Intoxicacion por metales y no metales

Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

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Capítulo 8 Tóxicos Metálicos

Autores: Bioq. Fernando Rainoldi. Docente de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP. Dra. Leda Giannuzzi. Profesora Adjunta de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP. Bioq. Cristian Oliver. Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General de Policía Cinetífica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires. Docente de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.

Introducción Resulta bien conocido que los metales cumplen un doble papel en los seres vivos: son varios de ellos nutrientes esenciales mientras que en función de su dosis pueden resultar extremadamente tóxicos. La lista de los metales toxicológicamente importantes se va ampliando al descubrirse nuevas funciones bioquímicas, dado que algunos de ellos son considerados esenciales tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, molibdeno, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, selenio y flúor. A esta lista podrían incorporarse el estaño y el silicio. Si bien se suele unir en un solo grupo a los así llamados ―metales tóxicos‖ esta distinción no hace referencia a las propiedades metálicas – de hecho incluye metaloides como el selenio y el arsénico – ni a la forma de metal elemental como la especie tóxica, ya que usualmente las formas iónicas solubles son las más activas. Los metales, especialmente los denominados metales pesados, constituyen una importante fuente de riesgo para la salud y el medio ambiente tanto bajo la forma de intoxicaciones agudas o crónicas. La actividad antropogénica es la principal fuente de riesgo, pues actúa concentrando los metales y produciendo múltiples ocasiones de exposición en la vida diaria a través de los alimentos, aire, agua e incluso en nuestros hogares. En este capítulo veremos los distintos metales de mayor importancia en nuestro medio y los distintos métodos de análisis.

8.1 Toxicocinética A los efectos de realizar los monitoreos correspondientes y seleccionar las muestras, resulta útil realizar una síntesis de las vías de entrada, depósito y eliminación de los metales.

8.1.1 Vías de absorción Se conocen como vías de entrada posibles a la inhalatoria, dérmica, oral, mediada por prótesis metálicas y la transferencia madre-hijo por la placenta o la leche materna. De estas, especialmente en personal expuesto en industrias, la vía inhalatoria se considera una de la más importantes y habituales, observándose en la mayoría de las legislaciones laborales una especial preocupación por la protección de los empleados y la medición en el aire. En los ambientes fabriles o talleres metalúrgicos la forma de exposición más habitual es a través de material particulado, vapores o gases, siendo estos últimos generalmente compuestos organometálicos (carbonilos de níquel, cobalto). Estas combinaciones son mucho más tóxicas que las formas elementales. La vía dérmica, ya sea para la forma elemental o en forma de polvos o gases, resulta otra ruta de exposición importante en ambientes industriales, provocando dermatitis, alergias y distintos tipos de cáncer. La toxicidad de un metal se halla estrechamente relacionada con la vía de entrada y su especie química. Uno de los mejores ejemplos lo constituye el mercurio, el cual al ser ingerido en su forma elemental resulta prácticamente atóxica, mientras que una sal de mercurio soluble


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o el metil mercurio son absorbidos casi en su totalidad. El mismo metal muestra las mismas diferencia en la vía inhalatoria, donde tanto el metil mercurio como el vapor de mercurio atómico se absorben un 80 %.

8.1.2 Biotransformación

La mayoría de los metales circula unidos a la fracción proteica del plasma, mediante la unión a grupos funcionales como sulfihidrilos, amino, fosfato, imidazol e hidroxilo. La distribución refleja la diferente capacidad para atravesar membranas y para permanecer unidos a los diferentes componentes de los tejidos u órganos. Debido a que los organismos no pueden destruir a los metales a diferencia de lo que ocurre con las moléculas orgánicas existe una larga permanencia en el organismo. A pesar de esto se conocen mecanismos especializados de quelación y oxidorreducción, que pueden modificar su excreción y toxicidad.

8.1.3 Eliminación

Debido a sus características químicas, la vía principale de eliminación es a través de quelatos hidrosolubles por vía renal y gastrointestinal. La vía renal requiere previamente que los metales circulen en forma soluble unidos a proteínas como la albúmina o las metalotioneínas, siendo estas últimas las preferidas por su pequeño tamaño (5-6 kDa), lo que permite atravesar libremente por los glomérulos y llegar de esta forma a la orina. Si bien son rutas de poca importancia desde el punto de vista de la detoxificación, el sudor, el aliento y las faneras constituyen rutas conocidas desde hace tiempo (ej. Talio en pelo y uñas). Resulta importante hacer una breve referencia a un tema de por sí de inmensa complejidad, el de las especies químicas. El contenido total de un elemento presente en una muestra no es el factor principal para determinar su toxicidad sino la proporción de las distintas especies químicas presentes una matriz determinada. Existen dos ejemplos clásicos que ilustran este concepto: el As(III) resulta mucho más tóxicos que el As(V), pues sólo el arsénico trivalente puede unirse a los tioles; el Cr (VI) resulta más tóxico que el Cr(III) pues es mas soluble en agua que el trivalente, una vez en el interior de la célula pasa a varios estadios intermedios de reducción – Cr(V), Cr (IV) – todos ellos capaces de unirse al ADN y provocar mutagénesis. En lo que respecta a los metales de transición, basta recordar la especiación química del Fe en solución acuosa para tener una idea de las complejidades posibles. A la fecha, si bien los modelos de predicción incorporan la especiación dentro de sus parámetros la medición de esta resulta aún extremadamente compleja.

