INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS

DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLÉICOS

(N.A.T.)

BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI

FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO

lilianadt2003@yahoo.com.ar

INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN

Patógenos transmisibles por transfusión

Virus Virus de la Hepatitis B (HBV)

Virus de la Hepatitis C (HCV)

Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2)

Virus Linfotrópico Humano I/II (HTLV I/II)

otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus

Parásitos Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza)

otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum

Bacterias Treponema pallidum (Sífilis) Brucella abortus (Brucelosis)

otros

Agentes no convencionales-Priones2

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR

TRANSFUSIÓN EN ARGENTINA

(LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )

HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total

HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV

HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2

HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II

Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinación indirecta, ambos anti-

Tripanosoma cruzi

Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum

Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-Brucella abortus

3

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR

TRANSFUSIÓN

Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o

plasma) del donante de la presencia de una respuesta

inmune contra un patógeno dado Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio

Ej: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del

donante (EIA anti-HIV 0/1/2)

Métodos directos: detección directa de la presencia

del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del

donante Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag

Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral

4

FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIÓN DE

INFECCIONES A TRAVÉS DE LAS TRANSFUSIÓN

Errores humanos o de laboratorio

Problemas en los sistemas de análisis/equipos

Insuficiencias en la calidad de los análisis

Entrenamiento deficitario

Seroconversiones atípicas

Variantes o genotipos del patógeno no detectadas

Cambios epidemiológicos

Periodo de “ventana” serológico

5

TiempoInfección

Reacción inmune

Reactivo Serológico

PERÍODO VENTANA

TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIÓN Y EL

DESARROLLO DE MARCADORES SEROLÓGICOS

6

Período

Ventana: NAT

Eclipse

Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al.

Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003

Año

1/1000

1/10,000

1/100,000

1/1000,000

Rie

sg

o d

e i

nfe

cció

n p

or

un

ida

d tr

an

sfu

nd

ida

1985 1990 1996 1999 2001

HCV

HBV

HIV1/180,000

1/1.600,000

1/1.900,000

1/100

Ac Anti-HIV Ac Anti-HCV NATp24

EVOLUCIÓN DEL RIESGO EN LA PROVISIÓN DE SANGRE

7

NUCLEIC ACID TESTING

Ventajas de NAT

Importante avance teconológico en screening de sangre

Altamente sensible & específico

dirigido especificamente a las secuencias nucléicas virales

Detección directa del RNA or DNA viral

Ayuda a la prevención de enfermedades transmisibles por

transfusión

Provee una etapa adicional de seguridad a la provisión de sangre

segura

Reduce el Período Ventana desde la infección hasta la detección8

Tiempo

Infección

Reactividad Serológica

Virus

Detección más temprana

NAT positivo

OBJETIVO DE NAT O DGV:

DISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA

Reacción inmune

9

Eclipse

Período

Ventana

EJ: EVOLUCIÓN CLÍNICA DE HIV: DÓNDE ACTÚA NAT?

10

EVOLUCIÓN EN LA IMPLEMENTACIÓN DE LAS TÉCNICAS NAT EN LOS BANCOS DE SANGRE

1993 se considera formalmente la utilización de NAT para el tamizaje en bancos de

sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos

de infección por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa

manufacturada.

1995 Comité Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se

adhirió a este lineamiento, haciéndolo extensivo a todos los productos medicinales

derivados del plasma.

1997 Organización Mundial de la Salud (OMS) se establecen estándares para el

ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.

2000-2001 diferentes países incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el

tamizaje de donaciones.

2009 OMS en su documento “Recommendations: Screening Donated Blood for

Transfusion-Transmisibles Infection” sugiere que junto a los ensayos de tamizaje

serológicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serológicos de

antígenos y/o anticuerpos, se realice la búsqueda de ácidos nucléicos virales para

estos patógenos.11

PERÍODO VENTANAMODEL TESTING DATA

Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.

Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .

12

VENTAJAS NAT

13

VIRUS Pruebas

serológicas

NAT MP

(Minipool)

NAT ID

(Individual)

VIH

(incluye p24)16 días 10 días 7 días

VHC 70 días 9 días 7 días

VHB 59 días 49 días 38 días

Acortamiento del período de ventana inmunológico

Disminución del riesgo residual

TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA

MOLECULAR

Involucran tres etapas:

1. Extracción o captura del genoma viral

2. Amplificación

3. Detección

Ejemplos:

PCR(Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR (Real Time PCR)

NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)

TMA (Transcriptional Mediated Amplification) 14

15

EasyQ Instrument &

Reagents

Desktop computer

Strip centrifuge

NucliSens

EasyQ

IncubatorNucliSens

EasyQ

Analyzer

Nuclisens Easy Q system TMA: pasos principales del ensayo

Detección

Captura del blanco

o diana (target)

Amplificación

PCR Real

Time

PCR

TMANASBA

MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS

TÉCNICAS NAT

Técnicas “in house”

Técnicas comerciales

Técnicas Cualitativas

Técnicas Cuantitativas

Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)

16

POOL

48

POOL

24

UNIDADES

POOL

24

UNIDADES

POOL

8

POOL

8POOL

8

POOL

8

POOL

8

POOL

8

NAT DETECTA INFECCIÓN HCV MÁS TEMPRANO QUE EL

TEST DE ANTICUERPOS

17

0

1,000

10,000

100,000

10,000,00

10,000,000

0

1

2

3

4

5

0 10 20 30 40 50

NAT pool

HCV Ac

HCV GEq/mL S/CO

Días

28 días7 días

Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999

NAT ID test

HCV GEq/mL

PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN

CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR:

Sensibilidad

Especificidad

Detección de variantes/subtipos

Reproducibilidad

Trazabilidad de reactivos y resultados

Software adecuado

Control Interno

Control de Contaminación

Ensayos discriminatorios/confirmatorios

Identificación de su uso: RUO o IVD

Marca CE, FDA, ANMAT18

PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA

SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS

EN SUS DIFERENTES ETAPAS:

Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de

ADN/ARN foráneo o productos de amplificaciones

precedentes.

