Introducción El cáncer no es una enfermedad única. Al contrario, el cáncer es una colección de enfermedades que tienen distintas manifestaciones histopatológicas, con variaciones genéticas y genómicas, y distintos comportamientos clínicos. Uno de los mayores retos para avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer es el acceso a un modelo experimental que recapitule estas distintas formas de la enfermedad. Debido a su complejidad y heterogeneidad, no hay un modelo único que pueda mimetizar todos los aspectos de la enfermedad. Por ello, cuando investigamos el cáncer, debemos considerar distintos elementos clave. Nosotros nos centraremos en comprender las alteraciones en el tumor primario que facilitan la metástasis de la células tumorales. Asimismo, evaluaremos las oportunidades terapéuticas que se basan en la comprensión de los mecanismos que subyacen en la progresión metastática, principal causa de mortalidad. Esto representa uno de los más importantes desafíos para los investigadores del cáncer. La metástasis es responsable del 90% de las muertes en pacientes que padecen un cáncer originado por tumores sólidos. Para poder atajar esta problemática, es crucial comprender y entender los mecanismos moleculares y celulares responsables de que un tumor primario metastatize. Históricamente, los estudios sobre este fenómeno se concentraron en análisis individualizados de las funciones y las correlaciones clínicas de determinados genes de interés 1. Recientemente se han incorporado nuevas técnicas para el estudio a gran escala de las alteraciones genómicas que suceden en muestras de tumores, lo que permite detectar grupos de genes cuya elevada expresión se correlaciona con la habilidad de un tumor para formar metástasis 2-4. Una de las principales limitaciones de estos estudios es que no son capaces de separar aquellos genes que son causantes de metástasis de los que son simples marcadores de la misma. En estos últimos dos años se ha empezado a entender el complejo proceso de la metástasis, el cómo y el cuándo ésta ocurre, el mecanismo por el cuál la metástasis es un proceso órgano-específico y cuáles son los genes mediadores de metástasis que pueden ser utilizados como dianas farmacológicas para el tratamiento de la enfermedad5. Uno de los aspectos biológicos más sorprendentes de la metástasis es su patrón de diseminación a los órganos distantes. Frecuentemente, cuando un tumor se esparce por el organismo, lo hace invadiendo los nódulos linfáticos próximos. Sin embargo, los tumores más agresivos acceden al torrente circulatorio, desde donde colonizan tejidos distantes. Esta diseminación no se produce al azar. En general, cada tipo de cáncer sigue un guión definido de diseminación, afectando, por lo general, el mismo repertorio de órganos en distintos pacientes5. Por ejemplo, los tumores de mama tienen propensión a metastatizar al hueso, al pulmón/pleura, al cerebro, al hígado y a los nodos linfáticos. El hueso es el sitio metastático más frecuente en este tipo de tumores y se observa en aproximadamente el 70% de los pacientes. Por el contrario, el cáncer de colon en hígado y pulmón, y el cáncer de próstata forma metástasis mayoritariamente en hueso 6. Mientras los tumores agresivos pueden presentar una propensión intrínseca a evolucionar y formar metástasis (como un reflejo de la presencia de marcadores o de conjuntos de genes que predicen una mala prognosis), la mayoría de las células liberadas por un tumor fracasarán en el proceso de colonizar un órgano distante. Para