8.2 Tipos de muestras A efectos de establecer una relación dosis-respuesta es necesario conocer tanto la concentración del metal como el tiempo de exposición. La definición más precisa de dosis es la cantidad de metal dentro de las células del órgano que manifiesta efectos tóxicos. Sin embargo la cuantificación de metales dentro de los órganos no es posible en sujetos vivos. Se pueden hacer estimaciones indirectas a partir de modelos metabólicos derivados de las autopsias. La sangre, orina y pelos son los tejidos más accesibles para realizar las medidas. Los resultados de dichas determinaciones reflejan exposición reciente, pasada ó de larga data, dependiendo del tiempo de retención y del tejido en particular. La muestra de sangre y orina refleja exposiciones recientes y se correlacionan muy bien con los efectos agudos. Una excepción es el cadmio en orina: su presencia en alta concentración en orina implica un daño renal relacionado con la acumulación del metal en el riñón. Las muestras pilosas pueden usarse en asociación a variaciones en la exposición a los metales durante largo tiempo. Los análisis pueden realizarse sobre distintos segmentos del cabello de modo tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse con exposiciones pasadas. Se debe tener la precaución de lavar el pelo previamente al análisis para remover el depósito de metal por la contaminación externa. Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas libres de materia en suspensión pueden ser analizadas directamente, mientras que las que presentan materia


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orgánica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros, sedimentos y otros tipos de muestras sólidas pueden ser analizadas después de un tratamiento adecuado. También muchas veces se presentan muestras ambientales o alimentos en los que resulta de interés conocer el contenido de metales. Desde el punto de vista cuantitativo, las intoxicaciones por metales más frecuentes provienen de la ingestión de agua o alimentos contaminados, ya sea su contenido o continente (latas con plomo).

8.3 Tratamiento de las muestras Previo a la cuantificación de metales presentes en medios biológicos, es necesario efectuar un tratamiento de la muestra, dependiendo el mismo de varios factores: 1- Material biológico (orina, suero, sangre, vísceras) 2- Metal en cuestión (volatilidad y formas no disociables del metal en el organismo) 3- Procedimiento utilizado para la determinación final (colorimétrico, absorción atómica, activación neutrónica). Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar formando complejos con moléculas orgánicas y deben ser liberados de los mismos para poder determinarlos. Entre los métodos más utilizados para el tratamiento previo de las muestras, pueden mencionarse: a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica (DMO) empleando ácido nítrico, nítrico-agua oxigenada, nítrico-sulfúrico, nítrico-sulfúrico-perclórico, o bien permanganato de potasio-clorhídrico. b) Destrucción de materia orgánica por vía seca. c) Formación de quelatos y extracción con solventes. d) Precipitación de las proteínas y determinación de los metales en el sobrenadante. e) Técnicas de volatilización (arsénico como AsH3, antimonio como SbH3 y mercurio como vapor del elemento). A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, de manera de obtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones. El método de destrucción de materia orgánica (DMO) sulfo-nitro-perclórico (SNP), puede ser aplicado para la determinación de arsénico, talio, plomo y otros metales de interés toxicológico en medios biológicos. Para la determinación de mercurio se efectuará en un dispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo con dedo frío para evitar pérdidas del elemento por volatilización del mismo. Existen también otros métodos denominados secos dado que realizan la Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por calcinación. A continuación se detalla el fundamento del método de DMO por Vía Húmeda Sulfo-Nitro -Perclórica

8.3.1 Destrucción de materia Orgánica (DMO) por vía húmeda sulfo-nitro-perclórica

Se basa en la acción de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en cuestión a fin de romper la unión entre los metales y la materia orgánica llevándolos a su máximo estado de oxidación.

El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullición: 56ºC).

2HNO3 H2O + NO + 3 O*__ en frío.

2HNO3 H2O + 2 NO2 +1O* en caliente.

Luego O* + H (de la materia orgánica) H2O

El H2SO4 permite trabajar a mayor temperatura (270 ºC) siendo además un indicador

de la destrucción de la materia orgánica: cuando ácido nítrico se consume comienza a actuar el ácido sulfúrico que ataca la materia orgánica dando carbono de color negro. En ese momento es necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante, entonces se agregará ácido


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nítrico y se continúa el calentamiento. (El C es reductor y podrá reducir el As a AsH3 perdiéndose por volatilización). Además el H2SO4 rompe cadenas de glúcidos, proteínas y grasas, dando moléculas más pequeñas que serán fácilmente atacadas por el ácido nítrico. El ácido sulfúrico es también un deshidratante fuerte. Es indicador de que la materia orgánica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humos blancos de SO3 . El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materia orgánica, por eso nunca se lo usa sólo sino como mezcla ácido nítrico-ácido perclórico. Además de ser oxidante produce el clivaje de cadenas.

4 HClO4 2H2O + 2Cl2 + 7 O2 (4 HClO4 :14 O*)

4 HClO4 4 ClO2 + 3O2 +2H2O

4ClO2 + C (de la materia orgánica) 4 CO2 + Cl2

La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta peligrosa debido a que los ácidos oxidantes empleados generan vapores tóxicos e irritantes así como pueden producir explosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se manipula con cuidado, permitiendo trabajar en presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenas carbonadas mientras que la calcinación por vía seca no resulta suficiente.

8.3.2 Muestras biológicas Se describe a continuación la metodología empleada para el caso de sangre, orina o vísceras. Para sangre, se emplean 5 a 10 ml de sangre entera; para orina se usan 50 ml y para vísceras se emplean 25 g vísceras desmenuzadas

Reactivos Acido nítrico (p.a.) Acido sulfúrico concentrado exento de Arsénico, Talio y Plomo. Mezcla en la proporción 1: 2 de ácido perclórico y nítrico Oxalato de amonio, solución saturada a temperatura ambiente.

Equipos Balón de Kjeldahl de 100ml.

