysosome; Receptor; Transporter

activity

CD81 CD81 antigen -0,40 0,004 7,E+08 43,0 2/2 11,9 Tetraspanin (TM4SF) family

Cell surface receptor signaling pathway; receptor internalization

VARS Valine--tRNA ligase HUM -0,80 0,017 2,E+08 12,5 10/10 11,2 Class-I aminoacyl-tRNA synthetase family

Aminoacyl-tRNA synthetase; Ligase; Protein biosynthesis; ATP-binding

MET Hepatocyte growth factor receptor HUM -1,90 0,024 5,E+07 11,4 5/4 5,1

Protein kinase superfamily, Tyr protein

kinase family

Negative regulation of autophagy and H2O2-mediated programmed cell death; positive regulation

of endothelial cell chemotaxis and transcription

JEG-3

Ribosomal related Nuclear-transcribed mRNA catabolic process, nonsense-mediated decay; rRNA processing; SRP-dependent cotranslational protein targeting to membrane; translational initiation

RPL12 60S ribosomal protein L12 HUM -0,98 0,008 2,E+08 9,1 3/3 24,2 Ribosomal protein L11P family

ribosomal large subunit assembly; poly(A) RNA binding

182 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

RPL14 60S ribosomal protein L14 HUM -0,65 0,046 1,E+09 5,2 2/2 11,2 Ribosomal protein L14e family

ribosomal large subunit biogenesis; cadherin binding involved in cell-cell adhesion; poly(A) RNA binding

TEX10 Testis-expressed sequence 10 protein HUM -0,68 0,019 3,E+08 31,2 12/12 19,9

rRNA processing; maturation of LSU-rRNA; DNA-dependent DNA replication initiation

Transcription regulation

INTS1 Integrator complex subunit 1 HUM -1,19 0,039 4,E+07 13,5 7/7 5,5 Integrator subunit 1

family snRNA transcription from RNA polymerase II

promoter; Transmembrane

DDX5 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 HUM -0,68 0,031 1,E+08 6,1 7/5 14,7 DEAD box helicase

family Spliceosome; mRNA splicing; Helicase; Hydrolase;

ATP-, Nucleotide- and RNA-binding

XPO1 Exportin-1 HUM -0,71 0,023 5,E+08 50,5 18/18 25,8 Exportin family Negative regulation of transcription; Protein and mRNA transport

RBM39 RNA-binding protein 39 HUM -0,49 0,012 2,E+08 24,7 4/4 13 Splicing factor SR family

Regulation of transcription, DNA-templated; Activator; mRNA processing and splicing

Protein transport CHMP2A Charged multivesicular

body protein 2a HUM 0,50 0,018 1,E+09 25,0 3/3 12,6 SNF7 family Autophagy; protein transport; cell separation after cytokinesis; positive regulation of exosomal secretion

RAB2A Ras-related protein Rab-2A HUM 0,37 0,019 1,E+09 28,0 6/6 37,3 Small GTPase superfamily, Rab family

ER-Golgi transport; Protein transport; small GTPase mediated signal transduction

COPB2 Coatomer subunit beta HUM -0,44 0,046 9,E+07 7,6 3/3 7,6 WD repeat COPB2 family ER-Golgi transport; Protein transport

Others GMPS GMP synthase [glutamine-

hydrolyzing] HUM 1,01 0,008 2,E+08 19,0 10/10 25,8 Purine metabolism / GMP biosynthesis

glutamine metabolic process; purine ribonucleoside monophosphate biosynthetic process

ANXA1 Annexin A1 HUM 0,34 0,041 6,E+09 323,3 11/11 39,9 Annexin family Adaptive and Innate immunity; Cell projection; Cilium; regulation of hormone secretion

PSMA2 Proteasome subunit alpha type-2 HUM 0,43 0,038 1,E+08 19,9 5/5 38 Peptidase T1A family

Regulation of Wnt pathway, and ubiquitin-protein ligase activity involved in mitotic cell cycle; NIK/NF-

κB signaling; Threonine protease

ALDH7A1 α-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase HUM -0,63 0,009 2,E+08 6,7 5/5 13,5 Amine and polyamine

biosynthesis Glycine betaine biosynthetic process from choline;

lysine catabolic process

CAP1 Adenylyl cyclase-associated protein 1 HUM -0,86 0,034 4,E+08 73,4 10/1 33,9 CAP family

Activation of adenylate cyclase activity; cell migration; signal transduction; actin polymerization or

depolymerization

MCM7 DNA replication licensing factor MCM7 HUM -0,56 0,004 4,E+08 24,4 14/14 26,4 MCM family Cellular response to DNA damage stimulus and EGF

stimulus; DNA unwinding involved in DNA replication

PXDN Peroxidasin homolog HUM -1,51 0,009 8,E+08 110,0 13/13 15,3 Peroxidase family, XPO subfamily

ECM organization; H2O2 catabolic process; immune response; response to oxidative stress

*p-value < 0,05. Para todas las indentificaciones el Q-value (FDR) fue cero. Orgm. Organismo, humano o bovino (morado), exclusivamente humano (azul). F.Ch.: Fold change; S.Q.: Sequence coverage; Pep. Peptides; Uniq.: Uniques Peptides.

En HTR-8/SVneo, TGF-β reguló proteínas relacionadas con transcripción, reparación de ADN, metabolismo, transporte de proteínas, adhesión y migración, entre otros (ver Tabla 3-9). La proteína con mayor disminución fue el receptor del factor de crecimiento hepatocito o proteína tirosin quinasa MET (log2 F.C. -1,9, disminuida 2,28 veces), el cual es un conocido oncogen que regula muchos procesos fisiológicos, incluida proliferación, diseminación, morfogénesis y supervivencia. Adicionalmente reguló a la baja la proteína 1 con dominio Staphylococcal nucleasa (SND1, log2 F.C. -1,3, disminuida 2,46 veces), también conocida como proteína 11 con dominio Tudor quien funciona como un factor de puente entre STAT6 y el factor de transcripción basal y como un coactivador transcripcional para el antígeno nuclear 2 del virus de Epstein-Barr (EBNA2) y juega un papel en la regulación PIM1 de la actividad MYB. Dentro de las proteínas reguladas al alza están la queratina de citoesqueleto 16 tipo I (K1C16, log2 F.C. 1,9, aumento 3,73 veces), la argininosuccinato sintasa (ASSY, log2 F.C. 1,53, aumento 2,89 veces) envuelta en la biosíntesis de L-arginina y en el ciclo de la urea y el miembro 7 de la subfamilia golgina A (GOGA7, log2 F.C. 1,2, aumento 2,30 veces), la cual puede estar involucrada en el transporte de proteínas de Golgi a la superficie celular y hace parte del complejo ZDHHC9-GOLGA7 que es una palmitotranseferasa específica de HRas y NRas. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25) A diferencia de HTR-8/SVneo, las proteínas reguladas en JEG-3 por parte de TGF-β fueron mucho menores, la mayoría a la baja y algunas relacionadas con regulación de la transcripción, ribosoma y transporte de proteínas (Tabla 3-9). Adicional a CHMP2A, la otra proteína al alza fue la GMP sintasa (GMPS, log2 F.C. 1,01, aumento 2,01 veces), quien está involucrada en la síntesis de novo de nucleótidos guanina, no solo los esenciales para la síntesis de ADN y ARN, sino también al aportar GTP, el cual se requiere para procesos celulares importantes incluida la división celular. Dentro de las proteínas reguladas a la baja está el homólogo peroxidasina (PXDN, log2 F.C. -1,5, disminución 2,83 veces), también conocido como antígeno asociado a melanoma MG50, el cual exhibe una actividad peroxidasa baja y juega un rol en la formación de la matriz extracelular. La subunidad 1 del complejo integrador (INTS1, log2 F.C. -1,2, disminución 2.30 veces) está involucrada en la regulación de la transcripción de ARN nucleares pequeños (snRNA) del promotor de la ARN polimerasa II (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Adicional al análisis de las diferencias entre los dos modelos, los datos proteómicos se trabajaron como un único experimento con diferentes replicas técnicas, asumiendo a las dos líneas celulares como modelos similares de trofoblasto. Teniendo en cuenta que la normalización de las condiciones de cultivo condujo a una aparente homogenización de los dos modelos biológicos (ver Capítulo 2, sección 2.1.4), es interesante evaluar las similaridades entre los dos modelos y el efecto general o común del TGF-β sobre la expresión de proteínas de EVs derivados de estos. Para esto, con el programa Perseus se realizó un t-test de dos vías para buscar las razones de cambios siginificativas en ambas líneas celulares. Se identificaron 2.445 proteínas, incluyendo 2.151 humanas, siendo un 88% del total de proteínas identificadas; las 294 proteínas restantes son de origen exclusivamente bovino, provenientes del SFB. Estas no fueron tenidas en cuenta en los análisis bioinformáticos, como se realizó en la sección anterior. Adicionalmente, 614 proteínas pueden ser de origen tanto humano como bovino; para estas se verificó la ontología, incluyendo la especificidad de tejido y la localización subcelular reportada, para determinar si eran falsos positivos o no (ver Tabla 3-10). A diferencia del análisis anterior, en este se obtuvieron razones de cambio más extremas, pero con una menor signficancia, debido al enfoque trabajado (ver Figura 3-18).

184 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Tabla 3-10 Sumario de proteínas identificadas y cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ en común

Multiconsenso 24 reportes Total Humana (excl.) Humana / Bovina Bovina (excl.) Total proteínas identificadas 2.445 1.537 614 294 Total proteínas cuantificadas 2.419 1.514 613 292

Proteínas significativas p <0,20 216 130 56 30 p < 0,05 50 31 13 6

Proteínas diferenciales significativas 34 19 11 4

Reguladas a la baja < -0,5 13 9 3 1 < -1,0 5 3 1 1

Reguladas al alza > 0,5 21 10 8 3 > 1,0 12 6 4 2

Proteínas diferencialmente reguladas estadísticamente significativas (p-value<0,05, log2 fold change >0,5 y <-0,5). *razón de cambio en el nivel de la proteína expresada como log2 Fold Change; excl.: identificadas de forma exclusiva en un organismo. Figura 3-18 Diagrama de Vulcano de proteínas cuantificadas en EVs inducidas por TGFβ

en común.

Significancia estadística (-log T-test p-value) vs. significancia biológica (razón de cambio en el nivel proteico, log 2 fold change) de las proteínas cuantificadas. Las proteínas diferencialmente reguladas estadísticamente significativas (p<0,05, log2 fold change >0,5 o <-0,5) se muestran como puntos rojos.

Como en el análisis anterior, las proteínas reguladas por el TGF-β pertenecen a procesos de remodelamiento de cromatina, regulación de la transcripción y traducción, migración celular y adhesión, procesos metabólicos y regulación del sistema inmune y neuronal (ver Tabla 3-11). Dentro de las proteínas cuantificadas, estadísticamente significativas, resalta la proteína asociada a metástasis MTA2 (Metastasis-associated protein MTA2) la cual tuvo una disminución de 16 veces (log2 F.C. -5,53) para ambos modelos en respuesta al TGF-β, y el transportador de Zinc ZIP14 (Zinc transporter ZIP14) el cual aumento cerca de 46 veces (log2 F.C. 12,16). MTA2 puede estar implicada en la regulación de la expresión génica como represor y activador; la represión podría estar relacionada con modificación covalente de proteínas histonas. ZIP14 puede mediar la captación celular de hierro unido a non-transferrina y es un transportador de iones metálicos de amplio alcance con una preferencia por la absorción de zinc. La dehidrogenasa 1 retinal (ALDH1A1), quien disminuyo 14 veces (log2 F.C. -3,81), puede convertir/oxidar retinaldehido a ácido retinóico y participa en la regulación positiva de actividad GTPasa.

Tabla 3-11 Proteínas cuantificadas significativamente en EVs de JEG-3 y HTR-8/SVneo, inducidas por TGF-β de forma conjunta Gene name Protein Name O. log2

FC p-

value Int. Scr.

Pep/Uniq

S.Q [%] GO BP

MTA2 Metastasis-associated protein MTA2 -4,06 0,004 7,E+07 5 3/3 6,6

chromatin assembly or disassembly; DNA methylation; regulation of transcription from RNA polymerase II promoter; regulation of fibroblast

migration; regulation of signal transduction by p53 class mediator Signal transduction

GRK6 G protein-coupled receptor kinase 6 -0,95 0,010 4,E+07 8 4/4 10,5 desensitization of G-protein coupled receptor protein signaling pathway;

negative regulation of anion channel activity; Wnt signaling pathway

CSN1S1 Alpha-S1-casein 1,34 0,035 9,E+09 96 4/4 26,2 negative regulation of apoptotic process and gene expression; positive

regulation of androstenedione and progesterone secretion; response to 11-deoxycorticosterone, dehydroepiandrosterone, estradiol, growth hormone

and progesterone

CSNK2A2 Casein kinase II subunit alpha 1,77 0,041 1,E+07 3 3/2 10 apoptotic process; mitotic spindle checkpoint; protein phosphorylation;

regulation of transcription, DNA-templated; Wnt signaling pathway Chromatin remodeling

CHD4 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4 -0,62 0,042 6,E+07 15 8/7 5,8

ATP-dependent chromatin remodeling; regulation of signal transduction by p53 class mediator; regulation of transcription from RNA polymerase II promoter;

spindle assembly; terminal button organization

SMARCA5

SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent

regulator of chromatin subfamily A member 5

-0,42 0,032 9,E+08 152 20/15 25,3

Chromatin remodeling; chromatin silencing at rDNA; covalent chromatin modification; DNA-templated transcription, initiation; double-strand break repair; nucleosome assembly and positioning; positive regulation of gene expression

(epigenetic) and of transcription (DNA-templated) HIST1H1T Histone H1t -0,35 0,050 2,E+08 4 3/2 15,5 cell differentiation; multicellular organism development; nucleosome assembly

Regulation of transcription and translation SF3A3 Splicing factor 3A subunit 3 -0,90 0,031 3,E+07 10 6/6 20 mRNA 3'-splice site recognition; mRNA splicing, via spliceosome; RNA splicing,

via transesterification reactions RPS2 40S ribosomal protein S2 -0,60 0,046 1,E+09 38 6/6 26,6 positive regulation of transferase activity; translation

IARS Isoleucine--tRNA ligase, cytoplasmic -0,53 0,043 8,E+08 166 19/

19 20,6 isoleucyl-tRNA aminoacylation; tRNA aminoacylation for protein translation; osteoblast differentiation

PABPC1 Polyadenylate-binding protein 1 -0,44 0,037 2,E+09 75 17/

13 36 gene silencing by RNA; mRNA processing; negative regulation of mRNA

catabolic process, nonsense-mediated decay; positive regulation of mRNA catabolic process, deadenylation-dependent decay and of nuclear-transcribed

mRNA poly(A) tail shortening SNRNP20

0 U5 sn ribonucleoprotein 200

kDa helicase -0,34 0,028 2,E+09 147 32/32 22,3 cis assembly of pre-catalytic spliceosome; mRNA splicing, via spliceosome;

osteoblast differentiation

NACA Nascent polypeptide-

associated complex subunit α

0,81 0,037 6,E+08 22 5/5 32,6 myoblast migration; protein transport; transcription, DNA-templated

MATR3 Matrin-3 1,03 0,013 4,E+08 115 8/8 17,4 posttranscriptional regulation of gene expression Cell migration and adhesión

186 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

DAAM1 Disheveled-associated activator of morphogenesis 1 -0,83 0,014 2,E+07 9 6/6 8,9 actin cytoskeleton organization; Wnt signaling pathway, planar cell polarity

pathway

ACTN1 Alpha-actinin-1 -0,51 0,039 2,E+09 147 20/14 31,1

actin filament network formation; focal adhesion assembly; negative regulation of cellular component movement; platelet degranulation; regulation of apoptotic

process

RGN Regucalcin 0,35 0,002 1,E+09 12 4/4 19,4 cellular calcium ion homeostasis; L-ascorbic acid biosynthetic process; positive regulation of ATPase activity; regulation of calcium-mediated

signaling

DAB2 Disabled homolog 2 0,55 0,050 3,E+08 17 8/8 18,6

cell proliferation; leading edge cell differentiation; negative regulation of AR and canonical Wnt signaling pathway; negative regulation of apoptotic

process, protein binding and protein localization to plasma membrane; positive regulation of cell migration, endocytosis, endosome transport, pathway-

restricted SMAD protein phosphorylation, proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process, protein phosphorylation, SMAD protein import into nucleus and planar cell polarity pathway; regulation of transcription, DNA-

templated; positive regulation of TβR and Wnt signaling pathway

PFN1 Profilin-1 0,59 0,026 2,E+09 31 5/4 52,1 positive regulation of actin filament bundle assembly; regulation of actin filament polymerization

KRT14 Keratin, type I cytoskeletal 14 0,76 0,036 5,E+09 296 15/

8 39 aging; epithelial cell differentiation; hemidesmosome assembly; intermediate filament bundle assembly; response to ionizing radiation and to Zn

MPP7 MAGUK p55 subfamily member 7 0,98 0,021 2,E+07 6 4/4 10,4 bicellular tight junction assembly; establishment of cell polarity; positive

regulation of protein complex assembly; protein localization to adherens junction

KRT6C Keratin, type II cytoskeletal 6C 1,19 0,040 3,E+09 322 14/

0 26,2 intermediate filament cytoskeleton organization

ITGA1 Integrin alpha-1 1,95 0,010 2,E+08 24 9/9 10,9

activation of MAPK activity; cell-matrix adhesion; cellular extravasation; ECM organization; integrin-mediated signaling pathway; negative regulation of cell

proliferation and EGFR signaling pathway; neuron projection morphogenesis; neutrophil chemotaxis; positive regulation of neuron

apoptotic process

DPYSL3 Dihydropyrimidinase-related protein 3 1,98 0,007 5,E+07 28 7/5 22,5

actin crosslink formation; actin filament bundle assembly; cellular response to cytokine stimulus; negative regulation of cell migration; positive regulation

of filopodium assembly; regulation of neuron projection development; response to axon injury

PCDH12 Protocadherin-12 4,04 0,042 5,E+07 8 2/2 3 calcium-dependent cell-cell adhesion via plasma membrane cell adhesion molecules; glycogen metabolic process; labyrinthine layer development;

neuron recognition Metabolic process

ALDH1A1 Retinal dehydrogenase 1 -3,81 0,045 5,E+07 5 3/3 9,4 retinol metabolic process

GFPT1 Glutamine--fructose-6-

phosphate aminotransferase [isomerizing] 1

-0,32 0,042 9,E+08 63 17/17 34,5

fructose 6-phosphate and UDP-N-acetylglucosamine metabolic process; cellular response to insulin stimulus and sucrose; circadian regulation of

gene expression; IRE1-mediated unfolded protein response; negative regulation of glycogen biosynthetic process

CPD Carboxypeptidase D 0,64 0,039 2,E+08 95 10/10 13,5 peptide metabolic process; protein processing

Capítulo 3 187

BHMT Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1 0,69 0,038 1,E+08 11 4/4 13,3 amino-acid betaine catabolic process ; L-methionine salvage

LAMTOR1 Ragulator complex protein LAMTOR1 0,77 0,023 3,E+08 12 5/5 52,2

cell cycle arrest; cell growth; cellular protein localization; cellular response to amino acid stimulus; endosome and lysosome localization and organization;

macroautophagy; regulation of cholesterol efflux, esterification and import; regulation of receptor recycling; positive regulation of GTPase

activity, MAPK cascade and TOR signaling

UGP2 UTP--glucose-1-phosphate uridylyltransferase 1,56 0,034 1,E+08 46 5/5 13,7 glucose 1-phosphate metabolic process; glycogen biosynthetic process; UDP-

glucose metabolic process; UDP-glucuronate biosynthetic process

ACAT2 Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 3,00 0,028 2,E+07 17 3/3 11,3 lipid metabolic process

SLC39A14 Zinc transporter ZIP14 5,53 0,023 2,E+08 5 2/2 5,1 cellular zinc ion homeostasis; zinc II ion transmembrane import

Immune process

MIF Macrophage migration inhibitory factor -3,37 0,049 8,E+07 76 1/1 18,3

cell proliferation; cell surface receptor signaling pathway; DNA damage response, signal transduction by p53 class mediator; inflammatory response;

innate immune response

IGKC Ig kappa chain C region 0,33 0,011 6,E+07 7 4/4 61,3

B cell receptor signaling pathway; complement activation, classical pathway; Fc-εγ receptor signaling pathway; Fc-γ receptor signaling pathway involved in phagocytosis; innate immune response; phagocytosis, engulfment and recognition; positive regulation of B cell activation; receptor-mediated

endocytosis; regulation of immune response Neuronal development

YWHAG 14-3-3 protein gamma -0,70 0,007 5,E+08 131 4/3 21,5 regulation of neuron differentiation and synaptic plasticity

SHCBP1 SHC SH2 domain-binding protein 1 0,39 0,043 8,E+07 10 6/ 11,8 FGF receptor signaling pathway; regulation of neural precursor cell

proliferation

USP14 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 0,55 0,042 9,E+07 11 7/7 17,9

chemical synaptic transmission; negative regulation of ER-associated ubiquitin-dependent protein catabolic process; regulation of chemotaxis;

regulation of proteasomal protein catabolic process

AIMP2 Aminoacyl tRNA synthase

complex-interacting multifunctional protein 2

1,06 0,015 6,E+07 9 3/3 16,9 apoptotic process; negative regulation of cell proliferation; positive regulation of neuron death and protein ubiquitination; tRNA aminoacylation for protein

translation; Type II pneumocyte differentiation Otros

USP5 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5 -0,32 0,017 3,E+08 29 7/7 14 positive regulation of proteasomal ubiquitin-dependent protein

catabolic process; protein K48-linked deubiquitination TUBB1 Tubulin beta-1 chain 0,32 0,004 1,E+09 47 4/2 12,2 spindle assembly

Protein HP-20 homolog 1,64 0,023 3,E+07 7 2/2 19,9 collagen trimer, extracellular region *p-value < 0,05. Para todas las indentificaciones el Q-value (FDR) fue cero. O. Organismo, humano o bovino (morado), exclusivamente humano (azul) o exclusivamente bovino (rojo). F.Ch.: Fold change; S.Q.: Sequence coverage; Pep. Peptides; Uniq.: Uniques Peptides.

El factor inhibitorio de la migración de macrófagos (MIF) fue disminuido 10 veces (log2 F.C. -3,37) en respuesta al TGF-β, sin embargo, su identificación se hizo únicamente para bovino y con solo un péptido único; esta es una citoquina pro-inflamatoria que regula negativamente procesos inmunes asociados a inflamación, participa en la respuesta inmune innata a patógenos bacterianos, su expresión en sitios de inflamación sugiere un papel de mediador en la regulación de la función de los macrófagos en la defensa del huésped, contrarresta la actividad anti-inflamatoria de los glucocorticoides y tiene actividad fenilpiruvato tautomerasa y dopacromo tautomerasa. La protocaderina-12 (PCDH12), aumentada 16 veces (log2 F.C. 4) y también conocida como caderina-2 endotelio vascular (VE-cad-2), es molécula de adhesión celular que puede desempeñar un papel importante en las interacciones célula-célula en las uniones interendoteliales, promueve la agregación homotípica dependiente de calcio y de adhesión y las agrupaciones en las uniones intercelulares, y puede participar en el proceso en el que la capa laberíntica de la placenta avanza, desde su formación hasta su estado maduro. La subunidad alfa de la caseína quinasa II (CSNK2A2), aumentada 3,4 veces (log2 F.C. 1,77) es la subunidad catalítica de un complejo de serin/treonina-proteína quinasa constitutivamente activa que fosforila un gran número de sustratos y regula numerosos procesos celulares, tales como la progresión del ciclo celular, apoptosis y transcripción, así como la infección viral; puede actuar como un nodo de regulación que integra y coordina numerosas señales que conducen a una respuesta celular apropiada. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Mediante la aplicación CluePedia de Cytoscape se generó una red de interacción física proteína-proteína en base a las acciones reportadas en STRING, para los dos análisis (ver Anexo A 8). Ya que las proteínas invariables constituyen el background de acción de las proteínas diferencialmente reguladas por el TGF-β, se trabajaron con todas ellas, situación que permite obviar la adición de nodos background reportados en la literatura. Al trabajar con todas las proteínas identificadas y cuantificadas, se observó que todas las proteínas anotadas en STRING se interconectaron entre sí, revelando su conexión y sugiriendo procesos de modulación coordinados. Se generó una nueva red teniendo en cuenta solo el p-value <0,200 y todas las razones de cambio, obteniendo redes menos densas en las que muchas de estas proteínas interactuan entre sí, sugiriendo nuevamente que la regulación ejercida por el TGF-β genera un cambio coordinado en proteínas relacionadas, que cumplirían una acción conjunta en la célula de destino (Supl. Capítulo 3 CluePedia, Redes de Interactómica para las proteínas reguladas por TGF-β en cada modelo o común a los modelos).

3.4 Análisis general de resultados Gracias a los resultados obtenidos en el primer capítulo (S. Novoa-Herran et al., 2016) se evidencia el efecto que tienen las condiciones de cultivo y el microambiente sobre la función del trofoblasto. No obstante, esta regulación es de doble vía, gracias a una comunicación o crosstalk recíproco entre las células tumorales/placentales y sus células estromales vecinas, la cual permite modular las funciones del trofoblasto, cuyo proceso de deportación parece ser de vital importancia en la regulación de la respuesta inmune materna (Pantham et al., 2011). En la última decada ha ido en aumento el interes por estudiar exosomas y otras EVs, su aislamiento y análisis, así como su uso potencial en tratamientos terapéuticos y como biomarcadores diagnóstico. Sin embargo, una de las dificultades del análisis de EVs

Capítulo 3 189

consiste en la presencia de agregados proteicos macromoleculares, libres de membrana, durante su aislamiento; por eso es importante una caracterización de las EVs aisladas, incluyendo marcadores bioquímicos, espectrometría de masas y técnicas de imagen como crio-TEM y NTA (Raposo & Stoorvogel, 2013). En este capítulo se aislaron por ultracentrifugación diferencial EVs provenientes de medios condicionados por las líneas derivadas de trofoblasto HTR-8/SVneo y JEG-3, y se realizó una caracterización preliminar de ellas, incluyendo presencia de marcadores exosomales por DotBlot, distribución de tamaño por NTA, estructura y tamaño por crio-TEM y perfil proteómico por espectrometría de masas. Finalmente se analizó la composición proteica de EVs derivadas de trofoblasto, las cuales pueden ser liberadas para comunicación con células en su microambiente, pero especialmente con células distantes vía circulación a través del sistema materno. En este capítulo se consideran a las EVs derivadas de trofoblasto, particularmente a los exosomas, como entes claves en la comunicación estroma uterino - placenta, y en la modulación de la regulación que ejerce el microambiente uterino sobre el trofoblasto. Considerando al trofoblasto como tejido “pseudomaligno” o “fisiológicamente metastático”, y teniendo en cuenta las diferencias de la línea inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo y de la línea de coriocarcinoma JEG-3, es de gran relevancia la regulación que ejerce el microambiente sobre estas células, y a su vez la modulación que puede ejercer el trofoblasto sobre su propio microambiente, pudiendo existir procesos biológicos, estrategias celulares y alteraciones similares a las encontradas en etapas tempranas del proceso de carcinogénesis. Como se planteó anteriormente, es necesario considerar las condiciones extracelulares y el microambiente como un determinante clave en la malignizacion celular y progresión tumoral; y teniendo en cuenta el potencial que tienen las EVs especialmente los exosomas en modular al microambiente, es de interés el estudio del proteoma de estas EVs derivadas de trofoblasto. En los últimos cinco años la investigación de EVs placentales se ha incrementado al ser reconocidos como importantes transportadores moleculares que pueden jugar un rol crucial en la comunicación feto-materna (M. Tong & Chamley, 2015). La mayoría de los estudios se enfocan en miARNs y proteínas específicas en fracciones particulares de EVs de placentas con complicaciones patológicas, como los de Tanneta et al, quien investigó el rol de las micro y nano-vesículas liberadas por sincitiotrofoblasto (STBM) en pre-eclampsia (Tannetta et al., 2013). Son pocos los estudios proteómicos que se han realizado: en el primero de ellos se aislaron exosomas de células de trofoblasto humano Swan71 mediante ultrafiltración y ultracentrifugación y se identificaron 282 proteínas por LC-MS trampa de iones (Safinur Atay et al., 2011). El grupo de Tanneta comparó microvesículas de ST (STBM) obtenidas por perfusión de placentas normales y pre-eclampticas usando identificación de proteínas multi-dimensional (MudPIT) y LC-MS/MS, encontrando 538 proteínas únicas para pre-eclmapsia, 604 únicas para placentas normales y 1.421 comunes (Redman et al., 2012). Otro estudio investigó macro-, micro- y nano-vesículas de placentas de primer trimester (cultivo de explante placental ex vivo), colectadas por ultracentrifugación diferencial detectando mediante LC-MS/MS Orbitrap, encontrando 1.585, 1.656 y 1.476 proteínas, respectivamente en cada fracción (Mancy Tong et al., 2016). El grupo de Salomon estudió exosomas derivados de cultivos primarios de citotrofoblasto de primer trimestre, en relación con la concentración de oxígeno en cultivo, los cuales fueron aislados por centrifugación diferencial y densidad de flotación, se evaluó su efecto en la proliferación e invasión de células HTR-8/SVneo y se analizaron por LC-MS/MS ToF ToF identificando 160 proteínas exosomales (Salomon et al., 2013). Adicionalmente, este grupo comparó los exosomas derivados de HTR-

190 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

8/SVneo y JEG-3 y sus efectos en la migración de células del músculo liso vascular (VSMCs); dentro de sus hallazgos figura un mayor nivel de invasión y más exosomas liberados por células HTR-8/SVneo comparado con células JEG-3 y un efecto positivo de los exosomas sobre la migración de VSMCs, el cual fue abolido al sonicar los exosomas; el análisis MS identificó más de 140 proteínas exosomales, incluyendo proteínas específicas para cada línea (Salomon et al., 2014). Las proteínas exosomales aisladas por Salomon de células JEG-3 y HTR-8/SVneo se asociaron con el movimiento celular y la morfología, el tráfico de células inmunes y el montaje y organización celular; y se observó un enriquecimiento significativo en HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3 de proteínas relacionadas con migración celular y movimiento. A diferencia de los estudios anteriores, en este trabajo se identificó un número significativamente mayor de proteínas, logrando un mayor cubrimiento del proteoma de las EVs y por lo tanto del secretoma de células derivadas de trofoblasto. Esta caracterización extensiva se logró gracias al método eFASP y a la arquitectura “tribida” del equipo LC-MS/MS empleado. De todas formas, algunas de las proteínas identificadas concuerdan con lo obtenido en estudios previos y similar a lo encontrado por Salomon, las proteínas identificadas en EVs derivadas de HTR-8/SVneo la vinculan más con procesos de migración celular, que a JEG-3. Adicionalmente se analizó el efecto del TGF-β sobre el contenido proteico de estas EVs, estudio que aún no se había llevado a cabo. Para esto se utillizó un método de cuantificación libre de marcaje LFQ, basado en XIC, con una adquisición dependiente de datos (DDA) empleando una ventana de exclusión dinámica con LFQ rápido. El método de cuantificación basado en XIC es superior al conteo espectral si se tiene una resolución suficiente y un algoritmo óptimo. El equipo empleado, al combinar un orbitrap, con cuadrupolo y trampa de iones, permite una alta resolución de las señales registradas. Según un estudio de este año, la cuantificación con el software MaxQuant es la que mejor desempeño tiene cuando se usa la métrica LFQ basada en XIC, comparado con otros flujos de trabajo, en términos de sensibilidad (tasa de positivos verdaderos) y FDR (tasa de descubrimientos falsos) (Ramus et al., 2016). No obstante, es necesario reconocer que la función de exclusión dinámica en el modo DDA, especialmente cuando se hace cuantificación por conteo espectral, causa una selección de iones precursores estocástica e irreproducible, además de un bajo muestreo que limita las capacidades de cuantificación (Zhang et al., 2016). Estos valores perdidos son comunes entre los datos MS, siendo un desafío importante en la proteómica cuantitativa; es por esto que la cuantificación se limita a las señales registradas para proteínas identificadas en cada muestra biológica, imputando aquellas señales perdidas (Karpievitch et al., 2012). Esto finalmente conduce a un bajo número de proteínas cuantificadas dentro del set de proteínas identificadas.

3.4.1 Consideraciones sobre las EVs obtenidas

Proteínas cargadas en EVs y exosomas

De los resultados obtenidos es claro que las células secretan una variedad de exosomas y EVs, cada una de las cuales podría cargar un set de proteínas diferentes. Si consideramos a las proteínas como esferas y el rango de sus radios (ver Anexos B 6), es posible estimar el número máximo de proteínas que podría contener una EV de tamaño específico. Dependiendo del tamaño de la proteína en cuestión y asumiendo una

Capítulo 3 191

eficiencia de empaquetamiento máxima de 64% (referida para un empaquetamiento aleatorio), un exosoma como los obtenidos de 100 nm de diámetro (50 nm de radio) podría cargar hasta 80 proteínas de 10 nm de radio (como fibrinógeno o una proteína mayor a 500 kDa) o hasta 80.000 proteínas de 1 nm de radio (5 kDa o más pequeña que la ribonucleasa A bovina pancreática) (radios reportados por Erickson, 2009). No obstante, este valor puede ser menor, ya que el radio proteico dependerá de la forma de la proteína y su superficie, y la eficiencia de empaquetamiento puede ser menor al considerar repulsiones debidas a las cargas superficiales e hidrofobicidad (el empaquetamiento más denso de esferas es del 74%, según la conjetura de Kepler). De cualquier forma, cada exosoma de 100 nm de diametro puede cargar de decenas a miles de proteínas en su interior. En la realidad, y considerando las proteínas identificadas en los EVs derivados de trofoblasto, cada exosoma puede estar compuesto de una variedad de proteínas, desde únicas por vesícula, hasta varias decenas o cientos de un tipo, que pueden organizarse en estructuras para el caso de las proteínas estructurales, o complejos macromoleculares, incluyendo las proteínas de choque térmico, chaperonas y scaffolds, para las cuales habrá una mayor eficiencia de empaquetamiento. Adicionalmente están las proteínas de membrana y proteínas extracelulares posiblemente unidas a la superficie exosomal, como las que se identificaron (Figura 3-9). En cuanto a las balsas lipídicas, su tamaño puede oscilar de 10 a 200 nm, incluyendo caveolas (ver Anexos B 6) (Pike, 2006), por lo que también es probable que estas estructuras de señalización se encuentren enriquecidas en los exosomas. El grupo más heterogéneo y abundante lo constituyen las proteínas citoplasmáticas y nucleares, muchas de las cuales se encuentran en una proporción más baja. Así se podrán tener EVs diferentes, cada una con proteínas carga y de superficie diferentes y específicas. Debido a las diferentes funciones de las proteínas identificadas, se propone como hipótesis para probar en futuros estudios que, según sus proteínas de superficie las EVs y exosomas se unirán selectivamente a células blanco específicas en las cuales liberarían y tendrían efecto las proteínas de carga que llevan en su interior, constituyendo sets diferentes según el blanco al que estén dirigidos.

Origen celular de las proteínas en EVs inducidas por tratamiento

En el caso de la estimulación con TGF-β, las proteínas diferenciales identificadas en el análisis proteómico comparativo tras 48 horas de tratamiento, pueden ser producto no solo de la expresión de novo, sino también deberse a procesos diferenciales de transporte y carga selectivo y/o secreción selectiva de proteínas, procesos que pueden ser inducidos por la estimulación con TGF-β. Así, los efectos del TGF-β no solo se deben considerar a nivel de la expresión de proteínas, vista como transcripción y traducción, sino también sobre el transporte, localización subcelular y exocitosis.

Destino de las EVs y exosomas

Es claro que los exosomas y otras EVs pueden alterar el fenotipo celular y el destino de poblaciones celulares en su microambiente mediante captación paracrina, y en sitios distantes mediante captación endocrina. Existen diversos mecanismos por los cuales los exosomas y otras EVs como ectosomas pueden ejercer sus funciones en células diana: al activar receptores en su superficie por la unión con ligandos en la superficie de la

192 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

vesícula, al fusionarse con la membrana plasmática o ser fagocitados y liberar su contenido incluyendo proteínas, ARNs y enzimas que regulen los procesos fisiológicos de la célula diana o le permitan adquirir nuevas habilidades. Incluso, al tener balsas lipídicas y posiblemente clústers de señalización con la misma configuración que en la célula donora, estos se pueden comportar como una pequeña célula que es capaz de generar activaciones que requieren clústers de ligandos y receptores en células diana distantes, sin necesidad de encontrarse en el mismo entorno celular, pudiendo ser consideradas una especie de “heraldo celular” al generar una señalización juxtacrina. Este tipo de señalización juxtacrina es típico de células inmunes, proceso que no puede ser generado por factores solubles de igual forma. Por último, teniendo en cuenta el contenido proteico de las EVs inducidas por TGF-β, este puede reflejar el estado intracelular de la célula o bien tener una composición especial destinada a células blanco específicas. Si se considera que es simplemente el primero, se puede especular que, la liberación de exosomas y otras EVs sería un mecanismo para influir en células trofoblásticas vecinas, las cuales no han sido afectadas por el TGF-β, debido a la biodisponibilidad y las limitaciones espaciales y de difusión, pero que pueden ser alteradas por éste de forma indirecta gracias a las proteínas transportadas en exosomas, que serían efectores de los procesos regulados por el TGF-β en la célula donora. Así, la liberación y captación autocrina de EVs podría ser un mecanismo de coordinación de la respuesta en los tejidos a señales externas.

