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La importancia de la masa exacta:

Identificación de desconocidos y

análisis diferencial de muestras

Jaume C. Morales

Especialistas de Producto

Agilent Technologies Spain Tarragona / Lleida Octubre de 2012

• Existe in creciente uso de las ciencias ómicas

• Las técnicas usadas són : Cromatografía más espectrometría de masas en

combinación con análisis estadístico.

• Las areas donde las ciencias ómicas están incrementando su presencia son :

– Salud y enfermedad (clinica), nutrición, calidad alimentaria

– Control de calidad en Fermentación

– Biofueles “green technologies” e investigación en cereales

– Monitorización ambiental

• Aspectos críticos en el flujo de trabajo:

– Preparación de muestra y automatización

– Identificación de los compuestos

– Integración de los resultados quimiométricos en contexto biológico (biociencia)

Ciencias ómicas

Agilent ….omics Workflow G

CM

S

LC

MS

Separate &

Detect

GC/MSD

GC-QQQ

LC-TOF/QTOF

LC-QQQ

Feature

Finding

Quantitate

MassHunter Qual AMDIS or Find by

chromatographic

deconvolution

MassHunter Qual MFE,

Find by Formula,

Find by Ion

Alignment &

Statistics

Mass Profiler

Professional

(MPP)

Identify

ID Browser

Pathways

Pathway module

Cytoscape

Mass Profiler

(MP)

Emerging Insights:

Metabolomics at Agilent 5990-6048EN

hydrophilic

hydrophobic

ionic

uncharged

Phospho sugars

amino acids

nucleotides

lipids

organic acids

amines

TCA cycle

pentose-phosphate path

glycolysis purine metabolism

proteins

peptides

sugars

hydrocarbons

phospholipids

quinones

aminoglycosides

cell membrane cell wall

amino acid metabolism

Métodos de Separación

Sulphated sugars

Análisis dirigido o indiscriminado

Adquisición Indiscriminada (untargeted adquisition) – TOF / QTOF

• Perfil de todos los compuestos detectables

• Significación de los datos: Basado en un enfoque de descubrimiento.

• Caracterización de los compuestos detectados por : m/z, abundancia, espectro y tiempo ret.

• Los compuestos se identifican despues del analisis diferencial

• La Identificación puede ser dirigida por búsqueda en bases de datos concretas, (metabolitos, pesticidas, compuestos toxicologicos, etc…) e incluso localizarlos en rutas metabólicas (biociencia)

Adquisición Dirigida (targeted acquisition) – QQQ

• Sólo de compuestos conocidos

• Mayor sensibilidad que el enfoque Indiscrimando

• Cuantificación absoluta – Necesita patrones externos e internos

• Desarrollo de metodos con SIM o MRM para cientos de compuestos (bases de datos)

• Susceptible de analisis diferencial para validación.

El análisis Indiscriminado puede utilizarse para

identificación Discriminada

La adquisición de datos Indiscriminada

se efectúa guardando el espectro total

en cada punto del cromatograma

La información es útil para usos a posteriori.

Los compuestos que el análisis estadístico

revela como diferenciales pueden dar un

significado al grueso de los datos originales.

El Software permite convertir puros datos

en una interpretación significativa.

El listado de compuestos diferenciales

puede enviarse de nuevo al equipo para

que realice ahora una Adquisición Dirigida.

Mass Hunter Targeted Data Mining For LC/MS:

Find by Formula (FBF)

Se trata de una búsqueda dirigida

usando una base de datos de masa

exacta de los compuestos de

nuestro interés:

• Calcula los iones basándose en las

fórmulas empíricas que le

proporcionamos

• La coincidencia de Retention time es

opcional

• Trabaja sobre bases de datos Agilent

PCDL o genéricas .xls, .csv

• El resultado de la búsqueda puede

revisarse en Mass Hunter Qual

• Produce un registro .cef para

exportar a Mass Profiler Professional

Compound chromatogram

Compound

spectra

MassHunter PCDL Manager B.04.00 Cree y edite su propia Base de datos de compuestos con masa

exacta, Tr y espectros MS/MS

Personal Compound Database and Library Manager (PCDL)

Añada compuestos con su información de Masa exacta, RT, espectro

MS/MS demasa excata a multiples EC, enlaces con otras web’s

Realize rápidas busquedas manuales interactivas.

