LA APLICABILIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS MICROORGANISMOS EN LA BIORREMEDIACIÓN DE

AMBIENTES CONTAMINADOS

introduccion

Muchas de las actividades industriales y agrícolas, especialmente en el último 50 años, han causado el aumento significativo de la concentración de contaminantes tóxicos en los ambientes. Entre las sustancias de origen humano los más peligrosos son los clorofenoles, nitrofenoles, BTEX (benceno, etilbenceno, tolueno y xileno), policíclico aromático hidrocarburos policíclicos (PAHs), bifenilos policlorados y orgánica disolventes. Las principales fuentes de estos compuestos en el suelo, las aguas residuales y los acuíferos son la gasificación del carbón, del horno de coque baterías, refinería, plantas petroquímicas y otras industrias, tales como la síntesis de productos químicos, herbicidas y pesticidas. La mayoría de estas sustancias son mutágenos y cancerígenos, romper lentamente y permanecer en el ambiente durante un largo período de tiempo. Por esta razón, la eliminación de esos productos químicos tóxicos procedentes de zonas contaminadas es constantemente de gran importancia [1, 11, 19, 26].

Métodos Hoy en día, biológicos en el tratamiento de los contaminantes orgánicos se recomiendan. Uno de los posible, rentable y seguro tecnología, que permite resolver el problema de contaminación es biorremediación. Se refiere a un proceso que utiliza microorganismos y sus enzimas para promover la degradación y la eliminación de contaminantes desde el medio ambiente. Métodos de biorremediación se realizan ya sea in situ (bioaumentación, bioestimulación y bioventeo) y ex situ (en tierra ubicadas, biopilas y biorreactores) [9, 26, 27].

Técnicas de biorremediación utilizan microorganismos debido a que muchos de ellos son capaces de descomponer contaminantes. Está conectado con su metabolismo que implica reacciones bioquímicas o

vías relacionadas con la actividad de los organismos y el crecimiento.

Microorganismos puede descomponer o transformar sustancias peligrosas al menos metabolitos tóxicos o degradar a productos finales no tóxicos. en el proceso llamado "cometabolismo" la transformación de contaminantes produce poco o ningún beneficio a la célula, por lo que se describe como una biotransformación sin beneficios [5, 9, 25].

A principios de los años 80 el desarrollo de la genética técnicas de ingeniería y estudio intensivo del potencial metabólico de microorganismos permitido diseñar microorganismos modificados genéticamente (MMG). En la actualidad, se aplican en una variedad de campos como la humana la salud, la agricultura, la biorremediación y diferentes tipos de industria [5].

La construcción de microorganismos modificados genéticamente, que será capaz de degradar orgánica compuestos, es posible porque muchas vías de degradación, enzimas y sus respectivos genes son conocidos y son reacciones bioquímicas bien entendido. Este conocimiento le da la oportunidad de crear MMG con nuevas vías metabólicas. Los microorganismos modificados genéticamente pueden ser una alternativa solución para cepas silvestres que degradan lentamente o no contaminantes en absoluto. Enfoques innovadores son indispensables para disminuir el nivel compuestos orgánicos de tóxicos en los ambientes y mantener su buena calidad y estado ecológico [5, 27]. En 1981 en

los EE.UU. los dos primeros cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa (NRRL B-5472) y Pseudomonas putida (NRRL B-5473) fueron patentados. ellos eran construido por Chakrabarty a principios de los 70 y los genes contenidos para el naftaleno, salicilato y la degradación de alcanfor [43]. Sucesivamente, naftaleno-degradar Pseudomonas fluorescens HK44 representa la primero microorganismo genéticamente modificado aprobado para pruebas de campo en los EE.UU. con fines de biorremediación [33].

Esta revisión se centra en la construcción y uso de microorganismos modificados genéticamente en la biorremediación de ambientes contaminados con orgánicos compuestos. Presenta varias herramientas y estrategias moleculares cómo crear nuevos microorganismos modificados y cómo usarlos en el entorno de forma segura. También se analiza el riesgo asociado a la liberación de los microorganismos modificados genéticamente en las zonas contaminadas. Además, algunos ejemplos de aplicaciones de GMM en experimentos de laboratorio y de campo se presentan. En parte final de esta revisión, se presta especial atención a las disposiciones legales de los organismos modificados genéticamente (OMG). una biotransformación sin beneficios [5, 9, 25].

