Ensayos enzimáticos

José Luis Cárdenas López

2014-1

Actividad

• Normalmente la actividad se evalúa siguiendo

la formación de producto vs tiempo

A

tiempo

[pro

du

cto

]

Inicia con una relación Lineal, pero va declinando

¿Porqué?

• Uso del sustrato

• Se aproxima al equilibrio (remover producto)

• El producto causa inhibición

• Inestabilidad de los reactantes• Inestabilidad de los reactantes

• Dependencia del tiempo

• Artefactos del método

• Cambios (pH)

• SOLUCIÓN: “velocidad inicial”

Velocidad inicial

• Trazar una tangente mediante regresión lineal

de los puntos iniciales, mientras se observa la

linearidad

y = a+bx

A

tiempo

[pro

du

cto

]

y = a+bx

Tipos de ensayos enzimáticos• Fotométricos (ley de Lambert Beer)

• Radiométricos (sustratos etiquetados con

isotopos radiactivos)

• Fluorométricos

• HPLC

• ELISA (ligados a inmunología)

• Electroquímicos (electrodos)

• Después de electroforesis (zimograma)

• Ensayos acoplados (medir una reacción

secundaria)

Radiometría

fluorometría

Kit para medir actividad de la HDAC (histona desacetilasa)…DNA

Se mide la fluorescencia de la aminometil cumarina (AMC)

ELISA

zimogramasIncorporar sustrato al gel

Ensayos acoplados

Enzima glutamiltransferasa

Glutatione

Remueve el glutamil del glutatione y lo pasaa un aceptor

Usada para medir glutatione

Enzima leucil aminopeptidasa Cys se lee facilmente

Capiello, et al 2013

Fotométricos (colorimétricos)

BApNA

Tripsina

BA + pNA

Absorbe en el Amarillo 410 nm

Sustrato cromogénicocromófero

Las unidades

• La unidad más utlizada es la U (unidad)

• La comisión internacional de nomenclatura de

bioquímica recomienda el uso del catal (kat)

como parte del SI (sistema internacional de como parte del SI (sistema internacional de

unidades)

• 1 catal corresponde a la conversión de 1 mol

de sustrato por segundo

• Inconvenientemente grande!!!

conversión

1 kat = 60 mol min -1 = 6 x 107 Unidades1 Unidad = 1 mM min-1 = 16.67 nkat

En la práctica se sigue usando más la Unidad, sobre todo en América, En la práctica se sigue usando más la Unidad, sobre todo en América, pero para fines de consistencia el catal puede ser la opción

Condiciones para la medición de

actividad

• Volúmenes pequeños = grandes errores al

convertir a moles o M

• Tiempo es crítico, debe ser muy exacto

• Temperatura• Temperatura

• pH

• Actividad = condiciones operativas

• Mantener activa la enzima (hielo)

Ley de Lambert-Beer

Dr. José Luis Cárdenas López

2014-1

cIo I

b

Si consideramos un rayo de luz monocromático que pasa a través de una disolución de un material que absorbe luz, la intensidad de la luz incidente disminuye de Io a I, al pasar por la muestra, debido a que la disolución la absorberá.

cIo I

Se le denomina transmitancia (T), a la cantidad de luz que pasa a través de una sustancia y se define por:

El logaritmo negativo de la transmitancia, la absorbancia (A), es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida y a la longitud del paso de la luz a través de la sustancia

Ley de Lambert

K1 es una constante y b es la longitud del medio

Ley de Beer

El logaritmo negativo de la transmitancia es también directamenteproporcional a la concentración de la sustancia absorbente c

Ley de Lambert-Beer

Si se combinan ambas leyes se obtiene :

Donde a es una constante llamada coeficiente de extinción (combinación de K1 y K2). Este coeficiente es dependiente de la longitud de onda (λλλλ) que atraviesa la sustancia y de la naturaleza química de la misma,

b es el paso de luz en cm (generalmente 1 cm) y c, la concentración de la sustancia.

Unidades

Las unidades del coeficiente de extinción dependen de las de c y viceversa. Si se expresa a como coeficiente de extinción molar (εεεε), cSi se expresa a como coeficiente de extinción molar (εεεε), cse expresa como moles por litro, o si a se expresa como milimolar, la concentración se expresará en milimolar.

Cálculos

Abs

403

nm

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Para la Vo

Usar ecuación de la regresión en la

tiempo (seg)

0 100 200 300 400 500 600 700

Abs

403

nm

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

tiempo

dAbs

Usar ecuación de la regresión en la

región inicial

EjemploFosfatasa alcalina

Tiempo Abs 403

0.7

0.8

0.90.05 0.50015712

10.0500002 0.55144584

20.0499992 0.5940221

30.0499992 0.62339956

40.0499992 0.64703828

50.0499992 0.66614646

60.0499992 0.68148702

70.0500031 0.69441003

80.0500031 0.70636261

90.0500031 0.71745592

100.050003 0.72665113

tiempo (segundos)

0 50 100 150 200 250 300 350

abs

403

0.4

0.5

0.6

0.7

Col 1 vs Col 2 Y=0.00365716 (X)+ 0.50988651

100.050003 0.72665113

110.050003 0.73463792

120.050003 0.74266666

130.050003 0.75084096

140.050003 0.75919402

150.050003 0.76732302

160.050003 0.77470923

170.050003 0.78061092

180.050003 0.78854549

190.050003 0.79529941

200.050003 0.80309194

210.050003 0.80963796

220.050003 0.8161602

230.050003 0.8238216

240.050003 0.83128041

250.050003 0.83928275

260.049988 0.84640175

270.049988 0.85312891

280.049988 0.85917383

290.049988 0.86543709

300.049988 0.87281275

¿No se sabe el coeficiente de

extinción molar?curva estándar de paranitrofenol

0.8

1.0

[paranitrofenol (M)]

0 1e-5 2e-5 3e-5 4e-5 5e-5

ans

403

nm

0.0

0.2

0.4

0.6

Coefficients: b[0] -4.9412451362e-3 b[1] 18974.59

r ² 0.9995664551

Pendiente de la curva de calibración

literatura: (a 405 nm)18,000 M-1 cm-1

Convertir Abs a vo

tiempo

dAbs403

1min221.min

60

40

147.0 −=

= seg

segvo

Pendiente de la región inicial

ANÁLISIS DIMENSIONAL

clA ε=Usando la ley de Lambert-Beer

Vo en M/min)1*18974(

min)/221.0(11 cmcmM

vo −−=

Vo= 1.162 x 10-5 M/min