Procedimiento Todo el procedimiento debe realizarse bajo campana de extracción de gases. Si se trata de vísceras se coloca 25 g de vísceras desmenuzadas en un balón Kjeldahl de 250 ml de vidrio Pyrex tratando de no tocar las paredes. Se agregan 30 ml de ácido nítrico concentrado y se calienta sobre tela metálica hasta disgregar todo el material. Se continúa calentando directamente sobre llama pequeña hasta disolver el material. Se retira y se deja enfriar. Si se trata de orina, se miden 50 ml de orina y se calienta sobre tela metálica en un vaso de precipitados hasta reducir a un quinto del original. Se pasa el líquido remanente a un balón Kjeldhal de 100 ml y se incorpora 10 ml de ácido nítrico concentrado. De allí en adelante se procede de la misma manera en ambos casos. Se agrega al contenido del Kjeldhal 4-5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Se calienta el contenido hasta llegar a carbonizar la materia orgánica. En ese momento debe suspenderse el calentamiento dado que se genera ambiente reductor y se perderán metales como el arsénico o el antimonio por volatilización. Se deja enfriar y se agrega lentamente por el cuello del balón 4 ml de ácido nítrico y se vuelve a calentar. El agregado de ácido nítrico se repite cuando se observe oscurecimiento del material. Se continúa calentando y si se produce carbonización se agrega 4 ml la mezcla nitrico-perclórico. Se calienta nuevamente y si se observa nuevamente oscurecimiento se agrega 4 ml de la mezcla nítrico-perclórico. Se continúa calentando hasta la aparición humos densos y pesados de trióxido de azufre. Llegado este punto, se retira el balón del fuego quedando un líquido incoloro o con un ligero precipitado blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente.


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Dejar enfriar y luego agregar 3 a 4 ml de oxalato de amonio y se vuelve a calentar para eliminar los restos de sustancias oxidantes hasta nuevamente humos blancos de trióxido de azufre. Se deja enfriar y se agrega 1 o 2 ml de agua destilada y se calienta para desprender vapores de agua. Se repite el agregado de agua y se calienta hasta humos blancos de trióxido de azufre. Se continúa calentando hasta obtener un líquido residual de 2ml, se deja enfriar y se trata el líquido y el residuo sólido si lo hubiera con agua destilada transvasándolo a un matraz de 25 ml. En estos 25 ml de investigará los metales como Talio, Arsénico, Plomo y otros metales de interés toxicológico.

8.3.3 Muestras de aguas

Para el caso de muestras de agua, antes de la recolección de la muestra debe tomarse la decisión de que tipo de dato se desea obtener como ser: metales disueltos, suspendidos, totales o recuperables totales. Los llamados metales disueltos que son aquellos constituyentes metálicos que

atraviesan una membrana filtrante de 0,45 m. Los metales suspendidos que son los que

quedan retenidos por la membrana de 0,45 m, los metales totales corresponden a la concentración determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestión y los metales recuperables totales corresponden a la concentración de metales en una muestra sin filtrar seguida de un tratamiento con ácido mineral diluido caliente. Para la recolección de las muestras de agua el recipiente debe ser de vidrio al borosilicato, polietileno lineal, polipropileno o teflón que deben ser muy bien lavados con detergente y agua corriente, enjuagado con ácido nítrico 1:1, agua corriente, ácido clorhídrico 1:1 y finalmente con agua destilada desionzada.

Procedimiento Para la determinación de metales disueltos las muestras de agua deben estar libres de

turbiedad o filtradas a través de membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con ácido nítrico diluido). La muestra debe ser filtrada en el momento de la recolección y luego se acidifica con 2 ml de nítrico concentrado por litro de muestra. Para la determinación de metales suspendidos la muestra se filtra a través de una

membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con ácido nítrico diluido) y el análisis se realiza sobre la porción de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a un vaso de precipitado de 250 ml y se agregan 3ml de nítrico concentrado. Cubrir el vaso con un vidrio reloj y calentar. Cuando se ha disuelto la membrana incrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3 ml de ácido nítrico continuar calentando hasta que se complete la digestión dado por un residuo de color claro. Agregar residuo seco 2 ml de ácido clorhídrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver el material. Lavar las paredes de vaso de precipitados con agua desionizada y filtrar si es necesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar el atomizador. Llevar al volumen original de la muestra con agua desionizada. La concentración de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de las fracciones disueltas y suspendidas. La determinación de metales extraíbles se realiza después del agregado de ácido mineral (2 ml/L) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En muchos casos esto representa el contenido metálico total si han sido disueltos todos los sedimentos. La muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de Absorción Atómica.

8.3.4 Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por vía seca Este tipo de destrucción de materia orgánica resulta de elección en el caso de muestras de alimentos que presenten una proporción de hidratos de carbono elevada. Esta técnica no es adecuada en el caso de matrices que presenten elevado contenido de proteínas o lípidos. Se realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido de magnesio que transforma el a los metales cuantitativamente en compuestos derivados de


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magnesio. En estas condiciones los metales no son volátiles. En el item denominado determinación de arsénico se describe el procedimiento y el fundamento de las reacciones. Luego, la muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de Absorción Atómica

8.4 Determinación de metales de interés toxicológico por absorción atómica Los metales en solución pueden ser muy bien determinados por espectroscopía de absorción atómica. El método es simple, rápido y aplicable a un gran número de metales en agua de bebida, desechos domiciliarios, barros, fluidos biológicos como las muestras de sangre, orina o vísceras luego de una adecuada DMO. Algunos metales como el antimonio, arsénico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio, platino, rhodio, ruthemio, selenio, plata, talio, estaño y titanio requieren modificaciones en el proceso de digestión.

Equipos Espectrofotómetro de absorción atómica: debe poseer uno o dos canales haz de luz simple o doble monocromador a red de difracción, detector fotomultiplicador, ranuras ajustables, rango variable de 190 a 800 nm e interconección a un registrador. Lámparas de cátodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las multicátodo.