Construcción de microorganismos modificados genéticamente La ingeniería genética es una tecnología moderna, que permite a microorganismos de diseño capaces de degradar contaminantes específicos. Ofrece la oportunidad de crear combinación artificial de genes que hacen no existir juntos en la naturaleza. Las técnicas usadas más a menudo incluyen la ingeniería con los genes individuales o operones, la construcción y vía alternancias de las secuencias de genes existentes [5, 8, 18].

El primer paso en la construcción de GMM es adecuada selección de genes / s. A continuación, el fragmento de ADN a clonar se inserta en un vector y se introduce en células hospedadoras. Las bacterias modificadas se denominan células recombinantes. El siguiente paso es la producción de gen múltiple copias y la selección de células que contienen ADN recombinante. la final paso incluye la detección de clones con insertos y de ADN deseadas propiedades biológicas [7, 8, 18, 28, 39]. Las etapas básicas en molecular clonación ilustra la Figura 1.

Las bacterias, especialmente de género Pseudomonas, son el objeto principalde manipulaciones genéticas. Hay habitantes omnipresentes de muchos medio ambiente y son conocidos como microorganismos degradadores eficiente de muchas tóxico sustancias. Tanto su cromosoma y los plásmidos pueden llevar genes para metabolismo de estos compuestos. Por lo tanto, dichos microorganismos son la principal fuente de genes catabólicos de la ingeniería genética [5, 9].

El primero plásmido TOL catabólica (117 pb) a partir de Pseudomonas putida mt-2 fue descrito por Williams y Murray [40]. Contiene dos operones enzimas que codifican xylUWCMABN y xylXYZLTEGFJQKIHSR involucrados en el metabolismo de tolueno, m-y p-xileno y m-etiltolueno. Otro plásmido catabólico NAH7 (83 kb) de P. putida G7 es un donante de dos operones NaH y sal, enzimas de codificación para naftaleno y metabolismo salicilato [25]. La tod operón de P. putida F1 es a menudo utilizado en experimentos de ingeniería genética como una fuente de todABC1C2DEF genes responsables de la degradación de tolueno [42]. A su vez, bifenil la utilización de bacterias Burkholderia cepacia LB400 puede ser utilizado como un donante bphAEFGBC de genes [23]. Muchos genes catabólicos plásmidos nacido para la degradación de las sustancias tóxicas a menudo se encuentra en los transposones, para ejemplo en Tn4653 de P. putida mt-2, Tn4655 de P. putida G7 y Tn4656 de P. putida MT53 [36].

Los plásmidos se utilizan comúnmente como vectores de clonación en genética ingeniería para multiplicar o las expresan genes particulares. Vector es una genética molécula para la transferencia de una nueva información genética en otras células, donde se replica independientemente de su ADN cromosómico. A menudo contiene un conjunto de diversos genes, por ejemplo genes de resistencia a antibióticos. Los otros elementos genéticos llamados transposones también podrían actuar como vectores [8, 9, 28].

Hoy en día, los vectores plásmidos artificiales en la construcción de MMG se utilizan comúnmente. Contienen las mejores características derivadas de diferentes plásmidos naturales tales como Oric (origen de replicación), MCS (sitio de clonación múltiple) y genes marcadores. En la actualidad, la expresión plásmidos son ampliamente utilizados, ya que permiten la producción rápida de una gran cantidad de proteína deseada. Además de los vectores, enzimas como una poderosa herramienta de ingeniería genética en las técnicas de cortar y pegar son indispensables. Estos incluyen enzimas de restricción que cortan el ADN en un región y ligasas de ADN específicas que cierran las mellas en el fosfodiéster columna vertebral de ADN. Entre ellos, la endonucleasa de restricción EcoRI, BamHI y HindIII y ADN ligasa de T4 se utilizan comúnmente en molecular biología [7, 8, 18, 38].

