La caracterización molecular de los árboles endémicos ... · Laurus, Apollonias, Persea y...
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La caracterización molecular de los árboles endémicos canarios como base para la estimación de la Diversidad Filogenética de la Flora Canaria. Ruth Jaén-Molina1*, Águedo Marrero1, José María Fernández-Palacios2, Alain Franc3, Juli Caujapé- Castells1 1Jardín Botánico Canario "Viera y Clavijo"-Unidad Asociada CSIC, Las Palmas de Gran Canaria (Spain); 2Universidad de La Laguna, Santa Cruz de Tenerife (Spain); 3INRA-UMR Biodiversité, Gènes et Communautés, Arcachon (France). V CONGRESO NACIONAL DE BIOLOGIA DE CONSERVACIÓN DE PLANTAS ES MERCADAL-MENORCA 28-30 DE SEPTIEMBRE Y 1 DE OCTUBRE DE 2011 Institut National de Recherche Agronomique (France)
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La caracterización molecular de los árboles endémicos canarioscomo base para la estimación de la Diversidad Filogenética de la
Flora Canaria.
Ruth Jaén-Molina1*, Águedo Marrero1, José María Fernández-Palacios2, Alain Franc3, Juli Caujapé- Castells1
1Jardín Botánico Canario "Viera y Clavijo"-Unidad Asociada CSIC, Las Palmas de Gran Canaria (Spain);
2Universidad de La Laguna, Santa Cruz de Tenerife (Spain); 3INRA-UMR Biodiversité, Gènes et Communautés,
Arcachon (France).
V CONGRESO NACIONAL DE BIOLOGIA DE CONSERVACIÓN DE PLANTAS
ES MERCADAL-MENORCA
28-30 DE SEPTIEMBRE Y 1 DE OCTUBRE DE 2011
Institut National deRecherche Agronomique (France)
ALGUNOS OBJETIVOS
-Construir un “Árbol de La Vida” preliminar de la Flora Canaria
-Establecer las bases para estimar la Diversidad Filogenética de la FloraCanaria (PD según Forest et al.2007, Schaeffer et al. in press )
1) “CASO GENERAL” (ÁRBOLES ENDÉMICOS CANARIOS)
•Testar la aplicabilidad de rbcL y matK (“códigos de barras moleculares” oficialespor el PWG CBOL, 2009) para la identification de los árboles endémicosCanarios.
PERSPECTIVAS FUTURAS:
•Evaluar tres locus (rbcL, trnH-psbA and trnK-rps16) para detectar posibles casosde especies crípticas en una muestra extensa de los tres géneros Macaronésicosde la familia Myrsinaceae: Heberdenia-Pleiomeris-Myrsine.
2) “CASO FOCAL” (MYRSINACEAE)
Basándonos en los resultados del proyecto arBOLcan, Garajonay,Bionatura entre otros:
MATERIAL y MÉTODOSRecolección de muestras y pliegos de herbario DNAbanK 6180
Amplificación y Secuenciación del ADN
Alineamiento, edición y análisis de datos
Caracteres diagnóstico detectados en distintasposiciones de secuencias alineadas de dos especies. Declic
Reconstructiónfilogenética
Extracción, cuantificación y conservación del ADN (Banco de ADN del JBCVC)
CTAB 2XPalmer et al, 1998
3. Heberdenia excelsa
2. Pleiomeris canariensisExclusiva de las Islas Canarias
Exclusiva de Azores
1. Myrsine africana (M. retusa)
No está presente en Azores.
Se distribuye en las Islas Canarias
y en Madeira.
CASO FOCAL (MYRSINACEAE)
¿Existen Diferencias Entre Las Especies DeMyrsinaceae Macaronésicas?
CASO FOCAL (MYRSINACEAE)
“aderno”: de porte yhojas de mayor tamaño,estando asociado a losbosques de laurisilva.
¿Apoyan los datos moleculares las diferencias morfológicas yecológicas encontradas en Heberdenia excelsa?
“saquitero”: de porte yhojas romboidales de menortamaño, estando asociado albosque termófilo.
