La hemoglobina es una heteroproteina de la sangre de peso moleculr de 64

HEMOGLOBINA

OBJETIVO:

Conocer la estructura de la hemoglobina con sus diferentes funciones.

Determinar la concentracin de Hemoglobina presente en los glbulos rojos utilizando la tcnica de Cianometahemoglobina.

Permitir al estudiante una interpretacin clnica segn los resultados obtenidos para un adecuado diagnostico de las patologas en animales.

MARCO TEORICO:

La hemoglobina (Hb) es una heteroprotena globular de la sangre, de peso molecular 64.000 (64 kD), presentes en los hemates en altas concentraciones, que fijan oxgeno en los pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos y clulas que rodean el lecho capilar del sistema vascular. Al volver a los pulmones, desde la red de capilares, la hemoglobina acta como transportador de CO2 y de protones.

Cuando la hemoglobina est unida al oxgeno, se denomina oxihemoglobina o hemoglobina oxigenada, dando el aspecto rojo o escarlata intenso caracterstico de la sangre arterial. Cuando pierde el oxgeno, se denomina hemoglobina reducida, y presenta el color rojo oscuro o bord de la sangre venosa (se manifiesta clnicamente por cianosis).

La forman cuatro cadenas polipeptdicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo, cuyo tomo de hierro es capaz de unirse de forma reversible al oxgeno. El grupo hemo se forma por:

1. Unin de la Succinil CoA (formado en ciclo de Krebs o ciclo del cido ctrico) a un aminocido glicina formando un grupo pirrol.

2. Cuatro grupos pirrol se unen formando la Protoporfirina IX.

3. La protoporfirina IX se une a una molcula de hierro ferroso (Fe2+) formando el grupo hemo. Finalmente cada molcula Hem se combina con una larga cadena polipptica, llamada globina, sintetizada por los ribosomas, formando una subunidad hemoglobina llamada cadena de hemoglobina. Cada una de estas cadenas tiene un peso molecular de aproximadamente de 16000 Kd; se unen cuatro de ellas de forma laxa para formar la molcula completa de hemoglobina.

SuccinilCoA+Glicina

Pirrol

4 Pirrol

Protoporfirina IX + Fe2+ Vit B6 Grupo Hem + Globina

( polipptidos cadenas , B, ,D) subunidad Hemoglobina (16000Kd)

4 subunidades de Hemoglobina (16000Kd) 1molcula de Hemoglobina (Hb)

Existen diferentes ligeras variaciones en distintas subunidades de las cadenas de hemoglobina, dependiendo de la composicin en aminocidos de la porcin

polipeptdica. Los diferentes tipos de cadenas se denominan cadenas alfa, cadenas beta, cadenas gamma y cadenas delta. La forma ms frecuente de hemoglobina es la A, es una combinacin de dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Debido a que cada cadena tiene un grupo protico hem, hay 4 tomos de hierro encada molcula de hemoglobina; cada una de ellas puede unirse a una molcula de oxgeno, siendo pues un total de 4 molculas de oxgeno las que pueden transportar cada molcula de hemoglobina.

Propiedades funcionales de la hemoglobina como transportador de oxgeno:

La afinidad por el oxgeno de la hemoglobina es tal que la hemoglobina se sutura por completo con oxgeno en los pulmones expuesto al aire atmosfrico y entrega oxgeno a la presin parcial de oxgeno que encuentra en los tejidos. Se puede comparar la afinidad por el oxgeno de diferentes hemoglobinas o diferentes eritrocitos determinando la presin parcial de oxgeno a los cuales es oxigenada la mitad de la hemoglobina y la mitad de deoxigenasa, es decir, la P50.

La unin inicial del oxgeno con la hemoglobina facilita la unin siguiente del oxgeno con la hemoglobina. Esta caracterstica se denomina interaccin hemo-hemo, porque la unin de un hemo afecta las propiedades de unin de otros hemos. La cambiante afinidad por el oxgeno de la hemoglobina con la oxigenacin produce una curva sigmoidea cuando se diagrama el grado de oxigenacin o porcentaje de saturacin con oxgeno de la hemoglobina contra la presin parcial de oxgeno. La gran afinidad por el oxgeno de la mioglobina a la presin de oxgeno normal en los tejidos permite que la hemoglobina acte como una protena de acumulacin de oxgeno del msculo, que lo libera a la presin parcial intracelular de oxgeno muy baja que se produce como consecuencia del ejercicio.