Por razones prácticas, muchos vectores recombinantes fueron diseñados. Por ejemplo, Ouyang et al. [29] plásmido pBBR1MCS-2 construidos albergar fragmento de 3,9 kb que contiene el promotor tac del plásmido pKST11 y todC1C2BA genes responsables de la degradación de tolueno. Este Se insertó ADN recombinante en el sitio de BamHI del plásmido para expresar genes tod en Pseudomonas putida KT2442, P. stutzeri 1317 y Aeromonas hydrophila 4AK4. En otro estudio, Chen et al. [6] diseñado artificial plásmido por clonación de genes OHB (orthohalobenzoate 1,2-dioxigenasa) en pSP329 vector y el gen lacZ en su sitio HaeII. A su vez, Sayler y Ripp [33] utiliza el transposón Tn4431 como vector de genes lux. Haro y de Lorenzo [14] vía montado incluido uno catabólico codificación segmento tolueno dioxigenasa del sistema TOD de P. putida F1 (todC1C2BA) y el segundo segmento catabólico codifican la totalidad

vía superior TOL de pWW0 plásmido de P. putida mt-2. tanto TOD y los fragmentos se ensamblaron en TOL separada bacteriana mini-Tn5 transposones y se insertaron en el cromosoma de 2-clorobenzoato degradadores P. aeruginosa PA142 y P. aeruginosa JB2. Transferencia genética es el mecanismo por el que se transfiere ADN de un donante a un receptor. En escala de laboratorio,recombinante bacterias capaces de metabolizar compuestos orgánicos tóxicos son generalmente obtenido a través de la transformación. La transformación es la transferencia de genes que resulta de la absorción de ADN desnudo libre del ambiente por unas células bacterianas competentes receptoras. La siguiente posibilidad de ADN transferencia por contacto físico directo entre las células es la conjugación.

La transferencia de ADN mediante conjugación se produce sólo en una dirección, desde un donante a un receptor [8, 28]. Ouyang et al. [29] utiliza la conjugación como una forma de transferencia de plásmido a partir de Escherichia coli pKST11 S17-1 a tres cepas receptoras representan por P. putida KT2442, P. stutzeri 1317 y A. hydrophila 4AK4. Chen et al. [6] plásmido transferido PE43 en las células receptoras Sinorhizobium meliloti por electrotransformación (baja tensión, corriente continua). A su vez, Matsui et al. [24] transforma

Mycobacterium sp. y las células competentes de E. coli JM109 con plásmido recombinante pNC950 por electroporación (de alto voltaje pulsos de electricidad). Hoy en día, para la selección e identificación de microorganismos modificados genéticamente moderna técnicas moleculares como FISH (hibridación fluorescente in situ), en la PCR in situ (en la reacción en cadena de la polimerasa in situ), DGGE (desnaturalización electroforesis en gel de gradiente), TGGE (gel de gradiente de temperatura electroforesis), T-RFLP (restricción terminal de longitud de los fragmentos polimorfismo) y ARDRA (análisis de restricción ADNr amplificado) están utilizado. Estos métodos se basan en la detección de ADN o ARN específica secuencias, fragmentos especialmente conservadores en bacteriana 16S rRNA [27, 37]. Por ejemplo, Dejonghe et al. [10] utiliza DGGE para la supervisión transferencia horizontal de los plásmidos pEMT1 y pJP4 de donante Engineered cepa de P. putida UWC3 a las bacterias indígenas durante la degradación de ácido 2,4-diclorofenoxiacético en el suelo.