Proteínas bovinas identificadas: ¿falsos positivos?

Algunas de las proteínas bovinas fueron identificadas de forma diferencial entre los dos modelos celulares, por lo que podría descartarse el hecho de ser un falso positivo sistemático debido a la presencia de proteínas bovinas del SFB durante el aislamiento de las EVs. Una hipótesis para explicar la presencia diferencial de estas, es que ciertas proteínas bovinas son incorporadas por la célula, para luego ser transportadas internamente y liberadas por métodos de secreción no clásica como exosomas y formación de ampollas. Esto tiene como base la capacidad de fagocitosis reportada en células trofoblásticas (Bevilacqua et al., 2010) y el proceso de deportación explicado previamente. En otros estudios se ha visto que células tumorales son capaces de incorporar la proteína sérica bovina Fetuina-A, vía anexinas, y secretarla de vuelta al medio usando un mecanismo desconocido que parece involucrar la formación de ampollas en la membrana (Sakwe et al., 2010).

Función de las proteínas identificadas en EVs

Las EVs derivadas de células HTR-8/SVneo y JEG-3 en general contienen un grupo importante de proteínas con funciones vinculadas a vías de señalización y regulación de la transcripción (Figura 3-12), no solo ligandos como se había propuesto. Dentro de estos se identificaron 203 receptores, 60 transductores de señal, 90 factores de transcripción y 148 proteínas entre coactivador, corepresor, cofactor y represor transcripcional, los cuales le permitirían a la célula diana ganar capacidades de respuesta a señales que puede no tuviera antes, y nuevas formas de regulación transcripcional y expresión de genes. Esto pone en evidencia el potencial de las EVs derivadas de trofoblasto de modular vías de señalización y alterar el programa transcripcional de las células diana.

Capítulo 3 193

El alto número de receptores identificado es lógico al considerar que las tetraspaninas, enriquecidas en exosomas, interactuan con otras proteínas transmembranales e intracelulares, como metaloproteasas de membrana, receptores y otras moléculas relacionadas con vías de señalización como endoglina (CD105, también identificada), las cuales son incorporadas a los exosomas y liberadas al microambiente, actuando sobre la matriz extracelular o células diana. Debido a su capacidad de asociación con diferentes moléculas, el reclutamiento de estas a microdominios especiales de membrana y su abundante presencia en EVs derivados de tumores, las tetraspaninas han sido propuestas tanto como supresores como promotores metastáticos (Zoller, 2009). Adicionalmente, y como era de esperarse, las EVs estaban enriquecidas en proteínas involucradas en transporte vesicular e inflamación. Por otro lado, se identificó un gran número de histonas, algunas dentro de las proteínas más abundantes, lo cual podría estar relacionado con el alto número de ácidos nucleicos transportados en exosomas; así mismo se identificaron proteínas relacionadas con remodelación de cromatina y reparación de ADN. Adicional a los miRNA y la regulación que generan, se podrían estar transportando fragmentos genómicos que junto con la maquinaria de integración génica podría consistuir una transferencia horizontal de genes, tal como lo sugieren los procesos biológicos enriquecidos como “integración de virus”, “ciclo de vida viral” y “enfermedad infecciosa” (ver Figura 3-13 y Figura 3-16). La transferencia horizontal de genes ha sido descrita como uno de los eventos que contribuye a la iniciación y progresión del cáncer (Tysnes & Bjerkvig, 2007). Adicionalmente, es relevante y plausible al considerar el microquimerismo fetal observado en el organismo materno (Boddy et al., 2015; Chan et al., 2012).

3.4.2 Las EVs derivadas de JEG-3 y HTR-8/SVneo presentan un contenido proteico diferente acorde con su origen

Las proteínas identificadas en EVs derivados de células de trofoblasto están potencialmente involucradas en procesos biológicos relevantes para el embarazo y la malignización, teniendo efectos potenciales en su microambiente y en sitios distantes. A partir de cada uno de los análisis proteómicos realizados se pueden evidenciar tanto similaridades como diferencias entre los dos modelos celulares empleados (ver Figura 3-14, Figura 3-15 y Supl. Capítulo 3 Análisis y diagramas Biocarta: agrin in postsynaptic differentiation, chromatin remodeling; diagramas KEGG: pathway in cancer, chemokine signaling pathway, axon guidance, cell adhesión, gap junction). Tabla 3-12 Proteínas identificadas a nivel general en EVs derivados de trofoblasto Caracterización (hallazgos comunes) * Proceso propuesto Implicación en embarazo Proteínas pertenecientes a nucleosoma, spliceosoma, ribosomas, degradación de RNA, co-reguladores transcripción, chaperonas, scaffolds, etc.

Regulación de la expresión génica a nivel epigenético, transcripción y traducción

Modificación del programa transcripcional y proteoma de las células diana, vía EVs

Proteínas de adhesión (Integrinas, caderinas, ADAM, Pax, Tln, Utro, FAK) y vía de señalización de G monoméricas (Rac, Rap, Ras, Src, DAG1, Rock, Pak, Cdc42, GsK3b), EGFR y MAPK

Procesos generales de adhesión EV-célula, célula-célula y célula-sustrato. Coordinación del trofoblasto (autocrina)

Reconocimiento del destino de EVs, procesos de organización tisular por regulación autocrina y paracrina de la adhesión y la migración

Componentes del complemento, antígenos MHC clase I, clusterin, L-plastin, STXB3,

Inmune (juxtacrina / paracrina): regulación de

Control nivel de inflamación en el sitio de implantación

194 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

dermicidin, PRKDC, CH60, MSH6, PSN1, calreticulina, Ned4L, DYN1, NSF, UBQL1, CAN1, A4, UBE2N, LYN, DPP4, S100A7 HTR8: gremlin, TRAF2, PVR/NECL-5 JEG-3: GDF15, IL-37, IL-36γ, S100A9, GATA3

leucocitos y linfocitos, activación y fagocitosis

Agrina, neurotrofina, neuroplastina, Sema 3C y 3F, netrin G1 y 4, Atx10, NCK1, Efnb, Ppp3 y vía de adhesión y señalización por Ras

Neuronal (endocrina): desarrollo de proyecciones neuronales, guía axonal, diferenciación neuronal

Remodelación neuronal del cerebro materno a través de EVs de trofoblasto

Rfc1, Dkc1, Mre11 JEG-3: Rad50

Mantenimiento de telómeros

Tasa de replicación y características stem cell

Histonas 1T, 2A2C, 2AZ, 2AY, 2AW, 2B2D, 1X, 4, 11, 15, 32, 33 NPM, NP1L4, MCM2, HMGA1, HP1B3, SMCA5, PPIA, Baf. Topoisomerasas 1, 2A, 2B. HTR-8: HMGB2; JEG-3: SMCA2

Transporte de ADN. Ensamblaje y remodelación de cromatina (HTR-8)

Regulación epigenética de la expresión y cambios del programa transcripcional, incluyendo integración de ADN. Alteraciones de la cromatina. En JEG-3: aumento en la expresión génica

MBD3, ACL6A, MO4L1, HAT1, RUVB2, RUVB1 JEG-3: TAF10, TAF6L, TRRAP, EP300, EP400, Q5TG36, y SUPT3 (DAVID) y OGT, MCRS1, BRCA2, DMAP1, MSL1, BRD8, ARRB1 y BEND3 (ClueGO)

Acetilación de histonas incluyendo H4(JEG-3) (Figura 3-16)

Tratamiento con TGF-β** Proceso propuesto Implicación en el embarazo PCDH12 e ITGA1 ↑↑ Adhesión a blanco específico El TGF-β podría promover la

adhesión (y supervivencia celular), controlar la migración/adhesión de poblaciones celulares e inducir cambios metabólicos, a través de la inducción de EVs con blanco de acción específica

DAB2↑ Selección de moléculas carga, conexión TGF-β - adhesión

(ZIP14, THIC, UGPA) ↑↑ (CPD, BHMT, LTOR1)↑

Procesos metabólicos y producción / transporte de nutrientes

DPYSL3↑↑, MPP7↑, PROF1↑ DAAM1↓

Remodelación del citoesqueleto y efectos negativos en la migración y positivos en la adhesión y formación de filopodios

MTA2↓↓ Disminución de secreción EVs oncogénicas por lisis lisosomal

Supresor tumoral: regulación negativa de la activación de HGF/Met con posibles implicaciones en proliferación e invasión del trofoblasto

Ver Material Suplementario Capítulo 3 *Análisis preliminar JEG3 y **Análisis comparativo H y J Al centrarnos en las proteínas únicas a un modelo o reguladas de forma diferencial por el TGF-β, se sugieren procesos potenciales, acordes con el origen y fenotipo de las células HTR-8/SVneo y de las células JEG-3. Tabla 3-13 Proteínas identificadas y reguladas por TGF-β en EVs de HTR-8/SVneo Hallazgos Proceso propuesto Implicación en HTR-8/SVneo Proteínas únicas* asociadas a mitosis, migración y adhesión célula-célula y célula-sustrato vía EVs (Figura 3-16)

Relevancia de las EVs en la coordinación de los procesos del trofoblasto invasivo

Proteínas asociadas a la vía de señalización TGF-β Relevancia del TGF-β en las EVs de HTR-8/SVneo

Tratamiento con TGF-β MET↓ SND1(STAT)↓ GOGA7 (HRas, NRas)↑

Regulación de otras vías de señalización

Modulación de otras vías mediante EVs

Capítulo 3 195

CAP1↑ Regulación de la migración a través de adhesión

Papel anti-migratorio de TGF-β y pro-adhesión

CHMP2A↓ y MET↓ clasificación de MET en ILV con destino a lisosomas y disminución de carga en exosomas

TGF-β como supresor tumoral: control de la distribución de MET vía exosomas

Ver Material Suplementario Capítulo 3Análisis comparativo H y J * únicas HTR8 y Qty HTR8 Tabla 3-14 Proteínas identificadas y reguladas por TGF-β en EVs de JEG-3 Hallazgos Proceso propuesto Implicación en el

coriocarcinoma Proteínas asociadas a Acetilación de histonas H4 (Figura 3-16)

Aumento de la expresión génica

GDF15, IL-37, GATA3 CEBPB

Supresión de la producción de citoquinas proinflamatorias maternas y regulación de Th2

Conserva algunos circuitos regulatorios típicos del trofoblasto. Manipulación del sistema inmune y del nicho hacia respuesta innata.

IL-36γ, S100A9 Promoción de la inflamación y respuesta innata

Tratamiento con TGF-β MCM7↓ CAP1↓ Defectos en la replicación del

ADN y citocinesis / fusión celular, células multinucleadas

Inestabilidad genómica / Características normales sincitio

CAP1↓ Baja sensibilidad a señales externas

Contribución al fenotipo maligno

CHMP2A↑ Predilección de la vía exosomal sobre la degradación vía lisosoma

¿Alteraciones en el proceso de degradación de proteínas?

GMPS↑ Producción de GTP para procesos varios, incluyendo mitogénicos

Mantenimiento de los procesos asociados a tumorogénesis

Ver Material Suplementario Capítulo 3 Análisis comparativo H y J * únicas JEG3 y Qty JEG3

Regulación del citoesqueleto en procesos de citocinesis, adhesión y migración y posible efecto autocrino

Las proteínas secretadas por células trofoblásticas vía EVs pertenecen a vías de organización del citoesqueleto, incluyendo moléculas de adhesión superficial, las cuales son relevantes en procesos de citocinesis o separación celular durante la mitosis, adhesión, migración, establecimiento de contactos célula-célula y célula-matriz, incluyendo canales gap, y otros que involucran una dinámica celular y de comunicación extracelular, todos estos procesos enriquecidos por las proteínas identificadas (ver Supl Capítulo 3 Análisis comparativo H y J y Análisis preliminar JEG3; BP Pathway Funct Clust). Estas podrían tener como destino otras células trofoblásticas, de tal forma que su captación autocrina permitiría modular y coordinar procesos celulares a nivel tisular. Se ha visto que los exosomas parecen contener todos los ingredientes necesarios para promover la fusión intercelular y se pueden comportar como iniciadores de la formación del sincitiotrofoblasto (Record, 2014). En este sentido, las células trofoblásticas estarían actuando de forma coordinada y organizada gracias a esta modulación vía EVs, sugiriéndo de nuevo al trofoblasto como una célula sensible y en armonía con su entorno como se espera para células normales. Adicionalmente, se ha observado en el cultivo celular de HTR-8/SVneo que un medio condicionado por varios días por estas células permite una mayor adherencia de las mismas y un repunte a nivel de proliferación en

196 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

comparación con medio fresco (observaciones personales) sugiriendo efectos de factores secretados por el trofoblasto, incluyendo EVs, sobre la adhesión y supervivencia. No obstante, se requiere de un estudio concreto para comprobar estas observaciones.

Efectos sobre el metabolismo

El análisis proteómico sugiere la regulación del metabolismo en las células blanco a través de proteínas involucradas en rutas metabólicas de proteínas, aminoácidos concretos, y glicólisis. Las vías enriquecidas en HTR-8/SVneo a diferencia de JEG-3 fueron las de las pentosas fosfato, ácido selenoamino, glutatión, piruvato y nucleótidos; mientras que en JEG-3 resalta el metabolismo del óxido nítrico. También hubo procesos catabólicos que involucraban el proteosoma y marcación por ubiquitina, con “lisosoma” enriquecido en JEG-3 y “degradación de ARN” en HTR-8/SVneo (ver Figura 3-13). Adicionalmente, se identificaron proteínas relacionadas al metabolismo de las purinas y su reciclamiento, la biosíntesis de IMP y el catabolismo de ribonucleótidos purina, como HPRT, GUAA, APT, Glyc, Pur2, Pur6, Pur9, Adk, VPS4B, RB11A, OLA1 y Acly. En relación con este último proceso, HTR-8/SVneo presentó las proteínas adicionales 5NTD y ATPB, que no fueron identificadas en JEG-3 (ver Análisis comparativo H y J y Análisis preliminar JEG3 BP Pathway Funct AnnotClust). Se sabe que la reprogramación metabólica de las células cancerosas está influenciada por el microambiente a través de un intercambio de EVs como exosomas (Chiarugi & Cirri, 2015), lo que sugiere una adaptación de estas células a las condiciones nutricionales vía EVs. Los procesos anteriores sugieren una alteración metabólica adicional al efecto Warburg, y permite enfocar la investigación en otros aspectos poco estudiados como el metabolismo de compuestos con nitrógeno, los que involucran a NAD+ y síntesis y reciclaje de purinas. En relación con esto, el metabolismo de la glutamina es de vital importancia en cáncer, siendo este un nutriente clave junto con la glucosa en la biosíntesis de masa y como fuente energética paralela a la glicólisis (De Vitto et al., 2016), como se discute posteriormente en el Capítulo 4.

Efecto sobre el sistema neuronal

Estudios en los últimos años asocian al embarazo con una variedad de cambios en el cerebro materno que incluyen plasticidad neural, neurogénesis adulta, plasticidad sináptica funcional y estructural, y remodelación dendrítica en diferentes regiones del cerebro materno. Estos cambios parecen ser un requisito previo para un adecuado desarrollo fetal, pero además ser cruciales para la salud fisiológica y mental de la madre y su comportamiento. Los estudios y avances se han centrado en el sistema neuroendocrino y factores de estrés, donde hormonas como oxitocina y prolactina generan los cambios en el cerebro materno durante el embarazo (Goodwin et al., 1998) (Hillerer et al., 2014). Sin embargo, el mecanismo molecular por el cual se dan estos cambios y cómo la placenta puede estar afectando la remodelación del cerebro materno aún es objeto de estudio. Existen observaciones de que los exosomas pueden cruzar la barrera hematoencefálica (Alvarez-Erviti et al., 2011) y reportes de microquimerismo masculino en el cerebro materno (Chan et al., 2012), lo cual indica que el material derivado de la placenta puede cruzar varias capas celulares e influenciar directamente el cerebro materno durante el embarazo, como lo sugieren las proteínas identificadas.

Capítulo 3 197

Algunas de las proteínas identificadas en EVs derivados de células HTR-8/SVneo y JEG-3 se relacionan con vías de modificaciones neuronales, específicamente con la vía de señalización de neurotropina, depresión y potenciación a tiempo largo y guía de axón (Figura 3-13 y Tabla 3-6). En esta misma agrupación figura la vía de señalización VEGF y vías relacionadas con efectores del sistema inmune, relación que se había evidenciado entre los factores que contribuyen al remodelamiento cerebral materno, pero sin un mediador molecular claro. En este análisis resaltan las proteínas Ras y procesos de dinámica del citoesqueleto (ver Supl. Capítulo 3 KEGG axon guidance y Biocarta: agrin in postsynaptic differentiation). Dentro de las proteínas relacionadas con vías y procesos neuronales que podrían implicar una remodelación del cerebro materno a través de EVs de trofoblasto, está la Agrina (AGRN), perteneciente a los procesos de “agrina en diferenciación postsináptica”, “ciclo de vida del receptor gamma-aminobutírico”, “desregulación de CDK5 en enfermedad de Alzhaimer”, “señalización de trombina y receptores activados por proteasas” y “asprina bloquea la vía de señalización involucrada en activación de plaquetas”. Por otro lado, la neurotrofina (NT) es un factor importante en la supervivencia y diferenciación del tejido neuronal, con funciones en el crecimiento tumoral, angiogénesis e inmunomodulación. Se ha visto que la membrana coriónica y el trofoblasto velloso expresan al factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, por sus siglas en ingles), mientras que el receptor de NT TrkB es expresado por el trofoblasto velloso y la decidua, sugeriendo un rol protector de BDNF/TrkB en el tejido velloso bajo condiciones desfavorables en el utero (Fujita et al., 2011). Así, más alla de la remodelación debida a hormonas, pueden existir modificaciones directas e internas a la célula que involucren transductores de señal como las proteínas G identificadas, y cambios en la expresión génica en la célula. La relación de las proteínas identificadas con estas vías permite proponer a las EVs derivados del trofoblasto, incluyendo los exosomas, como un mecanismo de remodelación del cerebro materno, hipótesis que debe ser confirmada.

Efectos relacionados con inflamación y respuesta inmune

Se identificó a la citoquina gremlin-1 en las EVs derivadas de HTR-8/SVneo, pero no en aquellas de JEG-3. Gremlin-1 actua como un inhibidor de la migración y adhesión de monocitos dependiente del factor inhibitorio de migración de macrófagos MIF e inhibe el efecto anti-apoptótico de MIF en monocitos (Beck et al., 2016; Müller et al., 2014). Por otro lado, es un antagonista de BMP y TGF-β (Walsh et al., 2010) y un agonista del receptor VEGFR2, con implicaciones en angiogénesis y desarrollo vascular (Mitola et al., 2010). Teniendo en cuenta las diferencias entre HTR-8/SVneo y JEG-3, estos hechos podrían sugerir que HTR-8/SVneo a través de sus EVs portadores de gremlin-1, inhibe la migración y adhesión de monocitos, controlando de esta forma la inflamación del sitio de implantación al evitar un reclutamiento persistente; mientras que JEG-3, que carece de este, permite el reclutamiento de monocitos, con la posible formación de un nicho inflamatorio generado por macrófagos. Otra interpretación sería a nivel de la remodelación vascular y angiogénesis que induce el citotrofoblasto extravelloso, modelado por HTR-8/SVneo, pero no por el precursor de citiotrofoblasto velloso, que representa JEG-3.

198 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Adicionalmente en HTR-8/SVneo, pero no en JEG-3, se identificó al factor 2 asociado al receptor TNF (TRAF2) y al receptor del poliovirus o proteína 5 similar a nectina (PVR, NECL-5), involucrados en la regulación positiva de inmunidad mediada por linfocitos y leucocitos. PVR juega un papel en la mediación de la invasión y migración de células tumorales, media la adhesión de células NK y desencadena sus funciones efectoras, puede promover el intercambio modular de células NK-células diana, y la transferencia de PVR a la célula NK, siendo esta transferencia importante en algunas células tumorales que expresan una gran cantidad de PVR, y puede desencadenar la activación de células NK fratricidas, proporcionando a los tumores un mecanismo de inmunoevasion (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Esto tiene sentido en las células HTR-8/SVneo, considerando que es el modelo que migra e invade el estroma uterino, diferenciandose en intersticial, donde interactua con células NK; allí puede haber un alorreconocimiento materno mediado por células NK uterinas que reconocen ligandos MHC del trofoblasto inusuales (Moffett-King, 2002). No obstante, pueden existir otras estrategias de control de la inflamación por las EVs derivadas de JEG-3. En estas se identificaron otras proteínas relacionadas con regulación de la respuesta inmune e inflamación. El factor de crecimiento/diferenciación 15 (GDF15) fue identificado únicamente en EVs derivados de células JEG-3 control (Supl. Análisis comparativo H y J unicas JEG-3), y en JEG-3 cultivado en F12 (Supl. Análisis preliminar). Esta proteína pertenece a la superfamilia del TGF-β y tiene un rol en la regulación inflamatoria y las vías apoptóticas en tejidos lesionados y durante procesos de enfermedades (Unsicker et al., 2013). Se ha sugerido que en el contexto del embarazo GDF-15/MIC-1 puede promover la supervivencia fetal al suprimir la producción de citoquinas proinflamatorias maternas en el utero (A. G. Moore et al., 2000), y se ha visto a GDF-15 desregulado, tanto en pre-eclampsia como en embarazos diabéticos (Sugulle et al., 2009). Adicionalmente, en las EVs derivadas de JEG-3 cultivado en F12 (condiciones normales de cultivo) se identificó a las interleuquinas IL-37 e IL-36γ (Supl Análisis preliminar). La IL-37 es un supresor natural de la respuesta immune e inflamatoria innata en cursos de inflamación excesiva, que actua mediante la supresión o reducción de la producción de citoquinas proinflamatorias, incluida IL1A, IL-6, CCL12, CSF1, CSF2, CXCL13, IL1B, IL23A and IL1RN, sin afectar a las citoquinas anti-inflamatorias y requiriendo a SMAD3 (Nold et al., 2010). También se identificó al factor de transcripción GATA3 especifico de célias T trans-actuando, el cual es un activador transcripcional requirido para el proceso de diferenciación T-helper 2 (Th2) tras respuestas inmunes e inflamatorias, así como la proteína β de unión al potenciador (C/EBP beta), factor de transcripción, el cual durante la embriogénesis temprana desempeña funciones esenciales y redundantes con CEBPA, tiene un efecto promitótico en muchos tipos de células tales como hepatocitos y adipocitos, pero tiene un efecto anti-proliferativo sobre las células T mediante la represión de la expresión de MYC, facilitando la diferenciación a lo largo del linaje Th2; se une a regiones reguladoras de varios genes de fase aguda y citocinas y desempeña un papel en la regulación de la reacción de fase aguda y la inflamación. . (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Por otro lado, en las EVs derivadas de JEG-3 se identificaron proteínas que promueven la inflamación. La IL36γ parece estar envuelta en respuesta inflamatoria en la piel actuando sobre queratinocitos, células dendríticas e indirectamente en células T para generar infiltración tisular, maduración y proliferación celular. En queratinocitos, la IL36γ induce la expresión de quimoquinas de macrófagos, células T y neutrófilos, como CCL3, CCL4, CCL5, CCL2, CCL17, CCL22, CL20, CCL5, CCL2, CCL17, CCL22, CXCL8,

Capítulo 3 199

CCL20 y CXCL1, así como su propia expresión y parámetros proinflamatorios TNF-alpha, S100A7/psoriasin y iNOS. S100-A9 es una proteína de unión a calcio y zinc, que desempeña un papel importante en la regulación de procesos inflamatorios y respuesta inmune, puede inducir la quimiotaxis y adhesión de neutrófilos, aumentar la actividad bactericida de los neutrófilos promovida por fagocitosis a través de la activación de SYK, PI3K/Akt y ERK1/2 e inducir la desgranulación de los neutrófilos por un mecanismo dependiente de MAPK. Sus funciones extracelulares implican actividad pro-inflamatoria, antimicrobiana, inductoras de apoptosis y captación-oxidante. Su actividad pro-inflamatoria incluye reclutamiento de leucocitos, promoción de la producción de citoquinas y quimioquinas, y la regulación de la migración y adhesión de leucocitos; actúa como una alarmina o una molécula patrón molecular asociado a peligro (DAMP, danger associated molecular pattern) y estimula las células inmunes innatas a través de la unión a receptores de reconocimiento de patrones, como el receptor similar a Toll 4 (TLR4) y el receptor para productos finales de glicación avanzada (AGER) y puede actuar como un potente amplificador de la inflamación en autoinmunidad, así como en el desarrollo y propagación de los tumores malignos. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Aparentemente, a pesar de que JEG-3 a través de un set de sus EVs controla la inflamación sin llegar a evitarla a través de citoquinas anti-inflamatorias; al mismo tiempo secreta EVs con proteínas que pueden estimular y exacerbar una respuesta inflamatoria, con inmunidad innata, a diferencia de HTR-8/SVneo, logrando un nicho adecuado para su progresión. Estudios previos ya habían mostrado como los exosomas dereivados de cáncer inducen la producción y secreción de citoquinas pro-inflamatorias (Brinton et al., 2015) y promueven la metástasis y el escape a la vigilancia inmune (Syn et al., 2016). Por otro lado, los factores solubles y exosomas derivados de placenta parecen tener efectos anti-inflamatorios y de polarización de la respuesta inmune de Th1 a Th2, así como la de macrofagos de M1 a M2 (Aldo et al., 2014) y la muerte celular inducida por activación mediante supresión de CD3-ζ y JAK3. (Taylor et al., 2006). El embarazo puede considerarse como un estado de inflamación leve y controlada, en el que se debe mantener un delicado equilibrio entre las respuestas de tipo Th1 /Th2 y las citoquinas anti-inflamatorias (como IL-4 e IL-10) y pro-inflamatorias (como TNF, IL-1, IL- 6 y IL-8). En general se acepta que durante el embarazo las EVs derivadas de placenta generan una polarización de la respuesta inmune hacia Th2, a pesar de existir estudios contradictorios al respecto. Sin embargo, la actividad Th1 juega un rol importante en la promoción de la respuesta Th2, por lo que es mas adecuado hablar de una “cooperación Th1-Th2” (Wilczyński, 2005). Por otro lado, las células inmunes CD4+CD25+Foxp3+, también conocidas como células T regulatorias (Tregs), juegan un rol importante en alterar la respuesta inmune al regular a los linfocitos Th1 alo-reactivos y crear un microambiente “tolerante” caracterizado por la expresión de IL-10, TGF-β y la isoforma 1 de la ocigenasa haem (HO-1), mas que por disminuir las citoquinas Th1 (Alijotas-Reig et al., 2014). Las acciones potenciales de las proteínas identificadas sugieren una manipulación del microambiente para la formación de un entorno inflamatorio propicio para su desarrollo, involucrando la regulación de células T, NK, neutrófilos y monocitos. Es interesante que los circuitos regulatorios que pueden existir en JEG-3 constituyan la disminución de las citoquinas pro-inflamatorias, mientras que los HTR-8/SVneo involucran la activación de procesos activamente antagonistas como la inhibición de la quimiotaxis.

200 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Modificación cromosomal, regulación epigenética y expresión de genes

Otros procesos biológicos relacionados con las proteínas identificadas, aunque con una significancia estadística baja, son integración de ADN y de virus, con proteínas como HMGA1, PPIA y Baf. Esta vía es relevante al modelo biológico si se considera el ADN y ARN fetal libre y encapsulado en EVs, presente en el sistema circulatorio materno (Chamley et al., 2014), el microquimerismo reportado en embarazos (Boddy et al., 2015), la fusión con células de origen diferente que exhibe el citotrofoblasto extravelloso (Weise et al., 2011), el posible rol de los exosomas en la fusión célular del trofoblasto (Record, 2014) y la integración genómica que debe existir para generar las quimeras genómicas. Se encontró el mantenimiento de telomeros vía telomerasa con las proteínas Rfc1, Dkc1, Mre11, y con Rad50 identificada únicamente en JEG-3. Las topoisomerasas 1, 2A y 2B identificadas en ambos modelos. También se encontró el ensamblaje de cromatina como término significativo únicamente en HTR-8/SVneo (p=0,0010) con las Histonas 1T, 2A2C, 2AZ, 2AY, 2AW, 2B2D, 1X, 4, 11, 15, 32 y 33, y las proteínas NPM, NP1L4, MCM2, HP1B3 y SMCA5, identificadas también en JEG-3, a excepción de la proteína B2 del grupo de alta movilidad (HMGB2), relacionada también con la anulación del ADN durante la replicación e identificada sólo en HTR-8/SVneo y la proteína relacionada con helicasas SMCA2 identificada únicamente en JEG-3. Adicionalmente únicamente en JEG-3 se identificó a la proteína de susceptibilidad tipo 2 a cáncer de seno (BRCA2), involucrada en la reparación de rompimientos de doble hebra y recombinación homóloga, y la DNA ligasa 3 (LIG3) que repara quiebres en el ADN. La acetilación de histonas fue enriquecida tanto en HTR-8/SVneo como en JEG-3, con las proteínas comunes MBD3, ACL6A, MO4L1, HAT1, RUVB2, RUVB1, y con las proteínas identificadas únicamente en JEG-3 TAF10, TAF6L, TRRAP, EP300, Q5TG36, EP400 y SUPT3. Precisamente la Acetilación de Histonas H4 fue el proceso revelado por ClueGO como específico para JEG-3, adicionado a las proteínas OGT, MCRS1, BRCA2, DMAP1, MSL1, BRD8, ARRB1 y BEND3 (Figura 3-16), junto con procesos metabólicos de snRNA, y resalta ya que es una modificación que permite un aumento en la expresión génica, sugiriendo que en JEG-3 existe una regulación diferencial de la expresión por modificación epigenética. Ya se había reportado que las células diana pueden ser alteradas por interacciones directas, transferencia de receptores de superficie celular o una reprogramación epigenética vía reguladores transcripcionales (Quesenberry & Aliotta, 2010). Esta alteración epigenética generá un cambio de fenotipo celular que está relacionado con la plasticidad transcripcional de las células madre o stem cells y es un fenómeno que puede tener lugar tanto en células de coriocarcinoma/trofoblasto, como en células del microambiente, de tal forma que estas podrían ganar la capacidad de expresar genes que de otra forma estarían silenciados. Este proceso implica una ganancia de capacidades y tiene profundas repercusiones en la malignización, ya que de esta forma las EVs de coriocarcinoma podrían estar alterando la expresión génica de células de trofoblasto no transformadas.

Capítulo 3 201

3.4.3 Comparación de las EVs derivadas de HTR-8/SVneo y JEG-3 inducidas por la estimulación con TGF-β

De los resultados obtenidos en el Capítulo 1 y 2 es claro que el TGF-β tiene diversos efectos sobre las células HTR-8/SVneo y JEG-3, adicionales a los reportados, así como una potencial interacción con otras vías de señalización que ayudarían a modular sus efectos contexto-dependientes. En este capítulo se encontró que el TGF-β afecta de forma diferencial el perfil proteómico de las EVs derivadas de trofoblasto, en función del modelo empleado. El tratamiento con TGF-β disminuyó proteínas en las EVs derivadas de células HTR-8/SVneo que le daban un carácter oncogénico a estas EVs como el receptor tirosin quinasa MET y que permitían la regulación transcripcional mediada por otras vías como SND1, vinculando el efecto del TGF-β sobre la regulación de proteínas exosomales con la disminución de la actividad de otras vías de señalización, que sería particularmente importante si se considera que MET es internalizado cuando ha sido activado, y es posible que esté aún activado en los exosomas. Adicionalmente el TGF-β reguló al alza proteínas como GOGA7, quien es un modificador postraducciónal de HRas y NRas. Esto implica que TGF-β puede regular otras vías de señalización como la de HGF/MET, Jak/Stat y proteínas G monoméricas a través de reguladores de estas, cumpliendo un posible rol de supresor tumoral. Estas EVs inducidas por TGF-β podrían ser captadas de forma autocrina y ejercer sus efectos en otras células de trofoblasto. La proteína asociada a adenilil ciclasa 1 o CAP1 fue aumentada 1,54 veces (log2 F.C. 0,62) en HTR-8/SVneo y disminuida 1,81 veces (log2 F.C. -0,86) en JEG-3 en respuesta al TGF-β. CAP1 juega un papel activo en la dinámica de los filamentos de actina. Adicionalmente se han descrito roles cruciales en señalización celular, desarrollo, tráfico de vesículas y migración celular (Ono, 2013). CAP está incrementado en lamelipodios ricos en actina de células migratorias, y se sugiere que aumenta las protuciones lamelipodiales al promover la dinámica de los filamentos de actina durante la migración celular; sin embargo, también se localiza en el cortex posterior de células migratorias (A.A. Noegel et al., 1999) y promueve la formación de fibras de estrés. A pesar de tener diferentes roles durante la migración celular, aún no se comprende completamente cómo está regulando este proceso (Ono, 2013). Por otro lado, la reducción de los niveles de proteína CAP en la ameba Dictyostelea condujo a un número incrementado de células multinucleadas, con morfologías celulares alteradas y tamaños muy heterogéneos, sugiriendo un defecto de citocinesis (A.A. Noegel et al., 1999). Adicional, la pérdida de CAP causó una disminución drástica en la sensibilidad a señales externas, resultando en una polaridad celular reducida y una alteración en la señalización de cAMP, sugiriendo una interacción entre CAP con la adenil ciclasa y una influencia directamente en las vías de señalización (Noegel et al., 2004). Así mismo, se demostró en levaduras el rol in vivo de CAP1 (conocida como Srv2) en la regulación del citoesqueleto de actina durante la endocitosis mediada por clatrina, siendo requerido para esta (Toshima et al., 2016). Sin embargo, aún se desconoce el rol preciso de CAP en los defectos de citocinesis. Tanto la migración celular como la citocinesis son procesos regulados de forma anómala en cáncer, y las isoformas de CAP están sobre-expresadas en diferentes tipos de cáncer, existiendo una correlación funcional entre los niveles de CAP y el fenotipo maligno (Ono, 2013). En este estudio, el aumento de CAP1 en EVs de HTR-8/SVneo correlaciona con el fenotipo migratorio e invasivo de este modelo, a diferencia de JEG-3. Mientras que la

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disminución de CAP1 en EVs de JEG-3 podría estar relacionado con su fenotipo multinucleado, característica normal y propia del sincitiotrofoblasto al que puede diferenciarse, así como en una posible baja sensibilidad a señales externas, característica maligna que se ha propuesto previamente. Por otro lado, se ha visto que CAP1 es un receptor de resistina y media acciones inflamatorias en monocitos humanos; la resistina y su receptor CAP1 regularon positivamente la concentración intracelular de cAMP, actividad de PKA, y transcripción relacionada con NF-kB de muchas citoquinas inflamatorias en monocitos, de tal forma que se podría conducir a una inflamación crónica (Lee et al., 2014). Considerando que la resistina es secretada por macrófagos, leucocitos mononucleares y otras células inmunes, y asumiendo que los macrófagos y células inmunes uterinas secretan resistina y los monocitos deciduales captan los exosomas con CAP1, se puede generar una activación autocrina/paracrina de estos y una condición inflamatoria en la interfase materno-fetal. En relación con la endocitosis, la otra proteína regulada de forma inversa fue la proteína 2A del cuerpo multivesicular cargado (CHMP2A, Vps2-1), la cual fue disminuida 2,19 veces (log2 F.C. -1,13) en EVs de HTR-8/SVneo y aumentada 1,41 veces (log2 F.C. 0,5) en JEG-3 en respuesta al TGF-β. Esta es un componente central probable del complejo de transporte III (ESCRT-III) requerido para la clasificación endosomal, participa en la maduración del autofagosoma y está involucrada en la clasificación de las proteínas de carga endosomal en MVBs (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25), las cuales contienen las ILVs que serán fusionadas en su mayor parte con el lisosoma para ser degradadas, mientras que otra parte será liberada y constituirán los exosomas (György et al., 2011). La maquinaria ESCRT también funciona en los eventos de fisión de membrana topológicamente equivalentes, como las fases terminales de la citocinesis (Guizetti et al., 2011) y junto con SPAST, el complejo ESCRT-III promueve el sellado de la envoltura nuclear y el desmonte del huso mitótico durante la anafase tardía (Vietri et al., 2015). La desregulación de las proteínas ESCRT está implicada en el desarrollo de muchos tipos de cáncer (Tanaka et al., 2008) ya que pueden funcionar como supresores tumorales al internalizar receptores como EGFR, c-Met y Notch y controlar su degradación vía MVB-lisosoma (Stuffers et al., 2009). Adicionalmente existen funciones no endosomal de ESCRT en la patogénesis del cáncer, como defectos de citocinesis, el control de la polimerasa de ARN y el silenciamiento de genes, la formación y secreción de exosomas, y el control del ciclo celular y el mantenimiento tumoral (Tanaka et al., 2008). La clasificación de moléculas carga en ILVs con destino lisosoma y exosomas hasta hace poco se empezó a comprender. Se han descrito mecanismos de clasificación de carga dependientes de ESCRT para proteínas ubiquitinadas, de tetraspaninas y lípidos para otros componentes exosomales independientes de ESCRT, y hnRNPA2B1 sumoilado para la clasificación de miRNAs (Villarroya-Beltri et al., 2014). La disminución de Met junto con CHMP2A en EVs de HTR-8/SVneo inducidas por TGF-β puede significar una selección de los MVB con ESCRT para ser degradados vía lisosoma, de tal forma que el TGF-β cumpliría su rol de supresor tumoral al evitar la distribución vía exosomas de Met potencialmente activado. El posible significado del aumento en JEG-3, junto con la disminución de CAP1 aún no es claro, ya que su relación con la citocinesis es contradictoria. Considerando solo las funciones de clasificación endosomal de CHMP2A, su aumento en las EVs de JEG-3 en respuesta al TGF-β puede representar una preferencia de la ruta exosomal sobre la degradación vía lisosoma, considerando la

