Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos · 2013. 6. 18. · - 0,5 % (16 de 3115) de las...

CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN


Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos:

Análisis físico-químico de medicamentos veterinarios

Unidad Zoosanitarios

Majadahonda, 5 de junio de 2013


Programa Jornada Zoosanitarios

Actividades de referencia y nuevos objetivos Patricia Muñoz

Información procedente de EU-RLs: RIKILT (Wageningen), BVL (Berlín) y ANSES (Fougeres) José Blanca y Patricia Muñoz Análisis de fenilbutazona en músculo equino Regina Muñoz Análisis de epímeros de tetraciclinas Macarena Ramos

JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS Majadahonda, 5 de Junio 2013



Intercomparación de medicamentos veterinarios en

piensos. Preparación y resultados. Jaume Bosch. Laboratorio Agroalimentario. Cabrils

Póster: “ Experiencia de validación método de cribado LC-MS/MS

para análisis de residuos de antibióticos en músculo”. Laboratorio de Salud Pública de Jaén




Actividades de referencia y nuevos objetivos

Patricia Muñoz. Unidad Zoosanitarios.

Análisis físico-químico de medicamentos veterinarios. Jornadas de Referencia sobre Análisis de Alimentos. Majadahonda, 5 de junio de 2013


Contenido

Principales actividades como LNR

Crisis de la carne de caballo: análisis de

fenilbutazona

Inspección FVO 2013

Workshop ANSES 2012



Sustancias para las que somos LNR (1)

Grupo A (2) : Sustancias con efecto anabolizante y sustancias no autorizadas

1. Estilbenos 3. Esteroides 4. Lactonas del ácido resorcílico 5. β-agonistas 6. Sustancias incluidas en el Anexo IV Reglamento

2377/90 cuadro II del Reglamento 37/2010: sólo para cloranfenicol y nitrofuranos

(1) BOE 20-junio-2007 (2) Anexo I de Directiva 96/23/CE y BOE 7-agosto-1998.


Grupo B (2) : Medicamentos Veterinarios (incluidos los no registrados) y contaminantes.

1. Antibacterianos 2f. Otras sustancias con actividad farmacológica: - Corticosteroides - Carbadox y olaquindox 3e. Colorantes

(1) BOE 20-junio-2007 (2) Anexo I de Directiva 96/23/CE y BOE 7-agosto-1998.

Sustancias para las que somos LNR (1)


ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN ENSAYOS DE APTITUD 2012

Hormonas en orina de bovino (57-ZO-12) Quinolonas en músculo de porcino (58-ZO-12)

Anunciados en la CL Nº 244 (3 septiembre 2012) Envío muestras: 24 de septiembre 2012 Fecha límite entrega de resultados: 19 octubre Informes definitivos: 18 noviembre 2012




Hormonas en orina de bovino (57-ZO-12)

2 muestras / 7 compuestos evaluados (A1, A3 y A4)

Analitos adicionados: DES 1,5 µg/kg y zeranol 1 µg/kg 15 participantes (10 LC-MS/MS, 4 GC-MS/MS y

1 GC-MS)

Resultados en general satisfactorios



ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN ENSAYOS DE APTITUD

PARÁMETRO % Acreditados

% Validados

% No Validados

Dietilestilbestrol (DES) 80 6,7 13,3 Zeranol 66,7 13,3 20 β boldenona 26,7 13,3 60 β nortestosterona 46,7 6,7 46,6 Estanozolol 26,7 6,7 66,6 Metiltestosterona 26,7 6,7 66,6 16 β hidroxiestanozolol 13,3 6,7 80


Hormonas en orina de bovino (57-ZO-12)



Quinolonas en músculo de porcino (58-ZO-12)

2 muestras / 6 compuestos evaluados y la suma de enrofloxacina y ciprofloxacina

Analitos adicionados: enrofloxacina (100 µg/kg) y ciprofloxacina (100 µg/kg)