Otra forma de seguimiento y visualización de bacterias en el medio ambiente muestras es sistema de marcadores. El sistema marcador ideal debería permitir detección y cuantificación de organismos específicos y permitir a supervisar los eventos celulares asociados con la expresión de genes y la señal transducción. Como genes marcadores lacZ (β-galactosidasa), lux (bacteriana sistema luciferina-luciferasa), tfd (monooksygenase), xylE (catecol 2,3-dioxigenasa), GFP (proteína verde fluorescente) son comúnmente aplicado [8, 9, 15, 37]. Sayler y Ripp [33] utilizan operón lux en el plásmido pUTK21 para la detección de la cepa recombinante naftaleno-degradantes de P. fluorescens HK44 en el suelo. En otro estudio, Villacieros et al. [38] monitoreado P. fluorescens recombinante F113L :: 1180 cepa por el gen gfp expresión durante la biorremediación rizosfera de policlorados bifenilos (PCB). A su vez, Quan et al. [31] genes marcadores utilizados dsRed (proteína fluorescente de color rojo) situado en el gen gfp plásmido y pJP4 inserta en el cromosoma de P. putida SM1443 en la detección de recombinant bacterias durante ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) la degradación en el suelo bioaumentado. Con el fin de reducir el riesgo potencial de la utilización de microorganismos modificados genéticamente en el entorno se crean algunas barreras genéticas. Limitan la supervivencia de bacterias recombinantes y la transferencia de genes. La propagación de genes de

MMG a otros microorganismos pueden estar limitadas por el uso de transposones sin gen transposasa o eliminando genes de conjugación de tra el plásmido recombinante. Transferencia horizontal de genes al azar puede ser también disminuido mediante la inserción en el vector colE3 gen que codifica colicina que todos los cortes 16S rRNA procariotas y mediante el control de gen que codifica immE3 represor de la síntesis colicina [9, 20]. La regulación del gen letal

presenta la Figura 2.

Higo. 2. Reglamento del gen letal. La transferencia horizontal del plásmido

con el gen colE3 a otra celda sin gen bacteriano en immE3 cromosoma conduce a su muerte [20; modificado]. abreviaturas: Chr - cromosoma bacteriano, Pl - plásmido. Explicación en el textoMMG con fines de biorremediación

La fusión de la microbiología tradicional, bioquímica, ecología y la ingeniería genética es una solución muy prometedora para la biorremediación in situ. Muchos informes mostraron que los microorganismos modificados genéticamente tenían mayor predisposición a las caries de diversos contaminantes orgánicos en comparación con las cepas naturales [5]. El ejemplos de microorganismos modificados genéticamente seleccionados que degradan compuestos orgánicos tóxicos son

presentado en la Tabla 1.

Tabla 1

MMG degradar compuestos orgánicos MMG Introducido gen / s de referencia compuesto orgánico Escherichia coli AtzA chlorohydrolase atrazina atrazina [34] Pseudomonas fluorescens HK44 luxCDABE naftaleno [33] Burkholderia cepacia L.S.2.4 pTOD plásmido tolueno [2] Pseudomonas fluorescens F113rifpcbrrnBP1 :: GFP mut3 Pseudomonas putida KT2442 (pNF142 :: TnMo- d-OTC) Burkholderia cepacia VM1468 pTOM-Bu61 plásmido tolueno [35] Rhodococcus sp. RHA1 (pRHD34 :: fcb) fcbABC operón Pseudomonas putida PaW85 pWW0 plásmido de petróleo [17] Comamonas testosteroni SB3 pNB2 :: dsRed plásmido 3-cloroanilina [3] Escherichia coli JM109

(pGEX-AZR) azorreductasa genes colorantes azoicos decolorize, Pseudomonas putida PaW340 (pDH5) pDH5 plásmido ácido 4-clorobenzoico [22]

Hay una amplia gama de posibilidades para manipulaciones genéticas de bacterias para fines de biorremediación. Ellos incluyen la modificación de especificidad de la enzima, el diseño de una nueva vía metabólica y su la regulación, la introducción de gen marcador para la identificación de recombinante en el entorno y la construcción de biosensor para contaminada detección de compuestos químicos específicos [9, 20, 33]. La genética Pseudomonas fluorescens ingeniería HK44 fue el primera cepa utilizada en el experimento de campo. El objetivo de este estudio fue evaluar su aplicabilidad en la biorremediación a largo plazo de naftaleno suelo contaminado y para visualizar las células inoculadas por bioluminiscencia imagen. P. fluorescens HK44 contenía plásmido pUTK21, que se hizo por transposón Tn4431 de inserción en el plásmido NAH7 de P. fluorescens 5R. Este transposón se originó a partir de Vibrio fischeri y llevó a luxCDABE casete del gen. Los genes responsables de la degradación del naftaleno casete de vía y el gen lux se dispusieron bajo un común promotor lo que dio lugar a la degradación simultánea de naftaleno y la señal luminiscente [33]. La otra cepa modificada genéticamente P. putida KT2442 (pNF142 :: TnMod-OTC) capaces de degradar naftaleno en el suelo fue construido por Filonov et al. [12]. Para su construcción Se utilizaron tres cepas de bacterias. Ellos incluyen Escherichia coli S17-1 con el plásmido pTnMod-OTC (llevar resistencia a la tetraciclina gen), Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) capaces de degradar naftaleno y P. putida KT2442 con el gen GFP localizada en el cromosoma. El resultados de este estudio confirman que las bacterias