Capítulo 3 203

selección de proteínas ubiquitinadas por ESCRT; no obstante, en contra de esta hipótesis está el menor número de proteínas identificadas en las EVs de JEG-3 con respecto a HTR-8/SVneo. Así, un defecto o disminución en la formación de MVB y liberación de exosomas puede existir en JEG-3, comparado con HTR-8/SVneo, quizás asociado a la disminución de CAP y a una endocitosis alterada. Los efectos del TGF-β comunes a los dos modelos incluyen el aumento de proteínas de adhesión como la protocaderina-12 (PCDH12) y la integrina α1 (ITGA1), lo que hace pensar en la inducción de EVs específicas con una célula blanco concreta. El aumento de la proteína homólogo inhabilitado 2 (DAB2), también conocida como molécula de adaptador deshabilitado-2 y diferencialmente expresada en carcinoma de ovario 2 (DOC-2), puede vincular la señalización por TGF-β con las cargas seleccionados y sus efectos. Esta es una proteína adaptadora que funciona como proteína de clasificación asociada a clatrina (CLASP) requerida para la endocitosis mediada por clatrina de las proteínas de carga seleccionadas que contengan motivos de internalización NPXY no fosforilados, tales como el receptor de LDL. Está involucrada en la endocitosis del receptor de lipoproteína de megalin/LRP2 durante el desarrollo embrionario, de la integrina β1 y de CFTR y su tráfico al endosoma tardío. Está involucrado en varias vías de señalización mediadas por receptor, como la del TGF-β, siendo requerido para el reciclaje de TβR, facilita la fosforilación de SMAD2 y media la activación de JNK estimulado por TFG-β. Puede inhibir la vía de señalización Wnt / β-catenina canónica y activar la señalización de Wnt no canónica. Se ha propuesto que inhibe la activación de ERK mediante la interrupción de la unión de GRB2 a SOS1, y de SRC mediante la prevención de la activación de su fosforilación, en las vías de señalización que provienen de factores de crecimiento de superficie celular/Ras. Tambien se ha propuesto estar involucrada en la modulación de los receptores de andrógenos (AR) y la señalización mediada por la activación de SRC, donde parece competir con AR por la interacción con SRC. Juega un papel en la transducción de señales vía CSF-1, en la diferenciación celular, está involucrada en el posicionamiento celular y es requerido para la transición epitelial mesenquimal. Puede estar implicado en la diferenciación de células mieloides e inducir la adherencia de los macrófagos y su diseminación, así como actuar como un supresor de tumores. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Las proteínas carga de estas EVs inducidas de forma común por el TGF-β, podrían ser las otras proteínas aumentadas en respuesta al TGF-β, particularmente las relacionadas con un aumento de la adhesión a través de filopodios y polaridad celular como la proteína 3 relacionada a dihidropirimidinasa (DPYSL3) y el miembro 7 de la subfamilia MAGUK p55 (MPP7), y cambios en el citoesqueleto de actina con profilin-1 (PROF1). Adicionalmente estas EVs podrían inducir cambios metabólicos a través del aumento del transportador de zinc (ZIP14, S39AE), la acetil-CoA acetiltransferasa citosólica (THIC), la UTP-glucosa-1-fosfato uridililtransferasa (UGPA), carboxipeptidasa D (CPD), betaina-homocisteina S-metiltransferasa 1 (BHMT). Resalta la proteína del complejo Ragulator LAMTOR1 (LTOR1), aumentada 1,71 veces, la cual como parte del complejo Ragulator está implicada en la detección de aminoácidos y la activación de mTORC1, un complejo estimulante del crecimiento celular de señalización en respuesta a factores de crecimiento, niveles de energía, y aminoácidos. LAMTOR1 es directamente responsable de anclar el complejo Ragulator a las membranas, donde funciona como un factor de intercambio de nucleótidos de guanina activando GTPasas Rac monoméricas; Ragulator activado y GTPasas Rac funcionan como un andamiaje de reclutamiento de mTORC1 a los lisosomas donde es a su vez activa, y puede regular tanto el reciclaje de receptores a través de endosomas como la vía de señalización MAPK a través del reclutamiento de

204 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

algunos de sus componentes a los endosomas tardíos. (Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016), neXtProt release 2016-08-25). Los efectos del TGF-β sobre proteínas relacionadas con el citoesqueleto, particularmente involucradas en procesos de extensión celular dependiente del sustrato de adhesión, regulación negativa de la motilidad celular y organización de componentes celulares, no es nueva, y ya se había discutido previamente en el capítulo 1 y 2. En este capítulo resalta el papel regulatorio que cumplen las EVs al coordinar, posiblemente, estos procesos de adhesión y migración, contribuyendo al orden tisular, y permitir la comunicación de una célula con su entorno. De igual forma resalta el rol que cumple el TGF-β como supresor tumoral en células HTR-8/SVneo. Sin embargo, la regulación de proteínas relacionadas con citocinesis y la relación de defectos de citocinesis con el desarrollo del cáncer es un nuevo tópico que no se había considerado. La potencial implicación en estos procesos de las proteínas identificadas, sugiere que el TGF-β podría estar regulando procesos celulares aún no estudiados, como la división celular y la fisión de grandes estructuras membranales. En relación con esta, se sabe que el TGF-β afecta el procesos de formación del sincitiotrofoblasto (Morrish et al., 1991); la formación del sincitio podría implicar tanto una fusión celular como una alteración de la división celular o citocinesis, en el que el TGF-β estaría regulando la dinámica del citoesqueleto. Ya que este es un estudio exploratorio, se requieren de experimentos adicionales que verifiquen las hipótesis discutidas anteriormente y los procesos propuestos a partir de las proteínas identificadas. Estos incluyen comprobación de los resultados proteómicos mediante análisis por Western Blot y ensayos funcionales para determinar el efecto de los factores secretados por células HTR-8/SVneo y JEG-3 sobre la proliferación, migración y quimiotaxis de células inmunes como Jurkat; estos experimentos están proyectados para desarrollarse en el grupo de investigación en hormonas. Igualmente, debido a la relación de las proteínas identificadas en las EVs inducidas por TGF-β, con procesos de endocitosis, clasificación de proteínas cargadas y degradación vía lisosoma o reciclaje a la membrana, es de relevante evalular los posibles efectos del TGF-β en la deportación y liberación de exosomas. Finalmente, el análisis proteómico comparativo de EVs derivadas de modelos de trofoblasto revela la secreción diferencial de reguladores metabólicos, de señalización e inmunes en respuesta a la estimulación con TGF-β.

3.4.4 Implicaciones in vivo de las EVs derivadas de los modelos de trofoblasto JEG-3 y HTR-8/SVneo

Es bien sabido que el embarazo se mantiene gracias a una comunicación bidireccional madre-feto en la cual diversos factores de tipo endocrino, inmune y neuronal son intercambiados, gran parte a través de EVs. Se ha propuesto que las EVs derivadas de placenta ejercen sus efectos sobre células inmunes y del microambiente como endoteliales, teniendo tanto efectos predominantemente pro-inflamatorios como anti-inflamatorios en leucocitos (M. Tong & Chamley, 2015). Adicionalmente, durante el embarazo ocurren conocidas transformaciones a nivel hormonal, metabólico y neuronal y regulación del calcio, resaltando la reprogramación neuronal y cambios neuroendocrinos (Hillerer et al., 2014) en los cuales la placenta debería tener un rol pivotal. Sin embargo, la base molecular tras estas transformaciones es poco conocida.

Capítulo 3 205

Preparación del nicho metastático por parte de los exosomas y otras EVs

La hipótesis de “suelo y semilla” postulada por Stephen Page hace 126 años parece ser el mecanismo que gobierna la metástasis específica a un órgano u organotropismo metastático, dónde el microambiente de destino es una las fuerzas conductoras detrás de la metástasis. Sin embargo, estudios recientes proponen a los exosomas derivados de células tumorales como vitales en la preparación del nicho metastático gracias a un perfil específico de integrinas o “código postal” que podría dirigir los exosomas a su sitio metastático y acumularse en ellos. Se demostró que células residentes específicas al órgano de destino, como fibroblastos y células endoteliales, captan a estos exosomas los cuales activan la fosforilación de Src y la expresión de genes de la familia S100 pro-inflamatorio, conduciendo al reclutamiento de células inmunes que generan un proceso de inflamación y vascularización previa a la llegada de las células tumorales. Las integrinas exosomales α6β4 y α6β1 fueron asociadas con metástasis a pulmón, mientras que las integrinas αvβ5 fueron vinculadas con metástasis a hígado; de tal forma que las integrinas exosomales pueden ser usadas para predecir el órgano específico de mestastasis (Hoshino et al., 2015). En las EVs estudiadas se identificó un gran número de integrinas y otras moléculas de adhesión, con cambios en respuesta al TGF-β. A pesar de que la confianza estadística de la cuantificación de estas fue baja debido a la pérdida de señales, es evidente la diferencia en el perfil de algunas de estas integrinas en las EVs derivadas de HTR-8/SVneo y de JEG-3, y en respuesta al TGF-β. Particularmente para la integrina β4, quien aumenta 0,59 veces en HTR-8/SVneo (p-value=0,19) y disminuye 0,2 en JEG-3 (p-value=0,072), en respuesta al TGF-β, o para la integrina α3 quien disminuye 0.55 en HTR-8/SVneo (p-value=0,089) y aumenta 0.27 en JEG-3 (p-value=1, un valor pérdido) (ver Supl. Capítulo 3, Análisis efecto TGFB, KEGG Cell adhesión molecules)

3.4.5 Perspectivas: Exosomas como fuente de biomarcadores plasmáticos y blanco terapéutico

Los exosomas han sido propuestos como una fuente de biomarcadores para la detección y clasificación de enfermedades, especialmente en el diagnóstico del cáncer, y como potencial blanco terapéutico (Kahlert & Kalluri, 2013). En la formulación de candidatos a biomarcadores, las proteínas transportadas en los exosomas constituyen un grupo molecular interesante. Considerando la alta deportación que exhibe el trofoblasto y la liberación de exosomas como mecanismo de comunicación, es evidente considerar los exosomas como una fuente de biomarcadores tumorales que permitan diferenciar estados de embarazos normales de los crecimientos malignos como el coriocarcinoma. Las proteínas identificadas de forma diferencial entre las EVs derivadas de células de trofoblasto HTR8/SVneo y coriocarcinoma JEG-3 pueden constituir candidatos a biomarcadores para el diagnóstico del coriocarcinoma, por lo que son propuestos para estudios adicionales. No obstante, estos deben ser evaluados y confrontados con otros modelos de trofoblasto y coriocarcinoma para evaluar tanto sus roles biológicos, como su idoneidad como candidatos a biomarcadores. La inmunoterapia del cáncer, que aprovecha el sistema inmunológico para combatir tumores, es un área en boga tanto en el campo de la investigación como en el clínico. En

206 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

este contexto, los exosomas derivados de céluas tumorales al modular la respuesta del sistema inmune son un blanco atractivo. Estos exosomas pueden inducir una inflamación de bajo grado, lo que podría conducir, dependiendo del contexto, a una respuesta anti-tumoral si se genera una inflamación aguda y de corto tiempo, o contribuir a la diseminación metastática, si la inflamación es crónica (Altevogt et al., 2014). Gracias a esta capacidad de estimular diferentes células del sistema inmune e inducir tanto respuestas de tipo innato como adaptativo, los exosomas son ahora blanco de la optimización vía ingeniería, con el fin de inducir respuestas inmunes fuertes y de larga duración y mejorar su inmunogenicidad (Gehrmann et al., 2014). Conclusiones Finalmente, como conclusión se encontró que: Los resultados del análisis NTA muestran más partículas derivadas de células

HTR-8/SVneo con respecto a JEG-3. En las EVs derivadas de células HTR-8/SVneo se identificaron más proteínas con

respecto a las EVs derivadas de JEG-3; lo que puede significar una mayor capacidad de comunicación con el ambiente.

La caracterización proteómica de EVs derivadas de células HTR-8/SVneo y de JEG-3 permitió identificar 90 factores de transcripción y 148 co-reguladores transcripcionales.

Las proteínas identificadas en las EVs derivadas de células HTR-8/SVneo y de JEG-3 están vinculadas a procesos de regulación transcripcional y traduccional y modificación de la cromatina, de relevancia para las posibles células blanco de EVs.

El TGF-β indujo cambios en el perfil proteómico de las EVs derivadas de HTR-8/SVneo, incluyendo disminución de MET, y en JEG-3, incluyendo aumento de GMPS.

Las EVs inducidas por el TGF-β tienen un contenido proteómico diferente, mostrando una regulación inversa en los dos modelos para las proteínas CAP1 y CHMP2A.

El TGF-β reguló de manera similar proteínas en las EVs derivadas de los dos modelos, resaltando MTA2.

4. Discusión general e implicaciones biológicas en la malignización

Debido a su condición fisiológica tan especial, el embarazo puede ser visto como un parásito, transplante semialógrafo o un crecimiento tumoral; es esta última concepción la que se emplea en el presente trabajo. La placenta es el órgano a través del cual se lleva a cabo la comunicación madre-feto, siendo el tejido trofoblástico vital en este proceso. Actualmente se cuenta con bases de datos de proteínas con anotaciones a placenta de calidad verificable (http://www.proteinatlas.org/humanproteome/placenta). Sin embargo, hasta hace pocos años se empezaron a realizar estudios proteómicos de placentas y células derivadas de trofoblasto, y son pocos los que consideran las características pseudo malignas del trofoblasto, aún menos los que han realizado análisis comparativos. Este trabajo de tesis es un estudio exploratorio, generador de hipótesis en gran medida, gracias al cual se identificaron proteínas expresadas por las células inmortalizadas de trofoblasto HTR-8/SVneo y derivadas de coriocarcinoma JEG-3, bajo diferentes estrategias y enfoques experimentales. Los resultados y las proteínas identificadas y cuantificadas están potencialmente involucradas en procesos biológicos que contribuyen a explicar las diferencias a nivel de regulación entre el trofoblasto y el coriocarcinoma. Este estudio también proporciona una lista de proteínas candidato, que pueden servir como base en la identificación y selección de marcadores robustos que se pueden utilizar para aislar EVs derivadas de placenta desde la sangre materna. Sin embargo, es necesario validar estos hallazgos tanto la regulación de las proteínas cuantificadas como las proteínas propuestas como candidato a biomarcadores. Por otro lado, los procesos biológicos sugeridos en los que las proteínas identificadas están potencialmente implicadas y las hipótesis generadas a partir de estos deben ser investigados y evaluados de forma particular. Interpretar datos de expresión de proteínas y comprender los procesos biológicos que subyacen puede ser una tarea desafiante, especialmente cuando cambios moderados en la expresión de proteínas tienen un profundo impacto en la fisiología celular.

4.1 Estrategias proteómicas empleadas Es claro que el fenotipo que caracteriza a las células cancerosas es el resultado de numerosas mutaciones y alteraciones heterogeneas que afectan muchas vías de señalización y un vasto conjunto de proteínas. Múltiples investigaciones han permitido identificar moléculas de señalización y oncogenes cruciales que contribuyen al proceso de tumorogénesis. En este campo, la proteómica ha emergido como una herramienta

208 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

prometedora para revelar proteínas que están asociadas con estas transformaciones malignas, al permitir estudios comparativos entre diferentes tipos y estados de cáncer. En el presente trabajo se implementaron diversos enfoques proteómicos comparativos, con el fin de aumentar el conocimiento sobre los mecanismos moleculares responsables de la oncogénesis. Los estudios proteómicos realizados son de tipo exploratorio y puntual, a diferencia de otros que son dirigidos basados en hipótesis, o que realizan un estudio dinámico. Ya que el proteoma es dinámico y varía con el tiempo y con los diferentes estados fisiológicos o patológicos específicos, los resultados presentados en este trabajo corresponden a un vistazo puntual a la biología celular. Son pocos los estudios proteómicos dinámicos que involucran la evaluación de proteomas a diferentes tiempos, para los cuales se requieren técnicas de alto rendimiento como las desarrolladas por Mathias Mann para evaluar el fosfoproteoma y la dinámica de señalización in vivo (Humphrey et al., 2015). Durante la última decada el desarrollo a nivel de espectrometría de masas, equipos, bases de datos y análisis computacional ha permitido un gran avance y desarrollo en las técnicas proteómicas, contando hoy en día con diferentes estrategias metodológicas. Como estrategias proteómicas se trabajó electroforesis bidimensional en gel comparativa E2D, análisis diferencial en gel DIGE, marcación con isótopos estables en cultivo SILAC analizado por 1D-LC-ESI-MS/MS, y cuantificación libre de marcaje LFQ analizado por LC-ESI-MS/MS o proteómica shotgun; todas estas enmarcadas dentro de las técnicas proteómicas “de abajo hacia arriba” o bottom-up en la cual las proteínas son digeridas y los péptidos son identificados por espectrometría de masas en tándem MS/MS y búsqueda en bases de datos. No obstante, cada una de las estrategias implementadas presenta ventajas y desventajas frente a las otras, así como problemas inherentes y desafios técnicos. Adicionalmente aún existen dilemas a nivel de la extracción de la información biológica. En el caso de los análisis E2D, cuando se obtiene más de una proteína por spot, el análisis de este puede generar recelo en cuanto a cuál es la proteína que domina el cambio en la densidad del spot, de tal forma que seleccionar spots de proteína únicos a un modelo puede evitar esta cuestión. Pese a esto es necesario tener en cuenta que un spot único en un gel no implica que la proteína no se exprese en el otro modelo, ya que puede representar solamente una isoforma o estado post-traduccional específico de ésta; ya que, como se analiza en los anexos, una proteína puede estar presente en más de un spot, cada uno representando diferentes estados post-traduccionales. Por otro lado, la E2D presenta inconvenientes a nivel del apareamiento de las imágenes cuando las muestras a comparar son muy diferentes, como en el caso de HTR-8/SVneo y JEG-3, lo cual requiere de un enfoque diferencial como el DIGE o SILAC. A pesar de las desventajas de la E2D frente a otras técnicas y la falta de certeza de la expresión o no de una proteína en particular, esta permite visualizar posibles isoformas de las proteínas y cambios de estas a nivel de peso molecular y pI. Ya la relevancia de estas isoformas in vivo, o si fueron producto del procesamiento de la muestra, debe ser evaluado con cautela. La actividad biológica de las proteínas depende de un estado y conformación específico, razón por la cual, a pesar que las células de HTR-8/SVneo y JEG-3 expresan proteínas en común, estas se identifican en pesos moleculares y puntos isoeléctricos diferentes,

Discusión general e implicaciones biológicas 209

constituyendo spots diferenciales entre los dos modelos que pueden representar un estado biológico y actividad diferente entre las dos líneas. Por otro lado, se emplearon técnicas proteómicas cuantitativas con marcaje (DIGE y SILAC) y libre de marcaje (LFQ). DIGE, al estar basada en gel presenta ventajas y desventajas similares a la E2D. SILAC, por su parte, al analizarse de forma 1D-LC-ESI-MS/MS como un compilado de las bandas permitió un análisis más completo de la expresión, así como evaluar variaciones propias al peso molecular en el que fue identificada la proteína; sin embargo, el éxito de ésta depende de la incorporación en cultivo del aminoácido marcado con el isótopo pesado, requiriendo un montaje experimental previo más caro y largo. El análisis de datos por LFQ requiere de un montaje experimental más barato y menos desafiante comparado con las técnicas de marcación. Como se discutió previamente, se empleó LFQ basada en XIC o intensidad de precursores, la cual presenta numerosas ventajas en comparación con el conteo espectral, y se lograron identificar isoformas de diferentes proteínas en base a los péptidos asignados. A pesar de las ventajas de aproximaciones cuantitativas como SILAC y LFQ, éstas presentan desventajas propias de la proteómica shotgun; en esta, el espectrómetro de masas se opera en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA), en el que el filtro de exclusión dinámica utilizado maximiza el número de proteínas identificadas a expensas de un muestreo aleatorio, presentando un sub-muestreo inherente al método. Esto hace que la falta de identificación de una proteína o péptido no siempre signifique su ausencia, y que la cuantificación solo se pueda realizar entre un par de señales. Así, solo se pueden cuantificar proteínas expresadas en ambos modelos, descartando las proteínas expresadas de forma única o exclusiva por un tipo celular, y las cuales presentan un alto interés biológico. A pesar de las limitaciones de los análisis en gel, estos permiten identificar y evaluar spots de proteína expresados de forma exclusiva a un modelo, identificando proteínas para evaluar posteriormente mediante western blot. Teniendo en cuenta los desafíos de cada técnica y los valores perdidos en MS, la expresión exclusiva de una proteína debe ser evaluada y confirmada mediante estrategias metodológicas alternativas. Por otra parte, la proteómica comparte problemas asociados a Big Data, y para resolverlos se cuenta con la mineria de datos (Data Mining). Así, para analizar los datos proteómicos se usan herramientas de esta área para buscar patrones ocultos en los datos que pueden utilizarse para predecir el comportamiento futuro y transformarlos en conocimiento biológico. En cuanto al análisis bioinformático, son necesarios diversos abordajes, cambiando de estrategia según la naturaleza de los datos analizados. Por ejemplo, existen proteínas con una gran razón de cambio como ZSCAN25 en respuesta al TGF-β que no son consideradas dentro del enriquecimiento de anotaciones debido a su ausencia en la base de datos que emplea el programa utilizado, perdiendo su relevancia, por lo que deben ser analizadas individualmente. Como parte necesaria para el desarrollo de esta tesis se propusieron diversas estrategias de análisis bioinformático y se evaluó su desempeño frente a set de datos proteómicos y azarosos (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2014, 2015).

210 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

4.2 Biología del cáncer y procesos biológicos En el 2.000 Hanahan y Weinberg describieron los marcadores centrales o hallmarks del cáncer, incluyendo auto-suficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a señales anti-crecimiento, evasión de la apoptosis, potencial replicativo ilimitado, angiogénesis prolongada e invasión tisular y metástasis (Hanahan & Weinberg, 2000). A partir del año 2.009 grupos adicionales resaltaron la reprogramación metabólica de las células transformadas y propusieron nuevos marcadores como la evasión de la vigilancia inmune (Kroemer & Pouyssegur, 2008), la inflamación asociada al cáncer (Colotta et al., 2009), la inestabilidad genética (Negrini et al., 2010), y se incluyó un set de características adicionales que describen al fenotipo estresado de las células cancerosas, englobando al estrés metabólico, estrés proteotóxico, estrés mitótico, estrés oxidativo y estrés por daños al ADN (J. Luo et al., 2009). Esto dio lugar a una nueva formulación de marcadores del cáncer, considerando como marcadores emergentes a la desregulación energética y la evasión de la destrucción inmunológica, en particular, por linfocitos T y B, macrófagos y células natural killer; adicionalmente, se consideraron como características de activación a la inflamación producida por células inmunes innatas del microambiente y la inestabilidad genética y mutaciones que puede generar (Hanahan & Weinberg, 2011). En cuanto a los eventos moleculares que conducen a la transformación maligna y la progresión del cáncer, estos generalmente involucran mutaciones en genes que regulan el crecimiento celular normal y la diferenciación. En los últimos años la investigación se ha centrado en las células madre de cáncer o cancer stem cells, como cabecillas del inicio y desarrollo tumoral. Se ha sugerido que la fusión celular y/o eventos de transferencia horizontal de genes también tienen un rol importante en la iniciación tumoral, así como la desregulación del centrosoma y los desarreglos cromosomales que puede generar (Tysnes & Bjerkvig, 2007). La invasión es una de las habilidades con las que se suele medir el nivel de agresividad de los tumores cancerosos; sin embargo, esta no es exclusiva del cáncer ya que muchas células pueden desarrollar un proceso de invasión fisiológico, como el trofoblasto y los leucocitos. En nuestro caso, la línea derivada de trofoblasto HTR-8/SVneo tiene un carácter más mesenquimal e invasivo que la línea derivada de coriocarcinoma JEG-3, debido a su origen; este carácter y su alta capacidad de migración se evidenció en los resultados proteómicos, la sobre-expresión de vimentina, la falta de expresión de E-caderina y la morfología celular. En este trabajo se identificaron proteínas adicionales vinculadas con otros procesos biológicos que resaltan al ser habilidades propias de los crecimientos malignos y suponer estrategias de supervivencia y su relación con el microambiente. Esta discusión se centra únicamente en el cariotipo alterado, la actividad antioxidante, la reprogramación metabólica, modelamiento de la cromatina, la plasticidad del programa de transcripción y del fenotipo y finalmente la influencia del microambiente, aspectos novedosos de la biología del cáncer y resaltados gracias a los resultados proteómicos y la potencial vinculación de las proteínas identificadas con estos procesos. A nivel del proteoma celular, en las células JEG-3 se identificó un mayor número de proteínas comparado con HTR-8/SVneo. Esto permite pensar en estrategias de supervivencia adicionales como la actividad enzimatica antioxidante, y una flexibilidad en el programa transcripcional y el fenotipo.

Discusión general e implicaciones biológicas 211

4.2.1 Fusión celular, citocinesis y cariotipo alterado La fusión celular es un evento normal del proceso de diferenciación del citotrofoblasto velloso a sincitiotrofoblasto, así como del citotrofoblasto extravelloso intersticial a células gigantes del lecho placentario (Paul Bischof & Irminger-Finger, 2005). Este es otro aspecto del trofoblasto que ha sido vinculado con el desarrollo del cáncer, ya que durante los procesos de fusión celular se generan células poliploides con una posible aneuploidia subsecuente (Shinn-Thomas & Mohler, 2011), aunque aún no es claro como se evita o controla en el trofoblasto el desarreglo cromosomal asociado a la fusión celular y la poliploidía que éste genera. Por otro lado, la enfermedad trofoblástica gestacional, incluyendo al coriocarcinoma, representa el resultado de un embarazo aberrante con un cariotipo anormal debido muchas veces a una fertilización incorrecta. En general, el coriocarcinoma se origina de mola hidatidiforme completa, pero puede provenir de cualquier evento gestacional, pudiendo presentar diploidía androgenética o triploidía según su origen (Stevens et al., 2015). El coriocarcinoma está compuesto de cantidades variables de citotrofoblasto neoplásico, sincitiotrofoblasto y trofoblasto (intermediario) extravelloso, similar al blastocisto prevelloso. En células de coriocarcinoma se ha detectado una sobre-expresión de p53, sin mutación alguna asociada, así como una sobre-expresión de la proteína asociada a p53 la E-3 protein-ubiquitin ligasa MDM2 y una pérdida del gen HOPX de la proteína de homeodominio único (designado inicialmente como NECC1) (Shih, 2007) En particular, la línea celular HTR-8/SVneo se ha descrito como un modelo de citotrofoblasto extravelloso invasivo y la línea JEG-3 como un modelo de citotrofoblasto velloso que permite estudios de sincitialización o fusión celular. JEG-3 al ser derivada de coriocarcinoma de placenta es una línea hipertriploide humana, el número cromosómico modal es 71, produciéndose en el 34%, y la poliploidía en el 2,6%. La t(4;11)(p15;q13), i(13q), t(10p15q), del(18)(q21), y otros 6 marcadores son comunes a la mayoría de las células, y otros dos marcadores se encuentran en algunas. Satélites gigantes se ven en un N14, y dos N22. N2, N5, y N9 tienen 4 copias y N7, N13, N18, N21 y X un solo ejemplar; un solo cromosoma Y se detecta mediante un examen Qband (ATCC, 2016). Respecto a la línea HTR-8/Sneo, a mi conocimiento su cariotipo no se ha descrito aún. Sin embargo, se ha demostrado que las células HTR-8/SVneo se pueden fusionar con las células maternas HUVEC, hecho relevante en el estudio de las células madre de cáncer (cancer stem cells) y la posible fusión celular entre orígenes diferentes (Weise et al., 2011). Como se observó con los resultados del Capítulo 3, diversas proteínas vinculadas a citocinesis y segregación de cromosomas se identificaron de forma diferencial en las EVs derivadas de HTR-8/SVneo y JEG-3 inducidas por TGF-β. Adicionalmente, en los análisis del proteoma total se identificó de forma diferencial tubulinas y otras proteínas involucradas en la formación de microtúbulos y en la dinámica celular, las cuales son vitales tanto en la fusion celular como en la citocinesis. En cáncer, alteraciones en éstas pueden generar fusión celular, dando lugar a un cariotipo alterado con poliploidias (Tysnes & Bjerkvig, 2007) como las observadas en coriocarcinoma. Por otro lado, las células cancerosas a menudo tienen centrosomas múltiples y en general presentan anormalidades centrosomales debido a defectos en la citocinesis; esta puede conducir a aneuploidía, que a su vez puede convertirse en cáncer (Sagona & Stenmark, 2010).

212 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

En cuanto al fenómeno de transferencia horizontal de genes, este se puede dar de células apoptóticas a células receptoras por fagocitosis, de tal forma que mutaciones en células somáticas pueden conducir a la apoptosis y el ADN fragmentado podría ser fagocitado por otras células somáticas, conduciendo a su reprogramación nuclear y a nuevas células tumorales. (Tysnes & Bjerkvig, 2007). Este fenómeno puede darse adicionalmente vía exosomas y otras extravesículas, como se discutió en el Capítulo 3. No obstante, la liberación de exosomas, shedding y deportación del trofoblasto es un fenómeno normal. A pesar que las células JEG-3 presentaron una menor cantidad de EVs secretadas y proteínas identificadas en ellas que las células de HTR-8/SVneo, el contenido de ácidos nucleicos puede ser mayor y existe la posibilidad de transferencia de genes mediante este proceso, el cual aún no se ha estudiado.

4.2.2 Reprogramación metabólica como una estrategia de supervivencia

El metabolismo alterado ha emergido como un marcador central del cáncer, el cual no se da como una respuesta pasiva a un daño mitocondrial, sino que resulta de una reprogramación metabólica dirigida por oncogenes necesaria para soportar el crecimiento anabólico; adicionalmente. Esta reprogramación metabólica en cáncer se da como una respuesta directa a las señales de proliferación y supervivencia celular. En ausencia de señales de crecimiento, una célula quiescente no captara suficientes nutrientes, optando por la autofagia y el catabolismo de lípidos y aminoácidos a través del ciclo TCA para suplir sus necesidades de ATP. En una célula proliferativa, la señalización por factores de crecimiento directamente reprograma la captación de nutrientes - como glucosa y glutamina- y el metabolismo, incrementándolo, lo cual puede soportar los requerimientos anabólicos de la célula en crecimiento, generando biomasa y secretando el exceso de carbono como lactato; esta célula proliferativa también puede usar estrategias para disminuir su producción de ATP mientras incrementa el consumo de ATP y mantener la razón ADP:ATP necesaria para sostener el flujo glicolítico. De igual forma, alteraciones en oncogenes clásicos como myc reprograman directamente el metabolismo para incrementar la ingesta de nutrientes y la biosíntesis (Ward & Thompson, 2012). En el Capítulo 1 y 2 se observó la expresión diferencial de proteínas vinculadas a la glicólisis, y particularmente para las células de JEG-3, la gluconeogénesis, la vía de las pentosas fosfato y la degradación de valina, por la sobre-expresión de enzimas como GPI, ALDOA, GAPDH, PGK1, Eno1 y 3, LDHA y B, MDH2, TALDO, PRPS1, ECHS1, HSD17B10, DLD, OXCT1 y HIBADH, sugiriendo un uso alternativo de monocarboxilatos, que podría incluir lactato y valina. De forma interesante, la PKM se cuantificó con un mayor nivel en células de HTR-8/SVneo, pero en JEG-3 se identificó en un grupo de spots 10 kDa más pesados y que estaba ausente en HTR-8/SVneo. Sonveaux et. al. demostraron la existencia de una "simbiosis metabólica" entre las células cancerígenas hipóxicas y aeróbicas, en las que el lactato producido por las células hipóxicas es absorbido por las células aeróbicas que lo utilizan como sustrato principal en la fosforilación oxidativa; esto hace que la glucosa disponible de forma limitada para el tumor se utilice más eficientemente: las células hipóxicas disminuyen la fosforilación oxidativa con el fin de mantener la homeostasis redox, pero consumiendo grandes cantidades de glucosa para mantener la homeostasis de la energía (Selamnia et al., 1998; Sonveaux et al., 2008). Sería interesante evaluar la expresión del transportador

Discusión general e implicaciones biológicas 213

MCT1 en un modelo con células hipóxicas como lo son el ensayo de esferoides, para determinar si las células de coriocarcinoma pueden desarrollar esta estrategia. Adicional a la glucosa, la glutamina ha emergido como un nutriente clave del cáncer, de tal forma que el aumento de glutaminolisis es reconocido junto con el aumento de la glicólisis aeróbica o efecto Warburg como una característica clave del perfil metabólico de las células cancerosas (Daye & Wellen, 2012). Algunos tipos de células cancerosas parecen ser dependientes de la glutamina, ya que la actividad metabólica de esta permite la producción de energía, la síntesis de biomasa al ser un donor de carbono y nitrógeno, la defensa antioxidante y la regulación de la señalización celular (De Vitto et al., 2016). En particular, la función de la glutamina en la biosíntesis de ADN, en la cual es un donor de nitrógeno obligado para la síntesis de purinas y pirimidinas, juega un papel importante al soportar la proliferación celular (Daye & Wellen, 2012). Dentro de las proteínas diferencialmente expresadas identificadas en el presente trabajo figuran miembros de rutas metabólicas del nitrógeno, como IMPDH en la biosíntesis de IMP (Capítulo 1), AK1 y 2, HPRT1 y APRT en el metabolismo de AMP y rescate de purinas y pirimidinas (Capítulo 2), y otros procesos metabólicos relacionados con el nitrógeno, incluyendo NADPH, discutidos en el Capítulo 3. La glutamina también es importante en la síntesis del glutatión, tripeptido del que se hablara a continuación por su actividad antioxidante. La síntesis de selenocisteina fue otro proceso enriquecido en JEG-3, principalmente con componentes ribosomales. Este es un aminoácido genéticamente codificado y la forma principal del oligoelemento antioxidante selenio en el cuerpo humano; gracias a estudios en los últimos 20 años se ha visto que algunas de las selenoproteínas juegan papeles tanto al prevenir como promover el cáncer (Rubin & Atweh, 2004). Como se indicó en el Capítulo 3, la reprogramación metabólica de las células cancerosas está influenciada por el microambiente a través de un intercambio de EVs como exosomas. En el caso del trofoblasto, esto sugiere un programa adaptativo a las condiciones nutricionales del microambiente vía EVs, resaltando la adaptación del trofoblasto al entorno y la capacidad de coordinación vía EVs. Se ha visto que el microambiente tumoral contribuye en gran medida al recalibrado metabólico de las células cancerosas, promoviendo la explotación completa de nutrientes y potenciando los intercambios a través de EVs de proteínas, lípidos y ARN pequeños entre células tumorales y estromales, situación en la cual tanto las células cancerígenas como las estromales sufren una reprogramación metabólica recíproca; los mismos impulsores moleculares de la reprogramación metabólica en el tumor y el estroma también son capaces de provocar motilidad, supervivencia y auto-renovación en las células cancerosas, manteniendo así estrategias de supervivencia al ambiente estresor (Chiarugi & Cirri, 2015).

4.2.3 Actividad antioxidante como una ventaja intrínseca Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos normales de numerosos procesos celulares, como metabolismo mitocondrial y plegamiento de proteínas; las ROS a niveles bajos actúan como moléculas de señalización, a niveles intermedios pueden dañar el ADN y promover mutagénesis, y a niveles altos generar un estrés oxidativo en la

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célula que conduce a su senescencia o muerte. Las ROS pueden iniciar el cáncer, pero la actividad oxidativa en células tumores las deja vulnerables a estrés adicional. (Schumacker, 2015). Para controlar el estrés oxidativo, las células generan antioxidantes que neutralizan a las ROS; el antioxidante más abundante en las células es el glutatión (GSH), el cual es requerido para la iniciación del cáncer, pero no para tumores ya establecidos, debido en parte a la posterior regulación al alza de la vía antioxidante de la tioredoxina (TXN) la cual involucra a las peroxiredoxinas (PRDX). Esta vía esta aumentada en diferentes tumores, y se ha propuesto que un bloqueo simultaneo de la vía GSH y TXN puede inhibir de forma sinérgica el crecimiento tumoral (Isaac S. Harris et al., 2015). Aunque en HTR-8/SVneo se encontraron proteínas vinculadas con el metabolismo del glutatión como CLIC1 y 4 (Tabla 2-7), las células JEG-3 sobre-expresaban un pool de enzimas antioxidantes que incluía TXN y las peroxiredoxinas 1, 2, y 6 (Tabla 2-8); adicionalmente en JEG-3 se encontró sobre-expresada a la dihidrolipoil deshidrogenasa mitocondrial (DLD) involucrada en el metabolismo de 2-oxoglutarato, glioxilato y lipoato, en el catabolismo de lisina, la regulación de la biosíntesis de acetil-CoA a partir de piruvato y la homeostasis redox; y la proteína disulfuro-isomerasa A3 (PDIA3) involucrada en el plegamiento de proteínas en el retículo endoplasmático, respuesta a estrés en el retículo y homeostasis redox. Respecto al embarazo, se sabe que al inicio de este el ST presenta bajas concentraciones de las principales enzimas antioxidantes, siendo especialmente vulnerable (G. Burton et al., 2010). La capacidad antioxidante vista a través de la identificación de enzimas de la vía TXN sobre-expresadas en JEG-3, se relaciona directamente con la capacidad de supervivencia de las células tumorales y es un tópico interesante y en auge, ya que constituye un mecanismo de progresión tumoral y le confiere al tumor resistencia frente a la radioterapia. El aumento del estrés oxidativo en células normales limita el inicio y la progresión tumoral. Por lo tanto, el bloqueo e inhibición estratégica de los sistemas antioxidantes como TXN puede impedir la supervivencia de nuevas células tumorales.