13 participantes (10 LC-MS/MS, 2 HPLC-Fluor y 1

combinado HPLC-Fluor + LC-MS/MS)



ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN ENSAYOS DE APTITUD

Estado métodos físico-químicos Ensayo Acreditados Validados No validados Quinolonas 2012 (músculo porcino)

9/13 69,2%

2/13 15,4%

2/13 15,4%




Quinolonas en músculo de porcino (58-ZO-12)

Resultados individuales satisfactorios, a excepción de 1 NS (cuantificación en exceso) con método validado/ no acreditado

Resultados suma de cipro y enro no adecuados en

algunos casos (sumas no correctas, CCα suma no declarado, información incompleta…)



Reglamento (UE) Nº 37/2010


Sustancia farmacológicamente activa

Residuo marcador

Especie animal

LMR Tejido

Enrofloxacino Suma de enrofloxacino

y ciprofloxacino

Porcino

....

100 µg/kg

...

Músculo

...

La decisión de conforme/no conforme debe hacerse en base a la suma


LMR suma de varios compuestos: CÁLCULO DE CCα

En el caso de LMRs expresados como suma de varias sustancias ¿cómo se calcula el CCα ?

SANCO/2004/2726-rev 4 December 2008 GUIDELINES FOR THE IMPLEMENTATION OF

DECISION 2002/657/EC (Aptdo. 3)

- Comunicación de Laboratorio Nº 113 - Presentación Jornadas de Referencia CNA de 2011



ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN DE OTRAS COMPARACIONES

Gestágenos en grasa perirrenal (58-ZO-12) - ensayo bilateral -

No existen proveedores comerciales Petición de un laboratorio 2 muestras / 1 compuesto evaluado Analito adicionado:

Acetato de melengestrol 1,6 µg/kg 2 participantes (2 LC-MS/MS) Resultados satisfactorios



ACTIVIDADES COMO LNR: ORGANIZACIÓN DE ENSAYOS DE APTITUD

ENSAYOS DE APTITUD PROGRAMADOS PARA 2013 (último cuatrimestre):

- Penicilinas en músculo - Cloranfenicol en músculo

Comunicación de laboratorio (septiembre)

Deben participar todos los laboratorios que realicen estas determinaciones para el PNIR



ACTIVIDADES COMO LNR: CURSOS 2013

Anunciados en la C.L. Nº 293 (11 abril 2013): Análisis de tetraciclinas en músculo por LC-MS/MS (18 de junio) Análisis de colorantes en pescado por LC-MS/MS

(19 de junio)

Número de participantes reducido Contenido teórico-práctico



PARTICIPACIÓN EN WORKSHOPS ORGANIZADOS POR EU-RLs

ANSES (Fougeres) CL Nº 254

RIKILT (Wageningen) CL Nº 264

BVL (Berlín) del 14 al 16 de mayo (pendiente CL)

JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Majadahonda, 5 de Junio 2013


PARTICIPACIÓN EN ENSAYOS DE INTERCOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR LR-EU

RIKILT (Wageningen) PT/ Research Study

Clorandrostendiona en orina (enero 2012) √

Esteroides en orina (agosto 2012) √

BVL (Berlín)

β-agonistas en pelo (septiembre 2012) √




PARTICIPACIÓN EN ENSAYOS DE INTERCOMPARACIÓN ORGANIZADOS POR LR-EU

ANSES (Fougeres):

Tetraciclinas en músculo (septiembre 2012) √

Metabolitos de carbadox en músculo (julio 2013)

Colorantes en pescado (octubre 2013)



Análisis de fenilbutazona en carne de caballo



Crisis de la carne de caballo

Fenilbutazona: compuesto perteneciente a los AINES (antiinflamatorios no esteroideos). Grupo B2e.

No autorizado su uso en animales destinados al consumo humano.