-Matrices con un número variable de secuencias según el marcador(77, 63, 58 y 37 para combinado, respectivamente) representando alos tres géneros y diferentes localidades en los tres Archipiélagos: *Heberdenia excelsa (Gran Canaria, Palma,Gomera,Tenerife,Hierro y MD)
*Pleiomeris canariensis (Gran Canaria y Tenerife)
*Myrsine africana (Sao Miguel y Faial).
Análisis de datos
Búsqueda de caracteres diagnósticos(1 o más nucleótidos en el alineamiento
que son exclusivos de un taxa)Máxima parsimoniaMáxima verosimilitudInferencia bayesiana
-4 Matrices de datos para 3 marcadores diferentes rbcL, psbA-trnH y rps16-trnK (análisis por separado y/o combinados)
Caracteres diagnósticosDe las 3 matrices la correspondiente a la región rps16-trnK detectó aprox. dos veces máscaracteres diagnósticos que la región psbA y 20 diagnósticos más que rbcL (únicaregión que es oficialmente reconocida como “código de barras”)
character type/locus rbcL psbA-trnH trnK-rps16 3-reg
TOTAL DIAGNOSTIC 1 10 21 42
TOTAL POLIMORPHIC 11 12 22 45
TOTAL VARIABLES 12 22 42 76
Se encontraron caracteres diagnósticos suficientes en cada una de las regiones paradiscriminar a nivel específico (infragenérico) pero no caracteres diagnósticos quediscriminaran a nivel infraespecífico.
taxa/locus rbcL psbA-trnH trnK-rps16 3-reg
Mysine africana 1 1+1 (indel 10bp) 9+ 3 gap (1bp) +1 gap (6bp) 16
Pleiomeris canariensis 0 4 1 5
Heberdenia excelsa 0 3+1 (indel 3bp) 6+1 gap (9bp) 11
Para casos en los que no se detectan suficientes caracteres diagnóstico con rbcL posiblesbuenas candidatas como regiones alternativas son: trnK-rps16 y psbA-trnH puesen este estudio detectaron muchos más caracteres diagnóstico entre las Myrsinaceaeque rbcL.
(trnK-rps16= 58 taxa/ 589 cxs.)
Hay una clara discriminación entrecada uno los géneros.
Para cada uno de ellos :
-Myrsine: las muestrascorrespondientes a Faial seseparan de las de Sao Miguel.
-Pleiomeris: no hay separaciónentre muestras de Gran Canaria yTenerife.
-Heberdenia: Las muestras deGran Canaria parecen ocupar unaposición independiente de lasP,G,H y T que se engloban con lasde Madeira.
Análisis Filogenético
Bayesiano (50%Majority Rule)
Análisis FilogenéticoLos “adernos” de la G y P se agrupancon la forma intermedia de una de laslocalidades de Madeira (Laguna DonaBeija).
Mientras que las muestras de la otralocalidad de Madeira (Levada doFontes) parece quedar más cercana almorfotipo “saquitero” de Canarias.
Dentro de Canarias no hay unadistribución clara de los morfotiposquedando los adernos de la G y la Pseparados del de T, y los saquiterosde la G y el H en un cladoindependiente del que agrupa alsaquitero de la Palma con una muestrade MD. Los saquiteros de C quedanbasales al resto.
Se necesitan de más estudios tanto anivel molecular (nuevos marcadores)como morfológico (frutos y flores,además de las hojas) especialmente enMadeira.
(37 taxa/ 1.427cxs)
3 locus combinados
46 árbolesendémicos Canarios
Proyecto “arBOLcan”
Sambucus nigrassp. palmensis
Apollonias barbujanaMaytenus canariensis
Picconia excelsa Ilex canariensis
Erica arborea
Dracaena draco
Pinus canariensis
Arbutus canariensis Juniperus cedrus
Laurus novocanariensis
Sideroxylon canariensis
Visnea mocanera
CASO GENERAL
181720familias292632géneros383246taxones
120116individuosmatKrbcLtotalarBOLcan
rbcL= 116 secuencias y 407 caracteres
matK= 120 secuencias y 443 caracteres
Matrices analizadas:
(rbcL+matK)= 96 secuencias y 906 caracteres
Muestras representadas:
Además, con matK dentro degéneros como Euphorbia yRosaceae hay resolucióninterespecífica (E. melliferaseparada de E. bourgeauana yEuphorbia lambii) y
Resultados(locus por separado)
La asignación correcta deindividuos distintos de una mismaespecie fue del 100% con laexcepción de Ilex para rbcL(endiferentes clados)
Buena resolución a nivel de familias(sombreadas con color) y entregéneros, con la excepción deLauraceae (que no se resuelve conrbcL y con matK no permite distinguirentre Ocotea y Persea)
Las dos únicas familias deGymnospermas representadasquedan muy próximas entre sí(Cupressaceae y Pinaceae) ybasales en el árbol.