Reactivos. Agua destilada desionizada Acido nítrico concentrado grado espectroscópico. Acido nítrico (1:1) Acido clorhídrico (1:1) Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de un cilindro con aire comprimido. Soluciones stock standard del metal

Preparación del estándar y la calibración. Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analítica no higroscópicas usando agua desionizada y ácido nítrico. Las soluciones stock se preparan en concentraciones de 1000 mg de metal por litro. Los standards de calibración se preparan por dilución de la solución stock del metal en el momento del análisis y se descartan luego del uso. Se deberá preparar un blanco y como mínimo cuatro estándares de calibración en intervalos de acuerdo al rango total esperado. Se preparan empleando el mismo tipo y concentración de ácido usado en la preparación de las muestras (ácido nítrico 1:1). Aspirar el blanco y las soluciones registrando las lecturas. La curva de calibración debe cubrir un rango apropiado de concentración que produce una absorción de 0 a 80 %.

Debido a que las concentraciones detectadas por este equipamiento son muy bajas (ppm o ppb), debe evitarse interferencias de todo tipo. Una de ellas puede provenir del material de vidrio utilizado. Por ello, debe mantenerse todo el material de vidrio en ácido nítrico 1:1 durante 24 hs, para luego realizar los lavados y enjuagues del material con agua bidestilada.

8.5 Métodos de Análisis para la determinación de metales

8.5.1 Investigación y determinación de Arsénico. Generalidades de la intoxicación

Ell Arsénico se halla presente en las aguas subterráneas utilizadas como agua de consumo. Por eso se lo halla también en los vegetales que lo absorben en la raíz o son regados con dichas aguas. Los mariscos filtran grandes cantidades de agua y concentran el As. El As forma parte también de algunos medicamentos orgánicos e inorgánicos usados antiguamente. El arseniato de sodio se usó como colorante y el arseniato de cobre en vidrio, papel y pinturas. En pirotecnia se usan compuestos de As para las llamas verdes. En algunos casos el As se usó desde el punto de vista criminal.


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La sintomatología observada en casos de intoxicación pude distinguirse según sea de tipo aguda o crónica.

Aguda: - Vaso dilatación de los capilares sanguíneos con alteración de la permeabilidad de

los mismos. - Vómitos, diarrea (pérdida de agua y sales), irritación de garganta, dolores faringes. - Edemas subcutáneos. Hipertensión. - Colapso, shock, coma. Muerte.

Crónica: El As se une a albúmina, se absorbe fácilmente a las mucosas y se deposita en hígado, riñón, huesos, pelos y uñas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en el tabulo contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorción es mayor que la eliminación, se acumula. Los síntomas más característicos son: - caída del cabello. - mano en forma de garra y pie colgante

- en piel: - erupciones - * hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies)

* hiperpigmentación (manchas oscuras) -degeneración grasa del hígado que puede dar cirrosis. -temblores por alteración del SNC con desequilibrio de Na y K -fase final: cáncer de piel

Investigación toxicológica de arsénico Para la determinación de arsénico en materiales biológicos, alimentos, etc, es necesario destruir previamente la materia orgánica. El método empleado depende del material biológico de que se trate.

Pelos y uñas Se utiliza una mezcla de ácidos oxigenados concentrados que deshidratan, oxidan y saponifican la materia orgánica. Procedimiento: En una cápsula de porcelana colocar 1 a 2 g de material. Si se trata de pelos es conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de ácido sulfúrico concentrado y 5 ml de ácido nítrico concentrado. Si es posible dejar en contacto varias horas. Calentar progresivamente sobre tela metálica y luego en baño de arena. Cuando aparecen humos blancos, retirar del baño de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida por dos partes de ácido nítrico concentrado y una parte de ácido perclórico concentrado (70%). Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del líquido por carbonización debe suspenderse el calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor se perderá As por volatilización. Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo sea incoloro o blanquecino. Retirar del baño y agregar 10 ml de agua destilada. Calentar nuevamente hasta residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada. El material está listo para la determinación cualitativa y luego cuantitativa empleando Absorción Atómica.

Alimentos Nos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. Se realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido de magnesio que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En estas condiciones el As no es volátil. En este caso es adecuada una DMO por vía seca porque la proporción de hidratos de carbono es elevada, ya que con la presencia de proteínas o lípidos, se dificulta la ruptura de las grandes moléculas. Procedimiento: Colocar 10 g de muestra en cápsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solución de nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de óxido de magnesio. Mezclar bien formando una papilla y calentar primero a baño maría hasta sequedad, luego en baño de arena y por último en triángulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de ácido sulfúrico al 10%. Filtrar si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto límpido.


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MgO + 2 Mg(NO3 )2 +As2O3 Mg3(AsO4)2 + 4 NO2 Mg3(AsO4 )2 CALOR As2O7Mg2 (piroarseniato) + MgO As2O7Mg2 +H2SO4 AsO4H3 + MgSO4 (ác. arsénico)

Determinación cualitativa.

Reacciones de identificación Se realizan luego de la destrucción de la materia orgánica (DMO). Las mismas se basan en las propiedades reductoras de la AsH3 o de ciertos reactivos. Reaccción de Bougault: En un tubo de ensayo colocar un volumen de líquido a ensayar con un volumen de reactivo (ácido fosfórico) a baño maría durante 10 minutos. En presencia de compuestos arsenicales aparece un color pardo oscuro a marrón cuya intensidad varía con la concentración. 2 AsO3

-3 + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As 0 (marrón) La reacción tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega I2. El selenito actúa como interferencia pues da la misma reacción. Se requiere ausencia absoluta de materia orgánica.

Reacción de Bettendorf: En un tubo de ensayo poner un volumen de líquido más un volumen de reactivo . Calentar a ebullición y dejar reposar. Si hay As aparece coloración parda oscura o marrón.

AsO3

-3 + 3 HCl Cl3As 2 Cl3As + 3 SnCl2 (2%) 2 As0 (marrón) + 3 SnCl4

Reacción de Gutzeit: En un tubo de hemólisis colocar 1 ml de ác. sulfúrico al 25% Agregar 1 ml del líquido problema y una granalla de Zn activado. En la parte media del tubo colocar un trozo de algodón embebido en solución de acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca una pequeña gota de una solución de nitrato de plata cuya concentración no sea menor del 50% Colocar el tubo en baño de agua fría. En presencia de As se obtiene una coloración amarilla característica. El papel colocado en la boca del tubo puede pasar a color negro correspondiente a Agº debido a la humedad del ambiente.