recombinantes podía degradar naftaleno y transferir plásmido pNF142 :: TnMod-OTC microorganismos autóctonos. La posibilidad de plásmido de transferencia pWW0 de Pseudomonas putida PaW85 capaz de hidrocarburos de petróleo degradantes en la rizosfera bacterias fue estudiado por Jussila et. al. [17]. Afirmaron que horizontal se han producido eventos de transferencia de genes en suelo contaminado con petróleo entre PaW85 y Pseudomonas oryzihabitans 29. Debido a las bacterias BPH operón, plásmido pNF142, gfp clorada bifenilos [4] naftaleno gfp [12] 2 (4) -chlorobenzoate 2 (4) -chlorobiphenyl [32] C. I. Direct Blue 71 [16

Hay una amplia gama de posibilidades para manipulaciones genéticas

de bacterias para fines de biorremediación. Ellos incluyen la modificación de especificidad de la enzima, el diseño de una nueva vía metabólica y su la regulación, la introducción de gen marcador para la identificación de recombinante en el entorno y la construcción de biosensor para contaminada detección de compuestos químicos específicos [9, 20, 33]. La genética Pseudomonas fluorescens ingeniería HK44 fue el primera cepa utilizada en el experimento de campo.

El objetivo de este estudio fue evaluar su aplicabilidad en la biorremediación a largo plazo de naftaleno suelo contaminado y para visualizar las células inoculadas por bioluminiscencia imagen. P. fluorescens HK44 contenía plásmido pUTK21, que se hizo por transposón Tn4431 de inserción en el plásmido NAH7 de P. fluorescens 5R. Este transposón se originó a partir de Vibrio fischeri y llevó a luxCDABE casete del gen. Los genes responsables de la degradación del naftaleno casete de vía y el gen lux se dispusieron bajo un común promotor lo que dio lugar a la degradación simultánea de naftaleno y la señal luminiscente [33]. La otra cepa modificada genéticamente P. putida KT2442 (pNF142 :: TnMod-OTC) capaces de degradar naftaleno en el suelo fue construido por Filonov et al. [12]. Para su construcción Se utilizaron tres cepas de bacterias. Ellos incluyen Escherichia coli S17-1 con el plásmido pTnMod-OTC (llevar resistencia a la tetraciclina gen), Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) capaces de degradar naftaleno y P. putida KT2442 con el gen GFP localizada en el cromosoma. El resultados de este estudio confirman que las bacterias recombinantes podía degradar naftaleno y transferir plásmido pNF142 :: TnMod-OTC microorganismos autóctonos.

La posibilidad de plásmido de transferencia pWW0 de Pseudomonas putida PaW85 capaz de hidrocarburos de petróleo degradantes en la rizosfera bacterias fue estudiado por Jussila et. al. [17]. Afirmaron que horizontal se han producido eventos de transferencia de genes en suelo contaminado con petróleo entre PaW85 y Pseudomonas oryzihabitans 29. Debido a las bacterias de 4-CBA. Los genes responsables de la FCB deshalogenación hidrolítica de 4-CBA a ácido 4-hidroxibenzoico (4-HBA) originado a partir de donantes Arthrobacter sp. Cepa FG1. El recombinante obtenido, así como de donantes de los genes FCB eran capaces de degradar 4-CBA efectiva, tanto en estéril y suelo no estéril. Por lo tanto, podrían ser utilizados en la biorremediación de

áreas contaminadas con 4-CBA.

