Jessica Gord ón Nú ñez

ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO DE PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE SEGMENTOS NODALES DE CUCARDA

(Hibiscus rosa-sinensis), COMO ESTRATEGIA DE REFORESTACIÓN DEL ESPACIO PÚBLICO DEL DISTRITO

METROPOLITANO DE QUITO

Jessica Gordón Núñez

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Pérdida de áreas verdes

Actividades antropogénicas Fenónemos naturales

Erosión del suelo Deforestación

Semillas

Cultivo in vitro

Estacas

Recuperación ecosistema

Abdelnour, A., & Escalant, J. (1994) Bendre, A., & Kumar, A. (2009) Abdelnour, A., & Escalant, J. (1994) Bird, L., & Molinelli, J. (2001)

Castillo, A. (2005) Leiva, L. (2010)

OBJETIVO GENERAL

Establecer un protocolo de propagación in vitro a partir de segmentos

nodales de cucarda (Hibiscus rosa-sinensis), como estrategia de

reforestación del espacio público del Distrito Metropolitano de Quito.

Leiva, L. (2010)

Kumari, S., & Pandey, K. (2011)

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Existe un protocolo de propagación in vitro de cucarda (Hibiscus rosa-sinensis) a partir de segmentos nodales, a ser utilizado como parte de la estrategia de reforestación del espacio público del Distrito Metropolitano de Quito.

HIPÓTESIS

MARCO TEÓRICOCARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE

Nombres comunes cucarda, rosa china, cayena, pacífico

Verano Primavera (semillas) Verano (estacas) Beneficio ornamental y medicinal

Marín, J., & Moll, H. (1997) Bendre, A., & Kumar, A. (2009)Marín, J., & Moll, H. (1997) Kumari, S., & Pandey, K. (2011)

Hojas simples,

alternas, de márgenes dentados

Ápice es agudo y por su base es cuneiforme

Flores solitarias

axilares en forma de embudo

Cinco pétalos de 10 cm de ancho,

Flor variable carmesí

anaranjado amarillo o

blanco

Arbusto de 5 m,

reproducción sexual y asexual

DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

MARCO TEÓRICO

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

MARCO TEÓRICO

Totipotencialidad celular

Cultivo de tejidos

Explante

Organogénesis directa

Ortiz, G. (2009)Ortiz, G. (2009)Ortiz, G. (2009)

Ramírez, A. (2008) Ramírez, A. (2008)

Recalde, C. (2007) Recalde, C. (2007) Recalde, C. (2007)

MEDIOS DE CULTIVO

MARCO TEÓRICOMedición

pH

Auxinas

Citoquininas

Giberelinas

Rueda, D. (2007)

Rueda, D. (2007)

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección material vegetal

Protegidas de condiciones ambientales: lluvia,

vientos, sequía

Tratamiento fitosanitario cada 15 días por

aspersión entre las 8 y las 9 de la mañana

Plantas 3 años Etapa de

maduración menos lignificada

Procesamiento explantes

Corte hojas, no pecioloSegmentos nodales de 3

cm de longitud

FASE DE CAMPO

Ensayos preliminare

s

Utilización segmentos

nodales

FASE DE LABORATORIO

Yema apical

Primer segmento nodal


Análisis del crecimiento segmentos nodales en partes

altas y bajas del arbusto

Respuesta al cultivo in vitro

Segmentos en partes altas

Marín, J., & Moll, H. (1997)


Tratamiento Concentración cloro (%)

T1 25

T2 30

T3 40

T4 50

T5 60

Desinfección explantes

Segmento nodal

Lavado detergente + Tween 20 Alcohol al 70% 30 s

Agua destilada estéril

Variables evaluadas:Contaminación

NecrosisOxidaciónViabilidad

Temperatura: 25 oCFotoperiodo: 12 h luz/12 h

oscuridad21 días

Tabla 1. Tratamientos de desinfección

Aplicación de los tratamientos

MATERIALES Y MÉTODOSEstablecimiento explantes


Medio de cultivoConcentración de BAP (mg.L-1)

0 0,1 0,3 0,5MS T1 T2 T3 T4

MS ½ T5 T6 T7 T8

MSVG T9 T10 T11 T12

MSVG ½ T13 T14 T15 T16Preparación medio de cultivoAplicación de los tratamientos


oscuridad21 días

Variables evaluadas:Longitud de brotes Coloración de las hojas Explante inicial nueva.