AsO4

-3 + Zn + 11 H+ AsH3 + Zn+2 + 4 H2O AsH3 + 6 NO3Ag As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3 As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O AsO3

-3 + 6 Ag0 ¯(negro) + 3 NO3- + 6 H+

La reacción tiene una sensibilidad de 10 ppm.

Determinación cuantitativa de arsénico a) Método de Gutzeit: Se basa en la formación de arsina por acción del hidrógeno naciente sobre compuestos arsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl2Hg formando complejos


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coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la concentración de As la cual se compara con manchas estándar. El aparato consiste en un frasco cuyo volumen varía según la cantidad de As a determinar (Fig. 1). Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyo volumen de 250 ml. Para cantidades de As entre 0,1 y 20 ppm el volumen del frasco es de 60 ml.

Lleva un tapón de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con un estrechamiento; a éste se adosa otro tubo similar pero de menor diámetro en cuya parte superior se coloca una banda de papel embebida con una solución de Cl2Hg y luego secado.

Reactivos. Solución de acetato de plomo al 1% Papel embebido en solución acuosa de cloruro de mercurio al 5% Mezcla ácida Alumbre férrico Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V Granallas de Zinc

Procedimiento Colocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado y embebido en solución de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo introducir lana de vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del tubo colocar una tira embebida en Cl2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que interfiere con el color. En el frasco colocar 20 ml de mezcla ácida, 2 ml de solución de alumbre férrico, 0,5 ml de Cl2Sn. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y llevar a volumen de 200 ml con agua destilada y colocar por último una cantidad exactamente medida de solución a ensayar. El agregado de ClNa y H2O a la mezcla ácida produce un desprendimiento regular de Arsina (AsH3). El alumbre férrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El Cl2Sn disminuye el sobrepotencial del Hidrógeno permitiendo la reducción. Tapar perfectamente y colocar en baño de agua fría durante 45 minutos. Sacar la banda de papel reactivo y sumergirla en una solución de KI al 10% que permite estabilizar el color. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de la misma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las cantidades de reactivos varían.

AsO4

-3 + 4 Zn0 + H+ <==========> AsH3 (arsina) + 4 Zn+2 + 4 H2O 2 AsH3 + 3 Cl2Hg <=========> As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl As2Hg3 + I-1 <===========> (I4Hg)3As3

La sensibilidad del método es de 50 ppm a 300 ppm


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Fig. 1: Equipo para determinación de arsénico por el método de Gutzeit cuali y cuantitativo.

Expresión de resultados: se indicará la cantidad de As sobre la masa de muestra pesada. Lo habitual es expresar el resultado en mg/Kg de muestra. b) Método de Vasac y Sedivec: El método es similar al anterior con el fundamento de reducir cuantitavamente el arsénico en la muestra con granallas de zinc y luego la arsina reacciona con una solución de dietilditiocarbamato de plata en piridina formando un complejo color rojo que es medido espectrofométricamente.

Reactivos: Solución Estándar de Arsénico: disolver 0.1734 g de arsenito de sodio en 1000 ml de agua bidestilada (solución A). Tomar 10 ml de esta solución (A) y llevar a 100 ml con agua bidestilada (solución B). Tomar 10 ml de la solución B y llevar a 100 ml con agua bidestilada

(solución C)= 1 /ml.

Se preparan Estándar de 0, 1, 2, 5 10 y 20 g de As tomando 0,1, 2,5, 10 y 20 ml de la solución patrón C. loduro de potasio 15% Acetato de plomo 10% P/V. Acido clorhídrico concentrado Solución piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg) 0.5% Granallas de zinc Ioduro de potasio 15% P/V. Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V

Procedimiento: Una vez finalizada la mineralización se trasvasa cuantitativamente el contenido del

balón al erlenmeyer A del dispositivo de Vasac y Sedivec lavando el balón con cantidad suficiente de agua destilada hasta un volumen de 25 ml. Paralelamente procesar un blanco de reactivos sin mineralización previa. Agregar a continuación en 1 ml de ioduro de potasio 15% más 10 ml de ácido clorhídrico concentrado. Dejar reposar 2 minutos y agregar 0,5 ml de solución de cloruro estanoso y dejar 15 minutos en reposo. La solución debe permanecer incolora o ligeramente turbia. Si en la etapa final de la mineralización no se eliminó todo el oxidante, el cloruro se convierte en Cl2 y aparece color amarillo en la solución).

Adaptar inmediatamente el tubo B que contiene algodón impregnado en acetato de plomo y el tubo acodado C que contiene la solución piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg). Finalmente se agregan tres granallas de zinc y rápidamente se cierra el equipo asegurando que no existan pérdidas en las juntas. Trabajar en campana de extracción de gases. Se deja burbujear (desprender hidrógeno) durante 30 a 45 minutos.


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En presencia de arsenamina el reactivo argéntico adquiere color rojo. Se realiza una curva de calibración con 5 patrones. Realizar la curva de calibración representando

Absorbancia vs. g de As. Leer la absorbancia del complejo formado a 540 nm y se calcula la concentración de As en la muestra interpolando el valor de la absorbancia obtenida en una curva de calibración. Interpretación química de la reacción: En el mineralizado el As se encuentra como AsO4H2. El agregado de ioduro de potasio tiene por objeto transformar el AsO4H2

- en AsO3H2- de acuerdo a la siguiente

reacción: AsO4H2

- + 2 H+ + 3I- AsO3H2- + H20 + I3

-

EI C12Sn además de actuar como despolarizante reduce el I3- formado:

I3- + 6Cl- + Sn2+ 3I- + (Cl6Sn)2-

El Znº libera H naciente el cual reduce el AsO4H2- a arsenamina (AsH3)

La AsH3, al incidir sobre la solución piridínica de dietilditiocarbamato de plata que es de color amarillo, forma con éste un complejo de color rojo. La reacción química es la siguiente:

C

N(Et)2

S +AH

3

SAg

C S

N(Et)2

SH

+ C S

S

N(Et)2

As/3 +

H2O + Agº

color rojo El acetato de plomo se utiliza para eliminar la interferencia del SH2 que en este caso estaría presente por las condiciones reductoras de estos ensayos lo que favorecería la transformación del SO4

2- en SH2 . Límite de cuantificación: En las condiciones de trabajo precedentes el límite de cuantificación es de 0,5 µg%. Esta técnica permite determinar As total y es útil para la investigación en intoxicaciones agudas y crónicas, pero no sirve para el seguimiento biológico de trabajadores expuestos al As inorgánico.

