Universidad de TalcaFacultad de Ciencias de la Salud

Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología

Iván Palomo

LMC

SMP

• Leucemia Mieloide Crónica (LMC)

• Mielofibrosis con metaplasia mieloide

• Policitemia Vera

• Trombocitemia esencial

Enf. Hematológicas malignas Incidencia

Leucemia Incidencia (/100.000)

TodasTodas 6–106–10

LMCLMC 1–21–2

LLCLLC 2–32–3

LMALMA 2–32–3

LLALLA 1–21–2

EPIDEMIOLOGíA

• 15-20% de las leucemias (adultos)

• 3-5% " " (niños)

• 25-50 años (promedio 40)

• 10 años más jóvenes que LLC

LMC

CARACTERÍSTICAS GENERALES

• Desorden clonal de una célula troncal Crom. Philadelphia (Ph) se encuentra en granulocitos,

megacariocitos, monocitos y cél. eritroides.

• Gran aumento del pool granulocítico

• Enfermedad bifásica

• Fase crónica • Fase acelerada

• Fase aguda (Crisis blástica)

LMC

ETIOLOGÍA

5% causa conocida

• Radiaciones• Agentes químicos

• Benzol y derivados• Solventes• Insecticidas

LMC

Enf. con alteración molecular única

LMC– Enf. proliferativa de stem cells hematopoyéticas– Curso clínico característico

Cromosoma de Philadelphia (Ph) Alteración cromosómica única

Tirosina kinasa Bcr-Abl– Alteración molecular única– Causa transformación de una Stem cells hematopoyética en

clon maligno

LMC

Crom. Philadelphia (Ph) y gen bcr-ablLMC

bcr-abl

ablProteína de

fusión

Actividad Tirosina Kinasa

22

bcr

Ph(or 22q-)

99 q+

1

p210Bcr-Abl

p185Bcr-Abl2-11

2-11

Chromosome 9

c-bcr

Chromosome 22

c-abl

2-11

Exons

Introns

CML Breakpoints

ALL Breakpoints

Translocación recíproca

t(9;22) (q34;q11)bcr-abl gene structure

Proteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocaciónProteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocación

Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl

Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl

Tirosinas kinasas

-Fosforilan tirosina

-Actividad controlada en

dominio N-terminal.

En región C-terminal dominio une a DNA y a los filamentos de actina (regular ciclo celular)

Funciones de la proteína BcrFunciones de la proteína Bcr

Serina-treonina kinasa.

Tiene homología a proteínas G.

Puede participar en reparación del DNA.

bcr-abl: Transducción de señales

Bcr-AblCytoskeletal

proteins

P

MYC

?

Nucleus

P

RAS-GAP

RAS-GTP

SAPKP

CBL CRK

PI3K P

BAD

14-3-3

P

BCLXL

14-3-3Mitochondria

BCLXL

BAD

RAS-GDP

AKT

ERKP

STAT1+5P

GRB-2

SOS

SHC DOK CRKL

PMEK1/2

PRAF-1

TYROSINE KINASE ACTIVITY

Proliferación

Apoposis

Adhesión(alteración)

LMC 95

LLA Adulto 15–30 Niños 5

LMA 2

Cromosoma Ph Prevalencia en Leucemias

Curso clínico: Fases de la LMC(pre-Imatinib)

Chronic phase

Median duration 5–6 years

Accelerated phase

Median duration6–9 months

Blast crisis

Median survival3–6 months

Advanced phases

Fase Crónica

CLÍNICA

Síntomas Inespecíficos y graduales:

Astenia, fatiga, cefalea, pérdida de peso, anorexia Signos Esplenomegalia (80%) Hepatomegalia (20%)

Normal

Normal

LMC

Laboratorio

• Hemograma

• Estudio citogenético• Cariograma• Fish

• RT-PRC bcr-abl

• FAN• Citometría de flujo

LMC

Laboratorio: Parámetros típicos(según fase)