las células liberadas al torrente circulatorio, el microambiente presente en los órganos distantes representa un territorio hostil. Esto es así porque los órganos imponen barreras frente a células heterólogas precisamente para preservar la integridad del órgano y del organismo. De este modo, ciertos factores del territorio a colonizar pueden resultar atractivos para las células de determinados tumores en un determinado microambiente. La metástasis es un proceso que implica múltiples etapas, incluidas la intravasación, la supervivencia en circulación, la extravasación, la angiogénesis y el crecimiento continuo en el foco secundario 7. Existen varios modelos sobre cómo las células procedentes del tumor primario adquieren las habilidades metastáticas. El modelo clásico asume que sólo algunas de las células adquieren estas habilidades a través de una acumulación de cambios genéticos y epigenéticos. Sin embargo, estudios recientes han identificado grupos o conjuntos de genes que predicen el potencial metastático a partir del tumor primario, lo que sugiere que las células del tumor primario ya poseen capacidad para metastatizar. Nosotros entendemos la metástasis como el resultado de dos determinantes fundamentales en la evolución biológica: la variación genética y la presión selectiva5, 8. En la evolución metastática de los tumores, la variabilidad genética es aportada por la inestabilidad genómica intrínseca del estado transformado, mientras que el ambiente que encuentran las células circulantes en los órganos receptores ejercerá e impondrá una presión selectiva. Mientras los tumores agresivos han adquirido una propensión intrínseca para desarrollar metástasis (como refleja la presencia de grupos de genes indicadores de mala prognosis antes mencionados), muchas de las células liberadas por los tumores primarios fallarán en su intento de colonizar el órgano distante9, 10. Para las células tumorales en circulación, el microambiente de los órganos distantes es, sin lugar a dudas, un territorio hostil10, 11. Los órganos distantes imponen barreras a las células heterólogas para reforzar la integridad del órgano y, con ello, del organismo. Es cierto que ciertos factores producidos por estos territorios distantes pueden resultar atractivos para ciertas células tumorales en un determinado microambiente. Sin embargo, la mayoría de las barreras impuestas por los microambientes específicos de cada órgano son suficientes para impedir el acceso a la mayoría de la células tumorales que reciben. A pesar de todas estas barreras, la colonización metastática ocurre y finalmente acaba con el organismo huésped. La colonización metastática de un órgano particular representa el resultado final de un proceso evolutivo en el cual células de un tumor con un fondo genéticamente diversificado han acumulado funciones que suceden para superar las barreras microambientales del órgano. Una vez se ha producido la salida de las células del torrente circulatorio y estas colonizan el nuevo órgano, este grupo de células coevolucionan conjuntamente con el tejido circundante hacia una completa colonización. Cada órgano presenta un microambiente distinto. Por ello, es posible pensar que un grupo de estos genes o funciones que median la colonización son en gran medida órgano-específicos 5, 12. El estudio de estos fenómenos ha permitido identificar recientemente grupos de genes normales cuyo abuso por parte de las células cancerosas los convierte en instrumentos para la metástasis 12-14. Dichos pasos rigen las etapas fundamentales de la fuga de células del tumor primario, la invasión de tejidos distantes por estas células circulantes, y a resultas de ello, el establecimiento de colonias microscópicas en

dichos tejidos. La metástasis no es solamente un problema de exceso de crecimiento de las células, sino sobre todo un problema de crecimiento en un lugar donde esas células no deberían estar. Por esta razón, para tratar la metástasis debemos identificar los mecanismos necesarios para estos procesos, para así mejorar el tratamiento de la enfermedad en especificidad y eficiencia.

Entre los genes necesarios para la metástasis a pulmón del cáncer de mama, destaca angiopoietina de tipo 4 (ANGPTL4). Este gen, inducido por el TGFβ, desempeña un papel muy importante en este proceso. La hormona TGFβ es un paradigma funcional de versatilidad: regula tanto la proliferación celular como también la diferenciación y las respuestas a estrés, la producción de factores de secreción y proteínas de matriz, y la actividad de muchas vías de señalización. Esta actividad pleiotrópica tiene importantes implicaciones en el cáncer (2). En una fracción de cánceres gastrointestinales y pancreáticos, así como en una fracción de otro tipo de cánceres, la resistencia a la acción del TGFβ sucede a causa de mutaciones que inactivan los receptores para la hormona o bien sus transductores de señales, las Smads (3). Sin embargo, en ciertos tipos de cáncer, las respuestas génicas citostáticas producidas por el TGFβ son eliminadas de un modo selectivo a causa de defectos de naturaleza desconocida que desacoplan las funciones del receptor y las Smads. Cuando esto ocurre, las células tumorales pueden usar las restantes respuestas producidas por el TGFβ en su beneficio durante los procesos de invasión, de evasión de la vigilancia del sistema inmune y de la colonización metastática. En su conjunto, esta propuesta presenta una estrategia multidisciplinar que integra una aproximación experimental para modelar los procesos de metástasis en ratón, el uso de muestras clínicas para el aislamiento de células metastáticas, el análisis de la expresión génica de estas células metastáticas, el estudio in vivo y ex vivo de la interacción entre el estroma y las células metastáticas, técnicas de imagen de alta resolución para el estudio de los procesos de metástasis in vivo, patología experimental, bioinformática y bioestadística. Una combinación robusta de tecnologías para atajar el problema que se plantea y que son una realidad en el IRB Barcelona. Estas tecnologías se han complementado con una colaboración con especialistas clínicos. Las técnicas de imagen en animales, de bioinformática y de bioestadística (Dr. David Rosell), de genómica (Herbert Auer), de citometría de flujo (Dr. Jaume Comas), de patología experimental y de microscopía son parte de las plataformas de apoyo a la investigación propias del IRB Barcelona y de su entorno en el Parc Científic de Barcelona. En la vertiente clínica, la colaboración con la Dra. Cristina Nadal, del Hospital Clínico de Barcelona, es una oportunidad única porque aporta la perspectiva y los conceptos clínicos al problema, y a la vez permite examinar en detalle las características de la metástasis en muestras procedentes de pacientes para la validación, relevancia clínica y traslación de los descubrimientos en beneficio del paciente.