8.5.2 Intoxicación por Plomo

Generalidades de la intoxicación El origen de la intoxicación con Plomo puede ser: Profesional: En la industria se usan compuestos organometálicos de Plomo como

antidetonantes. Revestimiento de cables, anticorrosivos, en pinturas y esmaltes (óxidos de Plomo), imprentas de tipografía. En fundiciones e industrias de recuperación del metal.

Ambiental: El agua potable puede contaminarse a partir del polvo atmosférico. Las

tuberías de Plomo vuelcan el metal soluble al agua en condiciones ácidas. En una intoxicación con Plomo, generalmente crónica, se verán afectadas

fundamentalmente dos enzimas de la vía de síntesis del Hem: (a) Delta-ALA dehidratasa, que cataliza la conversión de ácido delta-amino

levulínico (delta-ALA) a porfobilinógeno en el inicio de la vía


12

(b) ferroquelatasa que cataliza la introducción del Fe+3 en el anillo de la protoporfirina IX para dar lugar a la formación del Hemo.

Esto va a derivar en una porfiria secundaria o adquirida, que, en forma crónica, se manifiesta en el conjunto de síntomas característicos que constituyen el saturnismo.

En laboratorio se determina el Perfil Plúmbico, que consiste en la cuantificación de delta-ALA (aumentada) y coproporfirinas (aumentadas) en orina y delta-ALA dehidratasa (disminuída) y Plomo en sangre (aumentado).

Por otro lado se buscará también el punteado basófilo característico.

Investigación de intoxicación plúmbica Determinación de Plomo en sangre (Plumbemia) El método clásico para la determinación de Plomo en sangre es el método de Jacobs

modificado, que se basa en la formación del ditizonato de Plomo, una vez eliminados por complejación y extracción los metales interferentes, y su lectura espectrofotométrica a 510 nm.

Las técnicas de absorción atómica son más rápidas y precisas. Tienen además muy alta especificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos utilizados en las técnicas colorimétricas se simplifican enormemente. Raramente se usan para el análisis cualitativo.

Los límites de detección para las técnicas de atomización en llama se encuentran en el

orden de los g/ml y los volúmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Los coeficientes de variación son de 2 a 0,1%.

En técnicas en donde se realiza una atomización en horno de grafito se requieren

volúmenes de muestra de alrededor de 50 L, con límites de detección 10 a 100 veces menores que en la atomización en llama. Los coeficientes de variación son de 10 a 1%.

Se describe a continuación la determinación de plomo mediante espectrofotometría de absorción atómica en sangre por dos métodos:

1. Método del sobreagregado 2. Curva de calibración

En el método del sobreagregado, cantidades conocidas del analito es sobreagregado a la muestra de sangre realizándose luego la hemólisis de la muestra. Se forma luego un complejo metálico para realizar entonces una extracción en fase orgánica del mismo y la posterior medida mediante atomización en llama.

La muestra de sangre se toma por punción venosa una vez desinfectada la zona con alcohol, mediante jeringa descartable de plástico, previamente heparinizada. Se necesita del paciente un ayuno de por lo menos 10 horas.

Todo el material a usar debe ser tratado previamente con ácido nítrico 1:1 durante 24 horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada.

Reactivos: Pirrolidín ditio carbamato de amonio (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100 ml con agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman No4. Tritón X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritón X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia. APDC 2%-Tritón 5%: Se mezclan volúmenes iguales de las soluciones anteriores que deben ser preparadas en el momento de usar. Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK, dejando en contacto permanente ambos líquidos. Solución madre de Plomo: Se pesan 1.5985 gr de (NO3 )2Plomo p.a. llevando a un litro con ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 1 mg/ml. Solución testigo: 12,5 ml de la solución madre se llevan a 100 ml con ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 125 g/ml.(125 ppm).

Equipos. Espectrofotometro de absorción Atómica.

Procedimiento: 1. Colocar 2,5 ml de sangre entera de la misma muestra en cada uno de dos tubos,

provistos de tapa y cierre esmerilado.


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2. A uno de los tubos agregar una cantidad conocida, por ejemplo 0,1 ml, de la solución testigo de Plomo.

3. Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada y un tubo testigo con 2,5 ml de agua bidestilada y 0,1 ml de la solución testigo.

4. A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solución APDC-Tritón. Se agitan los tubos en Vórtex, hasta hemólisis completa, durante aproximadamente 15 segundos.

5. A los tubos blanco y testigo se les agregará 1 ml de la solución APDC 4%, pues la solución APDC-Tritón con el agua forma emulsiones muy difíciles de separar.

6. Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vórtex durante aproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea adecuada. Se centrifugarán luego durante 10 minutos a 3000 rpm.

7. Finalmente se separarán las fases superiores de MIBK. La fase orgánica debe tomar un leve color amarillo y de no ser así se debe sospechar una agitación insuficiente y se recomienda repetir la operación.

8. Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra MIBK, controlando el cero del aparato después de cada medida.

