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Jornada Práctica
Determinación deHuevos de Helmintos en Aguas
según método Bailengermodificado por la OMS
Meritxell Mas
Introducción
•Toma de muestras:
• Objetivos
• Tipos de muestras
• Control y vigilancia
• Punto de muestreo
• Medidas de seguridad
• Volumen de muestra
• Materiales y equipos
• Muestreo
• Etiquetado
• Transporte y conservación
Introducción
•Técnica analítica:
• Selección del método
• Equipos y material
• Reactivos
• Concentración por sedimentación
• Concentración por centrifugación
• Concentración por método difásico
• Concentración por flotación
• Observación
• Identificación
• Artefactos
TOMA DE MUESTRAS
Toma de muestrasObjetivos
• Obtener una muestra de agua que sea representativa del agua que queremos ensayar.
• La muestra debe ser suficientemente pequeña para poder ser transportada y manipulada con facilidad en el laboratorio.
• El personal encargado de la toma de muestras debe garantizar la validez e integridad de la toma de muestra, de su transporte y su conservación.
Toma de muestrasTipos de muestras
• Muestras simples: Muestras tomadas en un lugar y momento determinados para su posterior análisis individual.
• Muestras compuestas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas en un lugar determinado y en tiempos distintos, las cuales se mezclan y homogenizan.
• Muestras integradas: Muestras formadas por varias muestras simples tomadas simultáneamente en distintos lugares, las cuales se mezclan y se homogenizan.
Para el análisis de huevos de helmintos pueden tomarse muestras simples o compuestas
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El laboratorio debe disponer de un plan de muestreo que incluya:
• Objetivo• Antecedentes• Tipo de muestreo• Ubicación y descripción del sitio de muestreo• Medio de transporte• Personal• Lista de verificación de materiales, reactivos y equipos• Plan de seguridad• Control de calidad
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:• El muestreo debe estar debidamente documentado y debe ser
trazable.• El control del muestreo debe incluir:
• Recipientes para el muestreo• Reactivos y equipos necesarios• Condiciones de toma de la muestra• Preservación• Codificación• Transporte• Entrega de la muestra al laboratorio
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Identificar la muestra con la etiqueta
correspondiente
•Sellar la muestra con cinta adhesiva para evitar adulteraciones
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Elaborar un libro de campo donde anotar todas las observaciones
que procedan durante el muestreo
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Establecer un registro de control y vigilancia de la muestra
Toma de muestrasControl y vigilancia
• Proceso de control:• Acompañar la muestra con una solicitud del análisis• Entrega de la muestra al laboratorio en el menor tiempo posible• Registrar la recepción de la muestra en el laboratorio
Laboratorio
Toma de muestrasPunto de muestreo
• Consideraciones generales:• Punto de muestreo accesible• Posibles fuentes de contaminación• Caudal• Velocidad de la corriente
En general, tomar las muestras en zonas de mayor turbulencia o en el centro de la corriente
MUESTRA REPRESENTATIVA
Toma de muestrasPunto de muestreo
• Tipo de masa de agua:• Embalse• Lago natural• Lago artificial• Balsa• Río• Efluente tratamiento secundario EDAR• Efluente tratamiento terciario EDAR• Industrial:
• Tipo de industria• Tratamientos aplicados• Posibles contaminantes
Toma de muestrasPunto de muestreo
• Tipo de agua:• Agua corriente• Agua estancada superficial• Agua estancada de profundidad
• Uso al que se va a destinar (RD 1620/2007):• Urbano• Agrícola• Industrial• Recreativo• Ambiental
Medidas de seguridadEquipos y materiales necesarios
Toma de muestrasMedidas de seguridad
• El personal debe recibir formación e información sobre las medidas de seguridad y del uso de equipamiento adecuado.
•Si procede, debe recibir la inmunizaciónapropiada y someterse a un examen médicopara verificar que la actividad no supone riesgo para él ni para sus compañeros.
Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Es recomendable que el personal vaya acompañado cuando la zona de muestreo se considere de riesgo e informar a otros de la ubicación del punto de muestreo.
•Debe disponer de radio o teléfono, y de un botiquín de primeros auxilios, así como de un plan de emergencia.
Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Deben usarse los equipos necesariosque garanticen la seguridad del personal, y una vez finalizada la toma de muestras, deshacerse de los residuos generadosde forma adecuada (papel secante, guantes desechables…), lavarse bien las manos y desinfectar.
•Está prohibido comer, beber o fumardurante el muestreo.
Toma de muestrasMedidas de seguridad
• Equipo obligatorio:• Ropa cómoda• Bata• Guantes• Gafas de protección• Mascarilla con válvula• Calzado antideslizante
• Otros equipos/accesorios:• Casco de seguridad• Lámparas (muestreo nocturno)• Detector de gases• Arnés de seguridad
Toma de muestrasVolumen de muestra
• Según RD 162072007, la técnica de referencia para el análisis de huevos de helmintos en aguas és el método Bailenger modificado por Bouhoum & Schwartzbrod (OMS, 1989), que dispone que el volumen inicial de muestra es de:
• 1 litro para aguas residuales crudas o parcialmente tratadas• 10 litros para aguas tratadas
• La Agencia de Protección Ambiental (EPA) establece para lodos de clase A:
• Huevos de helmintos viables: < 1 huevo 7 4 gramos de SST
Toma de muestrasMateriales y equipos
• Envases de polietileno, con paredes lisas
• Etiquetas de identificación de la muestra
• Rotulador resistente al agua
• Cinta adhesiva para precintar la muestra
• Formol 4% si se requiere fijar la muestra
• Neveras para transporte a 4ºC
• Documentos que deben acompañar la muestra
10 L 1 L
4ºC
Toma de muestrasMuestreo
• Consideraciones previas:
• Lavar el recipiente con detergente (Tween al 80% o Tritón X-100) o con lejía.
• Enjuagar varias veces con agua destilada o desionizada.
• Antes de tomar la muestra, lavar varias veces con el agua que seva a muestrear (algunos autores consideran que para análisis de huevos de helmintos no es necesario).
• En caso de que no se pueda tomar las muestras directamente, se pueden tomar con muestreadores, cubeta y cuerda, o con una botella Van Dorn.
Van Dorn
Toma de muestrasMuestreo
• Muestreo en descarga libre:
• Colocar el recipiente directamente en el chorro de agua, destaparlo, dejar que se llene hasta el volumen deseado y tapar sacándolo del chorro.
Toma de muestrasMuestreo
• Muestreo en canales y colectores:
• Introducir el recipiente cerrado entre 15 y 30 cm de profundidadprocurando que la abertura esté a contracorriente del canal. Destapar y llenar hasta el volumen deseado. Cerrar y extraer.
Toma de muestrasEtiquetado
• Tomada la muestra:
• Se sella
• Se colocan las etiquetas identificativas
• Se rellena el cuaderno de campo y los documentos pertinentes
Toma de muestrasTransporte y conservación
• Muestras de agua:
• Transporte en neveras a 4ºC.
• Conservación a temperatura ambiente y sin fijar: hasta 4 días desde de la toma de muestras.
• Conservación refrigeradas a 4ºC en oscuridad: hasta 6 meses desde de la toma de muestras.
• Fijadas con formaldehído al 4%: hasta 6 meses desde la toma de muestras.
• Muestras de lodo:
• Transporte en neveras a 4ºC.
• Idealmente el análisis debe realizarse inmediatamente después de la toma de muestras.
TÉCNICA ANALÍTICA
Técnicas analíticasSelección del método
Técnicas analíticasSelección del método
Técnicas analíticasSelección del método
Técnicas analíticasSelección del método
Técnicas analíticasSelección del método
Equipos:•Bomba peristáltica•Centrífuga de 0 a 3.000 rpm•Microscopio de campo claro (Köheler)y objetivos de 10x y 40x
•Balanza•Agitador magnético•Densímetro
Método Bailenger modificado
Material:•Bomba de sifón•Tubos de centrífuga•Pipetas Pasteur de 3 ml•Cámara de McMaster•Probeta graduada de 1 litro•Matraz aforado de 1000 ml•Espátula•Guantes de látex•Varilla de agitación•Recipientes de plástico inerte con paredes lisas de 2000 ml•Pipetas graduadas de 5 y 10 ml
Equipos y Material
Método Bailenger modificadoReactivos
• Reactivos comerciales:• Acido acético glacial• Sodio acetato anhidro• Etil Acetato• Zinc Sulfato 7-hidrato• Agua destilada
• Preparación de soluciones:• Solución amortiguadora ácido-acética (pH 4,5): Disolver 15 g de
acetato sódico y 3,6 ml de ácido acético glacial; enrasar a 1 litro con agua destilada.