-Objetivo del estudio: Identificación de nuevos genes y funciones esenciales para la metástasis. Mediante la combinación de técnicas de análisis de perfiles de expresión génica mediante “arrays” de DNA con la selección funcional in vivo de células metastáticas órgano-específicas, identificaremos los genes responsables de la mediación de la metástasis a determinados órganos 3, 4, 13, 14. Esta estrategia experimental ha sido validada recientemente en el laboratorio del Dr. Massagué en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) 12-14. Para ello, se ha implementado en el Institut de Recerca Biomédica de Barcelona (IRB Barcelona) la tecnología necesaria para el aislamiento de células metastáticas órgano-específicas procedentes de pacientes con un cáncer metastático avanzado 12, 15. Mediante esta tecnología obtenemos células malignas procedentes de fluidos pleurales a partir de muestras residuales de procedimientos médicos estándar aplicados con fines paliativos a pacientes con esta enfermedad, procedentes del Hospital Clínico de Barcelona. Este proceso de obtención de células metastáticas órgano-específicas mediante selección funcional in vivo en ratones inmunodeprimidos se rige siguiendo los criterios y la supervisión del Comité Ético del Hospital Clínico de Barcelona y del IRB Barcelona. -Hito 1: Implementación de la metodología para el aislamiento de células metastáticas procedentes de pacientes con cáncer de mama o pulmón. Racional: Los pacientes con cáncer de mama o pulmón con diseminación y afectación de múltiples órganos desarrollan efusiones pleurales malignas que causan dificultades de respiración y unos bajos niveles de oxigenación debido a la restricción mecánica de la expansión pulmonar. El tratamiento estándar para este tipo de situaciones es la toracentesis, un proceso por el cual se sustrae aproximadamente un litro de fluido mediante el uso de un catéter (éste fluido normalmente es eliminado). El fluido pleural maligno contiene células tumorales, así como células de la pleura e inflamatorias. Partimos de la premisa de que los tumores primarios liberan células, algunas de las cuales serán recogidas en el fluido pleural. Estas células tumorales serán utilizadas como fuente para la obtención de subpoblaciones metastáticas órgano específicas. Las células malignas aisladas a partir de fluidos pleurales serán marcadas mediante el uso de un vector para la visualización multi-modal (bioluminiscencia, fluorescencia y micro-PET) de las células metastáticas en ratones mediante técnicas no invasivas. Figura 1. Esquema del proceso de selección de células CD15 y CD45 negativas y EpCAM positivas procedentes de efusiones pleurales de pacientes con cáncer metastático, su posterior marcaje y selección con la proteína de fusión TK-GFP-Luc mediante infección con lentivirus y finalmente su inoculación en ratones atímicos para posterior selección de subpoblaciones metastáticas