ParameterParameter ChronicChronic AcceleratedAccelerated Blast CrisisBlast Crisis

WBC countWBC count 20 x 1020 x 1099/L/L — — — —

BlastsBlasts 1%–15%1%–15% 15% 15% 220%0%

BasophilsBasophils 20% 20% — —

PlateletsPlatelets or normal or normal or or

Bone marrowBone marrow Myeloid hyperplasia Myeloid hyperplasia

CytogeneticsCytogenetics Ph+Ph+

Bcr-AblBcr-Abl ++

Laboratorio: Fase crónica (cont)

• Leucocitosis Fórmula leucocitaria alterada Basofilia

Eosinofilia

• Anemia NN

• Trombocitosis

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

• Reacción leucemoide• Sepsis, inflamación, Ca, hemólisis• Granulación tóxica, Cuerpos de Döhle• FAN aumentadas• Ph (-)

• Mielofibrosis con metaplasia mieloide• Poiquilocitosis (GR en lágrima)• FAN aumentadas • Fibrosis medular• Ph (-)

LMC

Estudio citogenético

Cariograma

Menos sensible que RT-PCR abl-bcr

LMC

9

22

Métodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma PhMétodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma Ph

FISHFluorescence in situ hybridisation

RT-PCRReverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction

Interphase MetaphaseLabeled DNA probe(fluorescent)

Nuclear DNA

bcr-abl geneSeparate DNA strands and add labeled probe

Labeled bcr-abl gene

Fluorescence in situ hybridisation (FISH)Fluorescence in situ hybridisation (FISH)

FISH en MO y sangre periféricaAlta correlación resultadosFISH en MO y sangre periféricaAlta correlación resultados

Peripheral Blood

Mar

row

% Ph+100

80

60

40

20

00 20 40 60 80 100

% Ph+

AMPLIFICACIÓN DE GEN abl/bcr

RT-PCR (Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction)

• Más sensible que Cariograma (detecta 1 cél. malig. en >106 cél. N)

Detección cél. Ph+ ( Diagnóstico y post-trasplante MO)

MÉTODO• Obtención Cél. Mononucleares de MO ( grad. de densidad)

• Obtención de RNA

• Transcripción reversa (obtención cDNA)• Transcriptasa reversa, “Primers”

• Amplificación• DNA polimerasa, “Primers”, Oligonucleótidos , • Termociclador

• Visualización del producto amplificado • Electroforesis Gel agarosa , • Bromuro de Ethidio , UV

Etapas del RT-PCRPlasma

LinfocitosFICOLL; d 1.077

PMN GR,

LMC

PM Cont – Ph+ N DNA

RT-PCR bcr-ablLMC

CRISIS BLÁSTICA

Periferia

• Anemia• Trombocitopenia • Leucocitosis (>20% Blastos)

Leucopenia, Trombocitosis Marcada displasia

Médula Ósea•Infiltración (mieloblastos)•Disminución series normales

LMC

Opciones terapéuticas

Trasplante alogénico de Progenitores Trasplante alogénico de Progenitores hematopoyéticos.hematopoyéticos.

Tratamientos basados en IFN-Tratamientos basados en IFN-αα

Quimioterapia: Hidroxiurea, BusulfanQuimioterapia: Hidroxiurea, Busulfan

Imatinib, Gleevec (STI571)Imatinib, Gleevec (STI571)

LMC

•Transfusión GR (Anemia grave)

•Transfusión plaquetas (Trombopenia marcada)

•Antibióticos (Infecciones)

Imatinib, Gleevec (STI-571)

Tirosina Kinasa 210 kDa

Tirosina Kinasa 210 kDa

(STI-571)

LMC LMC

EGF-R EGF-R

Ser474 Ser474

Imatinib: Mecanismo de acción(Inhibidor de tirosina kinasa)

Imatinib: Mecanismo de acción (cont)

Trasplante de progenitores hematopoyéticos:Alta morbilidad y mortalidadTrasplante de progenitores hematopoyéticos:Alta morbilidad y mortalidad

Survival by Disease Stage, June 2001, based on transplants 1987 – Feb 2001.