LNR: Santa Fe (Granada). Se detecta en la UE alimentos comercializados como de

carne de vacuno que contienen carne de caballo. Se publica la Recomendación 2013/99/UE: sobre un plan

coordinado de control para establecer la prevalencia de prácticas fraudulentas en la comercialización de determinados alimentos.



Crisis de la carne de caballo Recomendación 2013/99/UE (de 19 febrero) Acción I: control de la presencia de carne de caballo en

productos comercializados como de carne de vacuno (Análisis de ADN para identificación de especies)

Acción II: control de fenilbutazona en carne de caballo destinada al consumo humano

- Acción preventiva: ¿existe un riesgo para la seguridad alimentaria?

- Los países miembros debían analizar durante marzo un número de muestras según sus cifras de producción y/o importación e informar a Bruselas en un plazo máx. de 15 días.



Crisis de la carne de caballo Acción II de la Recomendación 2013/99/UE: Se le encomienda al CNA la realización de los análisis

correspondientes a la acción II: análisis de fenilbutazona (mediados del mes de febrero).

Puesta a punto/validación: finalizada primera semana de marzo.

Se realizan los análisis de un total de 108 muestras procedentes de 10 CCAA y Sanidad Exterior (muestreo realizado en marzo). Los análisis finalizan el 2 de abril.

Todas las muestras resultan negativas (no se encuentran residuos de fenilbutazona).



Crisis de la carne de caballo

Resultados de la Recomendación 2013/99/UE en la UE: - 5% de los productos analizados contenían ADN de

caballo. - 0,5 % (16 de 3115) de las muestras de carne de caballo

analizadas contenían residuos de fenilbutazona. Positivos en 3 países de la UE:

CZ (12,5 % -1 de 8-) UK (1,7 % -14 de 836-) IE (0,12 % -1 de 840-)

La Comisión Europea concluye que se trata de

un fraude y no de un problema de seguridad

alimentaria JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS



Inspección FVO 2013 DG(SANCO) 2013-6760

CON EL FIN DE EVALUAR EL CONTROL DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES EN ANIMALES

VIVOS Y PRODUCTOS DE ORIGEN ANIMAL



Inspección FVO 2013

- Del 22 al 31 de enero de 2013

- Autoridades competentes (central, regional y local), laboratorios (CNA, LSP de Toledo y Laboratorio de Córdoba), granjas y mataderos.

- CCAA visitadas: Castilla la Mancha y Andalucía.

- Informe final, aún en fase de borrador, incluye 8 recomendaciones.



Inspección FVO 2013: recomendación 1

Velar por que el muestreo de los residuos se distribuya uniformemente a lo largo de todo el año y por que se evite el muestreo múltiple de productores individuales, tal como se exige en el punto 2 del anexo de la Decisión 98/179/CE de la Comisión.




Velar por que el muestreo y el análisis se realicen dentro de los plazos previstos y por que, cuando se detecten incumplimientos, exista una cooperación y una coordinación eficaces y efectivas entre las autoridades competentes pertinentes, tal como se exige en el artículo 4, apartado 5, del Reglamento (CE) nº 882/2004, de manera que puedan aplicarse a tiempo medidas de seguimiento eficaces de conformidad con los requisitos pertinentes de la Directiva 96/23/CE del Consejo.




Posibles acciones a tomar: Plazos de respuesta analítica: - Cada laboratorio debe fijar un tiempo máximo Datos sobre la estabilidad de residuos en matriz:

- Difundir datos de estabilidad para que no todos lo laboratorios tengan que realizar estos estudios.

Próxima CL sobre la estabilidad de antimicrobianos

en matriz con la información de ANSES JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS




Velar por que los LNR cumplan todas sus funciones, tal como se establece en el artículo 14 de la Directiva 96/23/CE del Consejo, especialmente en relación con la coordinación de las normas y los métodos de análisis para cada residuo en relación con todos los laboratorios que realizan pruebas del PCR y garantizar que los métodos utilizados en los laboratorios de la Comunidad Autónoma sean lo suficientemente sensibles como para detectar el abuso de sustancias ilegales, de conformidad con los valores recomendados del LR UE.