Realize rápidas busquedas automáticas de lotes de compuestos.

Uso directo o incluido en Mass Hunter.

James Hutton, UK

Institute Heidger, Germany

University of Tuebingen, Germany

British American Tobacco, UK

Irish Distillers, Ireland

MARS, UK

Casos Reales

James Hutton Institute , UK

Se analizaron dos extractos de patata (SGT y D) en un QTOF de alta resolución en

modos MS y Auto MS/MS.

Los datos se procesaron a través del algoritmo de deconvolución con masa exacta

MFE (Molecular Feature Extractor) buscando todos los compuestos ionizables en las

muestras y el resultado se inspeccionó sobre la base de datos METLIN. Para

aquellos compuestos detectados pero AUSENTES en METLIN se pidió al software

que propusiera la formula elemental más probable a través del algoritmo MFG

(Molecular Formula generation )

Adicionalmente se exportó en un registro .CEF todos los compuestos detectados en

todas las muestras y comparadas con Mass Profiler y Mass Profiler Professional.

El enfoque “metabolómico” usado aquí usó solamente 5 replicas técnicas (n=5) con

el posible sesgo que eso pueda provocar en los datos.

James Hutton Institute , UK / Resultados

Este ejemplo nos muestra datos del análisis de la muestra D. Se detectaron 1895 compuestos con una

abundancia mayor que 2500. El cromatograma muestra la superposición de los EIC de la m/z de esos

compuestos junto al TIC (negro) así como una ampliación en la zona 6,5 – 9,7 min para observar mejor el

detalle.

Mass Profiler Professional: suministra un paquete de análisis estadístico más sofisticado. Eso permite la

comparación de múltiples conjuntos de muestras. En éste ejemplo se comparan 3346 compuestos a través

de las 10 muestras (5 por tipo de patata).


Mass Profiler Professional : La construcción del análisis estadístico puede hacerse a través de un Tutorial (Guided Workflow) o

en modo avanzado (Advanced Workflow) para usuarios expertos. En dicha construcción los datos se filtran, alinean y

normalizan. A posteriori el Tutorial permite una serie de filtros que nos reduce el número de artefactos. Aquí se muestra como

sólo 2302 “entities” de 3346 están presentes en al menos 2 muestras.


Mass Profiler Professional : Aquí se muestra una mayor reducción de “entities” pasando el filtro tan sólo

aquellas que aparecen en el 100% de todas las muestras que pertenecen a una condición (tipo de patata).


Mass Profiler Professional : Como parte del Tutorial se ejecuta un análisis por componentes principales (PCA) que nos permite

hacer un QC de las muestras en cuanto a representatividad , uniformidad y diferenciación. Esto nos permite comprobar si existen

compuestos que realmente diferencian las dos condiciones. En éste caso las bolas rojas representan a las Patatas D y las azules

a las Patatas SGT.


Mass Profiler Professional : Finalmente se realiza el análisis estadístico (t-Test) y se muestra en forma de “Volcano plot” de

SGT vs Desire. Esto nos muestra 476 compuestos cuyo fold change es >2.0 ( Log [cambio abundancia]) y el valor de

(probabilidad) P es <0.001. Los compuestos (cuadros rojos) en el panel de la derecha aumentaron en SGT respecto a Desire

mientras que los del panel de la izquierda decrecieron.


Mass Profiler Professional: En éste gráfico cada linea representa a un compuesto y su abundancia en Patatas Desire y SGT.

Cada uno de éstos compuestos viene caracterizado por su Rt y masa exacta.


Mass Profiler Professional: El menú lateral de Workflow permite a partir del resultado del análisis diferencial tomar acciones.

En éste caso se realiza un ID Browser que nos permite identificar los compuestos aquí mostrados en una base de datos de

masa exacta y/o generar fórmulas moleculares empíricas.


Mass Profiler Professional:. Para éste ejemplo se han volcado 476 para identificar por ID Browser. La Base de Datos

utilizada para identificar ha sido METLIN (>23.000 entradas). La búsqueda se ha realizado solamente en base a la masa exacta

aunque se podría incluir también el Tiempo de retención.