Tabla 2. Tratamientos de establecimiento

Multiplicación explantes


Preparación medio de cultivo

Medio de cultivo

Concentración de BAP (mg.L-1)

Concentración de AIA (mg.L-1)

0 0,01 0,02 0,03

MS + Vitaminas

MS

0 T1 T2 T3 T4

0,5 T5 T6 T7 T8

0,8 T9 T10 T11 T12

1 T13 T14 T15 T16

1,5 T17 T18 T19 T20

Explantes establecidos Corte desde la base


Incubación


oscuridad

Variables evaluadas:% inducción brotes Índice de propagaciónNúmero de brotes.

Tabla 3. Tratamientos de propagación

* Se agregó 6.67 mg.L-1 AG3 y 0.2 g.L-1 CA

MATERIALES Y MÉTODOSEnraizamiento explantes

Preparación medio de cultivo


Medio de cultivoConcentración de AIB (mg.L-

1)0 0,5 1 1,5 2

MS + 30 g.L-1 sacarosa T1 T2 T3 T4 T5

MS + 20 g.L-1 sacarosa T6 T7 T8 T9 T10

Corte de los brotes Incubación en medio de enraizamiento


oscuridad30-60 días

Variables evaluadas:% plántulas enraizadasTiempo de enraizamientoCategorías.

Tabla 4. Tratamientos de enraizamiento

* Se agregó 1 g.L-1 CA

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEnsayos preliminares

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVersión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil









Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVivo Descartado

1 2Tipo de explante

0

25

50

75

100

Porc

enta

je

Vivo Descartado

Figura 1. Viabilidad y descarte de yemas axilares y segmentos nodales por oxidación

1 segmentos nodales2 yemas apicales

Yemas apicalesAlto porcentaje de oxidación

Segmentos nodalesAlto porcentaje de viabilidad

Introducción hasta quinto segmento nodal

RESULTADOS Y DISCUSIÓNDesinfección explantes

Concentración de cloro

Frecuencia (%)Explantes

viablesExplantes

contaminadosExplantes

necrosadosExplantes oxidados

25% (T1) 70 30 0 030% (T2) 90 10 0 040% (T3) 60 30 10 050% (T4) 50 10 40 060% (T5) 40 10 20 30

Tabla 5. Resultados de las variables evaluadas en la fase de desinfección

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVersión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil














Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilContaminación Necrosis Oxidación Viabilidad

25% 30% 40% 50% 60%Tratamiento

-2

18

39

59

80

100

Porc

enta

je

Contaminación Necrosis Oxidación Viabilidad

Figura 2. Porcentajes de contaminación, necrosis, oxidación y viabilidad

p = 0,0667 (C)p = 0,0896 (V)p = 0,0012 (N)p = 0,0162 (O)

Contaminación fúngica Explante desinfectado

Oxidación Necrosis


RESULTADOS Y DISCUSIÓN















Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Crecimiento 25 Crecimiento 30 Crecimiento 40Crecimiento 50 Crecimiento 60

1 1 2 3Semana

-0,04

0,47

0,98

1,49

2,00

Crec

imie

nto

de b

rote

s

Crecimiento 25 Crecimiento 30 Crecimiento 40Crecimiento 50 Crecimiento 60

Figura 3. Crecimiento de los brotes por tratamiento durante 3 semanas

p = 0,0017 (1 semana)p = 0,0003 (2 semana)p = 0,1082 (3 semana)

Desinfección 25%

Desinfección 60%

Desinfección 30%

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEstablecimiento explantes

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVersión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil














Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil

Crecimiento 1 semana Crecimiento 2 semana

Crecimiento 3 semana

0 BAP 0,1 BAP 0,3 BAP 0,5 BAP

Tratamiento

0,02

0,79

1,56

2,34

3,11

Long

itud

de b

rote

s



Figura 4. Crecimiento de los explantes en medio MS con diferentes concentraciones de BAP

p < 0,0001 (1 semana)p < 0,0001 (2 semana)p < 0,0001 (3 semana)

















0 BAP 0,1 BAP 0,3 BAP 0,5 BAPTratamiento

0,07

0,55

1,04

1,52

2,01

Long

itud

de b

rote

s



Figura 5. Crecimiento de los explantes en medio MS ½ con diferentes concentraciones de BAP

p = 0,0009 (1 semana)p < 0,0001 (2 semana)p < 0,0001 (3 semana)

Establecimiento explantes
















Crecimiento 1 semana Crecimiento 2 semana Crecimiento 3 semana

0 BAP 0,1 BAP 0,3 BAP 0,5 BAP

Tratamiento

0,19

0,46

0,73

1,00

1,27

Long

itud

de b

rote

s

Crecimiento 1 semana Crecimiento 2 semana Crecimiento 3 semana

Figura 6. Crecimiento de los explantes en medio MSVG con diferentes concentraciones de BAP

