Hallazgos en límites (CCα) > CMR LR-UE Compuesto /matriz Límite laboratorio CMR LR-UE

Clenbuterol / hígado 0,4 µg/kg * 0,2 µg/kg Cimaterol / orina 50 µg/kg ** 0,5 µg/kg Zeranol / orina 5,76 µg/kg * 2 µg/kg Dienestrol / orina 3,85 µg/kg (4,44) * 2 µg/kg Tireostáticos / orina 80 µg/kg ** 10 µg/kg

Fenilbutazona 120 µg/kg * 5 µg/kg

- Atribuidos a laboratorios equivocados (*) - Algunos datos no existen en la aplicación PNIR (**)


Aplicación informática PNIR: configuración de laboratorios

Importante que los laboratorios conozcan y comprueben la

información contenida en la aplicación PNIR. No siempre los laboratorios actualizan los datos

- Esta información llega a la Comisión Europea, FVO, etc. - Se puede utilizar para diferentes finalidades:

consulta de LNRs y otros, etc.




Acciones a tomar: Se esta elaborando un procedimiento para la revisión de las configuraciones de los laboratorios del PNIR que incluirá cambios (se llevará a la próxima reunión CNPNIR):

1. Los LNRs elaborarán un informe individual para cada laboratorio (no serán informes globales)

2. Comunicación directa LNR Laboratorio CCAA 3. Se hará una segunda revisión para ver si el laboratorio

ha tenido en cuenta las recomendaciones del LNR. JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS




Velar por que todos los métodos analíticos de laboratorio restantes estén validados e incluidos en el ámbito de acreditación para todas las combinaciones de analito/matriz …



Inspección FVO 2013: seguimiento de las recomendaciones de la inspección 2008

El informe de la FVO sobre residuos (DGSANCO 2008-7781MRFINAL), incluía 12 recomendaciones: - 11 de ellas “han sido puestas en práctica” - 1 (la recomendación 3) “NO ha sido puesta en práctica”



Inspección FVO 2013: seguimiento de las recomendaciones de la inspección 2008

Recomendación 3 (2008) Hallazgos (2013) Velar por que el muestreo y el análisis se lleven a cabo a su debido tiempo con el fin de garantizar la estabilidad de cualquier residuo que pudieran contener estas muestras y, si los resultados no son conformes, optimizar la eficacia de las investigaciones de seguimiento, tal como se establece en el artículo 16 de la Directiva 96/23/CE del Consejo.

En algunos casos, el tiempo que transcurre desde el muestreo hasta que se dispone del resultado del análisis de las muestras es demasiado largo para que pueda garantizarse el cumplimiento de los requisitos establecidos en el artículo 16 de la Directiva 96/23/CE del Consejo en relación con el seguimiento de los resultados positivos (ver recomendación 5 2013) No se ha puesto en práctica esta Recomendación



WORKSHOP ANSES 2012

“CONTROL OF ANTIMICROBIAL RESIDUES IN FOOD INCLUDING

TRAINING SESSION ON METHODS FOR QUINOXALINES (B2f)

EU-RL Fougeres. Francia

(13 - 15 de junio 2012) JORNADAS DE REFERENCIA ANÁLISIS DE ALIMENTOS



Workshop ANSES 2012




Workshop ANSES 2012

Novedades de la CE sobre legislación. Resultados de los PNCR de la EU. Evaluación y validación de kits comerciales para

el análisis criba de residuos de antibióticos en miel (bioreceptores, ELISA y test microbiológicos).

Estudio de la estrategia para el establecimiento de límites en miel (LMRs o similar).

Guía internacional para validación de métodos multi residuo (MRM). Codex Alimentarius.




Workshop ANSES 2012

Demostración del método criba para análisis de antibióticos por LC-HRMS (LTQ-Orbitrap).