4.2.4 Regulación epigenética y reparación del ADN Se identificaron proteínas vinculadas a la remodelación de cromatina, modificación y acetilación de histonas y reparación de daños al ADN de forma diferencial en células JEG-3, tanto en su proteoma (Tabla 2-12) como en las EVs derivadas de estas (Tabla 3-14). Se sabe que los cambios genéticos de la célula tumoral son insuficientes para explicar la progresión tumoral y la metástasis y que varias alteraciones epigenéticas pueden afectar profundamente características de estas células durante su progresión maligna. La regulación epigenética de células cancerosas se puede dar en respuesta a señales ambientales y alteraciones intrínsecas de las células, induciendo adaptaciones que le permiten sobrevivir, invadir y colonizar tejidos y resistir a terapias citotóxicas. (Taddei et al., 2013). Por otro lado, la capacidad de reparación del ADN le permite escapar de la apoptosis y el estrés asociado a la alta tasa de proliferación. La respuesta a daños en el ADN (DNA

Discusión general e implicaciones biológicas 215

damage response, DDR) en general protege contra la inestabilidad genómica, la cual se puede dar por el daño al ADN y el estrés replicativo, típicos de lesiones precancerosas y tumores. Las vías de reparación del ADN reparan el daño que es inducido por agentes endógenos y ambientales dañinos del ADN, protegiendo por lo tanto al genoma; estas incluyen: reparación directa, reparación por escisión de base (BER), reparación de ruptura de una sola hebra (SSBR), reparación por escisión de nucleótidos (NER), reparación de desajuste (MMR), unión de extremo no homóloga (NHEJ), reparación por recombinación homóloga (HRR) y reparación por entrecruzamiento (ICL) (Curtin, 2012). Específicamente, en el proteoma de JEG-3 se encontró a las proteínas S100A4 y S100A11 aumentadas 8,11 y 3,11 veces, respectivamente, el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) aumentado en 1,71 veces, la proteína SET aumentada 2,8 veces y los miembros A, B y E de la familia de la fosfoproteína nuclear 32 rica en leucina acídica (ANP32A, B y E) aumentados en JEG-3 1,57, 1,86 y 1,95 veces, respectivamente, así como al miembro A disminuido 6,43 veces en células HTR-8/SVneo en respuesta al TGF-β. Respecto a las EVs, la proteína de susceptibilidad a cáncer de seno tipo 2 (BRCA2) y la Proteína de reparación del ADN RAD50 se identificaron en las EVs control de JEG-3 pero no en las de HTR-8/SVneo. PCNA se caracterizó originalmente como un componente esencial de la replicación del ADN; sin embargo, estudios posteriores han revelado su sorprendente capacidad para interactuar con múltiples parejas, que están involucradas en varias vías metabólicas, incluyendo procesamiento de fragmentos Okazaki, reparación de ADN, síntesis de ADN translesional, metilación de ADN, remodelación de cromatina y regulación del ciclo celular (Maga & Hübscher, 2003). BRCA2, junto con BRCA1 contribuyen a preservar la estructura cromosómica y están implicadas en diferentes procesos incluyendo reparación y recombinación del ADN, control del ciclo celular y transcripción; la importancia de estas se debe a que mutaciones hereditarias en BRCA1 o BRCA2 predisponen a cáncer de mama, ovario y otros tipos de cáncer (Venkitaraman, 2002). RAD50 es un componente del complejo MRN, que desempeña un papel central en la reparación de rupturas de doble hebra (DSB), recombinación de ADN, mantenimiento de la integridad telomérica y meiosis, y se ha asociado a susceptibilidad a cáncer de seno e inestabilidad genómica (Assenmacher & Hopfner, 2004). J Luo et. al. proponen que la interacción funcional entre las diferentes facetas del fenotipo estresado promueve el estado tumorigénico y suprime el estrés oncogénico, su estudio brinda un marco conceptual de cómo las adicciones a oncogenes y no-oncogenes contribuyen a estas características y cómo pueden ser explotadas mediante la sensibilización al estrés y sobrecarga de estrés para matar selectivamente a las células cancerosas. Por ejemplo, la utilización de la glicólisis permite a las células tumorales adaptarse a la hipoxia y acidificar su microambiente para evadir la vigilancia inmune. El aumento del estrés mitótico promueve la aneuploidía, lo que conduce a estrés proteotóxico que requiere una compensación de la vía de respuesta de choque térmico. Los niveles elevados de ROS resultan en aumento de los niveles de daño del ADN que normalmente provoca la senescencia o apoptosis, pero se supera por las células tumorales. (J. Luo et al., 2009).

216 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

4.2.5 Plasticidad del programa transcripcional y adaptabilidad celular

Adaptación fenotípica de la línea HTR-8/SVneo y flexibilidad transcripcional en la línea JEG-3

Como se había propuesto anteriormente, la línea celular HTR-8/SVneo puede presentar un fenotipo plástico o flexible. Esto es evidente en la adaptación celular al ambiente, por ejemplo a la depleción del suero, reforzando la idea de un switch adaptativo, de forma similar a las células malignas (Capítulo 1), y en la respuesta dual al TGF-β de acuerdo a las condiciones de cultivo y la presencia de suero (Capítulo 1 y 2). Así mismo, la habilidad de las células de sensar el ambiente mediante diversas estructuras como el cilio primario, y comunicarse con este a través de EVs, repercute en una adaptación a éste. Esta adaptación se debe a una dependencia a las señales ambientales, y puede ser vista como un cambio en el fenotipo, proteoma y programa transcripcional en respuesta a cambios en el medio de cultivo y estimulación con TGF-β, lo que en síntesis habla de un fenotipo flexible a las condiciones cambiantes del microambiente, como las que se discutieron en el Capítulo 1. En la línea HTR-8/SVneo, este fenotipo puede deberse a nuevas características adquiridas por la transformación con el virus SV40, características de stem cell como propone Weber (Weber et al., 2013), o indicar una habilidad propia del trofoblasto normal y su fenotipo altamente regulado, para el cual es necesario tener un programa transcripcional flexible y adaptarse a las condiciones cambiantes del microambiente propias del proceso de implantación y placentación. La línea HTR-8/SVneo a pesar de ser inmortalizada, se propone como un modelo de citotrofoblasto normal, dependiente de señales medioambientales a cuya regulación responde, adaptando su comportamiento; en este trabajo se observó una flexibilidad en la respuesta de estas células como una forma de adaptación al medio. Respecto a la línea JEG-3, al ser derivada de coriocarcinoma puede presentar una flexibilidad en su programa transcripcional, el cual es sugerido a partir de las proteínas identificadas de forma diferencial en su proteoma y en sus EVs como HMGN5 y que se encuentran vinculadas con remodelación de cromatina, modificación de histonas, especialmente acetilación, transferencia e integración de ARN viral, nucleosoma, spliceosoma y ribosoma y degradación de ARN. Por otro lado, el cambio en su comportamiento con respecto a las condiciones de cultivo y la aparente homogenización con respecto a HTR-8/SVneo (evidenciada durante la caracterización celular del Capítulo 2), sugiere que estas células están en capacidad de responder al ambiente, cambiando su fenotipo, de tal forma que los cambios observados entre la línea HTR-8/SVneo y la línea JEG-3 pueden obedecer a los medios de cultivo usados tradicionalmente. La “plasticidad fenotípica” se define como la propiedad de un genotipo dado de producir diferentes fenotipos en respuesta a distintas condiciones ambientales, donde las interacciones genotipo–ambiente están mediadas indirectamente por efectos epigenéticos durante el desarrollo (Pigliucci, 2001). En este sentido, el citotrofoblasto es un tejido altamente plástico, si se consideran sus diversas rutas de diferenciación a sincitiotrofoblasto (vía fusión) y citotrofoblasto extravelloso (vía invasiva), y este último a proliferativo, invasivo, intersticial, endovascular y células gigantes del lecho placentario; al grado que ha sido denominado un “camaleón

Discusión general e implicaciones biológicas 217

mononuclear” por Bischof (Paul Bischof & Irminger-Finger, 2005). Respecto al proceso de diferenciación, un estudio que evaluó el efecto de decorina en la proliferación, migración e invasión de células EVT, HTR-8/SVneo y de coriocarcinoma sugiere que las funciones invasivas de células EVT no están asociadas con una diferenciación terminal en un estado no cíclico, ya que estas células conservan parte de su habilidad proliferativa tras ensayos de migración e invasión (G. Xu et al., 2002). Esto implica que las células EVT y HTR-8/SVneo pueden sufrir una especie de de-diferenciación o diferenciación cíclica, pasando del fenotipo invasivo al proliferativo, y sugiriendo una alta plasticidad fenotípica. Esta plasticidad también es una característica de las células tumorales, que contribuye en la generación de diversas rutas de invasión y programas, aumentando la heterogeneidad tumoral y permitiendo una diseminación metastática (Friedl & Alexander, 2011; Taddei et al., 2013). En todo caso, son necesarios estudios adicionales para confirmar esta propuesta de fenotipo flexible, así como determinar las causas por las cuales se da este: si es debido al proceso de transformación o es una característica propia del trofoblasto, caso en el cual sería una señal de la diferencia en el comportamiento regulado fisiológico del trofoblasto y del patológico del cáncer.

El programa transcripcional dominado por nodos hubs

Las redes biológicas, incluyendo las redes de proteínas son de tipo libre de escala o free-scale, lo cual permite una robustez frente a mutaciones o cambios en la expresión de proteínas; así, solo cuando se cambia algún nodo hub o concentrador se altera de forma significativa la topología de la red. Son estos nodos hubs los que se esperan alterados en cáncer, ya que su alteración repercute en toda la red y con esto en la biología del sistema, pudiéndose proponer como oncogenes y supresores tumorales. Previamente Lu et. al. habían demostrado que nodos con alta conectividad (como hubs y superhubs) tienden a tener el menor cambio en su expresión génica y que estos nodos tienen funciones biológicas significativamente diferentes comparado con los nodos periféricos, y sugieren que una combinación de expresión génica diferencial más características topológicas de la red de interacción permiten un mayor entendimiento de un sistema biológico particular (Lu et al., 2007). Estos nodos hubs son los que dominan la topología de la red, y por tanto es necesario tenerlos en cuenta para comprender cambios en sistemas biológicos, inclusive cuando los cambios en su expresión son mínimos. Adicionalmente se ha visto la existencia de programas transcripcionales fijos y variables. En un estudio termodinámico de los patrones de expresión de genes desarrollado por Kravchenko-Balasha et al. (Kravchenko-Balasha et al., 2012), se evidenció que existen sets de proteínas invariables y fijas que contribuyen al estado estacionario, los cuales poseen un bajo nivel de energía libre, mientras que existe un grupo de proteínas con un alto nivel de energía libre y que varían entre tipos tumorales. Dentro del set fijo ellos encontraron proteínas como RPS ribosómicas, proteínas RPL y factores de iniciación y elongación eucariota, y redes de metabolismo energético tales como la vía de fosforilación oxidativa, incluyendo NDUF, transcritos de COX y ATP sintasas; estas serían los principales contribuyentes del set básico del estado estacionario. Dentro de las vías que no contribuyen significativamente al estado estacionario y cuyo nivel es menor están la transducción de señales y las vías de comunicación celular, que tienen mayor

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capacidad de respuesta a estímulos externos cambiantes y otras perturbaciones (Kravchenko-Balasha et al., 2012). A pesar de haber identificado un alto número de proteínas ribosomales y factores de elongación, los procesos biológicos que resaltan en las diferentes comparaciones realizadas son los referentes a regulación de la expresión génica, transducción de señales y comunicación celular. Especialmente, la identificación diferencial de proteínas hubs como chaperonas y chaperoninas, co-reguladores, scaffolds y proteínas adaptadoras que resaltan en todo el trabajo, las cuales serán discutidas más adelante. Otros estudios muestran que los mecanismos que conectan las proteínas de señalización en las redes de señalización son altamente modulares, lo que hace que estos sistemas sean más evolutivos; en principio, nuevos circuitos y por lo tanto comportamientos reguladores innovadores pueden surgir de eventos genéticos simples, como la recombinación, deleción o inserción. Esta arquitectura altamente modular también se da en transcripción, proteólisis y tráfico celular, y se caracterizan por el uso de elementos cada vez más generales y portátiles que pueden ser intercambiados genéticamente para mediar nuevas conexiones reguladoras, como dominios, motivos y proteínas adaptadoras o scaffolds. La reutilización de dominios modulares similares en diferentes contextos representa la estandarización de los medios de comunicación entre nodos de proteínas; aunque esto va en contra de la eficiencia que supone la integración de vías, estos sistemas modulares proporcionan una flexibilidad y adaptabilidad, siendo más robustos para acomodar y amortiguar cambios en el ambiente (Bhattacharyya et al., 2006). Esta capacidad de adaptación concuerda con la que presenta el trofoblasto frente a los cambios del microambiente intrauterino o los de una célula tumoral adaptándose a su microambiente, tal como se discutió en el Capítulo 1.

4.3 Influencia del microambiente y regulación recíproca En general, en este trabajo se vislumbra la influencia del microambiente, visto a través de las diferentes condiciones de cultivo, sobre la actividad metabólica, proliferación, expresión de proteasas, respuesta al TGF-β y en el proteoma de células HTR-8/SVneo y JEG-3. Los cambios en el microambiente in vivo pueden ser vistos como los cambios en el microambiente uterino y tumoral tal como se discutió en el Capítulo 1, y también, mediante extrapolación a situaciones de isquemia, hipoxia y restricción nutricional. Similar a lo observado en el Capítulo 1, el perfil de proteínas expresadas en respuesta a estrés nutricional puede evidenciar en como responden las células a esta condición, similar a la obtenida tras un crecimiento maligno en ausencia de angiogénesis. El microambiente tumoral es fundamental al promover el crecimiento de células tumorales y su progresión a través de un incremento en las características y habilidades malignas; diferentes células contribuyen al condicionamiento de este y al desarrollo de las funciones biológicas propias de los tumores, siendo vital para la progresión tumoral la activación de fibroblastos asociados a cáncer (CAFs, cancer-associated fibroblasts) y de los macrófagos asociados a tumores (TAMs, tumour-associated macrophages), mientras que las células madre de cáncer (CSCs, cancer stem cells) mantienen el crecimiento de la masa tumoral y son las que sobreviven fuera del tumor primario, residiendo luego en el sitio metastático. En este sentido, uno de los nuevos marcadores del crecimiento maligno es la inflamación relacionada con cáncer (Hanahan & Weinberg, 2011), la cual se vincula con inestabilidad genética (Colotta et al., 2009).

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Regulación de la inflamación y sistema inmune

Se sabe que existe una orquestación de doble vía entre las CSCs y las células estromales, en la cual las CSCs no solo se verán afectadas por su microambiente sino también estarán en capacidad de manipular a las células estromales e inmunes según sus necesidades, remodelando el microambiente, las células de este y la matriz extracelular, no solo en el tumor primario sino también en órganos distantes (Fessler et al., 2013). En el Capítulo 3 se discutió como las células cancerosas pueden manipular la respuesta inmune vía EVs, creando un microambiente favorable para su crecimiento y progresión, incluso en el nicho premetastático, el cual puede ser inducido vía EVs (Hoshino et al., 2015). En este trabajo se vió que las células de HTR-8/SVneo y JEG-3 expresan proteínas a través de las cuales pueden orquestar cambios en el microambiente, y particularmente sobre célular inmunes. Adicional a las proteínas cargadas en exosomas y otras EVs, gracias al análisis SILAC se encontró un aumento de 4,97 veces en la expresión de IL-18 en células JEG-3 respecto a HTR-8/SVneo; esto implica una polarización de la respuesta inmune hacia Th1, con un aumento en la inflamación a través de la producción de IFN-γ. Por otro lado, en el Capítulo 3 se observó un perfil de proteínas secretadas en EVs común y particular para cada linea, que incluia componentes del complemento, antígenos MHC clase I, clusterina, L-plastina, STXB3, dermicidina, PRKDC, CH60, MSH6, PSN1, calreticulina, Ned4L, DYN1, NSF, UBQL1, CAN1, A4, UBE2N, LYN, DPP4, S100A7; en particular para HTR-8/SVneo a gremlin, TRAF2, PVR/NECL-5; y encontradas en JEG-3 a CEBPB, GDF15, IL-37, IL-36γ, S100A9 y GATA3. Las proteínas identificadas en las células JEG-3 y sus EVs tienen funciones potenciales tanto a nivel de la supresión de la producción de citoquinas proinflamatorias maternas y regulación de Th2 como de promoción de la inflamación y respuesta innata tipo Th1. Como se había discutido previamente, es posible que la línea celular JEG-3 conserve algunos circuitos regulatorios típicos del trofoblasto, basado en la polarización de la respuesta hacia Th2 vía EVs, pero presenta un perfil de proteínas y citocinas que lleva a pensar en una manipulación del sistema inmune típica de las células cancerosas y con modulación del nicho hacia respuesta inmune innata. Respecto a la influencia del trofoblasto sobre el microambiente y el sistema inmune, el escenario más estudiado ha sido el de la pre-eclampsia, aunque también existen estudios en condiciones normales. En general se piensa que los residuos trofoblásticos de embarazos normales son generados por procesos apoptóticos y estos residuos han mostrado inducir un fenotipo anti-inflamatorio / tolerogénico tipo M2 en macrófagos fagocíticos, los cuales pueden contribuir con la tolerancia del sistema inmune materno al semi-alógrafo fetal. Se ha visto que los factores secretados por el trofoblasto pueden inducir una diferenciación de monocitos hacia un fenotipo de macrófagos CD14+/CD16+; estos macrófagos polarizados hacia M2 secretan altos niveles de citoquinas anti-inflamatorias, IL-1b, IL-10, IP-10, TGF-β y IL-13, tienen una alta capacidad de fagocitosis, una expresión aumentada de receptores manosa y scavenger o “basurero” y receptores de inmunidad innata, además de estar implicados en reparación tisular y control de la inflamación (Aldo et al., 2014). Los autores también sugieren que el TGF-β producido por el trofoblasto regula algunos aspectos de este fenotipo, ya que la inhibición del TGF-β disminuye la expresión de CD16, mientras que altera su producción constitutiva de citoquinas y quimiocinas.

220 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Adicionalmente se ha visto que las células Treg en la interfase materno-fetal previenen el rechazo inmune al crear un microambiente “tolerante” caracterizado por la expresión de IL-10, TGF-β y la isoforma1 de la oxigenasa heme (HO-1) mas que por disminuir las citoquinas Th1; también se ha visto que Tregs tiene la capacidad de bloquear las células T efectoras maternas, reduciendo la respuesta patológica a los antígenos paternos. Un subtipo de Treg inducido Th3, con marcadores CD4+CD25+, secreta principalmente TGF-β actuando probablemente sobre células T, células presentadoras de antígenos y células tumorales (Alijotas-Reig et al., 2014). En cuanto al cáncer, este se caracteriza por una evasión de la vigilancia del sistema inmune, similar a lo que sucede durante el embarazo, y una manipulación de este a traves de las células estromales y CAFs, generando una dinámica de doble vía en el que las células inmunes, principalmente TAMs, van a generar un microambiente inflamatorio que promueve la progresión tumoral, al tiempo que las células cancerosas, a traves de sus exosomas manipulan a las células residentes para reclutar y activar células inmunes, conformando el nicho tumoral (Hanahan & Weinberg, 2011), tal y como se describió previamente en el Capítulo 3.

4.3.1 Influencia del microambiente en los efectos del TGF-β El cambio en la respuesta al TGF-β por el tipo de medio de cultivo, la presencia de suero y en el tiempo, vista como la influencia del microambiente celular, puede ser debido tanto a cambios en el estado nutricional del medio como una señalización adicional por factores séricos o secretados por las mismas células y que alteran la respuesta al TGF-β al generar otras señales de entrada. Se han estudiado los efectos de Insulina e IGF-I, actuando solos o en sinergia con el suero sobre la secreción de hCG beta, proliferación e invasión en las líneas de coriocarcinoma BeWo, JAR y JEG-3, observando un fuerte efecto sinérgico con el suero (Mandl et al., 2002); otros estudios han visto que una alta concentración de glucosa inhibe la invasión in vitro de células HTR-8/SVneo, así como de la actividad de uPA, sin observar un efecto sobre los niveles de MMP-2, -9, PAI-1 o uPAR (Belkacemi et al., 2005). La dependencia observada con las condiciones de cultivo de la señalización del TGF-β y su versatilidad se explica ya que este es un factor dual (Pardali & Moustakas, 2007), cuyos efectos dependen en gran medida del contexto celular (Ikushima & Miyazono, 2010), que están dados en parte por el microambiente. En ciertos tipos celulares el TGF-β es considerado un supresor tumoral, no solo por inhibir la proliferación e inducir apoptosis, sino también porqué varias vías oncogénicas inactivan directamente la vía de TGF-β–Smad, favoreciendo de esta forma el crecimiento tumoral. Por otro lado, gran parte de los tumores sobre-expresan TGF-β cuyas acciones autocrinas y paracrinas promueven la invasión celular tumoral y metástasis, induce la expresión de señales mitogénicas y regula la angiogénesis (Pardali & Moustakas, 2007). Finalmente, aunque la ausencia o presencia de SFB al 0,5% puede alterar el estatus celular y con esto la capacidad de respuesta a factores exógenos, en base al estudio llevado a cabo no es posible discernir el papel que juega el SFB, pudiendo estar implicado tanto el componente nutricional como el de señalización, y son necesarios estudios adicionales que profundicen en el efecto concomitante del suero.

Discusión general e implicaciones biológicas 221

Efectos duales del TGF-β en la proliferación y apoptosis

In vivo, las células EVT pasan de un estadío de diferenciación altamente proliferativo, a un fenotipo invasivo perdiendo su potencial replicativo (Paul Bischof & Irminger-Finger, 2005). Según esta perspectiva, son lógicas las acciones anti-proliferativas del TGF-β para controlar una proliferación y crecimiento excesivo del trofoblasto como ocurre en molas y otras patologías de la Enfermedad Trofoblastica Gestacional (Ngan et al., 2006), mientras que podría promover la adhesión y supervivencia, evitando la apoptosis y/o necrosis de células que se ven sometidas a retos ambientales pero que deben tener un nivel de apoptosis controlado y sobrevivir para residir en el tejido. Incluso, se ha visto que un nivel incrementado de apoptosis correlaciona con pre-eclampsia y restricción del crecimiento intrauterino, donde la deportación de restos apoptóticos expulsados de la placenta activan a las células endoteliales maternas, iniciando la disfunción endotelial característica (Graham J. Burton & Jones, 2009). No obstante, la apoptósis es un proceso normal importante en el recambio celular (cell turnover) y la homeóstasis del trofoblasto, teniendo implicaciones tanto en la fusión celular del sincitiotrofoblasto y su deportación / shedding, como en la invasión arterial y los estadíos finales de diferenciación del EVT en el lecho placental y al interior de los vasos sanguíneos, procesos que son regulados temporalmente por células deciduales y células inmunes maternas como macrófagos (Huppertz et al., 2006). En todo caso, mientras que es bien conocido el efecto anti-prolifertativo del TGF-β en el trofoblasto, aún no se han descrito efectos sobre la supervivencia celular como los que se sugieren, pudiendo estar implicada tanto una disminución en la apoptosis como un aumento de la adhesión celular. Aunque no hay estudios del efecto directo del TGF-β sobre la apoptosis del trofoblasto, en experimentos in vitro usando explantes de placenta y niveles de TGF-β similares a los encontrados en mujeres con pre-eclampsia, se encontró que este incrementa el recambio o deportación del trofoblasto o shedding, generando fragmentos con características necróticas o aponecróticas que conducen a una activación del endotelio (L. M. Chen et al., 2010). Con respecto a la adhesión celular, un estudio en una línea celular no transformada representativa de trofoblasto normal (NPC) mostró que el TGF-β promueve la adhesión intercelular, al tiempo que inhibe la invasión celular (Zhao et al., 2006). Un aumento en la adhesión, como se sugiere a partir de los datos proteómicos y el ensayo de esferoides, puede evitar anoikis, la apoptosis en respuesta a interacciones inapropiadas célula/ECM generada en células dependientes de anclaje cuando se despegan de su entorno (Gilmore, 2005), y se sabe que las células HTR-8/SVneo son dependientes de anclaje al ser incapaces de crecer en agar suave (Graham et al., 1993). Así, la influencia del microambiente como reguladora, a través de interacciónes específicas con la ECM y células vecinas vuelve a ser protagonista. En síntesis, el escenario más probable es aquel en el cual el TGF-β podría promover la supervivencia al evitar la anoikis por un aumento de la adhesión célula-célula y célula-sustrato, como se sugiere a partir de los resultados del ensayo de esferoides.

Efectos duales del TGF-β en la invasión y adhesión

Es claro que la invasión del trofoblasto es un proceso vital cuya desregulación genera diferentes patologías en el embarazo (Chakraborty et al., 2002). La posible regulación temporal y los efectos duales observados del TGF-β sobre la expresión de MMP-9 y uPA, proteasas claves en el fenotipo invasivo, son de notable interés y confieren un rol importante a estas enzimas en la invasión de células trofoblásticas, el cual está altamente regulado de una forma espacio-temporal, esperándose que la expresión y

222 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

actividad de sus efectores también. Los resultados del Capítulo 1 concuerdan con reportes previos, aparentemente contradictorios, del efecto del TGF-β en el trofoblasto, y son compatibles con el papel dual y contexto-dependiente del TGF-β en cáncer; como es el caso de la expresión de MMP-9 a partir de las 12 horas de estimulación. Sin embargo, el estudio cinético mostró una regulación temporal en la expresión de MMP-9 y uPA, con efectos no reportados del TGF-β. El suero influenció de forma notable la naturaleza del efecto del TGF-β sobre la expresión de uPA, concomitancia que no se había estudiado previamente en este modelo. En conclusión, la naturaleza y magnitud del efecto del TGF-β sobre la expresión de uPA y MMP-9, proteasas claves del proceso invasivo del trofoblasto, depende de de la presencia de suero, siendo las condiciones de cultivo y estimulación relevantes a la hora de analizar in vitro el efecto de un factor dado. Adicionalmente, el conocido efecto anti-invasivo del TGF-β podría deberse no solo a una regulación negativa de las vías que conducen a invasión, sino también a una regulación positiva de procesos antagonistas a la invasión como la adhesión celular a través de contactos célula-célula y célula-matriz, incluyendo interacción con otras vías de señalización. Como había mencionado anteriormente, un estudio previo propone que el TGF-β promueve la adhesión celular a través de un aumento en la expresión de E-caderina y β-catenina (Zhao et al., 2006). Estos resultados se suman a los hallazgos proteómicos en los que el TGF-β pareciera estabilizar los complejos focales de adhesión, al aumentar la expresión de sus miembros, promoviendo los procesos de adhesión estables, mientras que disminuye la tasa de desensamble de los filamentos de actina y con esto el reciclaje de los complejos focales, impidiendo la generación de nuevos lamelipodios necesarios durante el proceso de migración celular, invasión y metastasis (Friedl & Wolf, 2003). En síntesis, el TGF-β podría generar un aumento en la adhesión celular del trofoblasto, proceso sugerido en base a las proteínas identificadas y el resultado del ensayo de formación de esferoides, lo cual tendría implicaciones no solo al evitar la anoikis sino también al reducir la invasión celular. De esta forma el TGF-β se presenta como un importante regulador fisiológico del trofoblasto, cuyos efectos depenen de las condiciones del microambiente y que podría promover la interacción de células trofoblásticas con su entorno, a nivel de interacciones físicas y mediante comunicación intercelular, tema que se profundizara más adelante.

Regulación epigénetica y contextual de la señalización del TGF-β

Las diferentes respuestas a la señalización por TGF-β están controladas por númerosos factores de una forma dependiente al tipo celular y al contexto, incluyendo muchas parejas, cada una de las cuales es usada únicamente por un subset de genes de respuesta al TGF-β, así como distintos repertorios de compañeros transcripcionales de las SMADs, co-activadores y co-represores (Ikushima & Miyazono, 2010). Los determinantes contextuales de las acciones del TGF-β se han clasificado en: transducción de señales, como co-receptores y señales de entrada cruzadas; transcripcionales, como co-factores de unión a ADN y modificadores de cromatina; y el estatus epigenético que incluye heterocromatina, marcadores de linaje y oncogénicos (Massague, 2012). Diferentes condiciones de cultivo pueden desencadenar cambios en el estado celular interno, incluyendo los determinantes contextuales de la señalización por TGF-β, modificando la respuesta a este como se observó en el presente trabajo.

Discusión general e implicaciones biológicas 223

En cáncer de seno se ha visto que la respuesta celular al TGF-β y sus efectos contexto-específicos se encuentran modulados por el epigenoma. Según esto, los efectos opuestos del TGF-β son un resultado de la sinergia entre SMAD3 y los distintos epigenomas de células iniciadoras de cáncer de seno (BTICs), los cuales están asociados con programas de expresión génica distintos. Así, patrones específicos al tipo celular de modificaciones del ADN e histonas proporcionan un nivel modulatorio que determina la accesabilidad de genes a la regulación ejercida por TGF-β/SMAD3; por ejemplo, LBH es un gen blanco contexto-específico que es regulado de acuerdo a su estatus de metilación de ADN y es crucial para la promoción dependiente de TGF-β de BTICs (Tufegdzic Vidakovic et al., 2015). Teniendo en cuenta que en JEG-3 se encontró un alto número de proteínas vinculadas con modificación de histonas y remodelación de cromatina, es lógico pensar que tendrá unos determinantes contextuales distintos y cambiantes que pueden explicar las diferencias en la respuesta al TGF-β presentadas en comparación con HTR-8/SVneo. Por ejemplo, se encontró a la proteína del grupo de alta movilidad HMG-I / HMG-Y (HMGA1) aumentada 2,08 veces en HTR-8/SVneo, y la proteína 5 que contiene el dominio de unión a nucleosomas del grupo de alta movilidad (HMGN5) aumentada 8,03 veces en JEG-3. Mientras que la primera es un co-activador transcripcional que se une preferentemente al surco menor de las regiones ricas en A+T en ADN de doble hebra, la HMGN5 se une preferentemente a la eucromatina y modula la transcripción celular contrarrestando la condensación de la cromatina mediada por histonas.

Regulación de organelos de comunicación y señalización en la interacción célula-microambiente

En los diferentes análisis proteómicos en respuesta al TGF-β se identificaron proteínas vinculadas con procesos y estructuras como tráfico vesicular, cilios primarios, exosomas, canales gap, y otros que involucraban tubulinas y la conformación de microtubulos; previamente se resaltó la importancia de las tubulinas y los microtubulos (Janke & Chloë Bulinski, 2011), especialmente como blancos terapeúticos anti-tumorales (Kavallaris, 2010). Según estos resultados, el TGF-β podría estar controlando la expresión de proteínas envueltas en Ciliogénesis, que controlan el transporte de vesículas al cilio, así como el tráfico vesicular y secreción de EVs. El rol del cilio en este modelo es desconocido, pero puede involucrar procesos de señalización (Berbari et al., 2009), mientras que el papel de las EVs en comunicación intercelular es claro, sugieriendo en general una mayor comunicación e interacción de las células con su microambiente. En el Capítulo 3 se estudio con profundidad las EVs, incluyendo exosomas, derivadas de trofoblasto. Los exosomas derivados de tumores juegan un papel vital al interactuar con diversas células del microambiente y conferir cambios ventajosos para el tumor como activación del estroma, inducción de la angiogénesis, permeabilidad vascular aumentada y escape inmune; adicionalmente, inducen el nicho pre-metastático, y protegen a las células tumorales de los efectos citotóxicos de la quimioterapia al transferir las propiedades de quimioresistencia a células vecinas (Brinton et al., 2015). El cilio primario contribuye en parte a que las células sean capaces de interpretar señales ambientales, sean mecánicas/físicas o químicas, y factores metabólicos incluyendo

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niveles de nutrientes, oxígeno y calcio. Actualmente se sabe que el cilio primario juega un rol importante en la función de muchos órganos, siendo considerado una “antena celular sensorial” que coordina un gran número de vías de señalización celular, para lo cual se seleccionan receptores, canales y sus efectores corriente abajo que van a ser transportados al compartimento cilial o cuerpo basal, y en algunos casos el cilio acopla estas señales controlando la entrada al ciclo celular, migración y diferenciación (Ishikawa & Marshall, 2011). Esto incluye la coordinación de la señalización por receptores Tirosin quinasa (RTK), a través de la activación de PDGFRα, EGFR e IGF1R, que conduce a diversas vías de señalización vinculadas al eje cilio-centrosoma, el cual puede funcionar como un sitio importante para el entrecruzamiento o crosstalking de señales que activan blancos celulares específicos y programas transcripcionales de respuestas específicas celulares o tisulares (Christensen et al., 2012). Adicionalmente, en el alga unicelular Chlamydomonas se ha visto que el cilio podría funcionar liberando señales al medio extracelular mediante ectosomas que brotan directamente de la membrana cilial (Wood et al., 2013), funcionando no solo en la recepción sino también en la transmisión de señales. Cilios disfuncionales pueden generar un amplio espectro de Ciliopatías, en las que se incluye a la tumorogénesis; sin embargo la función del cilio en cáncer es muy compleja, presentando una dicotomía en su rol: se sabe que el desensamblaje del cilio es un prerequisito para la proliferación celular, y para algunos fenotipos tumorales se piensa que la pérdida del cilio puede ser necesaria en la progresión maligna considerando al cilio como un supresor tumoral; pero por otro lado algunos tumores dependen de la señalización del cilio y este puede orientar la migración celular. Así, dependiendo del evento oncogénico, se pueden seleccionar células con una retención o eliminación del cilio, estando dentro de las causas y consecuencias del desarrollo maligno (Basten & Giles, 2013). Esto resalta nuevamente el rol supresor tumoral del TGF-β al estimular la expresión de proteínas relacionadas con ciliogénesis en las células HTR-8/SVneo. Existen reportes en los que el cilio primario es un sitio de coordinación de la señalización por TGF-β, asociada con endocitosis dependiente de clatrina en la base del cilio, punto que permite un crosstalk entre diferentes vías de señalización (Clement et al., 2013). Sin embargo, el papel del TGF-β en la formación del BBSoma y ciliogénesis, así como el transporte de proteínas y otras moléculas a través de los cilios primarios, aún no es claro; y aún no hay estudios del cilio primario en trofoblasto o placenta, únicamente de proteínas relacionadas con este, siendo el cilio y su rol en placentación un nuevo aspecto biológico interesante que se debe considerar en estos estudios. El cilio primario en trofoblasto debería estar relacionado no solo con la comunicación intercelular, sino también con la detección de gradientes para quimiotaxis y mecanodetección. Específicamente, las células de EVT deberían ser capaces, a través de su cilio, de sensar los gradientes de nutrientes y oxígeno, así como de hormonas, factores de crecimiento y citoquinas, para orientar su migración hacia el endometrio, miometrio y al interior de las arterias espirales; incluso, detectar el flujo sanguineo y la presión que ejerce sobre los tejidos para regular su respuesta celular durante la invasión, oclusión y transformación de las arterias espirales. En los últimos años se ha propuesto que el daño mecánico ocasionado por el flujo sanguíneo debido a una deficiente remodelación de las arterias, puede contribuir en la fisiopatología de la pre-eclampsia, siendo una mala perfusión placentaria implicada como el daño inicial; esto implica que la sangre materna penetra en el espacio intervelloso placental con una mayor velocidad de lo normal, siendo suficiente para causar lagos

Discusión general e implicaciones biológicas 225

placentarios desprovistos de vellosidades que se desarrollen enfrente de las aberturas arteriales, observándose a menudo un flujo turbulento (Graham J. Burton & Jones, 2009). Es entonces lógico y de esperar que las células EVT, a través del cilio primario, detecten estos cambios en el flujo sanguíneo, adaptando su comportamiento y respondiendo a esta, permitiendo una adecuada remodelación arterial previa a la formación de los espacios lacunares. En este estudio, en las células de HTR-8/SVneo y en el cultivo primario de trofoblasto se observaron prolongaciones y protusiones, con posible formación de nanotubos a baja confluencia celular (ver Figura 2-1 y Figura 2-3) que parecen ser promovidos por el medio condicionado (observaciones personales). Los nanotubos o tunneling nanotubes - TNT son canales membranosos delgados (50-200 nm de diámetro) que median la transferencia de rango largo de organelos, proteínas de membrana, y contenido citoplasmático entre células en cultivo a través de una fusión célula-célula transitoria, que puede ser relevante para la formación de sincitio (Shinn-Thomas & Mohler, 2011). Este intercambio de moléculas y vesículas es una estrategia novedosa de comunicación intercelular, respuesta del sistema inmune y transmisión viral. En relación con lo anterior, para que se de el proceso de fusión celular es necesario una diferenciación, migración, reconocimiento y adhesión de células competentes para fusión; y requiere de proteínas involucradas en comunicación por canales gap y adhesión celular (Shinn-Thomas & Mohler, 2011). Resaltando las proteínas y los procesos biológicos sugeridos previamente.