1. Consentimiento informado 2. Recolección de la efusión pleural: Cáncer de mama

4. Transdución con un vector de imagen. 5. Inoculación.

< 2 semanas

3. Selección negativa (anti-CD15/anti-CD45) Selección positiva (anti-EpCAM)

6. Extracción, expansión y repetición del ciclo.

7. Análisis transcriptómico comparativo

-Hito 2: Identificación de poblaciones metastáticas con tropismo para determinados tejidos. Racional: Las células, EpCAM positivas y GFP positivas, procedentes del Hito 1 y las líneas celulares de cáncer de mama (Receptor de Estrógeno positivas) seleccionadas, son inoculadas vía circulación arterial en ratones inmunodeficientes para permitir la formación de lesiones metastáticas. Las posibles metástasis serán aisladas y las células que las forman expandidas ex vivo por un corto período de tiempo. Las poblaciones de células metastáticas resultantes del primer ciclo de selección en ratón serán re-inoculadas para verificar y enriquecer para tropismo órgano-específico. También hemos realizado la misma aproximación mediante inoculación de las células metastáticas en la circulación venosa de los animales. -Hito 3: ANGPTL4 Racional: La identificación de los genes de metástasis y sus mecanismos es esencial para el conocimiento básico de la biología de esta condición letal y sus implicaciones en la práctica clínica. Las recientes aportaciones del Dr. Massagué han permitido identificar y validar clínicamente grupos de genes la sobreexpresión de los cuales, confiere en tumores de cáncer de mama una ventaja selectiva para la colonización de los pulmones. También existe la posibilidad que el microambiente del tumor primario pueda influenciar las posibilidades de éxito de las células cancerosas que escapan de este tumor. Entre estos factores en el microambiente del tumor, nos centramos en la citoquina TGFβ, responsable de la modulación de la progresión tumoral en distintos sistemas. Para investigar el papel contextual de la vía de señalización del TGFβ en el cáncer en humanos y el mecanismo por el cual puede instigar la metástasis, basamos nuestro trabajo en el uso de datos clínicos y técnicas de análisis bioinformática. Aplicando esta tecnología, se identificó en aquellos pacientes con tumor de mama con elevada actividad para el TGFβ una elevada propensión a desarrollar metástasis pulmonares pero no óseas. Este fenómeno se produce mediante un mecanismo basado en ANGPTL4 como ejecutor del efecto del TGFβ. Resultados Experimentales: resultados anteriores del laboratorio posicionaron el gen de la ANGPTL4 como uno de los principales miembros de la LMS (o grupo de genes que identifican tumores de mama con elevada predisposición a metastatizar a pulmón). Estos resultados se obtuvieron en muestras de tumores primarios y células metastáticas procedentes del hito 1. En este trabajo, hemos demostrado que la estimulación con la hormona TGFβ estimula potentemente la expresión de ANGPTL4, y mediante técnicas de siRNA hemos validado la función de éste gen como mediador de la metástasis del cáncer de mama a pulmón. La supresión de la expresión de ANGPTL4 en las células LMS positivas inhibe la capacidad de estas células para colonizar los pulmones. Este efecto se produce sin afectar la proliferación de estas células como tumores en la mama, su capacidad de intravasación y de acceder a la circulación, así como invadir los nódulos linfáticos (Figura 4). La ANGPTL4 antagoniza la unión y la adhesión de la células del endotelio vascular, y compromete la integridad de las paredes de los capilares cuando es segregada por parte de las células metastáticas de cáncer de mama que han sido atrapadas en los pulmones

(Figura 6). Estos resultados nos sugerían que la ANGPTL4 actuaba como potenciador de la extravasación de las células de cáncer de mama mediante la supresión transitoria de la integridad de los capilares. Estas observaciones encajaban con el papel de ANGPTL4 como un regulador vascular en situaciones de isquemia y hipoxia tumoral y están en la línea del papel que desarrolla la angiopoietina y sus análogos en la remodelación vascular. El hecho que ANGPTL4 esté presente en dos signaturas génicas -LMS (signatura de metástasis a pulmón) y TBRS (Signatura de respuesta a TGFβ)- asociadas a metástasis a pulmón en pacientes con cáncer de mama, evidencia que ANGPTL4 es un mediador de metástasis a pulmón en cáncer de mama clínicamente relevante (Figura 5). Figura 4 A) Ratones inyectados con 5x10E5 células en la cuarta mama fueron analizados para el crecimiento de los tumores. El tamaño de tumor indicado corresponde al día 28. n=14; Los errores corresponden al error estándar de la media. B) La sangre de los ratones portadores de tumores fue aislada y los eritrocitos lisados. El RNA de las células restantes fue analizado por qRT-PCR. La presencia de células humanas circulantes fue medida en función de la cuantificación de la expresión de la isoforma humana de GAPDH relativo a los niveles de B2-microglobulina murina. C) Cuantificación por luminiscencia de la colonización a pulmón de tumores implantadas ortotópicamente en la mama. Estos tumores fueron crecidos hasta los 300mm3, en este momento se practicó una mastectomia. La colonización de los pulmones se ensayo por bioluminiscencia 7 post cirugía. n=7-15; Los errores corresponden al error estándar de la media D) Imágenes de bioluminiscencia y inmunohistoquímica de pulmones representativas de cada grupo experimental definido en C. Las células de cáncer de mama fueron teñidas con vimentina humana. E) Ratones inyectados con 5x10E5 células control, con silenciación de ANGPTL4 y su rescate en la cuarta mama fueron analizados para el crecimiento de los tumores. El tamaño de tumor indicado corresponde al día 28. n=14; Los errores corresponden al error estándar de la media. F) La presencia de células humanas circulantes fue medida en función de la cuantificación de la expresión de la isoforma humana de GAPDH relativo a los niveles de B2-microglobulina murina. G) Cuantificación por luminiscencia de la colonización a pulmón de tumores implantadas ortotópicamente en la mama. La colonización de los pulmones se ensayo por bioluminiscencia 7 post cirugía. n=13-15; Los errores corresponden al error estándar de la media H) Cuantificación por luminiscencia de la colonización a pulmón de células inyectadas en la vena de la cola del ratón. Antes de la inyección, estas células fueron tratadas tal y como se indica con 100 pM TGFβ durante 6 horas. La colonización de los pulmones se ensayo por bioluminiscencia. n=6; Los errores corresponden al error estándar de la media.