Control Negativo: para evaluar los riesgos de

contaminación (en la organización del espacio físico, en

los métodos de trabajo, posible aerozolización durante

el alicuotado de reactivos)

Control Positivo: para controlar la presencia de

inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas.

Control Interno: para verificar la idoneidad de la

amplificación y/o la presencia de inhibidores de la

misma. 19

Marca (s) Formato Muestra Uso habilitado Fabricante Fecha de

Aprobación

COBAS

Ampliscreen HIV-1

Test

PCR Plasma

Donor Screen

Expanded Indications

For Use: Source

Plasma donors, other

living donors, and

organ donors

Roche Molecular

Systems, Inc12/20/2002

Procleix HIV-1/HCV Nucleic

Acid Test (TMA)Plasma

Donor Screen

Expanded Indications

For Use: Source

Plasma donors, living

organ donors and

cadaveric samples

Gen-Probe

San Diego, CA

9212102/08/2002

UltraQual HIV-1

RT-PCR Assay PCR Plasma

Donor Screen National Genetics

Institute

Los Angeles, CA 9212109/18/2001

UltraQual HCV RT-

PCR Assay PCR Plasma

Donor Screen National Genetics

Institute

Los Angeles, CA

92121

09/18/2001

COBAS

AmpliScreen HCV

Test

PCR

Plasma

Donor Screen

Expanded Indications

For Use: Source

Plasma donors, other

living donors, and

organ donors

Roche Molecular

Systems, Inc 12/3/2002

COBAS

AmpliScreen HBV

Test PCRPlasma

Donor Screen

Indications For Use:

Source Plasma donors,

other living donors,

and organ donors

Roche Molecular

Systems, Inc 04/21/2005

Procleix WNV Assay

Nucleic Acid Test

(TMA)

ID

Plasma

Qualitative detection of

West Nile Virus

(WNV) RNA from

volunteer donors

Gen-Probe

San Diego, CA

9212112/01/2005

20

COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA

DE LOS TEST NAT

95% Límite de Detección (95% CI)

Ensayo HIV

(IU/ml)

HCV

(IU/ml)

HBV

(IU/ml)

WNV**

(Copies/ml)

Procleix TMA* 19.62

(17.15-23.16)

2.78

(2.44-3.37)

7.46

(6.43-8.97)

3.4

AmpliScreen*

Std

preparation

323.4

(284.9-387.3)

41.9

(28.0-111.8)

15.99

(13.78-20.06)

Taq

Screen

15AmpliScreen*

Multiprep

78.4

(68.4-94.4)

28.8

(20.5-85.8)

4.41

(3.56-6.13)

* Roche’s COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499

21

DISEÑO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA

DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Metas principales para la instalación:

Proporcionar el espacio suficiente para el flujo

de trabajo y mantenimiento de equipos

Evitar la contaminación

Mantener la correcta temperatura , humedad y

presión del ambiente

22

CONDICIONES GENERALES

Nivel de seguridad 2 : BSL2

Paredes con pintura resistente a la descontaminación (ácidos o álcalis)

Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo.

Presión relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa en área de post-amplificación

Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con bordes sanitarios y puertas corredizas

Mesadas: resistentes a agentes químicos

Iluminación: compartimiento estanco

Electricidad: UPS de soporte / grupo electrógeno

23

ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Área de preparación de reactivos y muestras

Área de pre-amplificación

Área de post-amplificación y detección

Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o

protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra.

Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo

diferentes24

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

BIOLOGIA MOLECULAR

Principal objetivo: minimizar la contaminación a través de…

Diseño del ensayo

Disposición del laboratorio

Control del flujo de trabajo

25

ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

26

Pre-Amplificación

Post-Amplificación

GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA

MOLECULAR

Manuales de Gestión de la Calidad

Manuales de procedimientos

Manual de Bioseguridad

Estándares y normativas: Norma ISO 9001:2000

Norma ISO /IEC17025 /1999

Estándar Paul Erlich Institute

Organismos internacionales: OMS “Collaborative Study

Group” (provee CCE y establece la unidad de medida:

UI/ml)

Acreditación27

CONCLUSIONES (1)

Disminución del período ventana

Otras aplicaciones: tests que permiten unadetección directa de otros virus. Ej: WNV, otrosvirus emergentes

Progresar desde analizar mini-pooles a analizarmuestras individuales.

Lograr la implementación de automatización totalde las técnicas de NAT:

-disminución de los errores del operador.

-mejor estandarización operativa.

-optimización de los tiempos de reacción.

-trazabilidad de los productos liberados. 28

CONCLUSIONES (2)

Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas

puntuales referentes a la implementación de NAT en

Argentina:

la obligatoriedad de las técnicas NAT en Medicina Transfusional,

creación de comités de expertos que evalúen la necesidad de

legislar el tema

definición de la logística de centralización de muestras para lograr

un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable

evaluación de resultados obtenidos hasta el momento mediante las

técnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de

definir si la sensibilidad de dichas técnicas y su ejecución son

útiles en nuestro sistema de salud

consolidación en la formación de los recursos humanos dedicados

a la aplicación de NAT. 29