P=.0001

LMC

IFN-IFN- IFN- tiene efectos biológicos múltiples:

– Inhibe proliferación celular

– Regula expresón de otras citoquinas

– Modula el Sistema immune

Respuesta citogenética: puede ocurrir a 12 a 18 meses

Mejor sobrevida en casos Fase Crónica temprana

IFN- combinada con cytarabina (Ara-C): mejor respuesta

LMC

IFN- Buen resultado en fase crónica tempranaIFN- Buen resultado en fase crónica temprana

CHR = complete haematological response; MCR = major cytogenetic response.

Phase Patients(n)

CHR(%)

MCR(%)

Chronic <12 mo 274 80 38

>12 to <36 mo 72 62 8

>36 mo 42 49 8

Accelerated 61 52 7

Blast Crisis 5 20 0

Quimoterapia es solo paliativaQuimoterapia es solo paliativa

Fármacos citotóxicos orales– Hydroxyurea– Busulfan

Respuesta Hematológica: 90%

Respuesta citogenéticas: 1%–5%

No modifica progresión de enfermedad

LMC

Bcr-Abl: Target terapéuticoBcr-Abl: Target terapéutico

Bcr-Abl: 95% pacientes

Bcr-Abl: Asociada a causa

Tirosina kinasa Bcr-Abl:

Requerida para función celular de LMC.

LMC

Imatinib: Inhibe selectivamente kinasasImatinib: Inhibe selectivamente kinasas

Kinases Inhibited Kinases Not Inhibited

v-Ablv-Abl 0.1–0.30.1–0.3 Flt-3Flt-3 >10>10p210Bcr-Ablp210Bcr-Abl 0.250.25 c-Fms, v-Fmsc-Fms, v-Fms >10>10p185Bcr-Ablp185Bcr-Abl 0.250.25 EGF receptorEGF receptor >100>100TEL-AblTEL-Abl 0.350.35 c-erbB2c-erbB2 >100>100PDGF-RPDGF-R 0.10.1 Insulin receptorInsulin receptor >100>100TEL-PDGF-RTEL-PDGF-R 0.15 0.15 IGF-1 receptorIGF-1 receptor >100>100c-Kitc-Kit 0.1 0.1 v-Srcv-Src >10>10

JAK-2JAK-2 >100>100

Imatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivasImatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivas

*Bcr-Abl–negative cell lines.

†Bcr-Abl–positive cell lines.

Imatinib Concentration (M)

U937*KG1*SU DHL1*

KCL22†

K562†

KU812†

Imatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzadaImatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzada

Estados avanzados de Cas: multiples cambios genéticos

En fase acelerada: A menudo recaen con resistencia a quimioterapia.

En crisis blástica: Algunos rsponden pero recaen

F. crónica F. blástica Recaida

Ph+

Ph+ blastsPh-negative

Ph+ imatinib-resistant blasts

Hae

mat

opoi

etic

diffe

rent

iatio

n

Bone m

arrow to peripheral blood

LMC

Cytogenetic Response

Imatinib (n=553)

IFN- + Ara-C (n=553)

Major (35% Ph+, MCR)* 457 (83%) 112 (20%)

Complete (0% Ph+)* 375 (68%) 41 (7%)

Partial (1%–35% Ph+) 32 (15%) 71 (13%)

Imatinib: Induce mayor respuesta citogenética

*P<.001.

Con Imatinib: Respuesta hematológica completa más rápida Con Imatinib: Respuesta hematológica completa más rápida

94%

55%

Imatinib

IFN- + Ara-C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Months Since Randomisation0 3 6 9 12 15 18 21

% R

esp

ond

ing

Con Imatinib:

Cambios citogenéticos más rápidos

Imatinib

IFN- + Ara-C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Months Since Randomisation0 3 6 9 12 15 18 21

% R

esp

ond

ing

83%

20%