MP (árbol consenso)
matK
MP (consenso)
(rbcL+matK)
En general se obtiene unárbol mejor resuelto:
-Nuevamente todas lasfamilias se separan enclados independientes.
- Hay una mayordiscriminación tanto entregéneros (se distinguen los4 géneros de Lauraceae:Laurus, Apollonias,Persea y Ocotea) como anivel infragenérico p.e Ilexy Picconia (población dela Gomera se distingue dela de Madeira)
Resultados(2-locus combinados)
Declic
CASO GENERAL
Cualquier distancia utilizada en filogenia es relevante.
Declic (Franc et al, in press)Institut National deRecherche Agronomique(France)
Declic es un método que no requiere deun alineamiento previo.
El primer paso es construir una matrizbasada en pares de distancias deedición o distancia de Levenshtein.
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Dracaena : greenSambucus : yellowRubus : purpleHeberdenia : cyanEuphorbia : orangeMyrsine : plumApollonias : redPicconia : lightblueMyrica : lightgreenLaurus : navyblueIlex : magentaPleiomeris : turquoiseErica : pink
CASO GENERAL(rbcL)
La mayoría de los géneros se corresponden con « cliques » (salvo unas pocas excepciones como p.e Lauraceae)
Generación de gráficos según ladistancia de edición encontradaentre muestras (nodos).
Conclusiones (CASO GENERAL)
Las regiones rbcL y matK (“códigos de barras” oficialesresuelven bien lo árboles endémicos Canarios a nivel defamilia y entre la mayoría de los géneros analizados.
Cuando se analizan las 2 regiones combinadas, ladisciminación aumenta, lográndose resolver algunasrelaciones a nivel inter e infragenérico (4 géneros deLauraceae, Ilex y Picconia)
Declic, es una herramienta válida para la caracterizacióntaxonómica molecular, especialmente cuando se analizanmatrices con un elevado número de taxa y de caracteres(multilocus) pues no requiere de los muy laboriosos ycomplicados procesos de alineamiento.
“Árbol de la Vida” Flora Canaria
Resultados preliminares
(rbcL)
PD de La Flora Canaria
Diversidad Filogenética (PD) deCanarias
J.A. Reyes-Betancort & al. (2008).
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Supermatrices Flora Canaria
354 secuencias/ 475 cxs (rbcL)
94 taxones
46 géneros
33 familias
Porcentaje localidades/islasrepresentada:
G=38,70%
C=31,29%
T= 17,68%
P y H =ca. 8%
F y L =ca. 5%
Gracias! A todos los Jardines Botánicos, Parques Nacionales, UnidadesInsulares MedioAmbientales, Cabildos, Universidades Canarias y Españolas,y a todos aquellos que han colaborado en la recolección de muestras para elbanco de ADN del JBCVC. A las instituciones que han financiado losproyectos "arBOLcan“ y "Garajonay“ (Gobierno de Canarias, Medio Ambiente,Cabildo de Gran Canaria) y que nos han dado su apoyo para desarrollar otrosestudios.
- 46 ÁRBOLES ENDÉMICOS (20 Familias y 32 géneros)
*13 ampliamente distribuídas= presentes en todas o casi todaslas Islas Canarias:
(Phoenix canariensis, Laurus azorica, Myrica faya, Apollonias barbujana,Heberdenia excelsa,.....)
**11 distribución restringida=presentes en una ó dos de lasIslas Canarias :
(ILex perado ssp.lopezlilloi, Dracaena tamaranae, Laurus novocanariensis,Limonium dendroides, ....)