Problemática análisis de tetraciclinas en ANSES: Cuantificación de OTC en músculo de porcino. Isomerización de CTC en presencia de

quinolonas (en soluciones patrón). Análisis de carbadox y olaquindox en pienso

(Lab Agrario y de Sanidad Animal de Murcia).



Workshop ANSES 2012

Análisis de metabolitos de carbadox y olaquindox en músculo e hígado: Demostración del método de Joe O. Boison

Análisis de DCBX, QCA and MQCA en tejidos



Boison, J. O, Lee, S.C, Gedir, R. G, 2009, Analytica Chimica Acta 637, 128-134

- En hígado porcino: DCBX y QCA ambos buenos residuos marcadores para carbadox - En músculo porcino: mejor residuo marcador DCBX (después de 10 días, no se detectaba QCA)



• Son agentes antibacterianos usados en el pasado como aditivos en piensos para porcino: promotores de crecimiento, prevención y tratamiento de disenteria • Prohibidos desde enero de 1999 en la UE (Commission regulation EC No 2788/98 of 22 December 1998)

• Posibles efectos genotoxicos y carcinogénicos, riesgo para consumidores, animales y trabajadores de la industria de los piensos.

Carbadox and Olaquindox (quinoxalinas)



- Residuo marcador en la actualidad: QCA - Concentración Recomendada: 10 µg/kg (músculo e hígado) ¿Sería el DCBX un residuo marcador más adecuado?

Metabolismo del carbadox

N

N

O

O

NO

O

H

Carbadox (CBX)

N

NN

O

O

H

N

N COOH

Quinoxaline carboxylic acid (QCA)

DiDesoxycarbadox (DCBX)

N

N

O

NO

O

H

Mono-desoxycarbadoxN

N

O

NO

O

H

Mono-desoxycarbadox


Metabolismo del olaquindox

• Residuo marcador: MQCA (3 methylquinoxaline-2-carboxylic acid) Concentración Recomendada: 10 µg/kg (músculo e hígado)

N

N

O

O

Olaquindox

Or

N4-monoxy-OQX N1-monoxy-OQX

desoxy-OQX

N

N COOH

MQCA

O

NH

OH

N

N

O

O

NH

OH

N

N

O O

NH

OH

N

N

O

NH

OH


PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

FRACCION A FRACCIÓNB

5 g tejido

Digestión ácida (1 h) Hidrólisis enzimática (overnight)

Oasis MAX - SPE clean-up

Elucción A DCBX

Elucción B: QCA y MQCA

Boison, J. O, Lee, S.C, Gedir, R. G, 2009, Analytica Chimica Acta 637, 128-134.



FRACCIÓN A FRACCIÓN B

Boison, J. O, Lee, S.C, Gedir, R. G, 2009, Analytica Chimica Acta 637, 128-134.

FM A Ácido fórmico 0.04 %

FM B Metanol

Analyte Parent ion

Product ion

DCBX 231 143 102

QCA-d4 179 133

Analyte Parent ion

Product ion

MQCA 189 145 143

QCA 175 129 102

QCA-d4 179 133

FM A Ácido fórmico 0.3% FM B Metanol/acetonitrilo 50:50

Columna C18



Conclusiones workshop método DCBX/QCA/MQCA

Método complejo: requiere optimización. Hay que analizar también DCBX para control de carbadox? Posible estrategia: En músculo (matriz donde parece importante el análisis

de DCBX) analizar A (DCBX)+ B (QCA y MQCA) En hígado no es posible analizar las dos fracciones juntas

(interferencias de matriz) analizar sólo fracción B (QCA y MQCA)


Objetivos ANSES


Unidad de Zoosanitarios del CNA

Ángela Aranda José Blanca Miguel Ángel Canéiro Rosario Díaz Josefa Gómez Víctor Gonzalo Mercedes Martín de Pozuelo Miguel Morgado Regina Muñoz Macarena Ramos


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