0 BAP 0,1BAP 0,3BAP 0,5BAP

Tratamiento

0,03

0,46

0,90

1,34

1,78

Long

itud

de b

rote

s



Figura 7. Crecimiento de los explantes en medio MSVG ½ con diferentes concentraciones de BAP


RESULTADOS Y DISCUSIÓNEstablecimiento explantes

Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVersión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil












Crecimiento de los explantes

MS MS 1/2 MSVG MSVG 1/2

Medio de cultivo

0,13

0,66

1,19

1,72

2,25

Long

itud

de b

rote

s

Crecimiento de los explantes

Figura 8. Crecimiento de los explantes en los diferentes medios de cultivo utilizados

Figura 9. Crecimiento de los explantes en el medio MS por análisis LSD Fisher

p < 0,0001p < 0,0001

Multiplicación explantes




0 0,01 0,02 0,03

Índice de propagación

0 1,63 1,63 2,00 1,60

0,5 1,70 1,29 1,40 1,60

0,8 1,50 1,38 1,44 1,70

1 1,44 2,60 1,90 1,50

1,5 1,20 1,40 1,70 1,50Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil











Brotes

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20

Tratamiento

0,6

1,4

2,2

2,9

3,7

Bro

tes

Brotes

Figura 10. Número de brotes por tratamiento

Tabla 6. Valores de IP en los diferentes tratamientos (cp1)

p = 0,0509

RESULTADOS Y DISCUSIÓNMultiplicación explantes

Ciclos de propagación

con subcultivos

%HR = 100% papel aluminio

%HR < 50% gasas

Una semana cuarteo medio de cultivo

Sin carbón activado Con carbón activado

RESULTADOS Y DISCUSIÓNMultiplicación explantes



0 0,01 0,02 0,03

% inducción de brotes múltiples

0 50 62.5 70 50

0,5 60 29 40 50

0,8 50 37.5 44.4 60

1 44.4 80 70 50

1,5 20 40 60 50

Tabla 7. Porcentaje de inducción de brotes múltiples (cp1)



0 0,01 0,02 0,03

Índice de propagación

0 1,60 1,56 2,30 1,50

0,5 1,67 1,47 1,40 1,65

0,8 1,30 1,30 1,40 1,60

1 1,12 2,67 2,00 1,42

1,5 1,20 1,41 1,30 1,50

Tabla 8. Valores de IP en los diferentes tratamientos (cp2)

p = 0,05

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEnraizamiento explantes

Medio de cultivoConcentración de AIB (mg.L-1)

0 0,5 1 1,5 2% explantes enraizados

MS + 30 g.L-1 sacarosa 90% 60% 33,3% 87,5% 14,29%

MS + 20 g.L-1 sacarosa 0% 10% 20% 0% 0%

Tabla 9. Porcentaje de explantes enraizados por tratamiento

Tratamiento(30 g.L-1 sacarosa)

Aparición raízTratamiento

(20 g.L-1 sacarosa)Aparición raíz

T1 30-40 días T6 Ausencia raíz

T2 44-58 días T7 60 días

T3 44-58 días T8 60 días



Tabla 10. Aparición de raíces en los diferentes tratamientos










Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilVersión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión EstudiantilCategoría raíz

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10Tratamientos

-0,9

0,1

1,1

2,0

3,0

Cate

goría

raíz

Categoría raíz

RESULTADOS Y DISCUSIÓNEnraizamiento explantes

Figura 11. Categorías según la presencia o ausencia de raíz en los tratamientos

p < 0,0001

CATEGORÍAS DE ENRAIZAMIENTO

Ausencia raiz Escasa presencia de raíz

Abundante raizModerada presencia de raiz

Con el tratamiento T2 (30% Cl) se logró un alto porcentaje de desinfección de los segmentos nodales (90%) sin presentar oxidación o necrosis en ninguno de ellos.

La coloración de las hojas de las plántulas indican su vigorosidad y si los nutrientes del medio son adecuados para su crecimiento o, por otro lado, si la desinfección fue demasiado agresiva.

El mejor tratamiento para el establecimiento de los explantes fue el T3 (MS + 0,3 mg.L-1 BAP) se logró obtener plántulas de hasta 3 cm de longitud, hojas de coloración verde oscuro y no se formó callo.