La afinidad por el oxgeno de la hemoglobina cambia con el pH intracelular. En los capilares de los tejidos en actividad metablica el CO2, entra en el plasma y los eritrocitos. Estos contienen anhidrasa carbnica que rpidamente convierte el CO2 al H2CO3, un cido dbil que se ioniza a H y HCO3, haciendo descender el pH intracelular. Este aumento de la concentracin del in hidrgeno reduce la afinidad del oxgeno por la hemoglobina (efecto Bohr) y facilita la entrega de oxgeno a los tejidos. A medida que se acumula en el eritrocito desoixhemoglobina, un cido ms dbil que la oxihemoglobina y que por lo mismo puede fijar los protones que se agregan, la desoxihemoglobina se une a los iones H liberado del H2CO3. La mayor cantidad de iones HCO3 se difunden hacia el exterior del eritrocito y son remplazados por iones cloruro en la llamada desviacin cloruro. En los pulmones el proceso se invierte; la sangre se desprende de CO2, se eleva el pH y aumenta la afinidad por el oxgeno de la hemoglobina.

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA:

Al mezclar la sangre con el reactivo de DRABKIN, se transforma la hemoglobina en cianmetahemoglobina, la intensidad de color de esta reaccin es medida en un fotocolormetro o espectofotmetro.

La reaccin se da as: El reactivo de Drabkin contiene cianuro potsico y ferricianuro potsico. El ferricianuro hace pasar el hierro de la hemoglobina del estado ferroso (Fe++) al frrico (Fe+++) para formar metahemoglobina, la cual se combina con cianuro potsico y da un pigmento estable, la cianmetahemoglobina.

La intensidad del color se mide mediante un fotmetro a una longitud de onda de 540 nm. La densidad ptica de la solucin es proporcional a la concentracin de hemoglobina.

MATERIALES

Solucin de Drabkin: Potasio ferricianuro 0.6mM

Potasio cianuro

0.7mM

Buffer y estabilizantes

Patrn de la hemoglobina

Espectofotometro Abs. 540nm

Celdas

Pipeta automtica o micropipeta

Puntas

Tubos de ensayo

Gradilla

Cronometro

Muestra: Sangre anticoagulada con aditivos como EDTA, Citrato y Oxalato.

PROCEDIMIENTO

Prender el fotocolormetro o el espectofotmetro y esperar a que alcance la temperatura adecuada para su funcionamiento.

Tome 3 tubos de ensayo:

En el primer tubo adicione nicamente 5ml del reactivo

En el segundo tubo adiciones 5ml del reactivo mas 0.02 ( 20ul)de la muestra

En el tercer tubo adicione 5ml del reactivo mas 0.02 ml ( 20ul)del patrn de Hb ( Hemoglobina) .

BLANCO

MUESTRA

PATRON

REACTIVO HEMOGLOBINA

5 mL

5 mL

5mL

SANGRE TOTAL

----

0.02 mL

----

PATRON

----

----

0.02 mL

Con papel absorbente eliminar el exceso de sangre que queda en las paredes externas de la pipeta antes de introducirla en la solucin de Drabkin.

Reactivo blanco muestra patrn muestra patrn

Drabkin

Llevar la pipeta hasta el fondo del tubo y depositar la sangre, procurando lavar las paredes internas de la pipeta; esto se logra mediante aspiraciones y expulsiones consecutivas de reactivo dentro del tubo.

Evitar la formacin de burbujas.

Tapar el tubo y mezclar 5 veces por inversin.

Dejar reposar por 10 minutos para que se produzca la hemlisis total de las clulas rojas y se complete la reaccin.

Realizar el mismo procedimiento para el patrn.

Transferir la solucin a las cubetas del fotocolormetro.

Leer la solucin obtenida, usar como blanco el reactivo de Drabkin. Calcular la concentracin de hemoglobina, utilizando la curva de calibracin o multiplicando por una constante que resulta de la calibracin del mtodo.

VALORES DE REFERENCIA

CAUSAS DE ERROR

La estasis prolongada, origina resultados falsamente elevados de hemoglobina en las muestras de sangre venosa.