A B C

D

G H

Para poder identificar mejor el papel del TGFβ y su significancia en la progresión de los tumores en pacientes, desarrollamos una herramienta bioinformática, un clasificador, el TBRS, que nos permite clasificar las muestras de tejidos tumorales que tienen un perfil de expresión correspondiente a una vía de señalización del TGFβ activa. Utilizando esta herramienta podíamos ver con que tipos de tumores se asociaba la presencia de actividad TGFβ y una mayor incidencia de metástasis. Para nuestra sorpresa, ésta asociación estaba restringida a los tumores de mama receptor de estrógenos (ER) negativos. Así pues, las contribuciones del TGFβ y ANGPTL4 a la metástasis a pulmón ocurren en el contexto del fenotipo LMS positivo (Figura 5). Figura 5. A) Identificación del estatus TBRS en un grupo de 368 tumores primarios de cáncer de mama del MSK/EMC sus anotaciones de incidencia de metástasis ósea y de pulmón. Rojo indica una correlación fuerte entre los perfiles de expresión génica individual de los tumores y el desarrollo de metástasis al hueso o al pulmón B) Supervivencia libre de metástasis al pulmón en pacientes con tumores ER negativos. Los pacientes fueron catalogados en función de su estatus TBRS y LMS. El valor P están indicados para las comparaciones con tumores LMS positivos. Muchas son las actividades adscritas al TGFβ que pueden favorecer la progresión tumoral en general, incluyendo el mantenimiento del fenotipo mesenquimal o la evasión del sistema inmune. Sin embargo, no es obvio como estos efectos del TGFβ pueden favorecer el proceso de metástasis a un órgano concreto. A pesar de ello, nuestra evidencia clínica y funcional asocia selectivamente el TGFβ en el tumor primario con la metástasis a pulmón y no al hueso. Esta observación implica un mecanismo de selección biológico, y nuestros resultados apuntan a la inducción de ANGPTL4 y su inducción por TGFβ como la pieza central de este mecanismo. Nuestros resultados indican que la estimulación de las células de carcinoma mamario con TGFβ antes de entrar en circulación las predispone y actúa como cebador para que estas células se implanten en los pulmones a gracias a la inducción transitoria de ANGPTL4. Este efecto está mediado por la vía de señalización canónica del TGFβ, cuyo efecto en células epiteliales en condiciones normales es suprimir la proliferación. Sin embargo, en células metastáticas de cáncer de mama, éstas pierden la capacidad de inducir las respuestas génicas citostáticas de un modo eficiente. Debido al efecto desestabilizador de ANGPTL4 en las uniones de las células endoteliales, nuestros resultados nos han permitido sugerir que la inducción mediada por el TGFβ de este factor incrementa la capacidad de extravasación de las células de cáncer de mama cuando éstas llegan a los pulmones. Esto representa la primera evidencia por la cual una citoquina en el micro-ambiente

E F

A

B

del tumor de mama primario puede predisponer y cebar las células dispersadas con la capacidad para incrementar los niveles de otra citoquina y con ello poder implantarse y colonizar un órgano distante de un modo más eficiente (Figura 6)

Figura 6. A) Monocapas de HUVEC fueron tratadas durante 24 horas con medio condicionado procedente de células control LM2 o células LM2 que sobreexpresan la ANGPTL4. Estas muestras fueron teñidas con anticuerpos contra ZO-1 (uniones célula-célula) y con Phaloidina (Marcaje del citosqueleto celular). B) Modelo esquemático del mecanismo de acción establecido por el TGFb en el tumor primario para favorecer la metástasis al pulmón. Las células tumorales ER negativas expuestas al TGFβ responden induciendo el gen ANGPTL4 a través de las SMAD. Cuando acceden a los vasos y arriban a los capilares pulmonares, estas células producen la hormona Angptl4, la cual compromete las uniones celulares de la pared endotelial permitiendo que las células cancerosas puedan acceder al parénquima pulmonar con facilidad. Estos resultados han sido generados en colaboración con el laboratorio del Dr. Joan Massagué en el MSKCC, y han sido publicados en: - Padua D., Zhang X.H.F., Wang Q., Nadal C., Gerald W., Gomis R.R. and Massagué J., “TGFβ primes breast tumors for lung metastasis seeding through angiopoietin-like 4” Cell (2008) 133: 66-77