4.4 Propuesta de proteínas claves en la malignización: chaperonas, proteínas adaptadoras y scaffolds de señalización

Como se discutió anteriormente en referencia a las interacciones modulares en las vías de señalización y la flexibilidad fenotípica que otorga, estudios bioinformáticos indican que las proteínas específicas de tejidos, especialmente las asociadas con funciones evolutivamente más próximas, tienden a tener una composición más modular que aquellas proteínas que se expresan globalmente y que tienen una función de housekeeping (Bhattacharyya et al., 2006). Esta modularidad se da por medio de dominios, motivos y adaptadores o scaffolds. Én los diferentes análisis proteómicos realizados se identificaron proteínas que se unen y modulan la acción de otras, participando en la regulación de múltiples procesos biológicos, desde activación diferencial de vías de señalización hasta la regulación de la transcripción génica dependiente del contexto. De estas, la expresión diferencial de proteínas adaptadoras y reguladoras, scaffolds y chaperonas tienen importantes implicaciones al ser nodos hub. Los scaffolds de señalización permiten diversificar las señales mientras que las chaperonas identificadas son reconocidos reguladores de oncogenes. Dentro de las chaperonas identificadas resaltan las proteínas de choque térmico Hsp; estas, especialmente Hsp27 y Hsp60, inicialmente se consideraban proteínas deja vú debido a su hallazgo recurrente en diferentes estudios proteómicos (Petrak et al., 2008). Sin embargo, han empezado a emerger como reguladores vitales de diferentes procesos y actualmente son propuestas como proteínas claves en el proceso de transformación maligna (Calderwood & Gong, 2016), como se discute a continuación.

226 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Por su parte, los scaffolds de señalización o proteínas de andamiaje son entes claves en la generación de la dinámica espacial y temporal propia de las vías de señalización y vitales para generar la especificidad de la respuesta (Kholodenko et al., 2010; A. S. Shaw & Filbert, 2009). En las últimas décadas los estudios estaban centrados en factores de transcripción, transductores de señal y receptores tirosin quinasa, considerados los protagonistas de la tumorogénesis y transformación maligna y desarrollándose múltiples terapias en torno a la inhibición de estos (Lamorte & Park, 2001). Sin embargo, los cambios en la expresión de proteínas identificados en el presente trabajo residen sobre proteínas reguladoras de los anteriores, que permiten su funcionamiento y generan la especificidad de su acción, como chaperonas y co-chaperonas, scaffolds de señalización, proteínas adaptadoras, proteínas reguladoras de transductores de señal y reguladores transcripcionales como co-activadores y co-represores. A algunas de estas proteínas se les han asignado roles de supresores tumorales y su baja expresión correlaciona con progresión maligna y agresividad. Teniendo en cuenta esto y su papel como nodos hubs y mediadores modulares y de contexto, se deben considerar a estas proteínas dentro de las claves moleculares que pueden ayudar a explicar el proceso de malignización y cáncer. Por lo anterior, en vez de los protagonistas clásicos, en este trabajo se proponen a las proteínas reguladoras como moléculas claves en la malignización, incluyendo a las chaperonas, proteínas adaptadoras y co-reguladores transcripcionales, los cuales permitirían la generación de fenotipos fisiológicos o patológicos contexto-dependientes frente a un factor dado y pueden llegar a constituir blancos terapeúticos alternativos. Dentro de las proteínas más notables encontradas en los estudios proteómicos se encuentran familias de chaperonas y proteínas scaffolds como Hsp, 14-3-3, S100, co-reguladores transcripcionales, y proteínas como GANAB, cuyo función se analizo previamente en el Capítulo 1.

4.4.1 Proteínas de choque térmico – HSP Las chaperonas pertenecientes a la familia de proteínas de choque térmico (Hsp) han emergido como blancos terapéuticos interesantes ya que se expresan a altos niveles en cáncer. Su papel primordial en cáncer es estabilizar las funciones activas de los genes sobreexpresados y mutados; así, para que la célula tumoral desarrolle muchas de sus características como aumento de la proliferación, supervivencia y metástasis, debe sobreexpresar a varias Hsps; estas además participan en la generación de la resistencia al tratamiento anti-tumoral (Calderwood & Gong, 2016). Las Hsp27, Hsp70 y Hsp90 han sido las más estudiadas, siendo propuestas como blanco terapéutico en el tratamiento del cáncer (Jego et al., 2013). La terapia combinada, empleando como blancos una combinación que incluyen chaperonas como Hsp70, Hsp90, Hs5X y NF1, Ras o tubulinas, así como estabilizadores y des-estabilizadores como KIF2C ha emergido como una estrategia prometedora; en esta aproximación terapeutica es necesario considerar el background genómico y en cual es más eficiente la combinación de blancos. Un estudio en cáncer de cabeza y cuello (HCN) resaltó a las chaperones moleculares como un conjunto común de proteínas que regulan el fenotipo de invasión de HNC y comprobó las funciones de supresión tumoral de Hsp60 o GANAB y la adquisición de funciones oncogénicas de Gp96 o Grp78 (Chiu et al., 2011).

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En células HTR-8/SVneo estimuladas con TGF-β se encontró por E2D a GANAB aumentada, junto con Grp75, Grp78, y HspA8 (Hsc70), mientras que STIP1, Hsp90 y ANP32A estaban disminuidas (Tabla 1-9); así mismo, por DIGE se vio ligeramente aumentada a HspA9, HspA1A, HspA1L, HspA6, Hsp90AA1 y AB1 y un aumento más evidente en HspA8 (Hsc70) (Tabla 2-9). En células JEG-3 estimuladas con TGF-β, se vio por DIGE un ligero aumento en HspA8 (Hsc70) y HspA9 y un mayor aumento en HspD1 (Tabla 2-10). Gracias al análisis SILAC se cuantificaron a HSP90AB, HSPA8 (Hsc70), HSPE1, HSPA1A, HSPD1 y GANAB sin variaciones significativas en su expresión entre los proteomas de JEG-3 y HTR-8/SVneo; se vio un aumento en Hsp90AA1 y HspB1 de 1,89 y 1,30 veces, respectivamente, en HTR-8/SVneo; y de Hspa5, HspA9, endoplasmina/Hsp90B1 y TRAP1 de 1,62, 1,35, 1,33 y 1,31 veces, respectivamente, en JEG-3; adicionalmente, en JEG-3 BAG2 estaba aumentada 1,96 veces y la proteína que interactua con Hsc70 STI3 estaba aumentada 1,5 veces (Capítulo 2). En las EVs derivadas de JEG-3 se identificó al factor B1 de acoplamiento al andamiaje (SAF-B), también conocido como proteína Hsp27de unión a la caja TATA y elemento de respuesta a estrógeno, o proteína de unión ERE-TATA Hsp27 y al receptor prosaposin receptor GPR37que se une a Hsp70. En las EVs derivadas de HTR-8/SVneo a la proteína de choque térmico beta-1 (HspB1), conocida también como Hsp27 y proteína regulada por estrógenos de 24 kDa, al miembro 1 y 11 de la subfamilia B homologa a DnaJ conocidos como proteína 1 de 40 kDa de HSP40 (DNAJB1) y DNAJ asociado a ER o co-chaperona Hsp40 asociada a ER (DNAJB11), la proteína 4L de choque térmico de 70 kDa (HSPA4L), el homologo de la proteína 25 de transporte intraflagelar (Hspb11).

TRAP1 / Hsp75

La proteína de choque térmico mitocondrial TRAP1, o proteína 1 asociada al receptor del factor de necrosis tumoral, es un miembro de la familia Hsp90 y un regulador importante del metabolismo de células madre de cáncer - CSC. Esta controla una variedad de funciones fisiológicas como proliferación, diferenciación y supervivencia, juega un papel anti-apoptótico y es importante en la generación del efecto Warburg al permite un switch metabólico entre la respiración mitocondrial y las glicólisis aeróbica (Im, 2016). Esta se vio ligeramente aumentada en el proteoma de células JEG-3 con respecto a HTR-8/SVneo (1,31 veces), concordando con la discusión en torno a la glicólisis y producción de lactato en células de JEG-3.

Hsp90

Hsp90 es una chaperona especial, ya que la mayoría de sus sustratos conocidos son proteínas transductoras de señal, y porque emplea una estrategia novedosa de plegamiento de proteínas que tienen múltiples estados regulatorios y requieren un switch conformacional (Young et al., 2001). Hsp90 puede incluso proteger proteínas mutadas, desestabilizadas o expresadas alternativamente o en contextos anormales, de tal forma que puede promover la actividad de ciertas oncoproteínas facilitando la supervivencia celular y la progresión tumoral (Haque et al., 2016).

228 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

La disrupción de Hsp90 afecta múltiples etapas de la cascada de señalización mitogénica, la progresión dependiente de ciclinas y la función del centrosoma e involucra la degradación de proteínas cliente como Akt y p53, conduciendo a apoptosis; es por esto que se han desarrollado numerosos inhibidores de Hsp90 que, en combinación con inhibidores de Grp75, constituyen una estrategia de bloqueo dual, siendo fármacos potenciales para la terapia tumoral (Guo et al., 2014).

Hsp70

Diferentes estudios han revelado un papel crítico de la proteína Hsp70 en la iniciación del cáncer y su progresión; aunque sus efectos en cáncer no estan relacionados con su actividad chaperona sino con su papel en la regulación de la señalización celular, siendo la co-chaperona Bag3 el principal factor que dirige la actividad en señalización del Hsp70 (Sherman & Gabai, 2015). En cuanto a la señalización por TGF-β, se ha visto que Hsp70 y Hsp90 regulan la formación de un complejo Smad3/CHIP, y que la sobre-expresión de Hsp70 o la inhibición de Hsp90 facilita la ubiquitinación y degradación inducida por CHIP de Smad3 que conduce al aumento en la señalización por el TGF-β. Cuando Hsp90 es sobre-expresado antagoniza la ubiquitinación y degradación de Smad3 mediada por CHIP y desensibiliza a las células al TGF-β. (Shang et al., 2014). Esto muestra la capacidad de regulación de la señalización del TGF-β por chaperonas.

4.4.2 Co-reguladores transcripcionales Es bien sabido que los receptores nucleares (NR), co-reguladores y factores de transcripción de unión al ADN (TFs) localizan los genes diana a ser regulados y se unen a estos en secuencias específicas o "elementos de respuesta a TF", para luego reclutar a otros co-reguladores que realizan todas las reacciones posteriores necesarias para inducir o reprimir la expresión de genes. A pesar que al principio se veía a los co-reguladores como simples adaptadores, gracias a los estudios de las últimas décadas han emergido como elementos de gran importancia que realizan prácticamente todas las reacciones necesarias para el control de la expresión génica. Cerca de 160 de los correguladores reportados se han asociado con algún estado patológico, siendo las más frecuentes una variedad de cánceres en los que se ha demostrado que los co-reguladores actúan como oncogenes o supresores de tumores, dependiendo de la señalización y del contexto celular (O’Malley, 2007). En el análisis SILAC resaltan proteínas como: la actinina alfa 1 y 4(ACTNA1 y ACTN4) aumentadas 3,85 veces en HTR-8/SVneo, las cuales pueden funcionar como un coactivador transcripcional, estimulando la transcripción mediada por los NR PPARG y RARA y la proteína del grupo de alta movilidad HMG-I / HMG-Y (HMGA1) aumentada en HTR-8/SVneo 2,08 veces, co-activador transcripcional de NR dependientes de ligando. Como coactivadores transcripcionales aumentados en JEG-3 a la proteína DJ-1 (PARK7) con múltiples funciones adicionales, la nucleofosmina y la subunidad alfa del complejo asociado a polipéptido naciente (NACA), aumentadas 1,95, 1,55 y 1,54 veces respectivamente. Como co-represores transcripcionales se identificó a a la proteína 1 soluble ácida cerebral (BASP1), a la proteína de unión al subcomponente CC1Q de la mitocondria (C1QBP) y la proteína 14-3-3 β/α (YWHAB), aumentadas 5,82, 1,62 y 1,54 veces, respectivamente en JEG-3.

Discusión general e implicaciones biológicas 229

Como se vió en el Capítulo 3, gran parte de las proteínas identificadas en EVs, relacionadas con señalización y transcripción fueron co-reguladores, identificando un total de 148 proteínas entre coactivador, corepresor, cofactor y represor transcripcional. Como se discutió en su momento, estos le permitirían a la célula diana nuevas formas de regulación transcripcional y expresión de genes, al cambiar el contexto celular en el que se encuentra.

4.4.3 Reguladores de proteínas de señalización: Familia 14-3-3 Las proteínas adaptadoras 14-3-3 tiene la habilidad de unirse a una multitud de diversas proteínas de señalización, incluidas quinasas, fosfatas y receptores transmembranales. Se han identificado más de 200 proteínas diana, muchas de las cuales están implicadas en la señalización mitogénica y supervivencia celular, el control del ciclo celular y la muerte celular apoptótica; debido a la participación de las proteínas 14-3-3 en la regulación de diversos oncogenes y genes supresores de tumores se ha propuesto que tienen un rol potencial en cáncer. La sobreexpresión de las 14-3-3 no se ha asociado todavía con patologías específicas; sin embargo, varios estudios reportan aumento de la expresión 14-3-3 en cánceres específicos; adicionalmente, parece que el microambiente tumoral también podría afectar la expresión de las 14-3-3 (Tzivion et al., 2006). Esto sugiere que las 14-3-3 podrían ser reguladores dependientes del entorno. En este trabajo, las proteínas 14-3-3 σ sigma (SFN), η eta (YWHAH), β/α beta/alfa (YWHAB), γ gama (YWHAG) y ζ / δ zeta/delta (YWHAZ) fueron aumentadas 4,42, 1,64, 1,54, 1,48 y 1,38 veces, respectivamente en el proteoma de JEG-3. Las isoformas 14-3-3 ε épsilon (YWHAEE) y θ teta (YWHAQ) permanecieron prácticamente invariantes (F.C. J3/H8 -1,08 y -1,10). Adicionalmente, las isoformas 14-3-3Z y B se encontraron de forma diferencial en spots de sub-proteomas de citoplasma y del proteoma total de células JEG-3. 14-3-3σ parece tener el patrón de expresión regulado más significativo y se considera que es una isoforma 14-3-3 no canónica (Tzivion et al., 2006). Con excepción de esta, la información disponible para las otras isoformas es escasa, especialmente la investigación en cáncer. No obatante, son múltiples las proteínas que interactúan con ellos, especialmente relacionadas con vías de señalización que se encuentran alteradas en carcinogénesis, constituyendo nodos hubs como se observó en la red de acciones STRING obtenida con CluePedia (Figura 2-23). Otras proteínas relacionadas con las 14-3-3 son las proteínas tumorales D52, cuyo miembro D53 se une a las 14-3-3 a través de un motivo codificado en un exón sometido a splicing alternativo (Boutros et al., 2003). Como se mencionó en el capítulo 2, la multifuncionalidad de estas proteínas adaptadoras puede aumentarse dramáticamente debido al splicing alternativo de exones (Boutros et al., 2004), proceso que ha sido vinculado a JEG-3 a través de las proteínas identificas de forma diferencial en estas células, como se discutió previamente. Por lo anterior, es relevante evaluar la expresión de la proteína tumoral D53, ya que, debido a las limitaciones del análisis SILAC no fue posible determinar con certeza su sobre-expresión en JEG-3.

230 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Determinantes contextuales de la señalización del TGF-β

Dentro de los pocos estudios que se han desarrollado del papel de las 14-3-3 en cáncer esta uno que las resalta como determinantes contextuales de la respuesta dual al TGF-β en cáncer de seno. Como se ha explicado anteriormente, la señalización por TGF-β /Smad exhibe un papel dual en cáncer, teniendo funciones dependientes del contexto celular. En modelos premalignos y malignos de cáncer de seno, Xu el al describieron un papel crítico de la 14-3-3ζ (Z) en modular la actividad de Smad al cambiar sus compañeros transcripcionales de p53 a Gli2, cambiando de esta forma las funciones del TGF-β durante la progresión tumoral. En células epiteliales premalignas, 14-3-3ζ desestabiliza a p53 al desregular a 14-3-3σ, suprimiendo de esta forma las funciones de supresor tumoral del TGF-β. Por otro lado, 14-3-3ζ estabiliza a Gli2 en celulas de cáncer de seno, permitiendo que interactue con las Smads para activar a PTHrP y promover la metástasis a hueso inducida por TGF-β (J. Xu et al., 2015). Ya que las 14-3-3 y particularmente las isoformas ζ y σ, pueden generar cambios contextuales en los compañeros transcripcionales de las Smads, la diferencia en la expresión de las proteínas 14-3-3, incluyendo las isoformas σ, η, β/α, γ y ζ/δ, entre células JEG-3 y HTR-8/SVneo y su regulación por el microambiente, puede explicar la dicotomía de los efectos del TGF-β observados en estos modelos y la influencia de los cambios en el medio de cultivo obtenidos a lo largo del trabajo. Como se discutió, las proteínas reguladoras y adaptadoras son moléculas claves en el proceso de malignización, y pueden ser de gran relevancia en el contexto trofoblasto / coriocarcinoma. Algunas de estas proteínas ya han sido propuestas como blancos terapéuticos y se han desarrollado diferentes fármacos contra estas; otras aún son desconocidas y deben ser estudiadas, pudiendo constituir blancos terapéuticos promisorios. La redirección de los estudios y las estrategias terapéuticas en cáncer hacia estas proteínas, especialmente los co-reguladores transcripcionales y proteínas reguladoras y adaptadoras como Hsp y 14-3-3, puede ser provechosa, teniendo en cuenta su importante rol en mediar efectos contexto-dependientes, relevantes en terapia personalizada. Este estudio contribuyó a reconocer y dar protagonismo a estos andamiajes moleculares anónimos, que permiten la orquestación de señales al actuar detrás de moléculas como transductores de señal y factores de transcripción que eran los protagonistas usuales en los estudios en cáncer. En síntesis, las células JEG-3 parecen tener ventajas intrínsecas respecto a las células HTR-8/SVneo gracias a la sobre-expresión de enzimas vinculadas a la glicólisis / gluconeogénesis, pentosas fosfato y la vía antioxidante de la tiorredoxina, de chaperonas y proteínas adaptadoras vinculadas a vías de señalización y procesos transcripcionales como las 14-3-3, y de proteínas vinculadas a remodelación de cromatina y reparación del ADN. La capacidad de supervivencia vista a través de una reprogramación metabólica, actividad antioxidante aumentada, estrategias de manejo del estrés mitótico asociado a la replicación y flexibilidad del programa transcripcional constituye una estrategia de supervivencia que puede diferenciar las células cancerosas del trofoblasto. Estas estrategias le permitirían a las células de coriocarcinoma sostener su alta tasa proliferativa y de replicación, observada en células JEG-3. La identificación de estas proteínas justifica el estudio posterior de funciones alteradas en la célula maligna y pueden convertirse en marcadores tumorales para el control y monitoreo de la enfermedad.

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones Esta tesis presenta avances tanto a nivel de la implementación de las técnicas de análisis como del estado del arte a nivel de la investigación biológica. La primera genera impactos en los trabajos actuales y futuros del grupo de investigación en hormonas y de otros grupos colaboradores. A nivel biológico, se logró una caracterización más profunda de las líneas celulares HTR-8/SVneo y JEG-3, modelos de estudio de trofoblasto y placenta empleados por diversos grupos que trabajan en el área de la reproducción. Por último, se llama la atención de la comunidad científica en cuanto a las condiciones de cultivo celular in vitro, ya que se determinó que el tipo de medio y la concentración de suero influencian en gran medida los análisis realizados, con un posible cambio en el fenotipo, lo cual puede repercutir en los resultados obtenidos en otros experimentos in vitro; esto como un aspecto a tener en cuenta en las prácticas experimentales y en relación con la reportada influencia del microambiente in vivo. Considerando la hipótesis planteada, el abordaje proteómico comparativo permitió identificar proteínas diferencialmente expresadas entre células de la línea inmortalizada de trofoblasto HTR-8/SVneo y de la línea derivada de coriocarcinoma JEG-3, vinculadas a procesos biológicos que pueden estar alterados en cáncer y promueven la supervivencia tumoral, las cuales no habían sido consideradas ni estudiadas previamente en estos dos modelos. Esto demuestra que, mas que una pérdida de regulación de la proliferación e invasión, como se esperaba, el coriocarcinoma en comparación con el trofoblasto parece estar adquiriendo capacidades de supervivencia como una estrategia de progresión tumoral. La comparación de los perfiles proteómicos de la línea celular HTR-8/SVneo como modelo de trofoblasto, y la línea JEG-3 como modelo de coriocarcinoma, permitió identificar proteínas relacionadas con capacidades y estrategias de supervivencia de células tumorales, mas allá de las habilidades compartidas reportadas entre las células trofoblásticas y los crecimientos malignos. La alta tasa de proliferación que exhibe JEG-3 se puede explicar por la sobre-expresión de proteínas asociadas a reparación de ADN y actividad antioxidante. Dentro de todas las proteínas identificadas emergen las proteínas adaptadoras 14-3-3 y las chaperonas de choque térmico Hsp, a las cuales no se les había dado tanta importancia hasta hace poco tiempo, ganando más protagonismo gracias a este estudio. El TGF-β afectó de forma diferencial el perfil proteómico de células HTR-8/SVneo y JEG-3, incluyendo el perfil proteómico de las EVs derivadas de estas células. Las proteínas identificadas diferencialmente en respuesta al TGF-β entre los dos modelos están

232 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

relacionadas con las diferencias esperadas según el fenotipo, y las funciones supresoras tumorales reportadas para el TGF-β. La influencia del microambiente en la fisiología celular fue evidente en cada capítulo, vista como las condiciones de cultivo e incluyendo la dosis de SFB y el tipo de medio de cultivo. Las condiciones de cultivo influenciaron los efectos del TGF-β sobre la proliferación de células HTR-8/SVneo y JEG-3, y sobre la expresión de las proteasas MMP-9 y uPA en células HTR-8/SVneo, resaltando los efectos contexto-dependientes del TGF-β. Se confirmó que las técnicas proteómicas son una herramienta valiosa para escrutar los aspectos moleculares que controlan la biología celular; sin embargo, las proteínas identificadas corresponden a un momento específico de la célula, y los procesos celulares que fueron inferidos de estas y están implicados en un momento dado, dependen del modelo celular y su contexto biológico.

5.2 Perspectivas y Recomendaciones Los resultados obtenidos en la presente tesis permiten proponer procesos biológicos diferenciales entre las dos líneas, y generan nuevas hipótesis de investigación con las que se pueda estudiar la regulación subyacente al trofoblasto y explicar el proceso de malignización. La identificación de estas proteínas justifica el estudio posterior de funciones alteradas en la célula maligna y pueden convertirse en marcadores tumorales para el control de la enfermedad. Se sugiere la confirmación de los hallazgos reportados en la presente tesis en células de trofoblasto primario y cultivos de células tumorales para lograr una mejor representación y significancia de cada uno de ellos. La relevancia in vivo de los procesos biológicos sugeridos, y la existencia de las redes de proteínas obtenidas deben ser verificadas mediante experimentos adicionales.

A. Anexo: Materiales y Métodos

1. Cultivo celular y tratamientos La línea celular de citotrofoblasto extravelloso (EVT) HTR8/SVneo fue desarrollada de un explante de placenta humana de primer trimestre e inmortalizada por transfección con el antígeno T grande del virus de simio 40 (Graham et al., 1993). La línea celular JEG-3 fue desarrollada a partir de coriocarcinoma placental humano, crecimiento maligno derivado de sincitiotrofoblasto (ST) (HTB-36 ATCC) (Kohler & Bridson, 1971). La línea HTR-8/SVneo fue donada por la Dra. Ángela Cadavid de la Universidad de Antioquia y por el Prof. Dr. med. Udo Markert (Placenta-Lab, Friedrich-Schiller University de Jena, Alemania). La línea JEG-3 fue adquirida de ATCC y también por donación del Prof. Markert y de la Dra. Karin Svedberg (CMB, Karolinska Institute, Estocolmo, Suecia). Las células se cultivaron a 37 ºC en atmósfera húmeda con 5% de CO2 en medio RPMI 1640 (Gibco®.) para HTR-8/SVneo y F12 (Gibco®) o DMEM alto en glucosa (Sigma Chemical Co.) para JEG-3, suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Gibco®) y 1% de PEST (100U/mL de penicilina/ estreptomicina). En general, las células fueron plaqueadas a platos de cultivo de 100 mm, incubadas en medio suplementado hasta el 70-90% de confluencia (según el tiempo del ensayo) y deprivadas de suero por 12 a 13 horas, tras lo cual se colocaron los estímulos por el tiempo señalado. Se empleó SFB al 10% como condición normal de cultivo y modelo de las condiciones fisiológicas de crecimiento. Adicionalmente se trabajaron dosis de 5, 1, 0,5 y 0,1% de SFB, en adición a la depleción de suero (0%). Según el ensayo, se estimuló durante 24 horas para los proteomas de expresión, o se extrajo sin someter a estimulación para el caso de los sub-proteomas de citoplasma (condición basal). Para la obtención de EVs, 5 millones de células fueron sembradas en platos de 100 mm, cultivadas por 5 a 7 horas para permitir adherencia, deprivadas de suero por 12 a 13 horas y lavadas 3 veces con PBS (Gibco) para eliminar posibles EVs bovinos, tras lo cual fueron cultivadas en el medio de obtención de exosomas: 10 mL de medio F12/RPMI 1:1 con SFB libre de EVs (free Exo) al 10%, durante 48 horas, tiempo en el cual se recolectó el medio condicionado y se centrifugó a 380 g por 10’ (Multifuge 1S, Heraeus) para eliminar células desprendidas y restos celulares, y se procedió a su almacenamiento temporal a -80°C. Paralelamente, las células fueron recolectadas para extracción de ARN y proteína mediante extracción con Trizol y buffer RIPA, respectivamente. Sumado a lo anterior, se empleó como estímulo TGF-β1 (hBA-112 sc-4561, grado ligando, Santa Cruz Biotechnology Inc.) en dosis de 1 ng/mL a 20 ng/mL en su respectivo medio control, de acuerdo al ensayo realizado. Las condiciones específicas se presentan en cada sección.

234 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

2. Ensayos de proliferación y viabilidad celular

a. MTT La viabilidad celular y proliferación fue determinada como actividad metabólica mediante ensayo de MTT, método colorimétrico basado en la conversión de sales de tetrazolio en cristales púrpuras de formazán, por parte de enzimas oxidoreductasas de células vivas (Supino, 1995). En general, 10.000 células / pozo fueron sembradas en una placa de 96 pozos con 200 μL de medio, se dejaron adherir por 12 horas y el cultivo se sincronizó por depleción de suero durante 13 horas, previo al tratamiento. Las células fueron cultivadas por triplicado con diferentes dosis de SFB (0, 0,1, 0,5 y 10%) concomitante con diferentes tratamientos (0.1, 1, 5, 10 ó 20 ng/ml de TGF-β1) a varios tiempos (0, 6, 24, 48 ó 72 horas) según el ensayo específico. Al cabo de cada tiempo se adicionaron 10 μL de una solución 5 mg/mL de MTT (Sigma-Aldrich Co., USA), e incubando por 4 h a 37 ºC, incluyendo un pozo con medio de cultivo libre de células que fue usado como blanco. El medio fue removido y los cristales de formazán fueron disueltos con 100 μL de DMSO (Sigma Chemical Co., USA). La placa fue agitada por tres segundos en un lector de microplaca (Microplate Reader 680, BioRad, USA) y la absorbancia fue medida en modo de lectura dual con filtro de medida a 570 nm y filtro de referencia a 630 nm. Los cambios en el número celular fueron confirmados y monitoreados por inspección cualitativa bajo microscopio de contraste de fase (Leica DMIL, USA). Análisis de datos y estadístico En general, la evaluación estadística de las diferencias en los resultados de los ensayos funcionales se analizó empleando el programa GraphPad Prisma (GraphPad Software, Inc.). Todos los datos fueron corregidos con el valor del blanco. Mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y corrección por el método Bonferroni pos-hoc (n=3, * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001) se compararon las diferencias en la actividad metabólica entre cada tratamiento y su control para cada tiempo, o entre dosis. Los datos son expresados como promedio y desviación estandar (SD) de la Absorbancia a 570 nm y como porcentaje de viabilidad:

% 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑎𝑎𝑉𝑉𝑉𝑉𝐹𝐹𝑉𝑉𝜋𝜋𝑎𝑎𝜋𝜋 = 100× 𝑇𝑇𝑇𝑇𝑛𝑛𝑇𝑇𝑛𝑛𝑇𝑇𝑇𝑇𝑛𝑛𝑛𝑛𝑇𝑇𝑇𝑇𝐶𝐶𝑇𝑇𝑛𝑛𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑙𝑙

(5-1) Para esta última, la desviación estándar fue calculada empleando la formula de propagación de error, asumiendo una covarianza cero (una falta de correlación entre los errores de los tratamientos):

𝑆𝑆𝑆𝑆% 𝑉𝑉𝑇𝑇𝑛𝑛𝑉𝑉 = % 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑎𝑎𝑉𝑉𝑉𝑉𝐹𝐹𝑉𝑉𝜋𝜋𝑎𝑎𝜋𝜋×��𝑆𝑆𝑆𝑆𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑇𝑛𝑛𝑇𝑇

�2

+ �𝑆𝑆𝑆𝑆𝐶𝐶𝑇𝑇𝑇𝑇𝐶𝐶𝐶𝐶𝑇𝑇𝑇𝑇𝑙𝑙

�22…(5-2)

b. MTS Adicional al ensayo clásico de MTT se realizó el ensayo MTS, el cual emplea un derivado de tetrazolio que genera una forma de formazán soluble en agua. 7.000 células / pozo fueron sembradas en una placa de 96 pozos con 200 μL de medio, se dejaron adherir por 4 horas y el cultivo se sincronizó por depleción de suero durante 13 horas, previo al tratamiento. Las células fueron cultivadas con 0, 0,5, 1, 5 ó 10% de SFB y evaluadas a las 24, 48 y 72 h, incluyendo un control al tiempo cero (Sección 2.1.), y estimuladas con TGF-β1 10 ng/mL en medio RPMI, F12 o RPMI: F12 1:1 suplementado con 0,5, 1, 5 ó 10% de SFB usando como control medio con SFB al 0,5, 1, 5 ó 10%, y evaluadas a las

Anexo A. Materiales y Métodos 235

48 y 72 h. Al cabo de cada tiempo, el medio fue reemplazado por medio libre de SFB y se adicionaron 20 μL de MTS (Promega), incubando por 4 h a 37 ºC, incluyendo un pozo libre de células que fue usado como blanco. Se determinó la relación espectrofotométrica a 570 nm. Los cambios en el número celular fueron confirmados y monitoreados por inspección cualitativa bajo microscopio de contraste de fase. Análisis de datos y estadístico Se realizó de forma similar al MTT. Los datos fueron normalizados al control en el tiempo cero.

c. Conteo celular El índice de viabilidad celular / proliferación obtenido mediante MTT se complementó con curvas de crecimiento celular obtenidas por conteo celular. De forma similar al MTT, 200.000 células fueron sembradas por pozo en una placa de 12 pozos, se dejaron adherir por 6 horas, el cultivo se sincronizó mediante deprivación de suero por 12 a 13 horas y se realizaron los respectivos tratamientos. Al cabo de cada tiempo, el medio condicionado fue retirado y colectado para estudios adicionales. Las células fueron lavadas con PBS, suspendidas por tripsinación y el número de células viables fue determinado mediante tinción con azul de tripán y conteo en cámara de Neubauer. Mediante un análisis gráfico de los datos, la curva de crecimiento celular fue obtenida (Butler and Spearman 2007).

3. Obtención de EV por ultracentrifugación El protocolo de “Purificación de Vesículas Extracelulares (EV)” (Aufreinigung extrazelluläre Vesikel (EV)) del Laboratorio de Placenta, Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, está basado en el protocolo de Théry (Théry et al., 2006) (ver Figura 5-1). Este fue modificado con el fin de poder implementarlo en la obtención de nanovesículas derivadas de trofoblasto, adecuadas para el análisis proteómico (ver Figura 5-2). Las ultracentrifugaciones se realizaron en una Ultracentrífuga Optima XL-100 (Beckman Coulter), perteneciente al grupo de Biología Molecular Ginecológica, dirigido por el Prof. Dürst, incluyendo los diferentes rotores y recipientes metálicos de cada rotor (Beckman Coulter) (Tabla 5-1). Se emplearon tubos portamuestras Ultra Clear Centrifuge de 5, 10 y 35 mL (Beckman Coulter) y en general se trabajó con buffer fosfato salino PBS fresco y de alta calidad (1X, pH 7,4 Gibco, Paisley, Escocia, UK). Cada paso de ultracentrifugación se realizó a 4 °C, y las muestras y tubos fueron mantenidos en hielo. La suspensión de exosomas fue filtrada a través de filtros de tamaño de poro 0,8/0,2 mm (Pall Life Sciences), antes de ser centrifugados a 100.000 g. Los pellets fueron suspendidos en PBS o lisados con buffer RIPA modificado (ver Extracto proteico de Exosomas y otras EVs). Tabla 5-1 Tipos de rotor y conversión de aceleraciones de ultracentrifugación.

Rotor Volumen Tubo 10.000 g 18.890 g 100.000 g SW 55 Ti 5 mL a 10.300 rpm 14.100 rpm 32.500 rpm SW 40 Ti 10 mL b 8.900 rpm 12.200 rpm 28.100 rpm SW 28 35 mL c 8.700 rpm 12.000 rpm 27.500 rpm

Beckman Coulter. g: aceleración de la gravedad, rpm: revoluciones por minuto.

236 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 5-1 Comparación protocolos de ultracentrifugación para la obtención de EVs.

Tomado de (Théry et al., 2006) y Arbeitsanweisung: Aufreinigung extrazelluläre Vesikel (EV)

(Pastuschek, 2014). Figura 5-2 Protocolo de ultracentrifugación implementado para la obtención de EVs.

Anexo A. Materiales y Métodos 237

4. Preparación general de extractos proteicos Las células fueron sembradas por triplicado en platos de cultivo de 100 mm y cultivadas como se describe en las condiciones de cultivo y tratamiento, tras lo cual fueron estimuladas de acuerdo al experimento (ver Tabla 5-2). Tabla 5-2 Condiciones de cultivo celular según experimento. Sección Modelo Tratamiento Control Tiempo Técnica

1.1 H Medio con SFB al 0% ó 0,5%

medio con SFB al 10% 24 h Total, Coomassie

y DIGE

1.2 H TGF-β 1 y 10 ng/mL en medio con SFB al

0,5%

medio con SFB al 0,5% (plus: medio con SFB al 10%)

24 h Total, Coomassie

2.2.1 H y J Proteoma estimulado: SFB al 10% 24 h Total, 2DE coomassie

2.2.2 H y J Expresión basal: Cultivo sincronizado por deprivación 0 h Sub-cito, 2DE

coomassie

2.2.3 H y J Expresión basal: Cultivo sincronizado por deprivación 0 h SILAC Total, nLC

2.2.4 H y J TGF-β 10 ng/mL en medio con SFB al

0,5%

medio con SFB al 0,5% 24 h Total, DIGE

3 H y J TGF-β 10 ng/mL en medio con SFB EV-

libre al 0,5% y al 10%

medio con SFB EV-libre al 0,5% y

al 10% 48 h Ultracentrifugación

de EVs / nLC

H: HTR-8/SVneo, J: JEG-3

a. Obtención de extractos proteicos

Extracto total de proteínas

Para la obtención del proteoma total, las células se lisaron con buffer RIPA (NaCl 150 mM, Tris-Cl pH 7,4 50 mM, EDTA 5 mM) con Tritón X-100 al 1% (Pierce, THERMO) y coctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Na3VO4 1 mM, PMSF 50 mM, Leupeptina 0,5 µg/mL, Pepstatina 0,5 µg/mL, Aprotinina 0,5 µg/mL ó Coctel Pierce, THERMO) (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b).

Obtención de los sub proteomas de citoplasma

Se realizó un fraccionamiento diferencial con detergentes, descrito inicialmente por Rambsy y Makowski en 1999 (Walker, 2005) y modificado por Novoa-Herrán con el que se obtuvo un extracto enriquecido en proteínas citoplasmáticas (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b). En general se utilizó buffer PIPES (sacarosa 300 mM, NaCl 100 mM, PIPES 10 mM, MgCl2.6H2O 3 mM) con coctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Na3VO4 1 mM, PMSF 50 mM, Leupeptina 0,5 µg/µL, Pepstatina 0,5 µg/µL, Aprotinina 0,5 µg/µL) y diferentes detergentes con EDTA. La fracción de citoplasma se obtuvo al permeabilizar las células con buffer PIPES / Digitonina al 0,015% (pH 6,8), incubando por 10 minutos a 4°C, tras lo cual se centrifugó a 2.000 rpm por 10 minutos. El pellet residual que contiene los fantasmas celulares intactos fue lavado 4 veces con 50 µL de buffer PIPES con coctel de inhibidores, reuniendo las 2 primeras aguas de lavado

238 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

con el extracto citoplasmático. La fracción de membrana fue solubilizada a partir del pellet con el buffer PIPES / Tritón X-100 al 0,5% (pH 7,4) e incubando por 30 minutos a 4°C, tras lo cual se centrifugó a 10.000 rpm por 10 minutos. El pellet residual que contiene las proteínas nucleares y las fibras del citoesqueleto fue lavado 2 veces con 50 µL de buffer PIPES con coctel de inhibidores. La implementación y validación del fraccionamiento celular se consigna en (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b).