Mass Profiler Professional: De cara a tener una mayor confirmación de algunos compuestos se puede exportar la lista de

éstos a una lista de inclusión para QTOF en modo dirigido pues conocemos ya su m/z y Tiempo de retención. Esta lista se

importa directamente desde MH Acquisition y se inyectan de nuevo las muestras. Los datos resultantes con espectros MS/MS

pueden buscarse en librerías de espectros MS/MS . La librería Agilent METLIN incluye >6000 espectros MS/MS.


• Dos extractos de diferente patata se han analizado por LC/MS y se han detectado los

compuestos presentes por MFE

• Usando Mass Profiler Professional, se observaron diferencias significativas entre éstas

muestras.

• De >3000 entities, 467 mostraron ser significativamente diferentes en términos de

abundancia entre las dos muestras.

• Las entities significativas pueden ser Identificadas con MPP usando Bases de Datos y/o

Generando fórmulas Moleculares empíricas.

• La lista de entites significativa puede exportarse como lista de un inclusión para hacer un

Análisis de adquisición Dirigido por MS/MS y buscar sus espectros en librerías

espectrales MS/MS

James Hutton Institute , UK / RESUMEN


Comparación de muestras de Vino y Whisky usando Mass Profiler Professional: PCA Analysis.


Comparación de muestras de Vino y Whisky usando Mass Profiler Professional: Predicción de Modelos

University of Tuebingen, Germany

En este ejemplo Mass Profiler se utilizó para evaluar las diferencias entre dos muestras de agua 2112 y 2012

para detectar el origen de una contaminación en un rio. Los gráficos muestran la Masa vs. Tiempo de

Retención de los compuestos encontrados por MFE . Se aprecia una marcado incremento de compuestos

encontrados en la Muestra 2012.

Sample 2112

Sample 2012

Una comparación estadística usando 5 réplicados (n=5) permite la visualización de compuestos únicos de

cada muestra. Los gráficos muestran aquellos compuestos que sólo estan en una de las dos muestras.

De un total de 766 compuestos encontrados :

579 estaban sólo presentes en las muestras 2012

33 compuestos sólo en las muestars 2112.

El resto estaban en ambas muestras

University of Tuebingen, Germany / Results

British American Tobacco, UK

Mass Profiler tiene la capacidad de compara dos conjuntos de muestras. Primero se extraen los compuestos

por MFE y luego se alinean y comparan. Al igual que MPP, los compuestos significativamente diferentes (t-

Test solo) pueden identificarse por Bases de Datos o Generación de Fórmula. En el gráfico inferior puede

observarse una comparación entre las muestras 1 y 4 . El gráfico muestra sólo aquellos compuestos que han

aumentado su abundancia en la Muestra 4 respecto a la Muestra 1.

Cada uno de los compuestos puede estudiarse para determinar su distribución de abundancia. P.e. El compuesto nº 9 abajo.

British American Tobacco, UK / Results

Aquí se muestra un listado de compuestos identificados por ID Browser. Algunos a través de base de datos y otros generando

fórmulas.


4. Results

Expandiendo cada compuesto nos muestra los diferentes resultados de la búsqueda con el Overal Score donde por defecto

es seleccionado el máximo. The BEST.

Mass Profiler al igual que MPP puede tambien generar listados de inclusión para adquisición MS/MS en QTOF dirigido.


Análisis Quimiométrico

Mass Profiler y Mass Profiler Professional proporcionan potentes herramientas

estadísticas para el análisis diferencial.

Este enfoque puede aplicarse a cualquier estudio de cambios en un proceso con datos

MS.

Los resultados de MP y MPP pueden exportarse a una lista de inclusión para análisis

MS/MS dirigido.