ÁRBOLES ENDÉMICOS CANARIAS
CASO FOCAL (MYRSINACEAE)
Myrsine africana
Islands Localities
Sao Miguel 3
Faial 3
Pleiomeris canariensis
Islands Localities
Gran Canaria 4
Tenerife 4
Heberdenia excelsa
Islands Localities
Gomera 5
Palma 4
Tenerife 5
Gran Canaria 4
Hierro 1
Madeira 3
Taxa Individuals Localities Islands
Myrsine africana 36 6 2
Pleiomeris canariensis 23 7 2
Heberdenia excelsa 71 22 6
Total 130 35 10
Muestreos (3 especies en 3 archipiélagos distintos)
Matrices de Datos (1 locus versus 3)
Para cada locus:
Para la combinación de los 3 locus:
Genus/region analyzed rbcL psbA-trnH rps16-trnKMyrsine 17 15 16Pleiomeris 11 12 3Heberdenia 49 36 35Total samples analyzed per locus 77 63 54
Genus/region analyzed rbcL+psbA-trnH+ rps16-trnK
Myrsine 12
Pleiomeris 3
Heberdenia 21
Total samples analyzed combined 36
three-loci combination
"official barcodes" "barcode candidates" 1 official barcode +2 other loci
rbcL psbA-trnH rbcL + psbA-trnH +rps16-trnK
rps16-trnK
Maximum parsimony Maximum parsimony Maximum parsimony
Maximum likelihood Maximum likelihood Maximum likelihood
Bayesian inferences Bayesian inferences Bayesian inferences
Diagnostic characters
one locus
Data Analysis
Métodos de Análisis(parsimonia, verosimilitud, bayesiano
y caracteres diagnósticos)
Polimórfico
Polimórfico
Monomófico
Monomórfico
DIAGNOSTICO
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NO- DIAGNÓSTICO
¿Qué es un carácter diagnóstico?Uno o más nucleótidos exclusivos en una posicióndeterminada de todas las secuencias alineadas de distintosindividuos de un taxa especifico. Puede ser monomórfico opolimórfico.
Análisis de Datos
one locus two-loci combinations
rbcL rbcL + matK
matK
Maximum parsimony Maximum parsimony
Maximum likelihood Maximum likelihood
Bayesian inferences Bayesian inferences
Diagnostic characters** ONLY IN "CONFLICTIVES" CASES
FAMILIAS CON 2 ó MÁS GÉNEROS:
-Myrsinaceae (Heberdenia & Pleiomeris)
-Caprifoliaceae (Viburnum & Sambucus)
-Lauraceae (Apollonias, Laurus, Ocotea & Persea)
FAMILIAS MONOTÍPICAS pero representadas por variosindividuos :
-Ilex (3 especies + 2 subsp.=14n)
Dracaenaceae (4 especies+ 1 subsp.=12n)
-Euphorbiaceae (4 especies =9n)
-Sambucus (2 especies + 1 subsp.=10n)
ÁRBOLES ENDÉMICOS CANARIASMuestras secuenciadas para rbcL
Green : HeberdeniaCyan : MyrsineRed : Pleiomeris
Cada género quedó englobado en un «clique» independiente.
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Un taxón es un clique cuando ladistancia de edición encontrada entrelas muestras que lo constituyen esmenor que un % de homologíaestablecido (p.e. 97%)
Conclusiones (CASO FOCAL)
ii) Los tres géneros de Myrsinaceae se resolvieron bien tanto con cada locus por separadocomo combinados y para cada uno de los métodos empleados pero parece que el análisis delos locus combinados por el método bayesiano permitió la obtención de los árboles mejorresueltos (apoyos de PP altos)
iii) La región psbA distinguió entre las poblaciones de Faial y Sao Miguel, por lo que seríaconveniente un estudio morfológico más detallado de Myrsine africana en Azores.
v) La variabilidad morfológica y molecular de las MyrsinaceaceasMacaronésicas necesitan de más estudios. La distinción entre“saquiteros” y “adernos” en las distintas islas y archipiélagos,requiere del análisis de más marcadores moleculares y, de unanálisis en profundidad de además de hojas, de los frutos yflores.
iv) El método Declic, es un método rápido y fiable para el análisis de regiones “código debarras” pues fue capaz de a partir de las secuencias rbcL sin alinear, discriminar sinambigüedades entre las muestras de Heberdenia, Myrsine y Pleiomeris analizadas.