Extracto proteico de Exosomas y otras EVs

Las EVs fueron lisadas empleando un buffer basado en un buffer RIPA modificado (reemplazando al Tritón X-100 por: 1% de NP-40, 0,1% de SDS y 0,5% de Na deoxicolato), con composición 5X de acuerdo a la Tabla 5-3, ideado de tal forma que al diluirse con el PBS en el cual se encuentra la muestra, de una composición final 1X de acuerdo a la Tabla 5-3. Se emplearon los cocteles de inhibidores de proteasas y fosfatasas de Serva (Serva, Heidelberg). Para la lisis se emplearon 3 ciclos de congelamiento en Nitrógeno líquido y descongelamiento, alternados por ultrasonicación por 30 segundos y vortex. Tabla 5-3 Composición buffer lisis EVs.

PBS mM NaCl 137,9 KCl 2,7

KH2PO4 1,5 Na2HPO4-7H2O 8,1

Buffer RIPA mod. 1x 5x

[final] trabajo NaCl (M) 0,15 0,15

Tris HCl pH 7.5 (M) 0,025 0,025 EDTA (M) 0,01 0,05 NP-40 (%) 1 5 SDS (%) 0,1 0,5

Na deoxycolato (%) 0,5 2,5 Inhibidor de proteasas 1X 5X

b. Desalinización y concentración por precipitación

Método Cloroformo/Metanol Cada extracto obtenido fue limpiado por precipitación con cloroformo/metanol para concentrar la muestra y eliminar las sales, y se re suspendió en buffer de muestra para isoelectroenfoque IEF (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 40 mM DTT, anfolitos 1% en gradiente No Lineal 3-10) (Westermeier et al., 2008). Este método se basa en una partición mediante la conformación de un sistema terciario Agua/Metanol:Cloroformo, en el que las proteínas permanecerán precipitadas en la interfase.

Método Ácido Tricloroacético/Acetona Alternativamente, y en el caso de volúmenes grandes se inició la concentración de la muestra precipitando con Ácido Tricloroacético/Acetona. A la muestra de proteína se agrega ácido tricloroacético frío para una concentración final de 10% v/v y se incuba por 1 hora a -20°C, tras lo cual se centrifuga a 12.000 rpm, por 15 minutos a 4°C. Se lava dos veces con acetona fría y un último lavado con Acetona:Agua 90:10. Finalmente se disuelve en buffer de solubilización.

Anexo A. Materiales y Métodos 239

c. Cuantificación de proteínas Cada extracto proteico obtenido se cuantificó por triplicado usando el kit de proteína 660 nm de Pierce (Pierce, Thermo, USA), diluyendo la muestra a una razón adecuada al rango lineal de cuantificación (ej. 20 veces) y usando como estándar proteico BSA 2,0 – 0,0625 μg/μL. Se midió la absorbancia a 660 nm y se construyó la curva de calibración. Las muestras del capítulo 3 fueron cuantificados con el kit de proteína BCA (ácido bicinconínico) de Pierce (Pierce, Thermo), de forma similar a la anterior y siguiendo las indicaciones del fabricante. Alternativamente, y para las muestras solubilizadas en buffer de IEF, se cuantificó con amidoblack por blot, diluyendo la muestra y usando como estándar proteico BSA 2,0 – 0,0625 μg/μL. Las imágenes fueron digitalizadas y analizadas mediante el software Quantity One 4.6 (Bio-Rad). La intensidad de cada spot se determinó por densitometría como IN/mm2 y se construyó la curva de calibración.

5. Separación de proteínas por electroforesis bidimensional (E2D)

a. E2D - Coomassie Cada muestra analizada se corrió en un gel individual por duplicado o triplicado, como se describe previamente (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011c). Para el isoelectroenfoque (IEF) (primera dimensión), una cantidad adecuada de proteína en buffer de muestra IEF se llevó a volumen final con buffer de rehidratación (7 M Urea, 2 M Tiourea, 2% CHAPS, 40 mM DTT, 1% anfolitos 3-10, y trazas de azul de bromofenol) (ver Tabla 5-4). Se usaron tiras secas inmovilizadas (pH NL 3-10 de Bio-Rad ó 4-7 de GE o Bio-Rad, USA) y la tira con la muestra se rehidrató de forma pasiva por 2 horas a T. ambiente, y de forma activa por 11 horas a 50 V en un focalizador Protean IEF (BioRad, USA) Bio-Rad. El programa de IEF se llevó a cabo a 20°C y empleó los siguientes gradientes de voltaje: 250 V por 30’ (rampa rápida), 1.000 V por 30’ (rampa rápida), 1.000 V por 1h (constante), 4.000 V por 45’ (rampa rápida), 4.000 V por 1h (constante) y a 8.000 V (rampa rápida) hasta un total de 55 kVh para las tiras de 18 cm, o a 4.000 V hasta 16 kVh para las tiras de 7 cm. En algunos casos, inicialmente se empleó un rango amplio de tiras (7 cm, pH NL 3-10 de Bio-Rad), y con los resultados obtenidos se escogió el rango donde la mayoría de las proteínas se focalizaban (7 cm, pH 4-7 de Bio-Rad). Las tiras fueron reducidas en buffer de equilibrio (5 mL, 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M, pH 8.8, Tris-HCl, 20% glicerol) con Ditiotreitol (DTT) 130 mM, seguido de alquilación en buffer de equilibrio con Iodoacetamida (IAA) 135 mM con agitación suave por 20’ en cada caso. La electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE, segunda dimensión) se corrió en geles al 10% o al 12% usando una cámara de electroforesis TETRA (7 cm) o DODECA (18 cm) (Bio-Rad, USA). El sistema TETRA se corrió a 80V por 15’, 100V por 1 h y finalizando a 120V. El sistema DODECA se corrió a voltaje constante de 80 V por 12 horas y luego 100 V por 5 horas. Como marcador de peso molecular se usó el estándar RPN 5800 (GE), PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder o Pierce Blue Prestained Molecular Weight Marker Mix (Thermo, USA). Los geles fueron teñidos con Coomassie Coloidal basado en el protocolo modificado de Peisker (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b; Peisker, 1988). La tinción Las proteínas en el gel fueron fijadas

240 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

con etanol al 30% y ácido fosfórico al 2%; lavadas dos veces con ácido fosfórico al 2%; sensibilizadas en ácido fosfórico al 2%, etanol al 18% y sulfato de amonio al 15%; y teñidas con Coomassie Coloidal (G-250) al 1% durante 2 días hasta alcanzar el equilibrio en la tinción. Tabla 5-4 Condiciones E2D según experimento.

Sección Tira Proteína Volumen final IEF Voltaje final IEF 1.1.2, 1.2.3 7 cm, pI 3-10 y 4-7 100 a 200 μg 16 kVh

1.1.3, 2.2.1 y 2.2.2 18 cm, pI 4-7 500 μg a 1 mg 300 μL 55 kVh 1.1.2.y 2.2.4 24 cm, pI 3-10 DIGE: 150 μg 450 + 150 μL 67 kV

El perfil proteico en los geles fue analizado mediante el programa Melanie 7.0 (Genebio Geneva Bioinformatics SA). Se identificaron los spots de proteína y se compararon los patrones de expresión en cada línea celular y entre líneas celulares, con y sin estímulo, para establecer los spots de proteína diferencialmente expresados. Se usaron marcadores o landmarks para mejorar el apareamiento de las imágenes y la comparación de los geles. Para algunos geles se empleó el programa SameSpot (Progenesis) (Sección 1.1.2, 1.2.3 y 2.2.4 VHIO, Barcelona) Alternativamente para algunos spots en los que la determinación de la intensidad óptica fue compleja debido al alto background local o spots de tamaño significativamente diferentes, se realizó una confirmación del fold o razón de cambio con el programa Quantity One (Bio-Rad); se determinó el volumen (Int x mm2) para cada spot de interés, con área personalizada de acuerdo al tamaño del spot y remoción local de background (Sección 1.2.3.).

Análisis estadístico Para los análisis proteómicos, tres experimentos biológicos independientes fueron separados en geles 2DE y analizados. Las proteínas presentes de forma diferencial en los geles con respecto al control fueron identificadas usando el test estadístico Kolmogorov-Smirnov (n=3, nivel de significancia 0,10, parámetro D>0,642), y/o test de ANOVA (n=3, p<0.05).

b. Electroforesis bidimensional en gel diferencial fluorescente (2-D DIGE)

El extracto proteico fue limpiado adicionalmente con el kit 2-D-CleanUp (GE Healthcare, USA), una modificación del método de precipitación tricloroacético/acetona, y re-disuelto en buffer de marcaje DIGE a una concentración final de 5 μg/μL aproximadamente y pH 8-9. Cada muestra fue cuantificada nuevamente con el kit Bio-Rad RCDC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Los extractos proteicos fueron marcados con N-hidroxi-succinimidil ésteres derivados de fluoróforos de cianina Cy2 o Cy3, y separados en el mismo gel usando la tecnología fluorescente 2-D DIGE, como se describió previamente (Canals et al., 2006). Cada fluoróforo fue preparado como 0.4 μL de cianina y 0.6 μL de DMF por gel a una concentración de 400 pmol/μL por cianina; 40 μg de proteína de cada muestra fue marcado con 1 μL de fluoróforo de Cy2 o Cy3 y 1 μL de Lisina, de acuerdo al siguiente esquema:

Anexo A. Materiales y Métodos 241

Tabla 5-5 Diseño experimento DIGE. Gel Cye 5 Cye 3 Cye 2 1 pool C1 C2 2 pool C3 C4 3 pool T1 T2 4 pool T3 T4

Se siguió un diseño de referencia en el que cada condición en cada gel se comparó con un estándar interno. El estándar interno se generó como un pool de las 8 muestras, empleando 5 μg de proteína de cada muestra por gel para un total de 40 μg de proteína por gel, que fue marcado con el fluoróforo de Cy5; este estándar interno permite el apareamiento de imágenes y el análisis estadístico entre geles. Adicionalmente se incluyeron 30 μg de pool invisible por gel, correspondiente a un pool de las 8 muestras sin marcaje, el cual fue incluido para ayudar en la identificación por MS.

Tabla 5-6 Muestras analizadas en el experimento DIGE.

Modelo Tratamiento Experimento

Trofoblasto inmortalizado, línea celular HTR8/SVneo

SFB 10% T1 SFB 0,5% T2

TGF-β 10 ng/mL T3 TGF-β 1 ng/mL T4

Coriocarcinoma, línea celular JEG-3

SFB 10% C1 SFB 0,5% C2

TGF-β 10 ng/mL C3 IGF-II 10 nM C4

Las muestras se analizaron por triplicado. Para la primera dimensión IEF se usaron tiras secas inmovilizadas (24 cm, pH 3–10 NL, GE Healthcare) en un sistema Ettan immobilized pH gradientphor (GE Healthcare), las cuales fueron rehidratadas de forma pasiva toda la noche con 450 μL de buffer de rehidratación (7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 1% pharmalytes pH 3–10, 100 mM DeStreak y 0.002% de azul de bromofenol). Las muestras, en un volumen de 150 μL por tira, fueron cargadas por el método de cup loading cerca al extremo ácido de la tira. El IEF fue desarrollado a 20 °C hasta alcanzar un voltaje global de 67 kV. Las tiras fueron reducidas en buffer de equilibrio con 5 mg/mL de DTT, seguido de alquilación en buffer de equilibrio con 22,5 mg/mL de IAA. Como segunda dimensión se corrió una SDS-PAGE empleando geles al 12% en el sistema Ettan DALTsix (GE Healthcare, UK), con vidrios de baja fluorescencia. Los geles fueron corridos a 20 °C a una potencia constante de 2.5 W por gel por 30 min, seguido de 17 W por gel hasta que el frente de corrido de azul de bromofenol alcanzó el fin del gel. Las imágenes fluorescentes de los geles fueron adquiridas con un escáner Typhoon 9400 (Amesham Biosciences, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), las imágenes Cy2, Cy3 y Cy5 fueron escaneadas a longitudes de excitación/emisión de 488/520, 532/580 y 633/670 nm, respectivamente, a una resolución de 100 μm. Las imágenes fueron inicialmente analizadas con el programa ImageQuant TL Toolbox Version 7.0 (GE Healthcare), el análisis diferencial DIGE y la cuantificación estadística de la abundancia relativa de proteína se hizo con el programa DeCyder V. 6.0 (GE Healthcare) y el alineamiento de las imágenes y posteriores análisis con el programa Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics, UK, V. 4.5.4325.32621). Los geles 2 y 4 fueron teñidos con Flamingo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Flamingo Fluorescent Gel Stain, Bio-Rad, USA) y los spots de proteína que presentaron diferencias significativas en su densidad óptica entre los grupos (p < 0,05) fueron picados

242 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

en estos dos geles con el equipo Ettan Spot Picker (GE Healthcare, USA) y analizados por MS MALDI-ToF. La comparación de spots de proteína fue hecha de acuerdo a las recomendaciones del fabricante del programa, usando triplicados de las imágenes y el análisis estadístico se realizó de forma similar a los análisis E2D. Las proteínas expresadas diferencialmente en los geles fueron identificadas usando el test de ANOVA (n=3, p<0.05).

6. Marcación con isótopos estables mediante aminoácidos en cultivos celulares - SILAC

Se realizó un análisis proteómico cuantitativo basado en la metodología SILAC (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture). Esta es una técnica de marcación con isótopos estables aplicada al cultivo de células, que emplea los aminoácidos L-lisina (Lys) y L-arginina (Arg) marcados, para los cuales se reemplazan 6 carbonos 12C por 13C (Ong et al., 2002). Se emplearon los medios RPMI 1640 y DMEM sin L-Glutamina y sin los aminoácidos Lisina (Lys) y Arginina (Arg) del kit Pierce SILAC (THERMO), suplementado con Lys 6 marcada (K6, C13) y Arg normal (C12) para el medio RPMI 1640 o con Lys y Arg normal (C12) para el medio DMEM. El medio se suplementó con antibióticos de manera similar a los cultivos anteriores y con SFB dializado (THERMO). Las células HTR-8/SVneo fueron cultivadas con RPMI 1640 y constituyó el cultivo pesado, paralelamente las células JEG-3 fueron cultivadas con DMEM y constituyó el cultivo liviano. El cultivo celular para el establecimiento del marcaje se realizó a lo largo de dos semanas de acuerdo al esquema de la Figura 5-3. Figura 5-3 Establecimiento del cultivo celular SILAC.

La eficiencia del marcaje isotópico se comprobó corriendo un extracto de HTR-8/SVneo pesado Lys K6 (C13) por SDS-PAGE y analizando la banda proteica más intensa por MS. Las células fueron lisadas siguiendo el protocolo de obtención de fosfoproteomas (a). Cada extracto fue cuantificado por triplicado con el kit de ensayo de proteína BCA de Thermo, empleando BSA como patrón estándar, y mezclado a una razón de 1:1 (w/w) (HTR-8/SVneo pesado : JEG-3 liviano). Una fracción del extracto fue usada para la obtención de un fosfoproteoma. La otra fracción fue precipitada y redisuelta, ajustando a una concentración de 5 μg/μL con buffer Bicarbonato de Amonio 50 mM y Urea 8 M. El extracto proteico fue cuantificado por triplicado con el kit de determinación de proteína RD DC de BioRad, empleando BSA como patrón estándar. 100 μg de proteína en buffer

Anexo A. Materiales y Métodos 243

carga con β-mercaptoetanol fueron separados en un gel SDS-PAGE al 10% y teñido con Azul de Coomassie coloidal. El carril fue cortado en 20 bandas, digeridas con tripsina y analizadas por nLC-ESI-MS/MS Q/ToF, como se detalla posteriormente.

7. Identificación de proteínas por espectrometría de masas MS

a. Procesamiento de los spots en el Laboratorio de Hormonas, Unal – Bogotá

Los spots de proteína seleccionados fueron picados y seccionados usando un bisturí limpio. Se lavaron con 400 µL de ACN 50% / NH4HCO3 25 mM en agua MiliQ por 15 minutos para eliminar el Coomassie y restos de detergente, por triplicado o hasta que los pedazos de gel fueran descoloridos. Los geles se deshidrataron con 200 µL de ACN al 100% y se secaron en Speed Vac por 15 minutos. Para la digestión tríptica se preparó una dilución de tripsina 20 ng/mL en NH4HCO3 50 mM (Seq. Grade modified, Promega, Madison WI USA). Los geles se rehidrataron con 15 µL de la solución de tripsina a 4°C por 30 minutos, tras lo cual se completo el volumen con 20 µL de NH4HCO3 50 mM y se llevo a cabo la digestión a 37°C por 18 horas. Tras esto, la solución con los péptidos se transfirió a un nuevo tubo, y los péptidos absorbidos en el gel se extrajeron por duplicado con 30 µL de ACN 50% / Ac. Fórmico 5% y ultrasonido por 15 minutos, reuniendo el extracto con el digerido inicial. El extracto con los péptidos fue concentrado en Speed Vac hasta un volumen aproximado de 10 µL. Los péptidos analizados por MS-MALDI fueron tratados por ZipTip (C18 RP, Millipore®) según indicaciones del fabricante, para eliminar las sales y otros contaminantes como detergentes y IAA. La muestra fue eluida con 3 µL de ACN 50% / TFA 0,1% y 0,5 µL de muestra se plaqueó con 0,5 µL de suspensión de matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxi-cinámico (CHCA) (Pierce®).

b. Análisis por LC-ESI-MS/MS (Instituto Karolinska – Suecia) El análisis nLC-ESI-MS/MS del capítulo 1 se realizó como servicio técnico en el Instituto Karolinska en Suecia, y con la colaboración del Dr. Leopold Ilag y Gianluca Maddalo de la Unidad de Proteómica de la Universidad de Estocolmo, Suecia. Los spots de proteína de geles 2DE que presentaron patrones diferenciales de expresión fueron digeridos y los péptidos trípticos analizados e identificados por nanocromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (nLC-ESI-MS/MS) en un instrumento híbrido Quadrupolo Tiempo de vuelo Q-ToF (Agilent Technologies) equipado con un cromatógrafo líquido serie 1200, interfase MS ESI chip cube, y un espectrómetro de masas Q-TOF 6530. El instrumento fue operado con el software de adquisición MassHunter Data Acquisitions. Todos los espectros MS/MS fueron procesados con el software de análisis Qualitative. La identificación peptídica fue llevada a cabo usando el motor de búsqueda Mascot Daemon 2.1.6 contra la base de datos humana IPI (build 3.70). Tripsina fue usada como enzima, permitiendo un rompimiento faltante. Como modificaciones fijas se empleó carbamidometilación (CAM) en cisteína, y como modificación variable a la oxidación en metionina. La tolerancia para la masa del precursor fue fijada a 50 ppm para PMF y a 0,5 Da para los fragmentos iónicos en el espectro TOF/TOF. Los criterios para una identificación positiva por Mascot fueron un

244 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

puntaje de proteína mayor que el umbral de significancia (p<0,05) para PMF, y un puntaje de iones mayor que el umbral de identidad para las coincidencias MS/MS.

c. Análisis por MALDI MS/MS (Instituto Karolinska – Suecia) Adicionalmente algunos spots del capítulo 2 fueron analizados por MALDI MS/MS ToF/ToF en el Karolinska Biomics Center (KBC) en Estocolmo, Suecia, gracias a la colaboración del Dr. Leopold Ilag y el Dr. Henrik Johansson. Los spots seleccionados fueron preparados en el Laboratorio de Hormonas en Bogotá como se indicó anteriormente, y sembrados en un inserto para MALDI de 384 pozos Opti-TOFTM. La placa de MALDI fue analizada en un instrumento 4800 MALDI TOF/TOF de Applied Biosystems, Framingham (MA, USA). Los datos fueron adquiridos en modo reflector positivo, en un rango de masas de 700-4000 m/z usando spots de calibración externa con digeridos de BSA. Los espectros de masas fueron obtenidos de cada spot usando 1.500 disparos por espectro. Los picos con una razón señal / ruido (S/N) mayor a 50 fueron seleccionados para MS/MS. Hasta 25 espectros MS/MS pudieron ser obtenidos de cada spot, comenzando con el pico menos intenso y terminando con el pico más intenso. La lista de picos fue generada como archivos mgf desde el software 4000 series explorer, usando los siguientes criterios: MS, S/N 20 y área 300, MS/MS S/N 10 y area 100. La identificación de los péptidos se realizó usando el buscador Mascot Daemon 2.1.6 contra la base de datos IPI humana (build 3.70, td_20100114). La tasa de descubrimiento falso (FDR) fue estimada al buscar los datos contra una base de datos correspondiente a las secuencias correctas y reversas; no se observaron hits con puntaje de Mascot significativo en la base de datos reversa. Los parámetros para modificaciones, especificidad de la enzima y corte fueron las mismas del análisis anterior, con tolerancia para ionrs parentales e hijos establecida en 150 ppm y 0,2 Da, respectivamente. Las proteínas fueron identificadas nuevamente a partir de los archivos .mgf o .ppw con el motor de búsqueda Mascot del programa ProteinScape (Nonlinear Dynamics), empleando la base de datos SwissProt (score >28, p<0,05) (2012_11, 538585 sequences; 191240774 residues) con Homo Sapiens en taxonomía, tripsina como enzima, tolerancia para la masa de péptidos de 0,5 Da y de fragmentos de 0,2 Da, un clivaje pérdido permitido, sin restricción en la masa de la proteína, carbamidometilación (CAM) de cisteína como modificación fija y oxidación de metionina como modificación variable, alternativamente se usó oxidación en histidina y triptofano . La tasa de falsos descubrimientos (FDR) se obtuvo buscando contra una base decodificada y sin decodificar, sin obtener ningún resultado positivo en la decodificada. Los criterios para una identificación positiva fueron un puntaje de proteína en Mascot mayor que el umbral de significancia (p<0,05) para PMF, y un puntaje de iones mayor que el umbral de identidad para las coincidencias MS/MS. Se analizó la correspondencia entre la masa teórica de la proteína y la masa del spot de proteína.

d. Análisis por MS-MALDI-ToF/ToF (Fiocruz, Brasil) El análisis por MS-MALDI ToF/ToF, se llevó a cabo en el laboratorio de la Dra. Patricia Cuervo en el Instituto Oswaldo Cruz – FIOCURZ en Rio de Janeiro, Brasil. Se siguió un procedimiento similar al anterior análisis, utilizando 3.000 pulsos de laser y 1 keV de energía de colisión. Para la identificación se usó una búsqueda de ión MS/MS con modificaciones fijas como carbamidometilación en cisteína, y modificaciones variables

Anexo A. Materiales y Métodos 245

como acetilación del N-terminal y oxidación de metionina, en adición a los parámetros previamente específicados.

e. Análisis por LC-ESI-Q/ToF, (FUNDAO, Brasil) Los spots seleccionados del sub-proteoma de citoplasma de células JEG-3 fue analizado por nHPLC-ESI-MS/MS Q/ToF en la Universidad Federal de Rio de Janeiro FUNDAO, gracias a la colaboración de la Dra. Patricia Cuervo. Los espectros se adquirieron usando un instrumento Q-TOF Ultima de Micromass, equipado con una fuente nano Z - spray operando en modo iónico positivo. Las condiciones de ionización usadas incluyeron voltaje capilar de 2,3 kV, voltaje de cono y lentes RFI de 30 V y 100V, respectivamente y energía de colosión de 10 eV. La temperatura de la fuente fue de 80ºC y el cono de gas fue establecido con N2. Se usó Argón en la celda de colisión. Las proteínas fueron identificadas a partir de los archivos ppw con el motor de búsqueda Mascot del programa ProteinScape (Nonlinear Dynamics), empleando la base de datos SwissProt (score >28) con Homo Sapiens en taxonomía, y parámetros y criterios idénticos a los utilizados con los datos de MALDI del Instituto Karolinska.

f. Análisis en el Laboratorio de Proteómica, VHIO - Barcelona Estos análisis se realizaron en el Laboratorio de Proteómica del Instituto de Oncología Vall d’Hebron VHIO, de Barcelona, España, bajo la dirección del Dr. Francesc Canals y el acompañamiento de la Dra. Marta Monge. Análisis por MALDI-MS-TOF Las proteínas de las secciones de la tesis 1.1.2., 1.2.3. y 2.2.4 fueron analizadas por espectrometría de masas con ionización/desorción laser asistida por matriz (MALDI MS). Los spots de proteína seleccionados de los geles E2D y DIGE fueron digeridos en gel siguiendo a (Canals et al., 2006), usando tripsina estabilizada contra autolisis (Promega, Madison, WI); brevemente,las muestras se digirieron con 2 μL de tripsina durante una noche a 37 °C y la reacción se detuvo por la adición de ácido fórmico al 0,5 %. El análisis de los péptidos trípticos fue desarrollado en un Instrumento Autoflex Speed MALDI TOF (Bruker, Bremen, Germany). Las muestras fueron preparadas usando 3 μL de digeridos y ácido α-ciano-4-hidroxi-cinámico como matriz en una tarjeta matrix on anchor-chip PACII (Bruker); la placa fue lavada con buffer y posteriormente analizada por MALDI TOF (Bruker) empleando de 3.000 a 4.000 disparos, deflection a 700, programa RP-800-4000-DanAPCII y calibración In (<1). La identificación de proteínas fue llevada a cabo como huella peptídica PMF y/o por espectros de fragmentación con decaimiento posterior a la fuente TOF-TOF. La búsqueda fue desarrollada usando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science, USA) de forma manual y a través del programa ProteinScape (Nonlinear Dynamics), empleando la base de datos SwissProt (score >56) con Homo Sapiens en taxonomía, tripsina como enzima y las combinaciones de parámetros tolerancia / clivajes perdidos permitidos de: 100/1, 50/1, 100/2 y 50/2; carbamidometilación (CAM) de cisteína como modificación fija y oxidación de metionina como modificación variable. Los criterios para una identificación positiva fueron un puntaje de proteína en Mascot mayor que el umbral de significancia (p<0,05) para PMF, y un puntaje de iones mayor que el umbral de identidad para las coincidencias MS/MS, y se rechazaron identificaciones con porcentaje de cubrimiento de secuencia (% Seq) menor a 20. Adicionalmente, se realizó la

246 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

búsqueda con los programas FlexAnalisis y Biotools de Progenesis para exportar los resultados. Análisis por 1D nHPLC- ESI MS/MS Q/ToF e IT TRAP

El extracto celular HTR-8/SVneo pesado / JEG-3 liviano precipitado fue posteriormente resolubilizado en buffer Urea 8 M /AMBIC 50 mM y cuantificado con el ensayo para proteínas RCDC (BioRad). El pH se ajustó entre 8,0 y 8,5, y 100 μg de proteína fueron reducidos con DTT 10 mM. (1h a temperatura ambiente) y alquilados con IAA 30 mM (30 min a temperatura ambiente, en la oscuridad), limpiados mediante precipitación con el kit Clean-Up de GE, y resolubilizados en 30 μl de buffer carga 1X sin β-mercaptoetanol. La muestra fue separada mediante SDS-PAGE en un gel al 12%, incluyendo un carril con BSA como control. El carril fue cortado en 15 fragmentos o bandas, los cuales fueron procesados y digeridos como se detalló anteriormente, empleando 80 μL c/banda, 10 μL de tripsina y 10 μL de buffer BA 25 nM. El análisis nLC ESI MS/MS se llevó a cabo en un instrumento Maxis Impact ESI Q-TOF (Bruker, Alemania) con el sistema Proxeon easy nLC (Proxeon Biosystems, USA). Las mezclas de péptidos disueltas en una solución acuosa de acetonitrilo al 5% y ácido fórmico al 0,1% se concentraron en una columna nanotrampa de 2 cm, con un ID de 100 μm (Proxeon Biosystem), después se cargó en una columna de nanoseparación Acclaim PreMap de 25 cm, con ID de 75 μm (Thermo Scientific, USA). La corrida cromatográfica se realizó usando un gradiente de separación ácido fórmico – acetonitrilo al 0,1% (de 2 a 30% en 180 min para el sobrenadante del digerido total; velocidad de flujo 300 nL/min). La columna estaba acoplada al espectrómetro de masas por medio de una fuente ESI Captive Spray (Bruker). La adquisición de MS se ajustó a ciclos de 2 Hz, seguido por un MS/MS de 2 a 20 Hz, seleccionando los 20 iones precursores más intensos con un límite de intensidad por fragmentación de 2.500 cuentas y usando una ventana exclusión de tiempo de 0,32 min. Todos los espectros fueron adquiridos en el rango de los 130 a 2.200 Da. Los datos del análisis LC- MS/MS se analizaron usando el programa Data Analysis 4.1 (Bruker). Los archivos crudos fueron procesados como un batch de las 15 bandas, con el programa Data Analysis, obteniendo los compounds para todos los fragmentos, empleando un algoritmo log mass para deconvolucionar los picos y un método descrito en (Esselens et al., 2010). Los datos con todos los compounds como fichero .xml fueron cargados en el programa ProteinScape (v. 3.1.0 348) con el que se realizó la identificación, empleando un servidor Mascot-in-house para la búsqueda en la base de datos SwissProt, taxonomía humana, modificación Lys 13C6 K6, con una tolerancia de 10 ppm para el precursor y 0,05 Da para fragmentos y especificidad de la enzima tripsina con un máximo de 2 puntos de corte perdidos. Como modificación variable se usó la marcación 13C(6)K, adicional a las modificaciones usuales. Los espectros para los péptidos livianos se definieron como 12C6(K/R) y los pesados como 12C6(R) y 13C6 (K). El límite de significancia para las identificaciones se fijó en p <0,05 y la tasa de falsos descubrimientos FDR se estimó mediante búsqueda en una base de datos decoy o aleatoria. La identificación de la proteína se realizó compilando el listado de proteína en todo el batch analizado (Protein list compilation) mediante Protein Extractor. La cuantificación se realizó sobre la lista compilada con la aplicación WARP-LC (v 1.3, Bruker Daltonik) de Compass DataAnalysis. Los péptidos marcados con isótopos estables se identificaron con un desplazamiento en la masa de +6 Da para lisina; se trabajó un flujo de trabajo LC-ESI-SILE, definiendo una masa mono-isotópica de 6,020129 para la Lisina pesada C(-6) 13C(6), calculando la razón en base a la intensidad del pico con una tolerancia en la masa de 0,05 Da y en el tiempo de retención de 70 seg.

Anexo A. Materiales y Métodos 247

para el reconocimiento del marcaje y estableciendo el estado de carga en el EIC (Extracted Ion Chromatogram) de +2 a +4. Se realizó la cuantificación relativa de la relación entre JEG-3 /HTR-8/SVneo (ligera/ pesada). Los espectros de MS y MS/MS de las proteínas relevantes se revisaron visualmente para la cuantificación de proteínas. Los resultados se normalizaron contra la mediana asumiendo que la distribución de los valores cuantificados está centrada en 1. Se seleccionaron las proteínas cuantificadas con coeficiente de variación (%CV) menor al 30%; aquellas que tenían un CV% mayor al 30% fueron revisadas individualmente y cuantificadas nuevamente en las situaciones dudosas obteniendo con el programa DataAnalisis (v. Bruker Daltonics) el EIC y los Compound Spectral de la pareja pesada / liviana, evaluando el espectro y cada clúster isotópico, asignando las parejas faltantes y recalculando la razón L/H. La razón de cambio se linealizó, al convertir los valores inferiores a 1 (x<1) en su inverso negativo (n=-1/x). Finalmente, los valores obtenidos de la cuantificación se filtraron por Excel (Microsoft), para excluir las proteínas que no cumplen con los siguientes criterios: proteínas identificadas con un score de Mascot >30, proteínas cuantificadas con por lo menos 2 péptidos y con un coeficiente de variación (CV) <30%. El límite de 30% para el CV se estableció arbitrariamente como una forma de filtrar los artefactos de cuantificación de cualquier origen. Alternativamente y para la confirmación de los espectros y marcaciones, se usó el instrumento ESI-TRAP (Bruker). Los parametros de búsqueda para la identificación fueron similares al caso anterior, con una tolerancia para precursores de 0,4 Da y para fragmentos MS/MS de 0,8 Da y #13C 1, carga 2+ y 3+, masas monoisotópicas, con peptide decoy activado, un umbral de sginificancia de 0,05, y como modificaciones variables adicionales marcación 13C(6) (K). La compilación del listado de proteína se hizó por Protein Extracto. El cut-off del score de Mascot fue 30 para proteínas y péptidos significativos.

g. Análisis eFASP nLC-ESI-MS/MS - Centro de Investigación SEPTOMIC, Jena

El análisis proteómico de las EVs (Capítulo 3) se llevó a cabo en el Centro de Investigación Septomic, Beutenberg Campus, grupo de investigación liderado por la Dra. Hortense Slevogt y adscrito al Hospital Universitario de Jena, Alemania, con la colaboración del Dr. André Schmidt del Laboratorio de Placenta en la digestión y preparación de las muestras y del Dr. Roland Lehmann del Laboratorio de Septomic en la identificación de las proteínas y el análisis estadístico de los resultados. Procesamiento de las muestras por eFASP

Las muestras fueron procesadas usando el método eFASP, siguiendo a (Erde et al., 2014). 25 µg de muestra fueron mezcladas con buffer lisis (76 mM Tris-HCl pH 7,6, 97 mM DTT, 2% SDS) para un volumen total de 100 μL. Cada muestra fue incubada a 95°C por 5 minutos, sonicada y centrifugada. Para el análisis preliminar, estos 100 μL fueron divididos en dos muestras y procesados por duplicado con eFASP. Para los análisis comparativos en respuesta al TGF-β, las muestras se digirieron y analizaron por duplicado con 3 meses de diferencia. Se usaron unidades de filtración Microcon YM-30 (Millipore). 100 µL de muestra lisada fue mezclada con 200 µL de buffer UA (Urea 8 M en Tris/HCl 0,1 M pH 8,5) en la unidad de filtración y centrifugada a 14.000, repitiendo el intercambio de buffer. Se alquiló con 100 µL de solución IAA (iodoacetamida 0,05 M en UA) mezclando durante 1 min a 600 rpm en un thermo-mixer y luego incubando por 20

248 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

min sin mezclar. Se lavó 6 veces con 100 µL de buffer UA y luego 8 veces con 100 µL de buffer ABC (NH4HCO3 0,05 M en agua). La digestión se realizó con 50 µL de mezcla ABC/ 0,2% SDC/ tripsina (razón enzima a proteína 1:50, + 2 µL de solución stock de SDC (deoxicolato de sodio) al 5% en ABC + 1 µL de Tripsina 1 µg/µL por muestra) incubando a 37°C por 16 h. Al cabo del tiempo, las unidades de filtración fueron transferidas a un tubo nuevo recolector, y los péptidos fueron recolectados por centrifugación a 14.000 x g y adición de 50 µL de ABC. Las unidades de filtración fueron removidas y 10 µL de ácido fórmico (FA) al 5% se añadió para acidificar a pH~2 (1:10 de solución stock 5%, final 0,5%). 10 v/v (800 µL) de acetato de etilo saturado en agua (con 10% de agua) fue añadido, mezclado y centrifugado a 1.000 x g por 1 min y el sobrenadante fue removido, repitiendo dos veces. Finalmente se centrifugó a velocidad máxima por 5 min. El líquido fue transferido a viales de vidrio mass spec, secado al vacio en centrifuga por 30 min, resuspendido en 20 µL de agua con 0,1% de FA mediante vortex suave, repitiendo dos veces. Análisis nLC-ESI-MS/MS

Tras la digestión, cada muestra fue analizada tres veces por nanoLC-ESI-MS/MS. Se usó el kit iRT (tiempo de retención indexado, Biognosys) para normalizar el tiempo de retención y permitir un análisis de masas resuelto en tiempo (time-resolved). 2 μg de péptidos trípticos fueron analizados por UHPLC (RSLC, Thermo Scientific) acoplado a un sistema LC-MS/MS Orbitrap Fusion (Thermo Scientific) en corridas por triplicado. Escaneos MS completos fueron adquiridos con una resolución de 120,000 FWHM en un analizador Orbitrap (rango m/z 350-1550, aislamiento cuadrupolo) durante 150 min, en gradiente no lineal de 2 a 95% de acetonitrilo / 0,1% de ácido fórmico. Los precursores MS1 fueron fragmentados mediante disociación por colisión de alta energía (HCD, 30% energía de colisión) y los espectros de fragmentos iónicos fueron adquiridos en orden de mayor a menor intensidad de precursor durante un tiempo de ciclo máximo de 4 s en la trampa de iones en modo rápido. Los siguientes parámetros fueron usados: voltaje de spray de 2.5 kV, temperatura de calentamiento capilar de 275°C, nivel S-lens RF de 60%, valor máximo AGC de 1x106 conteos de MS1 con un tiempo de acumulación iónica máxima de 50 ms y un valor AGC máximo de 1x104 conteos de MS2 con un tiempo de acumulación máximo de 35 ms. Una ventana de tiempo de exclusión dinámica de masas MS2 de 30 s fue establecida con una ventana de masas máxima de 10 ppm. Los espectros de masas fueron analizados usando el software MaxQuant (v. 1.5.5.1) con el motor de búsqueda Andromeda. La desviación de masas permitida máxima fue fijada a 5 ppm para iones precursores monoisotópicos y 0,6 Da para fragmentos MS/MS. La especificidad enzimática fue tripsina, definida como C-terminal para arginina y lisina excluyendo prolina, y un máximo de dos rompimientos perdidos fueron permitidos. Carbamidometilación en cisteina como modificación fija, deamidación de asparagina y glutamina y oxidación en metionina como modificación variable. Un algoritmo de recalibración de masas dependiente del tiempo fue usado para mejorar la exactitud de masas de iones precursores. Los espectros fueron buscados con el motor de búsqueda Andromeda contra la base de datos Uniprot bovina y humana (v. 08/2015 y 01/2016). La identificación de proteínas requirió al menos de un péptido único o razor por grupo proteico. El ID para cada proteína fue calculado y asignado usando los espectros de todos los experimentos, en función de los espectros y su carácter único. Luego, este ID es usado para calcular el score para esta proteína en el grupo específico. Todos los resultados son filtrados contra un FDR de 0.01 obtenido por búsqueda contra una base de datos decodificada o scrambled. Para cada proteína identificada se reporta la sumatoria de:

Anexo A. Materiales y Métodos 249

cubrimiento, número de proteínas, número de péptidos y péptidos únicos y número de PSMs (peptide spectrum match) de los 6 análisis realizados (2 digestiones, 3 corridas). Cuantificación y análisis estadístico

Se realizó un análisis proteómico cuantitativo libre de marcaje, en base a las intensidades de los precursores o LFQ intensity (label free quantification) para el análisis comparativo de la estimulación con TGF-β. Los datos proteómicos fueron normalizados a partir de un multiconsenso de los 24 reportes, normalización que incluye las 4 muestras, 2 procesamientos y 3 corridas nLC. La cuantificación en MaxQuant fue desarrollada usando la construcción del algoritmo de cuantificación libre de marcaje LFQ basado en XIC (extracted ion current) usando LFQ rápido. La tasa de falsos positivos requerida fue establecida a 1% a nivel de péptidos y proteína, y la longitud mínima de péptidos requerida fue de 6 aminoácidos. Contaminantes, identificaciones reversa y proteínas identificadas solo por sitio fueron excluidas de los siguientes análisis de datos. Para cada muestra tratada, las razones fueron calculadas de las intensidades LFQ de cada proteína individual y de la mediana de la intensidad LFQ correspondiente de la muestra sin tratar. Los valores perdidos fueron imputados solo para muestras sin tratar por muestreo aleatorio de una distribución normal reducida generada alrededor del límite de detección de proteínas. Las proteínas sin cuantificar después de la estimulación fueron indicadas como valores perdidos. El análisis estadístico fue hecho con el programa Perseus, calculando la razón de cambio como log2 normalizado, y usando un t-test de dos colas y p-value para indicar la probabilidad de cada razón (p< 0,050, n=2). El análisis fue complementado con procesamiento en Microsoft Excel, para obtener la razón de cambio para cada línea celular como promedio aritmético del log2 fold change de cada tanda de procesamiento.