• Solución de sulfato de zinc al 33% de densidad relativa 1,18: Disolver 330 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4·7H2O) en 1000 ml de agua destilada; mezclar en el agitador magnético hasta homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro. Ajustar la densidad a 1,18 agregando sulfato de zinc o agua destilada según sea el caso.
• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger 2 litros de sedimento• Dejar decantar mínimo 24 horas• Eliminar el sobrenadante• Recoger de 50-200 ml de sedimento
25 o 10 L
Agua
Decantar mín. 24 h
Decantar mín. 24 h
50-200 mL
Método Bailenger modificadoConcentración por sedimentación
2 L
50-200 mL
• Centrifugar a 1000g durante 15 min• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento
1000 g15 min
Centrifgar Eliminarsobrenadante
Concentración por centrifugaciónMétodo Bailenger modificado
• Adicionar Tampón aceto-acético (a mín 10 mL)• Adicionar Acetato de etilo (a mín 5 mL)• Homogenizar y centrifugar a 1000g durante 15 min
1000 g15 min
1.Homogenizar
2.Centrifgar
-Tampón aceto-acético (mín.10 mL)
- Acetato de etilo (mín.5 mL)
Tapón lipófilo
Fase acuosaSedimento
Fase etérea
Método Bailenger modificadoConcentración por método difásico
• Eliminar el sobrenadante• Recoger el sedimento• Addicionar Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)
Eliminarsobrenadante
Sulfato de Zinc (densidad mín 1,18)
Método Bailenger modificadoConcentración por flotación
• Homogenizar la muestra• Transferir la muestra a la cámara McMaster• Dejar reposar durante 5 min• Observar al microscopio óptico (campo claro) a 10x• Repetir las operaciones anteriores hasta haber analizado toda la muestra
Homogenizar
Detectar, Identificar y Cuantificar
Método Bailenger modificadoObservación
IdentificaciónMétodo Bailenger modificado
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris fértilGrano de polen
TaeniaGrano de polen
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
AnquilostómidoTecameba (Arcella)
Grano de polen Diphyllobothrium
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
TaeniaGrano de polen
AnquilostómidoGrano de polen
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
TrichurisAlga
TrichurisEspora de hongo
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Anquilostómido
Grano de polen
AnquilostómidoHuevo de metazoo
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
Ascaris fértilQuiste de protozoo
Ascaris infértilFlóculo
ArtefactosMétodo Bailenger modificado
AnquilostómidoBurbuja de aire
Dipylidium caninumGránulos de almidón
EJERCICIOS PRÁCTICOS
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Trichuris
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Trichuris
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Burbuja de aireAscaris fértil
Grano de polenAscaris decorticado
25um
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Taenia
Quistes de protozoos Ascaris infértil
Flóculo compacto
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Anquilostómido
Granos de polen(Euphorbia pulcherrima)
Trichuris
Granos de polen
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
TaeniaAscaris
Anquilostómido
Tecamebas(Centropyxis)
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Trichuris Tecamebas(Arcella)
Huevo de rotífero(Macrotrachella)
Ascaris
Anquilostómido
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Hymenolepis
Huevo de rotífero
Fasciola
Paragonimus
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Ascaris Diphyllobothrium
Taenia
Schistosoma
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Clonorchis
Hymenolepis
Capillaria
Toxocara
Ejercicio prácticoMétodo Bailenger modificado
Dicrocoelium
Opistorchis
Enterobius
Fasciola
Jornada Práctica
Determinación deHuevos de Helmintos en Aguas
según método Bailengermodificado por la OMS