La lista de inclusión se importa directamente desde MH Acquisition

Pathway analysis es único de Agilent (Biociencia)

Agilent proporciona bases de datos de masa exacta :

METLIN PCD(L) unica de Agilent

Pesticidas

Compuestos Toxicológicos

Food Authenticity Determinations:

Metabolomic profiling of wines using

HPLC-QTOFMS coupled to Agilent's advanced

data mining and statistical tools

Ondrej Lacinaa, Lukas Vaclavika, Jerry Zweigenbaumb

a Institute of Chemical Technology Prague, Czech Republic b Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA

EXPERIMENTAL SETUP

INSTRUMENTAL ANALYSIS

• RRLC separation, RP column

• ESI(MM)-QTOFMS (MS and MS/MS)

DATA MINING

• molecular feature extraction

• background subtraction

DATA PROCESING • data filtering

• statistical analysis (ANOVA, PCA)

• classification model (PLS-DA)

IDENTIFICATION

• MS/MS experiments

• molecular formula estimation

• database search

SAMPLES

• Red wines (45 samples total)

• Varieties: Cabernet Sauvignon (15), Merlot (16), Pinot Noir (14)

• Countries of origin: Czech Republic, Slovakia, France, Italy,

Macedonia, Bulgaria, Hungary, Australia, Chile, Germany, USA

• Vintage: 2004 - 2008

VERY VARIABLE SAMPLE SET…

SAMPLES

INSTRUMENTATION

Agilent Technologies 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

Agilent Technologies 1200 RRLC system

Jet Stream ESI source

NO SAMPLE PREPARATION, DIRECT ANALYSIS OF SAMPLE…

Multimode ion source

Eclipse Plus C18 (2.1×100, 1.8µm)

HILIC Plus C18 (2.1×100, 3.5µm)

TIC of wine and LC blank, LC-(ESI+) QTOFMS

?

? ?

? ?

? ? ? ?

? ? ?

? ?

? ?

?

? ? ? ?

? ?

?

?

? ?

? ?

?

? ?

? ?

?

?

DATA MINING

BLANK WINE

Complex data, only valid

compounds needed to be

extracted.

Find compound by

molecular feature function

DATA MINING: FIND BY MOLECULAR FEATURE

FIND BY MOLECULAR FEATURE

Processing the blank file to obtain background ions

Settings of extraction method

Background ions to

be subtracted


Automatic batch processing of data


DATA PROCESSING

Agilent Technologies Mass Profiler Professional Software

…is often very tedious and time demanding with metabolomic based studies…

DATA MANAGEMENT DATA FILTERING STATISTICAL TOOLS DATA INTERPRETATION

DATA PROCESSING

Guided

workflow

Creating a new project

Un-Identified

compounds

DATA PROCESSING

Aligning MFs (entities) across the data set

20506 entities

obtained from all

samples

DATA PROCESSING

Guided Workflow:

8 steps for simple way through data analysis

DATA PROCESSING

Samples are divided into classes

DATA PROCESSING

Filtration of entries by frequency (occurrence in classes)

Default filter setting: presence of

an entity in 100% of samples at

least in one group.

In very variable sample sets, some significant compounds

could be filtered out…

Ave

rag

e i

nte

nsit

y

663 entities from

20506 remained

DATA PROCESSING

Filtration by frequency : Example of significant entity for

Pinot Noir

This compound is

present in 14 of

15 Pinot Noir

samples

Only few significant entities are present in 100% samples in a class

Ave

rag

e i

nte

ns

ity

DATA PROCESSING

3600 entities from

20506 remained

Change the default

value to 50%.

Filtration by frequency

Ave

rag

e i

nte

nsit

y

DATA PROCESSING

Statistical analysis: One way ANOVA

p<0.05

40 entities from 3600

DATA PROCESSING

Statistical analysis: Fold Change

Fold Change Analysis is used to identify entities

with significantly different abundance in selected

classes.