8. Análisis bioinformático de las proteínas identificadas

Las anotaciones de Ontología Génica (GO) para procesos biológicos, funciones moleculares y vías relacionadas se obtuvieron de Nextprot (Gaudet et al., 2015; Swiss-Institute-of-Bioinformatics, 2016); http://www.nextprot.org), DAVID Functional Annotation Tool ((D. W. Huang et al., 2008) DAVID Bioinformatics Resources 6.7, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), NIH; http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) o directamente de Uniprot (UniProt Consortium, v. 2016, http://www.uniprot.org/). Un análisis de enriquecimiento en anotaciones (Functional Annotation Clustering) de las proteínas identificadas fue desarrollado usando DAVID; términos con p < 0,05 fueron seleccionados y cada clúster generado fue llamado de acuerdo al término representativo de su función molecular, proceso biológico o vía, considerando el número de genes y p-value. La relevancia biológica de las proteínas identificadas fue analizada a partir de la clasificación de genes basada en sus anotaciones funcionales usando las herramientas de DAVID (Gene Functional Classification Tool), y a partir de la generación de redes de interacción con la plataforma STRING 10 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) (Jensen et al., 2009) y Pathway Commons (Computational Biology Center at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center). Un análisis de asociaciones directas (físicas) e indirectas (funcionales) entre las proteínas identificadas fue hecho con STRING y redes con relevancia biológica fueron hechas con el programa PCViz (Cerami

250 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

et al., 2011a). Los parámetros específicos de cada análisis se detallan en la sección correspondiente. Análisis de redes comparativo

Para obtener un mayor conocimiento del significado biológico de las proteínas diferencialmente identificadas se realizó un análisis de redes usando Cytoscape v. 3.4.0 (Shannon et al., 2003) con las aplicaciones ClueGO v. 2.2.6 (Bindea et al., 2009) para analizar las anotaciones funcionales, comparar clústers de proteínas y visualizar sus diferencias funcionales, y CluePedia v. 1.2.6 (Bindea et al., 2013) para la construcción de redes de proteínas o interactómica. ClueGO permite visualizar los términos biológicos de grandes grupos de genes en redes funcionalmente agrupadas (Bindea et al., 2009). El enriquecimiento de anotaciones fue hecho mediante test estadístico hipergeométrico en el lado derecho, aplicando corrección de Bonferroni y el método step-down o “pasos hacia abajo” de Holm para ajustar los valores p. En general, los términos GO con un valor p menor a 0,05 se consideraron significativamente sobrerrepresentados y la opción GOFusion se usó para combinar términos similares, los cuales fueron agrupados usando un umbral de puntaje Kappa de 0,4 (Kappa Score Threshold). El tamaño inicial del grupo fue de un término y se combinaron los grupos que compartían más del 50% de los genes; el término líder fue el más significativo (valor p más pequeño). La comparación de las redes de cada clúster de proteínas analizado fue hecha usando la funcionalidad de ClueGO, el porcentaje de un clúster para ser diferencialmente significativo fue del 60%. Por su parte CluePedia permite comprender las vías usando datos experimentales e in silico integrados en una red de relaciones funcionales (Bindea et al., 2013). Se utilizaron las asociaciones tipo acción y co-expresión obtenidas de STRING. En algunos análisis, una visualización tipo vía fue creada usando la función layout Cerebral. Los parámetros específicos de cada red están indicados en cada sección.

9. Análisis de la expresión génica por RT-qPCR

a. Extracción de ARN Se utilizó 1 mL de TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) para cada plato de cultivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células se lisaron con el reactivo, generando una solución monofásica de Fenol-Isotiocianato de Guanidina, y extrayendo el ARN total en la fase acuosa mediante partición de fase con Cloroformo. El ARN fue precipitado con Isopropanol, lavado con Etanol al 75% en agua libre de ARNasas y se solubilizó en 20 a 30 µL de agua libre de ARNasas. La concentración, y pureza del ARN obtenido se determinó espectroscópicamente (Pharmacia Biotech Ultraspec 2000) y su integridad se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa.

b. Obtención de ADNc por Retro-Transcripción La reacción se llevó a cabo en el Termociclador Perkin Elmer PC100. Para cada reacción, 2 µg de ARN de cada muestra se mezcló con 1 µL de mezcla de dNTPs 10 nM, 1 µL de random primers 50 µM, completando a un volumen de 11 µL con agua libre de ARNasas. Esta mezcla se calentó a 65 ºC por 5 min, se enfrió y se adicionó una

Anexo A. Materiales y Métodos 251

segunda mezcla de 0,66 µL/µL de Buffer de Transcripción 5x, 0,16 µL/µL de ditiotreitol (DTT) 0,1M, y 0,16 µL/µL de SuperScript IIIRT (200 U/µL) (Invitrogen), se homogenizó y centrifugó, continuando con el siguiente programa: 25 °C por 10 minutos, 50 °C por 50 minutos, 70 °C por 15 minutos y preservación a 4 °C.

c. Evaluación de la expresión por PCR en tiempo real – genes MMP9 y uPA

El ADNc obtenido fue diluido 1:10 con agua libre de ARNasas. Adicionalmente, se preparó un pool conformado por la mezcla de 1 µL de ADNc de cada muestra, realizando diluciones seriadas (1:5, 1:25, 1:125, 1:625 y 1:3.125) y se generó la curva de calibración de los genes 18S, β-actina, PLAU y MMP9, empleando dos concentraciones intermedias y eliminando las de menor concentración para MMP9. Las reacciones de PCR en tiempo real se efectuaron en el Termociclador BioRad CFX96 (BioRad Laboratories Inc), empleando como mezcla de reacción: 1 µL de ADNc (dilución 1:10 o dilución de la curva según corresponda), 1,5 µL de Master Mix iQ™ SYBR® Green (BioRad Laboratories Inc), 0,35 µL de agua libre de ARNasas y 0,15 µL de cebadores (primers) 10 µM específicos para cada gen. Los cebadores se diseñaron en base a las entradas reportadas en Genbank y las secuencias empleadas en sentido directo (D) y reverso (R) fueron: MMP9: D: AACCAATCTCACCGACAGG, R: CGACTCTCCACGCATCTC; PLAU (uPA): D: AGCAGAGACACTAACGACTTCAG, R: CTTACTCACACTTACACTCACAGC; Hrs-18s: D: ATGTGGTGTTGAGGAAAGC, R: TACTGGCGTGGATTCTGC; Β-actina: D: GCGTGACATTAAGGAGAAG, R: GAAGGAAGGCTGGAAGAG. Se realizaron 40 ciclos de 10s a 95 oC, 20s a 56 oC y 20s a 72 oC. El umbral de fluorescencia (Ct) se calculó con el programa CFX Manager versión 1.6 (BioRad Laboratories Inc.) y se realizó una curva de fusión al finalizar el último ciclo como criterio para detectar inespecificidad y formación de dímeros. Cada determinación se realizó por triplicado, obteniendo la expresión relativa normalizada a los genes 18S y β-actina, usados como genes de referencia, de acuerdo al tratamiento de datos y propagación de error sugerido por Hellemans et. al. (Hellemans et al., 2007). Finalmente, la expresión relativa normalizada (NRQ) y la desviación estándar obtenida (SD) fue re-escalada normalizando los datos a cada control biológico y siguiendo las fórmulas de propagación de error.

d. Evaluación de la expresión por PCR en tiempo real – genes TβRII

Este análisis se realizó en el laboratorio de Placenta, de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania. Para evaluar la expresión de TβRII se usaron 3 réplicas biológicas y 2 técnicas y GAPDH como gen de referencia. Se llevó a cabo la Retrotranscripción y posterior qPCR con los kits TaqMan® Gene Expression Assay (Life Technologies) en el equipo qTower (Analytik Jena AG), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La cuantificación relativa de la expresión génica fue calculada como la razón con respecto al promedio de 2-ΔCt de HTR-8/SVneo.

252 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

e. Análisis Estadístico Para comparaciones simples entre tratamientos y controles se utilizó t-test no pareado de dos colas. Para comparaciones entre tratamientos y tiempos o dosis de estímulos se realizó ANOVA de dos vías, y test de Bonferroni para el análisis posterior (n=3, p<0.05).

f. Análisis bioinformático de la región promotora y regulación por factores de transcripción

Las secuencias 5′ que flanquean las secuencias genómicas de MMP9 y PLAU (uPA) fueron analizadas usando el programa PROSCAN v. 1.7 (Dan Prestridge, University of Minnesota; http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/) usando los parámetros default. Para la secuencia del gen MMP9 se procesaron 14.654 pares de bases y para la de PLAU 13.398 pares de bases. Los resultados predichos de la región promotora fueron complementados con un análisis transcripcional empleando las herramientas de análisis de Enrich (E. Y. Chen et al., 2013). Los factores de transcripción que se unen al promotor de los genes fueron obtenidos a partir de las bases de datos experimentales ChIP ChEA 2015 (ChIP-x Enrichment Analysis) y ENCODE TF ChIP-seq 2015 (Encyclopedia of DNA Elements). Los factores de transcripción con sitios de unión en el promotor fueron inferidos contra las bases de datos TRANSFAC y JASPAR PWMs y Genome Browser PWMs. Se realizó un consenso entre los diferentes análisis de los Factores de Transcripción que se unen al promotor de MMP9 y/o PLAU. Para determinar cuáles de estos factores hacen parte de la vía de señalización del TGF-β, se empleó Cytoscape 3.3.0 (Shannon et al., 2003) para vincular el listado de Factores de Transcripción en la red TGF beta Signaling Pathway de WikiPathways App (Kutmon et al., 2014). Se crearon redes de interacción de proteínas con PCVIz de Pathway Commons (Cerami et al., 2011b), para TGF-β con MMP9 y uPA, en conjunto y por separado, incluyendo interacciones que controlan el cambio de estado y expresión. Adicionalmente se infirieron las quinasas que pueden estar controlando los factores de transcripción que regulan la expresión de los genes, usando el programa Expression2Kinases (Edward Y. Chen et al., 2012), partiendo de factores de transcripción obtenidos con ChEA, los cuales sirvieron de base para la construcción de una red de interacción de proteínas, a partir de la cual se realiza un enriquecimiento en quinasas usando la herramienta KEA (Kinase enrichment analysis) y una base de datos de interacciones quinasa-sustrato. Se escogieron los primeros 10 factores hits, ordenados por puntaje combinado (score p-value + Rank), y “humano” como organismo background. Para la red de proteínas se trabajó con una longitud de paso (path lenght) de 2 y todas las redes PPI, excepto figeys, predicted PPI, Murphy, Stelzl y vidal. Para la selección de las quinasas se usaron interacciones quinasa-proteína e interacciones de fosforilación en la base de datos background.

10. Análisis de la expresión proteica por Western Blot

Las diferencias en la expresión de vimentina entre las muestras se evaluaron por Western Blotting. Como anticuerpo primario se empleó el anticuerpo monoclonal de conejo Anti-Vimentina humana (EPR3776, Abcam, UK) y como secundario el Anticuerpo conjugado a HRP Anti-IgG de conejo (NA 934, Amersham Biosciences, UK) a diluciones

Anexo A. Materiales y Métodos 253

1:5.000 y 1:10.000 en TBS, respectivamente. En general, 30 μg de extracto de proteína de células completas (WC), para cada tratamiento, fueron separados por SDS-PAGE y trasferidas a una membrana de nitrocelulosa por electrobloqueo húmedo (wet electroblotting), como fue descrito previamente (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2011b). Los sitios de unión no específicos fueron bloqueados con leche en polvo libre de grasa al 5% en TBS pH 7,4 por 3 h. Cada membrana fue incubada con una dilución en TBS del anticuerpo primario toda la noche a 4°C, lavada tres veces con TBS-Tween por 10 min, incubada con el anticuerpo secundario diluido en TBS por 2 h. a temperatura ambiente y lavada tres veces en TBS-Tween por 10 min. Finalmente, las señales fueron visualizadas por el sistema de quimioluminiscencia ECL (ab5801, Abcam, UK) y detección en film (CL-XPosure Film, Thermo Scientific, USA) a un tiempo de exposición que generara la mejor señal. El peso molecular proteico fue determinado usando el marcador PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, Lithuania) y asignación con el programa Quantity One 4.6. (BioRad, USA). La cuantificación densitométrica fue obtenida por triplicado usando el programa Quantity One.

11. Análisis de la expresión proteica por Dot Blot Los análisis y caracterizaciones del Capítulo 3 fueron realizadas por Dot Blot. Se emplearon los anticuerpos primarios monoclonales de ratón Anti CD-9 humano (Mouse IgG1, Cat# 21270091 ImmunoTools, Alemania) y Anti CD-63 humano (Mouse IgG1, Cat# 21270631, ImmunoTools, Alemania) en diluciones de 1:1.000 a 1:500 en TBS; como anticuerpo secundario se usó el Anticuerpo conjugado a HRP Anti-IgG de ratón (Cell Signaling) en dilución 1:10.000 en TBS. En general, 2 μL de muestra por punto fueron sembrados en una membrana de nitrocelulosa, siguiendo un arreglo basado en una placa de 96 pozos. Se siguió el protocolo de Western Blotting para el bloqueo, incubación de anticuerpos, lavados y revelado. La detección y digitalización de la quimioluminiscencia se hizo directamente con el sistema de documentación de geles MF-ChemiBis 3.2 y el programa TotallabTL100 (Biostep GmbH, Jahnsdorf, Germany), utilizando como parámetros una exposición de 5 min, ganancia de 3 a 5, resolución de 1 e Iris 0.

12. Ensayo de formación de esferoides mediante gotas colgantes

Este ensayo se desarrolló en el Laboratorio de Placenta, Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania. Se siguió el protocolo de formación de esferoides mediante gotas colgantes aplicado por Weber (Weber et al., 2013) con modificaciones de Fröhlich (Froehlich et al., 2016). 20.000 células por gota de 20 μL de medio de cultivo suplementado con SFB 10%, fueron plaqueados en la tapa de cajas de Petri en arreglos regulares (50 gotas/tapa de Petri). Se trabajó una caja de Petri por tratamiento o control, sembrando las gotas con o sin TGF-β 10 ng/mL. Para el caso de la línea JEG-3 se usó como aditivo metilcelulosa al 25%, mientras que HTR-8/SVneo se trabajó con o sin metilcelulosa al 10%. La tapa fue invertida sobre la base de un plato de Petri lleno de PBS. Las cajas de Petri con las gotas colgantes fueron cultivadas en condiciones estándar, y monitoreadas al tiempo 0, 30 min, 3h, 6h, 12h, 24h y 3 días. Los esferoides formados fueron trasladados a una placa de 96 pozos, con 200 μl de medio de cultivo suplementado con SFB 10%, con o sin TGF-β 10 ng/mL y monitoreados al tiempo 0, 30 min, 3h, 6h, 12h y 24h. 9 a 16 esferoides por tratamiento se registraron con un microscopio de campo claro y adquisición con el programa ZEN (Carl Zeiss Microscopy GmbH).

254 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

13. Análisis de rastreo de nanopartículas El tamaño y número de partículas en las preparaciones de EVs fue determinado mediante análisis de rastreo de nanopartículas (Nanoparticle tracking analysis - NTA) basado en el rastreo de su movimiento browniano. Este fue realizado en el sistema Nanosight 2.3 (NanoSight Ltd, Amesbury, UK) del Instituto Leibniz de Tecnología Fotónica (Leibniz-Institutes für Photonische Technologien - IPHT) Jena, Alemania, gracias a la colaboración del Dr. Robert Müller. El sistema está configurado con un láser de 405 nm y cámara digital de alta sensibilidad con dispositivo de carga acoplada CCD Las muestras enriquecidas en microvesículas y exosomas fueron diluidas en PBS (Gibco) en un rango de 1:5 a 1:20 para obtener de 10 a 100 partículas por imagen antes de ser analizadas. El PBS usado en las diluciones fue analizado previo a cada análisis para confirmar su pureza respecto a nanopartículas contaminantes. Las muestras fueron administradas con jeringa y se purgó el sistema con PBS entre muestras. Las condiciones de medición fueron: velocidad de disparo de la cámara fija a 29,96 ms, shutter de la cámara 1.498 y ganancia de la cámara establecida a 502 para muestras MP o 600 para muestras Exo, velocidad del cuadro 30 fps, temperatura 22 °C y viscosidad 0,953 cP. Los videos fueron procesados y analizados usando el software NTA 2.3 (build 0033), con los siguientes parámetros instrumentales: tamaño mínimo de partícula esperado, longitud de trayecto mínima y ajuste de la falta de definición establecido en automático, con extracción de background para remover el ruido, brillo 0 y ganancia 1 y umbral de detección de partículas establecido en 4. La ganancia de la cámara y el umbral de detección fueron optimizados para las muestras: para exosomas ganancia 600 y umbral fijado en 3, y para las microvesículas ganancia 502 y umbral fijado en 4, para revelar las partículas pequeñas. Para cada muestra se grabaron y analizaron cuatro videos de 60 segundos en posiciones diferentes dentro de la zona óptima de la celda, generando cuatro replicas de histogramas que fueron promediados. Los valores reportados, incluyendo media, moda y desviación estándar de la distribución de poblaciones, son expresados como promedio de los cuatro videos grabados por cada muestra analizada.

14. Obtención de cultivo primario de trofoblasto Las células de trofoblasto velloso fueron aisladas de una placenta a término sana, obtenida del Departmento de Obstetricia, Hospital Universitario de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania. Se trabajó como se describió previamente por Morales-Prieto (Morales-Prieto et al., 2012), en base al protocolo de separación por Percoll descrito por (Constantinescu et al., 2005). En resumen, la placenta fue lavada en una solución de PBS con 1% de antibióticos y un cotiledón del lado materno fue seccionado. El tejido placental fue disgregado físicamente hasta obtener 10 g y digerido enzimáticamente a 37°C en 3 ciclos de 15 minutos con 33,3 mL de solución hasta un total de 100 mL; el medio de digestión fue 100 mL de medio DMEM con Proteasa XIV (100 mg, ≥ 3,5 U/mg), Colagenasa tipo IV (100 mg, ≥125 U/mg) y Dnasa tipo IV (3.000 kU, 4.5 mg). La solución de digestión fue filtrada por un Cell Strainer de 100 μm, la reacción se paró con RPMI+10% de SFB, y se centrifugó. Los eriotrocitos fueron lisados con buffer RBC, y las células aisladas fueron separadas por un gradiente de densidad de Percoll en RPMI de 60% a 25% (Percoll, Pharmacia, Sweden), colectando y lavando la fracción correspondiente a trofoblastos. Estos fueron cultivados por 3 días, con cambio de medio cada día.

B. Anexo: Estudios, ensayos y análisis preliminares

1. Comparación de los medios de cultivo empleados

Comparación medio F-12 con respecto a RPMI 1640

En general, el medio RPMI es más nutritivo que el F-12, con una mayor concentración de aminoácidos y vitaminas (ver Tabla 5-8). Sin embargo, la mezcla nutritiva F-12 presenta un alto contenido de vitaminas como colina, pantotenato, ácido fólico y notablemente de la vitamina B12, así como suplementación con minerales como cobre, hierro y zinc. Adicionalmente, y de forma interesante, está suplementado con ácidos grasos como ácido linoléico y lipóico, metabolitos como piruvato y estimulantes como hipoxantina, putresina y timidina (ver Tabla 5-7). El ácido lipóico es un cofactor del ciclo del ácido cítrico. El piruvato se suele añadir como una fuente adicional de energía y agente protector contra peróxido de hidrogeno. La timidina es una pirimidina deoxinucleósido que funciona como intermediario en la síntesis de DNA y la hipoxantina es un sustrato y fuente de nitrógeno, además de ser un derivado metabólico de purinas. Finalmente, la putresina es una poliamina y parece ser un factor de crecimiento necesario para la división celular (C W Tabor & Tabor, 1976; Ham, 1965; G. E. Moore et al., 1967). Tabla 5-7 Comparación medio F-12 contra RPMI 1640, componentes únicos.

RPMI 1640 Ham's F-12 Nutrient Mix Aminoacids L-Hydroxyproline L-Alanine

Vitamins Para-Aminobenzoic Acid

Inorganic Salts Cupric sulfate (CuSO4-5H2O)

Ferric sulfate (FeSO4-7H2O)

Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O)

Other Components

Glutathione (reduced) Hypoxanthine

Linoleic Acid

Lipoic Acid

Putrescine 2HCl

Sodium Pyruvate

Thymidine Medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, número de catalogo 11875/21875); mezcla nutritiva Ham's

F-12 (Gibco, número de catalogo 21765).

256 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Tabla 5-8 Comparación F-12 contra RPMI, componentes compartidos. Amino Acids % Vitamins %

Glycine -25 Biotin -96 L-Arginine -13 Choline chloride 367

L-Asparagine -74 D-Calcium pantothenate 100 L-Aspartic acid -33 Folic Acid 30

L-Cystine* -4 Niacinamide -96 L-Glutamic Acid -27 Pyridoxine hydrochloride -94

L-Glutamine -51 Riboflavin -82 L-Histidine 3 Thiamine hydrochloride -70

L-Isoleucine -92 Vitamin B12 27900 L-Leucine -74 i-Inositol -49

L-Lysine HCl -9 Inorganic Salts % L-Methionine -70 Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H2O) * -29

L-Phenylalanine -67 Magnesium Sulfate (MgSO4) ~ 48 L-Proline 72 Potassium Chloride (KCl) -44 L-Serine -65 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) -41

L-Threonine -41 Sodium Chloride (NaCl) 27 L-Tryptophan -59 Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4) -82

L-Tyrosine -73 Other Components % L-Valine -42 D-Glucose (Dextrose) -10

Phenol Red -76 %: porcentaje de diferencia relativa de F-12 referente a RPMI, concentración en nM.

100× ([𝐹𝐹12] − [𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝐼𝐼]) [𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝐼𝐼]⁄ *RPMI: L-Cystine 2HCl, F-12: L-Cysteine HCl H2O; * RPMI: Ca(NO3)2.4H2O, F12: CaCl2-2H2O; ~

RPMI: MgSO4, F12: MgCl2-6H2O

Comparación medio DMEM respecto a RPMI 1640

Tabla 5-9 Comparación medio DMEM contra RPMI 1640, componentes únicos.

RPMI 1640 DMEM

Aminoacids

L-Asparagine L-Aspartic acid L-Glutamic Acid L-Hydroxyproline

L-Proline

Vitamins Biotin

Para-Aminobenzoic Acid Vitamin B12

Inorganic Salts Ferric Nitrate Other Components Glutathione (reduced) Sodium Pyruvate

Medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco, número de catalogo 11875/21875); medio DMEM, alto en glucosa con piruvato (Gibco, número de catalogo 11995).

Anexos B: Análisis preliminares 257

En general las proporciones de los nutrientes en el medio DMEM se encuentran muy por encima de los mismos en el medio RPMI (ver Tabla 5-10), además de estar suplementado con hierro. Sin embargo, RPMI presenta otros nutrientes de forma exclusiva como algunos aminoácidos y vitaminas (ver Tabla 5-9). (Dulbecco & Freeman, 1959; G. E. Moore et al., 1967). Tabla 5-10 Comparación DMEM contra RPMI, componentes compartidos.

Amino Acids % Vitamins % Glycine 200 Choline chloride 33

L-Arginine -65 D-Calcium pantothenate 1500 L-Cystine -3 Folic Acid 300

L-Glutamine 95 Niacinamide 300 L-Histidine * 107 Pyridoxine HCl 304 L-Isoleucine 110 Riboflavin 100 L-Leucine 110 Thiamine HCl 300

L-Lysine HCl 265 i-Inositol -79 L-Methionine 100 Inorganic Salts %

L-Phenylalanine 340 Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H2O) * 325 L-Serine 40 Magnesium Sulfate (MgSO4) 100

L-Threonine 375 Potassium Chloride (KCl) 0 L-Tryptophan 220 Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 85

L-Tyrosine 2Na 2H2O 259 Sodium Chloride (NaCl) 7 L-Valine 370 Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4)* -84

Other Components % Other Components % D-Glucose (Dextrose) 125 Phenol Red 200

%: porcentaje de diferencia relativa de DMEM referente a RPMI; concentración en nM. 100× ([𝑆𝑆𝑅𝑅𝐷𝐷𝑅𝑅] − [𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝐼𝐼]) [𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝐼𝐼]⁄

*RPMI: L-Histidine, DMEM: L-Histidine HCl-H2O; * RPMI: Ca(NO3)2 4H2O, F12: CaCl2; * RPMI: Na2HPO4, DMEM: NaH2PO4.H2O.

2. Niveles séricos de TGF-β1 Tabla 5-11 Niveles séricos maternos de TGF-β1.

Grupo Número de Pacientes Rango Promedio (pg/mL) P

Embarazo normal 22 25–850 721,59 <.0001

Pre eclampsia media 29 250–1100 696,55 <.0001

Pre eclampsia severa 32 25–1150 595,31 <.0001

No embarazada 20 100–650 360,0 — * en tres grupos de mujeres embarazadas y controles no embarazadas. (Ayatollahi et al., 2005). 10 ng/mL = 10.000 pg/mL. Tabla 5-12 Niveles séricos maternos de TGF-β.

Grupo TGF-β1 activo(ng/mL)

Mujeres pre eclámpticas 10,41 ± 2.07

Mujeres embarazadas normotensiva 7,01 ± 3.29 (Peraçoli et al., 2008)

258 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

3. Propuesta y evaluación de un pipeline para análisis de datos proteómicos por redes de interacción

Se propuso un pipeline para analizar los datos proteómicos, basado en análisis de redes como se ilustra en la Figura 5-4 y Figura 5-5. Este fue implementado y evaluado, como se presenta en los trabajos (S. S. Novoa-Herran & Sanchez-Gomez, 2014, 2015).

Figura 5-4 Propuesta general de pipeline para análisis de datos proteómicos

Figura 5-5 Propuesta detallada de pipeline para análisis e interpretación de datos proteómicos

Anexos B: Análisis preliminares 259

4. Criterios de análisis 2DE – MS A continuación, se presentan los criterios que se siguieron durante el análisis de imágenes y para el análisis de datos posterior a la identificación por espectrometría de masas y búsqueda en bases de datos.

a. Análisis estadístico de las imagenes Los datos se filtraron, seleccionando únicamente los spots que presentaran un resultado del test de ANOVA p<0,05. Se ordenaron por fold o razón de cambio de acuerdo a la comparación que se estuviera realizando y se agruparon de la siguiente manera: Spots únicos: observados solo en un gel; spots con aumento en su nivel proteico: >2,0; spots con aumento moderado: 1,5 a 2,0; spots con una disminución en su nivel proteico: <2,0; spots con disminución moderada: -1,5 a -2,0.

b. Depuración y reducción de listas ID MS Debido a que generalmente se identifica la misma proteína en diversos spots, o múltiples proteínas en el mismo spot, se siguieron los siguientes criterios para la reducción de las listas de identificaciones de proteínas por búsqueda en bases de datos, apoyado en las imágenes de los geles 2DE. En general se verificó el estado de carbamilación de cada proteína identificada. Para el caso de queratinas, otras proteínas de citoesqueleto u otras proteínas usualmente consideradas contaminantes o muy abundantes, se eliminaron las identificaciones sin carbamilación o contaminaciones (tripsina, queratina proveniente de piel o pelo, etc.), debido a que pueden ser contaminaciones posteriores a la alquilación de la muestra.

Presencia de la misma proteína en spots diferentes

Se ordenaron las listas por el nombre de la proteína para identificar las proteínas repetidas. Se verificó el MW y pI para cada isoforma y se comparó con el reportado por la literatura, clasificando los spots en livianos (formas proteicas clivadas), originales (con el mismo MW y pI o diferente pI) y pesados para las cuales se buscó en la literatura reportes de posibles isoformas más pesadas o productos de splicing alternativos. En general se privilegió el análisis de los spots concordantes con el peso reportado por la literatura; aun así se verificó el fold de las otras isoformas y se compararon entre sí, para comprobar que todos los spots de una misma proteína siguen la misma tendencia de cambio. En el caso de clústers, agrupaciones o “rosarios” de spots con identificaciones repetidas, se verificó el fold que presentaba con otras isoformas, y se eliminaron los spots en los extremos. Para el caso de identificación en más de un clúster proteico, se eliminaron los más livianos, privilegiando el MW original.

260 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Presencia de más de una proteína por spot

En el caso de más de una identificación proteica por spot, se definió el # de hit para cada proteína, se comparó el puntaje en la identificación de cada uno (presencia de péptidos únicos, identificación con péptidos compartidos y posible homología de las proteínas), así como la presencia de alguna de las proteínas identificadas en otros spots cercanos, se trató de dejar un único spot para el caso de proteínas identificadas en más de un spot, y se eliminó la identificación con hit más bajo o con score borderline o marginal. Adicionalmente, en el caso de que muchos hits de proteínas pasaban el umbral de detección, se seleccionaron solo aquellos hits superiores, con score o puntaje diferencial del resto del rank y que se alejaran del clúster de hits con puntaje más bajo. Se rechazan estos últimos ya que, a pesar de ser reportados como verdaderos positivos por Mascot, podrían pertenecer a la población de falsos positivos a rechazar.

5. Criterios para el análisis SILAC y verificación manual

Se hizó una revisión manual de los resultados con coeficiente de variación CV superior a 20%. Se verificó la intensidad espectral de los péptidos según la relación m/z, tiempo retención y bandas en las que fue identificado, priorizando los péptidos con mayor score y presencia del péptido pesado. Para esto se obtuvo el EIC (Extracted Ion Chromatogram) de cada precursor y se evaluó la elución cromatográfica del par pesado/liviano en búsqueda de posibles picos interferentes; en los casos en los que había duda de la correspondencia del par pesado/liviano, se verificaron y compararon los espectros de fragmentación. Finalmente, los picos de elución (en el EIC) fueron integrados en función del tiempo de retención, obteniendo la razón de intensidades espectrales para el par de péptidos L/H teniendo en cuenta el promedio de las tres primeras señales del clúster isotópico, siempre que fuera posible (no existieran picos interferentes o en fase con el clúster). Cunado había una clara diferencia en la razón de cambio entre bandas electroforéticas pero concordante al interior de cada una de ellas, se separaron los resultados de la cuantificación en bandas y se privilegiaron los resultados de las bandas acordes con el peso molecular de la proteína. La normalización se realizó en base a péptidos, previa a la cuantificación final. Para el listado final de proteínas cuantificadas se tuvieron como criterios un C.V menor al 30% y cuantificación con mínimo 2 péptidos.

6. Radio de proteínas y otras estructuras subcelulares Radios reportados de proteínas, para el cálculo estimado de número de proteínas máximas cargadas en un exosoma promedio.

• Radio de Stokes de Albumina Sérica Bovina (BSA): 3,48 nm

Anexos B: Análisis preliminares 261

Tabla 5-13 Radio mínimo estimado para proteínas de diferentes masas Proteína M (kDa) 5 10 20 50 100 200 500

Rmin (nm) 1.1 1.42 1.78 2.4 3.05 3.84 5.21 Rmin para proteínas de diferentes masas, reportado por (Erickson, 2009). Radio mímimo de una esfera suave que podría contener la masa dada de proteína. Ya que las proteínas tienen una superficie irregular, incluso las que son aproximadamente esféricas tendrán un radio promedio mayor que el mínimo. Tabla 5-14 Proteínas globulares de peso molecular y Rs conocido

Proteína RS (nm) Fuente Ribonucleasae A beef pancreas 1.64 HBC

Chymotrypsinogen A beef pancreas 2.09 HBC Ovalbumin hen egg 3.05 HBC Albumin beef serum 3.55 S-M, HBC

Aldolase rabbit muscle 4.81 HBC Catalase beef liver 5.2 S-M

Apo-ferritin horse spleen 6.1 HBC Thyroglobulin bovine 8.5 HBC Fibrinogen, human 10.7 S-M

Valores Rs reportados por Siegel–Monte (S-M) (Siegel & Monty, 1966), o en el CRC Handbook of Biochemistry (HBC)(Sober & Harts, 1966). (Erickson, 2009). El tamaño de una balsa lipídica membranal puede oscilar de 10 a 200 nm, según microscopia electrónica acoplada a técnicas de fluorescencia. El límite superior de 200 nm fue establecido para incluir el área superficial (más que simplemente el diámetro) de la caveola, la cual fue aceptada como miembro de la familia de balsas membranales (Pike, 2006).

C. Anexo: Capítulo 1

1. Evaluación y determinación de las condiciones de tratamiento con TGF-β

Mediante ensayo de MTT se evaluó la actividad metabólica y viabilidad celular. 10.000 células fueron sembradas por pozo en una placa de 96 pozos, tratadas con 10 ng/mL de TGF-β1 de forma concomitante con SFB: al 0, 0.1 y 0.5%, usando SFB al 10% como control positivo y evaluadas a las 0, 24, 40, 48 y 64 horas. Para evidenciar el comportamiento frente a cada condición de cultivo, y teniendo en cuenta que incluso el control negativo usado tradicionalmente (medio sin suero) afecta la viabilidad de forma dual, los datos se presentan normalizados con respecto a diferentes controles (ver Figura 5-6). Figura 5-6 Evaluación efecto del TGF-β sobre la viabilidad celular y dependencia con el suero.

n=3, test ANOVA de dos vías, * p<0.05. ** p<0,01, *** p<0,001 con respecto al control

En A los datos son normalizados con respecto al medio sin suero (0%) al tiempo cero (0 h), evidenciando una pérdida general de la viabilidad a las 64 horas para el número de células empleado. En B los datos para cada tiempo se normalizaron con respecto al medio sin suero (0%) de su respectivo tiempo (ej. 0.5% SFB a las 24h con 0% SFB a las 24 h; 10% SFB a las 64 h con 0% SFB a las 64 h), confirmando que la dosis de SFB 0,5% soporta la viabilidad de forma adicional y significativa comparado con dosis de 0.1 y ausencia de suero. En C se muestra el efecto del TGF-β relativo a su respectivo control en cada tiempo evaluado, observando un efecto dependiente de la dosis de suero y el tiempo en el que se evalúa y por lo tanto las condiciones de cultivo. Debido a los efectos anti-proliferativos del TGF-β sobre HTR-8/SVneo, no hay mayor depleción de nutrientes comparado con su control, en el que hay una mayor tasa de

Dosis de suero

0 24 40 48 6450

100150200250300350400450600800

SFB 0% SFB 0,1%SFB 0,5% SFB 10%

Tiempo (h)

% V

iabi

ldad

(C /

SFB

0% 0

h)

Efecto TGF-β relativo al suero

0 24 40 48 640

50

100

150

200

250

300400

600

TGF-β / 0,1%TGF-β / 0,5% SFB 10%TGF-β / 0%

% V

iabi

ldad

(T /

Ctrl

)

Dosis de suero relativo a cada t

0 24 40 48 6450

100

150

200

250400

600

SFB 0,1% SFB 0,5% SFB 10%

% V

iabi

ldad

(C /

SFB

0%)

A B C

264 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

crecimiento con depleción de nutrientes y posterior perdida de la viabilidad celular a tiempos largos (iguales o superiores a 64 h para este ensayo). Al normalizar cada tratamiento con respecto a su control hay un aumento aparente en la viabilidad que se puede interpretar como un efecto proliferativo por parte del TGF-β. No obstante, esta observación puede ser parte de un resultado complejo, en el que el TGF-β puede actuar como un agente de supervivencia, manteniendo la adherencia y el metabolismo celular.