Genéticamente microorganismos modificados se pueden aplicar no sólo en la degradación de compuestos tóxicos, sino también en la promoción de crecimiento de las plantas.

Generalmente, las bacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPB) no son capaces de estimular el crecimiento de las plantas en presencia de diversos compuestos tóxicos [5, 9, 30]. Por esta razón, Yang et al. [41] trataron de diseñar genéticamente bacterias modificadas que podrían promover el crecimiento del maíz y degradar fenol simultáneamente. Las cepas utilizadas para la construcción de tales recombinante incluido fenol degradantes de Pseudomonas aeruginosa SZH16 que era no es capaz de promover el crecimiento de las plantas y fluorescens PGPB Pseudomonas sin capacidad para degradar fenol. Como resultado de la horizontal de genes transferir obtuvieron P13 recombinante, que estimuló el maíz crecimiento y fenol degradada con eficacia. En otro estudio, Barac et al. [2] utilizado manipulación genética para mejorar la eficiencia de tolueno desintoxicación. Para este propósito, se transfirieron tolueno-degradación plásmido pTOD de donante Burkholderia cepacia G4 en naturales cepa endófito de altramuz amarillo B. cepacia LS2.4. la obtenido resultados mostraron que las bacterias recombinantes tenían potencial de tolueno la degradación y la transpiración reducida a través de las hojas en el rango de 50 a 70%. Otro huésped natural amarillo altramuz B. cepacia VM1468 era utilizado por Taghavi et al. [35] en tolueno degradación experimento. Este cepa endófito se construyó mediante transferencia plásmido pTOM-Bu61 de B. cepacia BU61 través de la conjugación en B. cepacia BU0072. era confirmado que en presencia de tolueno ingeniería endófito transpiración a través de las partes aéreas de las plantas era 5 veces amante que en las plantas de control. Por otra parte, el aumento de aproximadamente el 30% de las raíces y

Se observó hojas de masa. Estos resultados indicaron que el plásmido pTOM- Bu61 podría transferir naturalmente a otros endófitos naturales en planta y estimular la degradación de tolueno. La construcción de naftalin- bacterias endofíticas degradantes Pseudomonas putida VM1441 (pNAH7) fue descrito por Germaine et al. [13]. Informaron que endofítico cepa podría proteger a las plantas de guisante de algunos de los efectos tóxicos de los naftaleno. Además, la inoculación de plantas con recombinante resultó en una mayor alrededor del 40% de eficacia de la eliminación de naftaleno en comparación con las plantas control de la ONU-inoculado.

Las normas de derecho

Los principios de la legislación polaca definen los organismos genéticamente modificados En el acto oficial en GMO 2001.76.811 del 25 de julio de 2001 (artículo 3, ley del 22 de junio de 2001). A su vez, el decreto del Ministro de Justicia de 08 de julio 2002 contiene normas sobre OGM, su utilización y liberación en medio ambiente. La República de Polonia como miembro de la Unión Europea Unión también depende de la legislación de la UE. Normativa básica sobre los OGM son contenida en el Parlamento Europeo y el Consejo de las directivas europeas: 2001/204 / WE del 8 de marzo de 2001, 2001/18 / WE, de 12 de marzo de 2001 y 2009/41 / WE, de 6 de mayo de 2009.

Conclusiones

La biodegradación de compuestos orgánicos tóxicos en el suelo es un complejo y el proceso de múltiples etapas. Se procede de manera efectiva sólo en favorable condiciones ambientales. La eficacia de biodegradación depende no sólo en la estructura química de los contaminantes, la estructura del suelo, pero También potencial catabólico de los microorganismos. La ingeniería genética ofrece una gran oportunidad para el uso de la capacidad natural de las bacterias en construcción de MMG. Por desgracia, son aplicables principalmente en condiciones de laboratorio. El nuevo enfoque relacionado con el uso

Parece bacterias endofíticas-planta asociada a ser un muy prometedor solución en la remediación de áreas contaminadas. Sin embargo, este campo de estudio requiere aún mucho trabajo a escala de laboratorio.