La muestra no se mezcla adecuadamente.

Temperaturas de almacenamiento y transporte inadecuado.

Errores de pipeteo o de dilucin.

Muestra de sangre con coagulo.

Sangre lipemia (alto contenido de grasas o lpidos)

CONSULTA: Explicar las deficiencias de la HEMOGLOBINA y sus posibles causas.

BIBLIOGRAFIA

Drabkin, D.L, Agustin, J.H, Biol Chem, 1935. Hemoglobina solucin Drabkin mtodo cianometahemoglobina

Gonzles V.E, 2005. Determinacin de la hemoglobina

M.G. Davidson, R.W. Else, J.H. Lumsden (Eds.), "Manual de Patologa Clnica en Pequeos Animales", Editorial Harcourt.

HEMATOCRITO

OBJETIVOS:

Determinar el volumen del paquete celular o volumen que ocupan los glbulos rojos en la sangre.

Permitir al estudiante una interpretacin clnica con los resultados obtenidos concluyendo as el diagnostico de diferentes patologas

MARCO TEORICO:

Hematocrito (Hto) o volumen globular agregado o Volumen de Paquete Celular

(VGA, o VPC), permite la determinacin del volumen que ocupan los eritrocitos en la sangre, se expresa en porcentaje (unidades convencionales) o L/L (sistema internacional de unidades). Un VGA de 43% (0,43 L/L) indica que los eritrocitos ocupan el 43% del volumen total sanguneo, es un parmetro que varia de acuerdo al sexo y puede verse afectado por la altitud sobre el nivel del mar.

Esta prueba quiere decir literalmente separacin de la sangre; esta ideada para

separar la sangre en un tubo en tres capas, mediante centrifugacin. Las partculas ms pesadas, los glbulos rojos, se depositan en el fondo, los leucocitos y las plaquetas forman una capa sobre ellos (llamada buffy coat) y la capa superior esta formada por el plasma. Es esta una prueba sencilla de realizar y proporciona muchos datos con gran rapidez. Debe realizarse dentro de las 5 horas siguientes a la toma de la sangre, preferiblemente menos. La informacin que se obtiene con frecuencia del Hematocrito es la altura relativa de la capa de los glbulos rojos que indica el porcentaje de sangre ocupado por los hemates.

El hematocrito se expresa de acuerdo con la nomenclatura tradicional como porcentaje, o preferiblemente, de acuerdo al Sistema Internacional (SI) de unidades como fraccin decimal (L/L).

FUNDAMENTO:

Conocido como microhematocrito o Hematocrito capilar. Se determina aplicando una fuerza centrfuga de 8.000 a 12.000 r.p.m por 5 minutos, determinando as el volumen que ocupan los eritrocitos en la sangre o paquete celular.

MATERIALES

Sangre total anticoagulada con EDTA o sangre capilar.

Tubos capilares de vidrio desechables de 1 mm de dimetro interior y 0.75 cm de longitud.

Plastilina.

Centrfuga para microhematocrito

Tabla de lectura

PROCEDIMIENTO

Mezclar cuidadosamente la sangre por un minuto.

Se sumerge el capilar en el tubo de sangre con anticoagulante

Dejar llenar por capilaridad 2/3 del capilar con la muestra evitando la formacin de burbujas.

Sellar uno de los extremos del capilar con plastilina.

Colocar los capilares del hematocrito en los surcos radiales del accesorio apropiado de la centrfuga, en posicin opuesta el uno al otro, y con su extremo sellado en la parte exterior.

Centrifugar a 10.000 rpm durante 5 minutos.

Extraer los tubos tan pronto la centrfuga se detenga. Efectuar la lectura de los capilares.

VALORES DE REFERENCIA

Bovino

Parmetros

Uds.

Valores

Hematocrito

25-45

Hemoglobina

g/l

8 - 13

Globulos rojos

**

5.0-10.0

Leucocitos

***

4 - 12

Neutrfilos

%

15 - 40

Abs.

0,6 - 4

Linfocitos

%

45 - 75

Abs.

2,5 - 7,5

Monocitos

%

1 - 5

Abs.

0,03 - ,8

Eosinfilos

%

2 - 10

Abs.

0 - 2,4

Basfilos

%

0 - 1

Abs.