A B

Actividades de colaboración científica Visita del laboratorio de metástasis tumoral (MetLab) del IRB Barcelona al laboratorio del Dr. Massagué en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. El Dr. Roger Gomis (director del MetLab) y la Dra. Mónica Morales (investigadora asociada) realizaron el noviembre de 2007 un seminario científico dirigido a los miembros del laboratorio del Dr. Massagué en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, mediante el cual hubo ocasión de intercambiar conocimientos y aprender nuevas tecnologías puestas a punto en dicho laboratorio. Nuevas técnicas aportadas: Entre otras, se aprendió la técnica para realizar ensayos de extravasación in vivo, en los cuales se inyectan células en la vena de la cola de ratones inmunodeprimidos. Dos días después de la inyección, se determina el número de células que han llegado al pulmón, han conseguido atravesar los capilares y se han adherido a las células de la matriz pulmonar. Asimismo, se pudo acceder a los detalles de las técnicas de immunohistoquímica para la detección de los antígenos de vimentina, Ki67 y caspasa3. La detección de estos antígenos es importante para determinar los focos de células humanas, la proliferación y el grado de apoptosis, respectivamente, de las células metastáticas infiltradas a nivel pulmonar. Seminario científico de Thordur Oskarsson a los miembros del laboratorio MetLab El investigador postdoctoral del laboratorio del Dr. Massagué en Nueva York Thordur Oskarsson realizó una estancia en Barcelona con motivo de la BBVA Biomed Conference sobre metástasis. Su estancia se extendió dos dias mas durante los cuales presentó su trabajo al equipo del MetLab. En él se presentaron los últimos proyectos en los cuales ha participado y las más recientes tecnologías incorporadas en los proyectos en MSKCC. Este proceso se realizó a modo general y con reuniones individuales con los distintos miembros del MetLab. Este tipo de experiencias es fundamental para la constante actualización y la superación de todas aquellas aproximaciones técnicas que se realizan en el laboratorio. Por último, esta visita fue de gran utilidad para poder valorizar el trabajo de los distintos miembros del MetLab en el contexto de colaboración entre ambos laboratorios.

Referencias: 1. Fidler, I.J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil'

hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 3, 453-458 (2003). 2. Ramaswamy, S. & Golub, T.R. DNA microarrays in clinical oncology. J Clin

Oncol 20, 1932-1941 (2002). 3. van 't Veer, L.J. et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of

breast cancer. Nature 415, 530-536 (2002). 4. van de Vijver, M.J. et al. A gene-expression signature as a predictor of

survival in breast cancer. N Engl J Med 347, 1999-2009 (2002). 5. Gupta, G.P. & Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell

127, 679-695 (2006). 6. Jemal, A. et al. Cancer statistics, 2007. CA Cancer J Clin 57, 43-66 (2007). 7. Chambers, A.F., Groom, A.C. & MacDonald, I.C. Dissemination and growth

of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer 2, 563-572 (2002). 8. Gupta, G.P. et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions.

Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70, 149-158 (2005). 9. Nguyen, D.X. & Massague, J. Genetic determinants of cancer metastasis. Nat

Rev Genet 8, 341-352 (2007). 10. Weiss, L. Metastatic inefficiency. Adv Cancer Res 54, 159-211 (1990). 11. Wong, C.W. et al. Apoptosis: an early event in metastatic inefficiency. Cancer

Res 61, 333-338 (2001). 12. Gupta, G.P. et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential

steps in lung metastasis. Nature 446, 765-770 (2007). 13. Kang, Y. et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to

bone. Cancer Cell 3, 537-549 (2003). 14. Minn, A.J. et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature

436, 518-524 (2005). 15. Gomis, R.R., Alarcon, C., Nadal, C., Van Poznak, C. & Massague, J.

C/EBPbeta at the core of the TGFbeta cytostatic response and its evasion in metastatic breast cancer cells. Cancer Cell 10, 203-214 (2006).