Expresión de los resultados, para los siguientes valores: Abs muestra = M

Abs muestra más testigo = M T Cantidad de Plomo en muestra = P Cantidad de Plomo sobreagregada = Pa Absortividad = a Longitud de la ranura del quemador = b Volumen de la muestra = Vm Volumen agregado de la solución testigo = Vt

Concentración del testigo en g / ml = Ct Se tienen las relaciones M = a . b . Pa Vm

M T = a . b . (Pa P)

Vm Vt

Despejando el valor de se llega a una relación, independiente de los valores de a y b, del siguiente tipo

M Pa

P = M T .

Vm Vt - M____

Vm M T Multiplicando este valor por el factor Ct xVt/Vm se obtendrá la concentración de Plomo en

g / ml. b) Método empleando curva de calibración: Este método es similar al anterior con las siguientes modificaciones: se construye una curva de calibración con sobreagregado de plomo concentración conocida a 5 tubos de muestra entera de sangre. La curva se construye de la siguiente manera:

De la solución madre de Plomo (1000ppm), tomar 12.5 ml y llevar a 100 ml con ácido nítrico 1/1000.De esta manera se obtiene una solución de Plomo de 125ppm. Realizar una curva de calibración con sangre de la siguiente manera En 5 tubos se colocan 2.5ml de sangre en cada uno y agregar 0, 5, 10, 15, 20 microlitros de la solución de Plomo de 125 ppm.

Tubo Microlitros de plomo de Concentración de plomo


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solución 125 ppm

1 0 X

2 5 X+25 µg/ 100 ml Plomo

3 10 X+50 µg/ 100 ml Plomo

4 15 X+75 µg/ 100 ml Plomo

5 20 X+100 µg/ 100 ml Plomo

1. Agregar 2 ml de APDC y tritón y luego agitar en vórtex durante 60 segundos. Luego

agregar 2 ml de MIBK durante 30 segundos. 2. Todos los demás pasos se conservan tal cual, incluido el tratamiento de la muestra

problema (cantidades, concentraciones, etc.) 3. La sangre empleada para realizar la curva debe ser de banco asegurando que no

contiene plomo mas allá de los valores normales. Es conveniente siempre contar con un vial con sangre y cantidad conocida de plomo sobreagregada (standard interno) a modo de verificar los resultados obtenidos.

4. Debe recordarse que el material de vidrio debe estar escrupulosamente manteniéndolo en ácido nítrico 1:1 durante 24 hs para luego lavarlo con agua bidestilada.

Valores de referencia para la población de Capital Federal y alrededores

Niños no expuestos: 17 ± 8 g %

Adultos no expuestos: 19 ± 7 g %

Adultos expuestos: 57 ± 21 g %

Valor límite para el sujeto expuesto: 70 g % (según Working Conference, Amsterdam 1968). Determinación de Porfobirinogeno (PBG) orina. Ensayo rápido

1. Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a la determinación de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ver item 5.3.2.4. ya que el plomo se polimeriza en medio ácido dando uroporfirina.

2. En un tubo pequeño a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil aminobenzaldehído en 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) se agregan 1 - 2 gotas de orina. Al cabo de 2 segundos un desarrollo de color rosado a rojo al tope de la solución indica un test positivo para PBG.

3. El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea y urobilinógeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentración de 200 mg/g.

4. En una intoxicación con Plomo se encontrarán valores de PBG en orina normales o disminuidos. Si se hallaran valores aumentados, sería indicio que la porfiria manifestada es de otra naturaleza, por ejemplo de tipo congénito.

Determinación de Acido Delta Aminolevulínico (delta ALA) en orina. Método de Berkó- Durkó modificado, Clinical Chem. Lab., 1973.

La reacción se fundamenta en la reacción del delta ALA con acetilacetona dando un compuesto pirrolico (2 metil, 3 acetil 4 – (3 propion) pirrol) que condensa luego con el reactivo de Erhlich originado un compuesto rojo que se determina por espectrofotometría a 553 nm.

Muestra: Orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solución saturada de ácido tartárico aprox. 1 ml/ 100 ml de orina.

Reactivos. 1. Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehído se disuelve en 35

ml de ácido acético glacial, se agregan 8 ml de ácido perclórico 70% y se lleva a 50 ml con ácido acético glacial.


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2. Solución acetato de sodio 0.5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de agua destilada.

3. Solución AcH 0.5 M: 28.7 ml AcH glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada. 4. Buffer acetato: 93.2 ml AcH 0.5 M más 6.8 ml AcNa 0.5 M (pH=3.5). 5. Solución diluyente: 0.25 gr de carbón medicinal se agregan a 100 ml de solución buffer

acetato 0.5 M.

6. Estándar de delta-ALA 400 g/ml: se disolverán 4 mg de delta-ALA p.a. en buffer acetato, llevando a 10 ml totales.

Equipos. Espectrofotómetro UV-visible Baño termostático Centrífuga hasta 500 rpm

Procedimiento: 1. Transferir 1 ml de orina (pH 6 – 6.5) a un tubo de centrífuga y agregar 9 ml de

solución diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar. 2. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alícuotas de 2 ml c/u del filtrado a sendos

tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al tubo D se le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a baño María (BM) hirviente durante 20 minutos.

3. Se enfrían entonces los tubos en baño de agua y se le agrega 2 ml de Reactivo de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del tubo D a 553 nm contra el tubo blanco.

4. La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibración

expresada en g/ml. Se tomarán soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 g/ml, diluyendo

la solución standard original de 400 g/ml. sobre ellas se realiza la reacción de Erlich en forma análoga a la realizada sobre las muestras.

Observación: La reacción del delta ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque no específica pues también la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista de la determinación del perfil plúmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos de

concentración de -ALA halladas en el saturnismo. Valores normales 0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 años 0.1 a 0.6 mg% para adultos excreción urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.

Ensayo para porfirinas en orina

Se trata de un test rápido cuyo resultado es positivo desde valores de concentración de 70

g% (1 mol/L).