Para la propagación in vitro de cucarda el mejor tratamiento fue el T14 (1 mg.L-1 BAP; 0,01 mg.L-1 AIA) se obtuvo hasta cuatro brotes por explante y un 80% de inducción de brotes múltiples.

CONCLUSIONES

La utilización de gasas permitió la salida del etileno debido a las condiciones de estrés. Es necesario realizar dos subcultivos, a pesar de la presencia de la fina capa de plástico con agujeros.

Para el enraizamiento de los explantes, el mejor tratamiento fue el T1 (MS + 1 g.L-1 CA + 30 g.L-1 sacarosa) con el que se obtuvo mayor número de explantes enraizados en un menor tiempo.

Al aumentar la cantidad de sacarosa en el medio de cultivo para la etapa de enraizamiento se favorece al desarrollo más temprano de raíces de cucarda.

La utilización de tapas plásticas para enraizar en lugar de gasas permitió un bajo intercambio, en donde los niveles hormonales de las plántulas disminuyen el estrés fisiológico y por ende la presencia de etileno.

CONCLUSIONES

Con el fin de obtener plántulas de cucarda libres de contaminación, es recomendable realizar un pre tratamiento de las plantas donadoras de explantes.

Para obtener un grupo homogéneo de plántulas, es necesario tomar hasta el quinto segmento nodal del arbusto ya que las primeras porciones tienden a la oxidación y las porciones finales no a dan lugar plantas saludables.

En la etapa de propagación de cucarda, es necesario utilizar gasas para la salida del etileno, y para evitar la intoxicación y muerte de los explantes es recomendable realizar un subcultivo pasado una semana.

Recomiendo realizar un estudio de la micropropagación de cucarda utilizando diferentes técnicas de eliminación de etileno, tal como el método químico, con ácido salicílico; o a su vez, la utilización de un medio de Murashige y Skoog con la modificación de Van der Salm, ya que puede porporcionar mejores resultados respecto al método físico probado.

Para evitar la presencia excesiva de outliers en los análisis estadísticos que se realicen, es recomendable realizar un estudio de las plantas in vitro de mejores características para llevar a cabo su producción masiva.

RECOMENDACIONES

GRACIAS

• Abedini, W. (2002). Biotecnología aplicada a la produccción vegetal.

• Alcorcés, N. (2009). Estudios citogenéticos de Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae). Monogas: Universidad de Oriente.

• Almodóvar, W. (1998). Enfermedades de los hidropónicos. Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.

• Bhalla, S., Abdullah, J., Sreeramanan, S., & Karuthan, C. (2009). Shoots induction from Hibiscus rosa-sinensis nodal explant using N6-benzylaminopurine (BAP). Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(4), 403-410.

• Bird, L., & Molinelli, J. (2001). Cuidado y protección de bosques y áreas verdes. Agencia de Protección al Ambiente y Desarrollo Sustentable del Municipio de Puebla.

• Daughtrey, M. (2001). Plagas y enfermedades de pantas de maceta con flores . The American Phytopathological Sociaty . • Distrito Metropolitano de Quito. (2012). Personal Municipal participa en campaña de reforestación. Agencia pública de noticias de Quito. • De la Torre, L., Navarrete, H., Muriel, P., Macía, M., & Balslev, H. (2008). Enciclopedia de las plantas útiles del Ecuador (Primera ed.). Herbario QCA.

• Hermida, M. (2010). Conocer, valorar, preservar. Verde Chaco. • Interagency Taxonomic Information System ITIS. (2012). Catalogue of Life. Retrieved julio 21, 2012, from www.catalogueoflife.org/

• Jácome, A. (2011). Microporpagación in vitro de la especie endémica Jiguerón (Aegiphila ferruginea) para la producción masiva y conservación de esta especie en peligro de extinción. Quito: ESPE.

• Montiel, M. (1999). Introducción a la Flora de Costa Rica. Universidad de Costa Rica.

• Ortiz, G. (2009). Flora ornamental española: Aspectos históricos y principales especies . Monografías Boutelaua.

• Roca, W., & Mogrinski, M. (1991). Cultivo de tejidos en la agricultura: Regeneración de plantas: embriogénesis y organogénesis. Colombia: Centro Internacional de Agricultura Tropical.

• Zaragoza, J. (2007). Atlas Todo Fauna. Retrieved julio 21, 2012, from www.todofauna.com

BIBLIOGRAFÍA

Figura 3. Botánica de la cucarda

Figura 2. Biosíntesis de etileno en las plantas

Figura 3. Carta Psicrométrica

Jessica Gord ón Nú ñez

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