2. Proteínas diferencialmente expresadas en respuesta a la depleción del suero

La cantidad de proteína para Vimentina, Piruvato quinasa y Enolasa 1 se mantiene invariable en los proteomas de células HTR-8/SVneo cultivadas con 0,5% de SFB, mientras que cambia en los proteomas de células cultivadas sin suero, en comparación con cultivos con SFB al 10% (condición estándar de cultivo).

Figura 5-7 Spots de PKM1/2, Enolasa y Vimentina identificados en geles DIGE. Comparación 0,5% vs 10% SFB en células de HTR-8/SVneo.

Imágenes aumentadas de los geles bidimensionales representativos mostrando algunos spots de proteína en los geles DIGE, comparando cultivos de HTR-8/SVneo con 0,5% de SFB o 10% de SFB. Las imágenes a la izquierda corresponden a SFB al 10% (T1) y a la derecha a SFB al 0,5% (T2). Se muestran cuatro spots de proteína identificados como Piruvato quinasa (PKM1/2), y spots correspondientes a Enolasa 1 (ENO1) y Vimentina (Vim), cada uno invariable.

Anexos Capítulos 265

Figura 5-8 Spots de PKM1/2, Enolasa, IMPDH2, KRT8 y Vimentina identificados en geles 2DE. Comparación 0% vs 10% SFB en células de HTR-8/SVneo

Imágenes aumentadas de los geles bidimensionales representativos mostrando algunos de los spots de proteína diferencialmente expresados entre cultivos de HTR-8/SVneo sin suero o con 10% de SFB. Las imágenes a la izquierda corresponden a SFB al10% y a la derecha sin SFB. Vimentina (Vim), Citoqueratina 8 (KRT8), Piruvato quinasa (PKM1/2), Enolasa 1 (ENO1) fueron encontradas diferencialmente expresadas.

D. Anexo: Capítulo 2

1. Adaptación del cultivo celular JEG-3 a medio RPMI 1640

Con el fin de homogenizar las condiciones de cultivo de la línea celular JEG-3 y HTR-8/SVneo en el laboratorio de Hormonas, se ensayó la adaptación de células JEG-3 de cultivo en medio DMEM alto en glucosa a RPMI 1640, el medio de cultivo tradicional de la línea HTR-8/SVneo. Las células fueron adaptadas gradualmente, siguiendo una proporción de cambio de medio DMEM:RPMI de: 1:0, 75:25, 50:50, 25:75, 20:80, 10:90, 0:1, mediante cambios de medio cada 3 días y abriendo el cultivo por tripsinación a una razón de 1:4 cuando este alcanzaba una confluencia del 90%. A lo largo de este proceso se observó un cambio en la forma de crecimiento de las células JEG-3, las cuales empezaron a crecer cada vez más agregadas. Las células JEG-3 adaptadas a RPMI 1640 presentaron una tendencia a crecer apiladas y formar montículos en vez de monocapa, y fueron más resistentes al proceso de dispersión celular por tripsinación, en comparación con el cultivo original, proceso que requirió tiempos más largos para ser efectivo; así mismo, un alto número de células permanecían redondas, aparentemente en suspensión, pero ligado a una especie de red encima de cada montículo. A pesar de lograr un cultivo en monocapa, las células tendían a permanecer agregadas, siendo evidente en la suspensión celular obtenida tras tripsinación. El cultivo celular se tiñó con eosina-hematoxilina, evidenciando una morfología y relaciones núcleo:citoplasma normales, como se aprecia en la Figura 5-9; sin embargo, las imágenes de microscopía muestran que de las células se desprenden fibras de las cuales se adhieren las células en suspensión (ver Figura 5-9 flecha roja). Este material fibrinoide, aparentemente secretado por las células, podría representar una especie de fibra proteica del tipo encontrado en las membranas basales y la matriz extracelular, que constituiría una especie de sustrato al cual se adhieren las células JEG-3, lo cual explicaría su resistencia a la tripsina, falta de dispersión y tendencia a crecer en agregados apilados. Se realizó un ensayo de MTT con estas células para determinar el efecto del TGF-β en ellas, empleando una dosis de 10 ng/mL en medio RPMI sin suero, o en medio con SFB al 0,5%, empleando medio RPMI sin suero o con SFB al 0,5% como control, respectivamente. Siguiendo un esquema similar, se evaluó el efecto de insulina 10 nM y del factor de crecimiento similar a la insulina 2 IGF-2 10 nM, debido a sus conocidos efectos en la línea JEG-3 (Diaz et al., 2007). La viabilidad celular y proliferación se evaluó a las 24, 48 y 72 horas. Sin embargo, los resultados no fueron concluyentes debido al gran error registrado producto de la dispersión celular poco homogénea.

268 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 5-9 Células JEG-3 adaptadas a cultivo en medio RPMI 1640

Fotografías representativas de las células JEG-3 adaptadas a cultivo en medio RPMI 1640

suplementado con 10% de SFB. Tinción eosina-hematoxilina.

2. Adaptación del cultivo celular HTR-8/SVneo a medio F-12

Durante la estancia de investigación en el laboratorio de Placenta, de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, se ensayó la homogenización de las condiciones de cultivo para las células HTR-8/SVneo de RPMI 1640 a la mezcla nutritiva F-12, medio de cultivo empleado en el laboratorio de Placenta para las células JEG-3. Se trabajó de forma similar al laboratorio de Hormonas, siguiendo un esquema de cambio de medio RPMI: F12 de 1:0, 75;25, 50:50, 25:75, 20:80 y 15:85, sin alcanzar nunca el reemplazo total del medio RPMI. Las células HTR-8/SVneo presentaron cambios en su morfología, con tamaños heterogéneos, una apariencia menos alargada y similar a fibroblastos, volviéndose más redondeadas tipo epitelial, una pérdida de proyecciones tipo nanotubo y de contactos célula-célula, así mismo se observó un alto número de células

Anexos Capítulos 269

desprendidas, con aparente lisis celulares, lo que indica una posible anoikis o apoptosis debida a la pérdida de adhesión. Finalmente, el bajo número de células que permanecieron adheridas a lo largo del proceso de adaptación pudieron verse sometidas a un proceso de selección celular, por lo que se descartaron estos cultivos y el enfoque empleado (ver Figura 5-10). Figura 5-10 Células HTR-8/SVneo adaptadas a cultivo en medio F-12

Fotografías representativas de las células HTR-8/SVneo en proceso de adaptación a cultivo en medio F12, suplementado con 10% de SFB. Proporción de medio RPMI 1640: F-12 de 15:85.

3. Ensayo de migración desde esferoides Se generaron esferoides de células HTR-8/SVneo con 10% de metil celulosa. Estos fueron sembrados en pozos de una placa de 96 pozos, con medio RPMI 1640 y SFB al 10% como control, o tratamiento con TGF-β1 10 ng/ml en el mismo medio. La migración y adhesión de las células desde el esferoide se monitoreo por microscopio óptico de campo claro a las 0, 4, 18, 24, 48 y 51 horas tras la siembra. Tiempos superiores a las 24 horas registraban efectos proliferativos, y por encima de las 48 horas se obtenía el efecto anti-proliferativo del TGF-β. A las 4 y 18 horas se observó más claramente el proceso de migración y adhesión de las células desde el esferoide. En

270 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

la Figura 5 11 se presentan imágenes representativas de los esferoides a las 18 horas para el tratamiento y el control.

Figura 5-11 Ensayo de migración desde esferoides de células HTR-8/SVneo

Anexos Capítulos 271

4. Confirmación del marcaje de células HTR-8/SVneo en Lisina pesada K(6)

Para el análisis proteómico cuantitativo SILAC es necesario verificar la incorporación del isótopo pesado mediante marcación con Lisina 6C13 de las células HTR-8/SVneo. Para esto, un extracto proteico de estas células fue separado mediante SDS-PAGE y una de las bandas más intensas fue seleccioanda, procesada y digerida con tripsina para ser analizada mediante nLC ESI MS/MS TRAP (Bruker). Se identificó a actina y queratinas entre otras proteínas en la banda 1D analizada, para las cuales todos los péptidos con lisina presentaban marcación con C13. En la Figura 5-12 se presenta el espectro MS del precursor de m/z 602,91 asignado a actina, en el cual se puede ver el clúster isotópico pesado y el clúster isotópico liviano, verificando el enriquecimiento en la marcación con el isótopo pesado. Figura 5-12 Espectro para el péptido de masa 1.203 de actina

Espectro MS del péptido precursor “K.DSYVGDEAQSK.R” con m/z 602.9100, asignado a actina en el rango 51-61 y con un puntaje de 72,2.

E. Anexo: Capítulo 3

1. Implementación del protocolo de obtención y purificación de EVs

Durante la implementación del protocolo se determinaron diferentes variables que fue necesario controlar.

Eliminar de EVs bovinas Para permitir una eliminación eficiente de vesículas, y debido a la viscosidad del suero, es necesario trabajarlo diluido al menos al 20% (Witwer et al., 2013). Para esto, el medio de cultivo con SFB al 20% fue ultracentrifugado a 100.000 g (27.500 rpm, rotor tipo SW 28, Beckman Coulter) por 13 horas, recolectado por pipeteo, filtrado por 0,20 μm en cabina esteril y almacenado a 4°C como stock de SFB al 20% libre de EVs (EV-libre

Comprobar la remoción de exosomas bovinos del medio de cultivo y evaluar el tipo de eliminación del sobrenadante final

La remoción de exosomas bovinos se comprobó por Dotblot, usando como marcador exosomal a CD-63. Se analizó directamente el medio de trabajo con 10% de SFB EV-libre en comparación con el medio tradicional con 10% de SFB original (control), así como el medio condicionado por células de JEG-3 tanto inicial como depletado de EVs (muestras n: normal): 1. Medio de cultivo Control: F12/RPMI con 10% SFB 2. Medio de cultivo EV-libre (EV-free): F12/RPMI con 10% SFB free EVs 3. Medio condicionado inicial: medio condicionado por JEG-3 cultivado con 10% de

SFB EV-libre 4. Medio condicionado EV-depletado: medio condicionado por JEG-3 cultivado con

10% de SFB EV-libre, depletado de EVs tras la ultracentrifugación de los exosomas.

Adicionalmente, 5 mL de cada uno de estos medios fueron precipitados con Acetona fría (ver Anexo A4b) y solubilizados en buffer RIPA para concentrar la muestra y aumentar la eventual señal (muestras p). Se comparó la cantidad de proteína presente en cada uno de estos medios, así como la presencia de exosomas bovinos, usando como marcado la tetraspanina exosomal CD-63 verificando una depleción de exosomas bovinos en el medio de trabajo (EV-libre) (Figura 5-13). A pesar de que hay un cambio en la cantidad de proteína presente en cada uno de los medios (Figura 5-13 A), el perfil proteico obtenido por SDS-PAGE es muy similar (Figura 5-13 C), siendo dominado por las proteínas bovinas (SFB control). En este perfil proteico se observa la presencia de aparentemente la misma banda de proteína, tanto en los medios analizados como en el

274 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

extracto de exosomas obtenido; esta banda presumiblemente corresponde a BSA (66,5 kDa) y revela que los exosomas obtenidos se encuentran contaminados por esta proteína bovina, que debe ser eliminada o disminuida para desplazar el rango dinámico y enriquecer la muestra en exosomas derivados de trofoblasto. El marcador exosomal CD-63 fue detectado en el medio con SFB control, pero no en el medio con SFB EV-libre, incluso tras ser precipitado con acetona fría (Figura 5-13 Ba). En cuanto al medio condicionado de células cultivadas con SFB EV-libre, a pesar que el CD-63 no es detectable inicialmente (Figura 5-13 Bb), al concentrarlo por precipitación es posible detectar al CD-63 como una señal débil (Figura Bc). Lo anterior demuestra que el SFB aportó una alta cantidad de exosomas y otras EVs, y que estos EVs proporcionan una cantidad apreciable de la proteína CD-63 detectada, adicional a la proteína sérica soluble que es evidente en todas las muestras y se encuentra contaminando al pellet de exosomas. Figura 5-13 Ensayo inicial de la implementación del protocolo.

A. Proteína presente en 5 mL de medio precipitado, cuantificada por el ensayo de BCA. B. Dotblot contra CD-63 (1:500, ImmunoTools), 2 μL de muestra por punto; a. medio con SFB control o EV-

libre, b. medio condicionado por células HTR-8/SVneo o JEG-3 con SFB control o EV-libre, c. medio condicionado por JEG-3 con SFB EV-libre, concentrado por precipitación. n: muestras

originales, p: muestras concentradas por precipitación. C. Perfil proteico por SDS-PAGE: gel al 12%, 0,8 mm de espesor, tinción con Azul de Coomassie; gel izq. 30 μg, gel der. 40 μL. MW: marcador de peso molecular PageRuler prestained protein ladder (THERMO); WC: extracto

proteico celular (whole cell); Exo: extracto de exosomas; MP: extracto de microvesículas; BfA: Buffer lisis A; BfB: Buffer lisis B.

Anexos Capítulos 275

En cuanto a la lisis de las EVs obtenidas, no se registró mayor diferencia entre el Buffer A y el Buffer B según el perfil proteico obtenido por SDS-PAGE (Figura 5-13 C). Paralelamente, se comprobó una pérdida de exosomas en el sobrenadante del pellet (medio EV-depletado) cuando este es retirado por inversión y no por pipeteo, práctica común en los procedimientos de centrifugación, a tal grado que la señal de CD-63 en el medio condicionado depletado de EVs es alta y supera la del medio inicial, al estar los exosomas concentrados en este último paso (Figura 5-13 Bc) y hay una pérdida de bandas proteicas en las EVs obtenidas comparado con el perfil proteico de las EVs obtenidas sin invertir el tubo (Figura 5-14 B). Mediante la técnica de NTA (Nanosight) no fue posible determinar la remoción de EVs bovinas debido a la presencia de otras nanopartículas que actuaban como interferentes, los cuales fueron observados mediante microscopía electrónica como agregados proteicos (ver Figura 3-7); esta interferencia puede ser debida a proteínas bovinas, resaltando la albumina, inmunoglobulina y fibrina, presentes en altas cantidades en el suero. Finalmente, el medio de obtención de exosomas fue una mezcla de F12/RPMI 1:1 con 10% de SFB libre de EVs (EV-libre).

Lavado y recolección de EVs Se establecieron tres volúmenes de PBS para resuspender la muestra y lavar el tubo durante la transferencia del pellet de un tubo a otro o recolección de la muestra, observando que incluso en el tercer volumen de PBS aún había presencia de micro y nanopartículas (dos órdenes de magnitud menor), por lo que se recomienda lavar el tubo al menos 3 veces, recolectando las aguas de lavado con el fin de realizar una mayor transferencia de EVs. En las primeras implementaciones del protocolo original se observó una alta contaminación del extracto de exosomas con bandas de proteínas encontradas en el SFB y los medios de cultivo suplementados, presumiblemente BSA (66,5 kDa) (ver Figura 3-4), por lo cual se evaluó un mayor número de pasos de lavado del pellet de exosomas, incluyendo implementar los lavados con Tween al 0,05% en PBS, lavado descontinuado en el Laboratorio de Placenta. Basados en los resultados de Nanosight y SDS-PAGE se descarta el lavado con Tween (Figura 5-14), prefiriendo un mayor número de ciclos de lavado del pellet con PBS (Figura 5-15).

Verificar la posible pérdida de muestra por adherencia al tubo y determinar el número de lavados del tubo

Se estableció un método de lavado de tres pasos, con PBS, para la transferencia del pellet de un tubo a otro o recolección final de la muestra, reuniendo las dos primeras aguas como muestra de exosomas: 1. Suspensión de exosomas en 100 μL y 2. Lavado del tubo con 100 μL, y reservando el tercer volumen de PBS (500 μL) para ser posteriormente analizado. Mediante Nanosight (NTA) se observó que en el tercer volumen aún había presencia de EVs (ver Tabla 5-15), por lo que se recomienda realizar al menos tres lavados del tubo después de la transferencia del pellet. Adicionalmente, se observó que el número de partículas medido por NTA no siempre correlaciona con la cantidad de proteína determinada por ensayo de cuantificación con BCA (resultados no mostrados).

276 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Tabla 5-15 Resultados Nanosight aguas de lavado del tubo.

Muestra Distribución del tamaño Cantidad total de partículas Promedio Modo SD

Suspensión Exosomas 152 nm 157 nm 82 nm 1,30E+09 3er lavado 139 nm 91 nm 67 nm 4,05E+07

Exosomas derivados de células HTR-8/SVneo, cultivadas con SFB EV-libre al 10%.

Determinar el número de pasos de lavado del pellet de Exo y MP

Figura 5-14 Lavado del pellet de exosomas con 0,05% Tween 20/ PBS.

A. Análisis físico de partículas NTA con Nanosight; 2 mediciones de una dilución 1:10 en PBS. B. Gel de SDS-PAGE al 10%, 60 μL del lisado de EVs fueron separados y teñidos con plata. Ctrl: lavado control con PBS, Tween: lavado con Tween 20 al 0,05% en PBS. Exo: exosomas, MP: microvesículas. MW: Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Thermo, Lituania). Como se evidenció en el perfil proteico de los exosomas obtenidos con el protocolo original (Figura 5-13 C), es necesario mejorar la limpieza del pellet de exosomas, ya sea aumentando el número de pasos de lavado con PBS, o implementar otra estrategia como el lavado con Tween 20 al 0,05% en PBS, reemplazado en el Laboratorio de Placenta por PBS. Se realizaron los pasos de lavado con Tween 0,5% en PBS buscando mejorar la limpieza de la muestra, pero basados en los resultados de NTA y SDS-PAGE, aparentemente este no reduce la contaminación por proteínas séricas (banda de BSA a 66,5 kDa) y parece lisar una sub-población de nanovesículas como sugiere un menor número de partículas detectadas por NTA (ver Figura 5-14).

Anexos Capítulos 277

Se decide implementar dos ciclos de lavado del pellet con PBS (ciclos de ultracentrifugación, eliminación del sobrenadante y repipeteo del pellet con PBS), al verificar que el segundo lavado de los exosomas presenta una cantidad mínima de proteína, y el perfil proteico de los exosomas luce mejor, con un aumento en las bandas detectadas y menor cantidad en la banda presumible como BSA (ver Figura 5-15). Figura 5-15 Lavado del pellet de exosomas con dos volumenes de PBS.

Lavado del pellet y transferencia de un tubo de 35 mL a uno de 5 mL. Volumen final de la suspensión de exosomas: 200 μL. A. Cantidad de proteína presente en cada solución de lavado del pellet con PBS, cuantificada por ensayo BCA (escala log.) B. Gel SDS-PAGE al 10%, a. 10 µg de proteína (protocolo final) y b. 60 μL del lisado de Exosomas (protocolo inicial) fueron separados y teñidos con plata. MW: Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Thermo, Lituania).

2. Evaluación de posibles efectos de la depleción de EVs bovinos del medio de cultivo

Para determinar si la depleción de EVs y exosomas bovinos afecta alguna función celular, se evaluó el comportamiento celular, incluyendo morfología celular por microscopía, proliferación mediante MTS a las 24, 48 y 72 horas, conteo celular a las 48 horas, y medición en el medio condicionado a las 48 horas de la secreción de hCG, el consumo de glucosa y la producción de lactato. Tras sembrar las células con el medio libre de EVs bovinos, se observaron células despegadas y redondas, y las células de HTR-8/SVneo lucían con una morfología alargada más pronunciada (similar a fibroblastos). Aunque inicialmente las células presentaron un cambio en su morfología, tras el proceso de adherencia esta retorna a la normalidad y no se presentan cambios significativos con respecto al cultivo con SFB normal, evaluado como actividad metabólica mediante MTS (Figura 5-16). De igual forma, a las 48 horas no se obtuvo ninguna diferencia estadística significa en el número celular, secreción de hCG al medio, el consumo de glucosa y la producción de lactato (Figura 5-17). En base a estos resultados y los análisis realizados es posible concluir que la remoción de EVs bovinos no está afectando significativamente el crecimiento de las células HTR_8/SVneo y JEG-3 estudiadas.

278 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Figura 5-16 Efecto de la remoción de EVs bovinos en la viabilidad celular.

Actividad metabólica normalizada al control al tiempo cero, evaluada por MTS. T-test comparando con control, n=3, p<0,05.

Figura 5-17 Efecto de la remoción de Evs bovinos en la función celular.

A. Consumo de glucosa y B. produccion de lactato determinado como la diferencia entre la

concentracion en la muestra y en el medio original ([Muestra] – [Ctrl]). C. Conteo celular y D. Ensayo de ELISA de la hCG secretada por células HTR-8/SVneo y JEG-3 3 tras 48 horas de

cultivo. T-test comparando con control, n=3, p<0,05.

HTR-8/SVneo

24h 48h 72h0

1

2

3

4ns

ns

ns

JEG-3

24h 48h 72h0

1

2

3

4

5ns

ns

ns

Tiempo (h)

Aciti

vad

met

aból

ica

norm

. (C

trl t

0h)

Ctrl Free-EV

Proliferación - MTS

Consumo glucosa

HTR-8/SVneo JEG-30

2

4

6

[Mue

stra

]-[M

edio

] (m

mol

/L)

Producción lactato

HTR-8/SVneo JEG-30

2

4

6

8

10

[Mue

stra

]-[M

edio

] (m

mol

/L)

Proliferación

HTR-8/SVneo JEG-32.0×105

4.0×105

6.0×105

8.0×105

1.0×106

1.2×106

Ctrl Free-EV

Con

teo

celu

lar,

48 h

Secreción hCG

HTR-8/SVneo JEG-302468

102025303540

b-hC

G (m

IU/m

L)

A. B.

C. D.

Efecto depleción EVs bovinas

Anexos Capítulos 279

3. Análisis proteómico preliminar - proteínas anotadas para placenta o trofoblasto

Anotaciones obtenidas de DAVID y Uniprot. Resaltado gris: proteínas reportadas en estudios de exosomas (Mathivanan 2010). Resaltado verde: proteínas con expresión exclusiva o elevada en placenta o trofoblasto. Tabla 5-16 Proteínas identificadas con expresión reportada en placenta o trofoblasto

Protein names Gene name

Alpha-2-macroglobulin (Alpha-2-M) A2M Alpha-2-macroglobulin-like protein 1 A2ML1 Alanine--tRNA ligase, cytoplasmic AARS

ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABCG2 Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 4 ACSL4

Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin) ACTB Actin-like protein 6A 53 kDa BRG1-asociated factor A ACTL6A

Alpha-actinin-4 ACTN4 AF4/FMR2 family member 2 AFF2

Adenosylhomocysteinase AHCY Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK AHNAK

Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase ALDH7A1

Alkaline phosphatase, placental type PLAP Alkaline phosphatase, placental-like ALPPL

Annexin A1 (Calpactin-2) ANXA1 Annexin A2 ANXA2 Annexin A5 ANXA5

Adipocyte plasma membrane-associated protein APMAP Apolipoprotein D APOD

ADP-ribosylation factor 4 ARF4 AT-rich interactive domain-containing protein 3A ARID3A Actin-related protein 2/3 complex subunit 4 ARPC4

Bifunctional purine biosynthesis protein PURH ATIC Sodium/potassium-transporting ATPase

subunit alpha-1 ATP1A1

Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 ATP1B3

Beta-1,4-galactosyltransferase 1 B4GALT1 BAG family molecular chaperone regulator 3 BAG3 Brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated

protein 2 BAIAP2 Barrier-to-autointegration factor BANF1 Tyrosine-protein kinase BAZ1B BAZ1B Mitotic checkpoint protein BUB3 BUB3

Calmodulin (CaM) CALM1 Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1 CAND1

Calpain-1 catalytic subunit CAPN1 Calpain-6 CAPN6

F-actin-capping protein subunit alpha-1 CAPZA1 Catalase CAT

CD276 antigen (4Ig-B7-H3) CD276 Cell division control protein 42 homolog CDC42 Cadherin-1 (CAM 120/80) (E-cadherin) CDH1

Cyclin-dependent kinase 2 CDK2 CCAAT/enhancer-binding protein beta CEBPB

Major centromere autoantigen B CENPB Charged multivesicular body protein 1b CHMP1B

Cytoskeleton-associated protein 4 CKAP4 Claudin-6 (Skullin) CLDN6

Chloride intracellular channel protein 1 CLIC1 Chloride intracellular channel protein 3 CLIC3

Protein names Gene name

N-acylneuraminate cytidylyltransferase CMAS Collagen alpha-1(XXI) chain COL21A1 Collagen alpha-2(IV) chain COL4A2 Collagen alpha-1(V) chain COL5A1 Collagen alpha-3(VI) chain COL6A3 Collagen alpha-3(IX) chain COL9A3

Carboxypeptidase Z CPZ Protein CREG1 CREG1

Exportin-2 CSE1L Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

receptor subunit alpha CSF2RA Casein kinase I isoform alpha CSNK1A1

Cystatin-C (Cystatin-3) CST3 Cystatin-B (CPI-B) CSTB

C-terminal-binding protein 2 (CtBP2) CTBP2 Catenin delta-1 CTNND1

Lysosomal protective protein CTSA Cathepsin B CTSB

Disabled homolog 2 DAB2 Dystroglycan DAG1

Dermcidin (Preproteolysin) DCD DEP domain-containing protein 1A DEPDC1

ATP-dependent RNA helicase A (RHA) DHX9 Disco-interacting protein 2 homolog B DIP2B

DIRC2 protein DIRC2 Protein dispatched homolog 1 DISP1

Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase

complex, mitochondrial (E2K) DLST

DnaJ homolog subfamily A member 2 DNAJA2 Dynamin-1-like protein DNM1L

DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 DNMT1 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B DNMT3B

Dipeptidyl peptidase 4 (ADABP) DPP4 Cytoplasmic dynein 1 heavy chain 1 DYNC1H1 Elongation factor 1-alpha 1 (EF-Tu) EEF1A1

Elongation factor 2 (EF-2) EEF2 Epidermal growth factor receptor EGFR

Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B EIF3B Eukaryotic translation initiation factor 6 EIF6

Endoglin (CD antigen CD105) ENG Alpha-enolase ENO1

Bifunctional glutamate/proline--tRNA ligase EPRS Suppressyn ERVH48

Endogenous retrovirus group V member 1 Env polyprotein ERVV-1

Endogenous retrovirus group V member 2 Env polyprotein ERVV-2

Niban-like protein 1 (Meg-3) FAM129B Fibulin-1 (FIBL-1) FBLN1 Fibulin-2 (FIBL-2) FBLN2

Fermitin family homolog 2 (Kindlin-2) FERMT2

280 Malignización analizada mediante proteómica comparativa en trofoblasto

Protein names Gene name

Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP12 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP4 FKBP4

Filaggrin FLG Filaggrin-2 (FLG-2) FLG2

Filamin-B (FLN-B) (ABP-278) FLNB Folate receptor alpha (FR-alpha) FOLR1

Forkhead box protein F1 FOXF1 Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 G3BP1

Lysosomal alpha-glucosidase GAA Cyclin-G-associated kinase GAK

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 1 GAR1

Trans-acting T-cell-specific transcription factorGATA3 GATA3 Glucosylceramidase GBA

Chorion-specific transcription factor GCMa GCM1 Growth/differentiation factor 15 GDF15

Rab GDP dissociation inhibitor beta GDI2 Glycerophosphodiester phosphodiesterase domain-

containing protein 3 GDPD3 Ganglioside GM2 activator (SAP-3) GM2A

GMP synthase GMPS Bifunctional UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase GNE

Growth factor receptor-bound protein 2 GRB2 GREB1-like protein GREB1L

General transcription factor 3C polypeptide 4 GTF3C4 Histone H1.0 H1F0

Core histone macro-H2A.1 H2AFY Hypermethylated in cancer 2 protein HIC2

Histone H4 HIST1H4 Hexokinase-1 HK1

HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G HLA-G High mobility group protein HMG-I/HMG-Y HMGA1

Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 HNRNPC Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like HNRNPDL

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F HNRNPF Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U HNRNPU

Heat shock cognate 71 kDa protein HSPA8 Hypoxia up-regulated protein 1 HYOU1

ICOS ligand (B7 homolog 2) ICOSLG Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding

protein 1 IGF2BP1

Ig gamma-1 chain C region IGHG1 Immunoglobulin superfamily member 3 IGSF3 Immunoglobulin superfamily member 8 IGSF8

Integrin-linked protein kinase ILK Importin-9 (Imp9) (RanBP9) IPO9

Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 IQGAP1 E3 ubiquitin-protein ligase Itchy homolog ITCH

Integrin alpha-5 ITGA5 Integrin alpha-6 ITGA6 Integrin beta-1 ITGB1 Integrin beta-4 ITGB4

Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H5 ITIH5 Junctional adhesion molecule C JAM3

Junction plakoglobin (Catenin gamma) JUP KH domain-containing, RNA-binding, signal

transduction-associated protein 1 KHDRBS1

Keratin, type I cytoskeletal 19 KRT19 Keratin, type II cytoskeletal 7 KRT7 Keratin, type II cytoskeletal 8 KRT8

Serine beta-lactamase-like protein LACTB, mitochondrial LACTB

Laminin subunit alpha-1 LAMA1 Laminin subunit alpha-5 LAMA5

Protein names Gene name

Laminin subunit beta-2 LAMB2 Laminin subunit gamma-1 LAMC1

Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 LAMP1 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 LAMP2

Leucine--tRNA ligase, cytoplasmic LARS Ribosomal biogenesis protein LAS1L LAS1L

Plastin-2 LCP1 Galectin-related protein LGALSL Protein lin-28 homolog B LIN28B

Probable lysosomal cobalamin transporter LMBRD1 Ligand-dependent nuclear receptor-interacting

factor 1 LRIF1

Low-density lipoprotein receptor-related protein 2 LRP2

Leucine-rich repeat-containing protein 1 LRRC1 Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor LSR

Lactotransferrin LTF Tyrosine-protein kinase Lyn LYN

Malate dehydrogenase, cytoplasmic MDH1 NADP-dependent malic enzyme (NADP-ME) ME1

Mediator of RNA poly II transcription subunit 14 MED14 Neprilysin (Atriopeptidase) MME

Matrix metalloproteinase-14 MMP14 MOB kinase activator 1B MOB1B

Myelin protein zero-like protein 1 MPZL1 DNA mismatch repair protein Msh6 MSH6

Moesin MSN Cytochrome c oxidase subunit 2 MT-CO2 Myotubularin-related protein 10 MTMR10

Myosin light polypeptide 6 MYL6 Myocardial zonula adherens protein (Gup) MYZAP

Nuclear cap-binding protein subunit 1 NCBP1 Cytoplasmic protein NCK2 (Growth factor receptor-

bound protein 4) NCK2 Nicastrin NCSTN

Nidogen-1 (NID-1) (Entactin) NID1 NLR family CARD domain-containing protein 4 NLRC4 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2 NLRP2

Nostrin (eNOS-trafficking inducer) NOSTRIN Neurogenic locus notch homolog protein 2

(Notch 2) NOTCH2

Niemann-Pick C1 protein NPC1 Nucleophosmin (Nucleolar phosphoprotein B23) NPM1

UDP-N-acetylglucosamine--peptide N-acetylglucosaminyltransferase 110 kDa subunit OGT

Multifunctional protein ADE2 PAICS Proliferating cell nuclear antigen (Cyclin) PCNA

Programmed cell death 6-interacting protein PDCD6IP Protein disulfide-isomerase A3 PDIA3 Protein disulfide-isomerase A6 PDIA6 PDZ and LIM domain protein 1 PDLIM1

p53 apoptosis effector related to PMP-22 PERP Profilin-1 PFN1

Phosphoglycerate kinase 1 PGK1 Pleckstrin homology-like domain family A member 3 PHLDA3

Phosphatidylinositol 4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing subunit alpha PIK3C2A

PI-PLC X domain-containing protein 1 PLCXD1 Plectin (PCN) (PLTN) PLEC

Phospholipid phosphatase 3 PLPP3 Phospholipid scramblase 1 PLSCR1

Protein POF1B POF1B Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic

subunit alpha isoform (PP2A-alpha) PPP2CA DNA-dependent protein kinase catalytic subunit

(DNA-PK catalytic subunit) PRKDC

Anexos Capítulos 281

Protein names Gene name

Phosphoserine aminotransferase PSAT1 Proteasome subunit beta type-4 PSMB4

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 1 PSMD1 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2 PSMD2

Glutamine-rich protein 1 QRICH1 Rab11 family-interacting protein 1 RAB11FIP1

Ras-related protein Rab-14 RAB14 Ras-related protein Rab-1A RAB1A Ras-related protein Rab-5A RAB5A Ras-related protein Rab-7a RAB7A Ras-related protein Rap-1b RAP1B Ras-related protein Rap-2c RAP2C

RNA-binding protein 14 RBM14 Recombining binding protein suppressor of hairles RBPJ

Replication factor C subunit 2 RFC2 Replication factor C subunit 3 RFC3 Transforming protein RhoA RHOA

Ribonuclease inhibitor (Placental RNase inhibitor) RNH1 60S ribosomal protein L13 RPL13 60S ribosomal protein L6 RPL6 60S ribosomal protein L7a RPL7A

60S acidic ribosomal protein P1 RPLP1 40S ribosomal protein S10 RPS10 40S ribosomal protein S13 RPS13 40S ribosomal protein S14 RPS14

40S ribosomal protein S15a RPS15A 40S ribosomal protein S16 RPS16 40S ribosomal protein S20 RPS20 40S ribosomal protein S23 RPS23 40S ribosomal protein S24 RPS24 40S ribosomal protein S25 RPS25 40S ribosomal protein S26 RPS26 40S ribosomal protein S3 RPS3 40S ribosomal protein S3a RPS3A

40S ribosomal protein S4, X isoform RPS4X 40S ribosomal protein S8 RPS8 40S ribosomal protein S9 RPS9

Ras-related protein R-Ras2 RRAS2 RuvB-like 1 RUVBL1

Protein S100-A11 S100A11 Serine--tRNA ligase, cytoplasmic SARS

U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 SART1 Sec1 family domain-containing protein 1 SCFD1

Syndecan-1 SDC1 Syndecan-4 SDC4 Syntenin-1 SDCBP

Short-chain dehydrogenase/reductase family 9C member 7 SDR9C7

Protein SEC13 homolog SEC13 Protein transport protein Sec31A SEC31A

Alpha-1-antitrypsin SERPINA1 Serpin B9 u

Splicing factor 3B subunit 3 SF3B3 Splicing factor, proline- and glutamine-rich SFPQ

SH3 domain-binding protein 4 SH3BP4 Thiamine transporter 2 SLC19A3

Neutral amino acid transporter A SLC1A4 Neutral amino acid transporter B(0) SLC1A5

ADP/ATP translocase 2 SLC25A5 Equilibrative nucleoside transporter 1 SLC29A1

Acetyl-coenzyme A transporter 1 SLC33A1 4F2 cell-surface antigen heavy chain SLC3A2

Sodium-dependent multivitamin transporter SLC5A6 Cationic amino acid transporter 2 SLC7A2 Cationic amino acid transporter 4 SLC7A4

Protein names Gene name

Large neutral amino acids transporter small subunit 1 SLC7A5 SWI/SNF complex subunit SMARCC1 SMARCC1 Synaptosomal-associated protein 23 SNAP23

Vacuolar-sorting protein SNF8 SNF8 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa

helicase SNRNP20

0 U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa SNRNP70

Small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 SNRPD1 Sorting nexin-2 SNX2

Superoxide dismutase [Cu-Zn] SOD1 Sortilin (100 kDa NT receptor) SORT1

Cornifin-B (14.9 kDa pancornulin) SPRR1B Sequestosome-1 SQSTM1

Signal recognition particle subunit SRP68 SRP68 Lupus La protein SSB Steryl-sulfatasa STS

Tumor-associated calcium signal transducer 2 TACSTD2 Transferrin receptor protein 1 TFRC

Transforming growth factor β receptor type 3 TGFBR3 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K TGM1

Tankyrase-2 (TANK2) TNKS2 Toll-interacting protein TOLLIP Target of Myb protein 1 TOM1 DNA topoisomerase 1 TOP1

DNA topoisomerase 2-beta TOP2B Trophoblast glycoprotein TPBG

Triosephosphate isomerase TPI1 Tripeptidyl-peptidase 1 TPP1

Translationally-controlled tumor protein TPT1 Transformer-2 protein homolog beta TRA2B E3 ubiquitin-protein ligase TRAF7 TRAF7

Testis-specific Y-encoded-like protein 2 TSPYL2 Tubulin alpha-1B chain TUBA1B

Tubulin beta chain TUBB Ubiquitin-60S ribosomal protein L40 UBA52

UDP-glucose 6-dehydrogenase UGDH Uroplakin-3b (p35) UPK3B

Vacuolar protein sorting-associated protein 29 VPS29 von Willebrand factor A domain-containing protein 1 VWA1

WD repeat-containing protein 1 WDR1 Xaa-Pro aminopeptidase 1 XPNPEP1

Nuclease-sensitive element-binding protein 1 YBX1 14-3-3 protein epsilon YWHAE 14-3-3 protein theta YWHAQ

14-3-3 protein zeta/delta YWHAZ Protein kinase C-binding protein 1 ZMYND8

Zinc finger protein 281 ZNF281 Zinc finger protein 292 ZNF292

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