Cabernet Sauvignon and Merlot was a

problematic pair, cut-off FC ≥ 2.0 was applied…

Ave

rag

e i

nte

nsit

y

26 entities from

40 remained

DATA PROCESSING REVEALING THE INTERNAL STRUCTURE OF THE DATA USING PCA…

PCA of the data initial entries (20506)

PCA of the data entries filtered by frequency (3600)

CABERNET SAUVIGNON

MERLOT

PINOT NOIR

FILTRATION

DATA PROCESSING REVEALING THE INTERNAL STRUCTURE OF THE DATA USING PCA…

PCA of the data Entries after ANOVA (p≤0.05) & Fold Change (≥2.0)

(26)

CABERNET SAUVIGNON

MERLOT

PINOT NOIR

FILTRATION

DATA PROCESSING BUILDING CLASS PREDICTION MODEL

Mass Profiler Pro enables use of many methods for construction of class prediction models…

DECISION TREE

ARTIFICIAL NEURAL NETWORKS

SUPPORT VECTOR MACHINE

NAIVE BAYESIAN

PARTIAL LEAST SQUARE DISCRIMINATION

DATA PROCESSING BUILDING CLASS PREDICTION MODEL

MODEL TRAINING

MODEL VALIDATION

• Calculation of discriminant functions from actual input data set

• Model is applied to input data set

• Classes in input data set are randomly divided into N equal parts, N-1 parts

are used for model training, remaining part is classified with the use of

obtained model

• The whole process is repeated N-times

MODEL RECOGNITION ABILITY

MODEL PREDICTION ABILITY

DATA PROCESSING

CONFUSION MATRIX - TRAINING

PLSD plot

CABERNET SAUVIGNON

MERLOT

PINOT NOIR

DATA PROCESSING

CONFUSION MATRIX - VALIDATION

• During model validation , two MERLOT samples were misclassified…

• All Cabernet Sauvignon and Pinot Noir samples were classified correctly

• The prediction ability of the model is 95.6%

Agilent 7200 GC/Q-TOF Applications.

The Experience so far

Sofia Aronova GC/Q-TOF Application Chemist

Agilent Technologies, Santa Clara

Food Testing and Flavors:

Caracterización del aceite de

oliva

• Procesado estadístico con MPP para los datos del GC/Q-TOF

• Búsqueda de espectros MS/IE de los espectros del GC/Q-TOF

• La ionización química proporciona información de masa exacta del

ión molecular

1. Las muestras de aceite de oliva fueron sometidas a un test sensorial y clasificadas en

PASA o FALLA

2. Adquisición por GC/Q-TOF con ambas fuentes IE y IC

3. MassHunetr Qual se utilizó para la deconvolución y listado de compuestos

encontrados que se volcó como registro CEF a MPP para efectuar el análisis

estadístico.

4. MPP después del análisis estadístico, se utilizó para la construcción del modelo de

predicción.

5. El modelo fue capaz de predecir correctamente si las muestras pasarian el test

sensorial o no.

Caracterización del aceite de oliva : Estrategia

Objetivos:

• Crear un modelo que pueda predecir si una muestra pasaría o no el test

sensorial

• Identificar compuestos en el aceite estadísticamente significativos presentes

a diferentes niveles dependiendo si pasó o no el test

Caracterización del aceite de oliva : Filtrado de datos

La deconvolución

cromatográfica encontró 442

compuestos únicos, la mayor

parte de los cuales se

manifestaron tan sólo en una

ocasión o dos y por lo tanto

fueron descartadas por MPP.

La tabla lista cuantos de esos 442 compuestos

aparecían en cada muestra.

Caracterización del aceite de oliva : Visualización del

agrupamiento de datos (Data Clustering)

Principal Component Analysis (PCA) del MPP ayuda a visualizar el

agrupamiento de datos.

falla

pasa

Caracterización del aceite de oliva : Fold Change Analysis

El Volcano Plot (derecha) muestra el “Fold Change” para cada “entity” en el eje de

X y su significancia en el eje de Y.

Compuestos presentes

en las muestras que

fallaron el test sensorial.

Caracterización del aceite de oliva : Búsqueda en Librerias

La librerías comerciales de IE aún siendo de masa unitaria puede utilizarse para

comparación por espectros usando datos de masa exacta de IE GC/Q-TOF para

identificar compuestos

Espectro del compuesto

Espectro en librería NIST

Espectro del compuesto

(masa exacta)

EI

Caracterización del aceite de oliva : Resultados MPP

• El modelo predijo correctamente las muestras incluyendo aquellas no

utilizadas para construir el modelo.

• Las muestras NO utilizadas para la creación del modelo se listan bajo el

parámetro “Training” como ‘None’

!!Gracias!!!

¿Preguntas?

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