Reactivos Acido acético Alcohol amílico Eter etílico

Procedimiento En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de ácido

acético, alcohol amílico y éter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos el reactivo habrá extraído la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara una capa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja, el test es positivo.

El ensayo se puede hacer más sensible transfiriendo la fase orgánica superior con una pipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20 seg) y se observa la capa clorhídrica inferior a la luz UV.

También puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y talco, agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el tubo. Determinación de coproporfirinas totales en orina. A.A.Fernández; R.J. Henry, H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).


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El método se fundamenta en la extracción de coproporfirinas a pH adecuado con acetato de etilo para la posterior oxidación del coproporfirinógeno remanente a coproporfinas que luego se extraen con ácido clorhídrico y posterior lectura en espectrofotómetro a tres longitudes de onda a efectos de corregir las interferencias

Muestra: Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo CO3Na2 como conservador en cantidad suficiente para una concentración final de 0.1 - 0.5%. El CO3Na2

tiene como finalidad de evitar las pérdidas de coproporfirinas fundamentalmente, conservando a pH 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los coproporfirinógenos pasarán a coproporfirinas.

Reactivos 1. Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16,6 g de acetato de sodio trihidratado se disuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solución es estable varias semanas a temperatura ambiente. 2. Buffer acetato de sodio (pH = 4,8): se mezclan 1 vol. de acético glacial con 4 vol. de solución saturada de acetato de sodio y 3 vol. de agua. 3. Solución saturada de acetato de sodio: la saturación se facilita mucho disolviendo el acetato de sodio a 70 - 80o C. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, se calienta de nuevo la solución y se añade más sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada. 4. Solución alcohólica de iodo al 1% (de reserva): Se disuelve 1 g de iodo en alcohol y se diluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapón de vidrio. 5. Solución de iodo al 0,005%: se diluyen 0,1 ml de la solución de reserva en agua destilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar. 6. Acido clorhídrico 1,5N se añaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destilada aproximadamente y se diluye hasta 100 ml.

Equipos: Espectrofotómetro UV visible.

Procedimiento: 1. Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se

encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH sea inferior a 5.

2. Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuviera fluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relación 1:10.

3. A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se transfiere a una ampolla de decantación. Se le agregan 30 ml de acetato de etilo y se agita suavemente durante 3 a 5 minutos. Se deja reposar y se descarta la fase acuosa.

4. La fase orgánica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez. Se colectan los extractos orgánicos, descartándose la fase acuosa y se agregan 2 ml de solución de iodo al 0.005% preparada en el momento, no dejando más de 5 minutos en contacto ya que el tiempo es crítico. Se desecha la solución de iodo y finalmente se efectúan tres extracciones o hasta que la capa orgánica no presente fluorescencia, con 2.5 ml de HCl 1.5 N cada vez. Se recoge el extracto clorhídrico en un tubo graduado midiendo este volumen.

5. En forma alternativa puede realizarse una separación mediante el sembrado de 1 ml de orina en una columna de intercambio aniónico Dowex 1X8, dejando eluir con 3 ml de agua destilada. Se eluyen luego las porfirinas con HCl 3 N hasta fluorescencia negativa.

6. A continuación, se lee la absorbancia del extracto clorhídrico a tres diferentes: 380, máximo entre 400 y 410 (generalmente 402) y 430 nm.

Expresión de resultados: A corregida = 2 A max - (A 380 + A 430 ) 1.835


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Coproporfirinas ( g/24 hs) = A corregida . V c .V t . D

. V alícuota orina donde: A 380 y A 430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamente A max : indica la absorbancia máxima en el rango 400 - 410 nm Vc : volumen total de los extractos clorhídricos Vt : volumen total de orina recolectada en 24 hs. D: factor de dilución, si se diluyó la orina

: coeficiente de extinción (ml/ g) de coproporfirinas en HCl 1.5 N = 0.673

Valores normales = 0 - 160 g / 24 hs. Determinación de la actividad de la enzima Delta- aminolevulinico dehidratasa. Berlin, A; Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974).

Muestra: Se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plástico usando heparina como anticoagulante, en un volumen mínimo de 1 ml. No deben emplearse NaF ni EDTA debido a que inhiben la actividad enzimática. La misma muestra puede usarse para la determinación del hematocrito y Plomo.

La muestra se mantendrá en heladera a 4oC hasta su procesamiento. Se recomienda efectuar la determinación en el día de recolección, pues la actividad enzimática desciende en un 12% a 15% luego de 24 horas.

El material de vidrio deberá ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado es necesario tratarlo previamente con HNO3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada, para evitar cualquier contaminación. El material de plástico será preferentemente de polipropileno.

Reactivos: 1. Buffer fosfato: 29 ml de fosfato disódico 0.1 M con 71 ml de fosfato monosódico 0.1 M.

Ajustar el pH a 6.4 con la solución correspondiente. Mantener en heladera a 4oC.

2. Buffer sustrato: disolver 0.01676 gr de -ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosódico 0.1 M, llevar a pH 6.4 con fosfato disódico 0.1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de pH 6.4. Se conservará en freezer a -18oC.

3. Reactivo de Erlich: Disolver 0.24 gr de p-DMAB en 7.2 ml de ácido acético glacial, posteriormente agregar 1.92 ml de ácido perclórico, completando a un volumen de 12 ml con ácido acético glacial. Se prepara en el momento de usar o se mantiene en heladera a 4oC.

4. Ácido tricloro acético (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua destilada.

Equipos. Espectrofotómetro UV-visible Baño termostatito Centrífuga

Procedimiento:

1. A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1,0 ml de buffer sustrato. Se produce la hemólisis total de la muestra de sangre.

2. Paralelamente se procesa un blanco con 0.2 ml de sangre a la que se le agrega 1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer sustrato. Incubar los tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38oC; el tiempo de incubación se empieza a contar desde el agregado de buffer sustrato a las muestras.

3. Cumplido el tiempo de incubación, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA 10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 RPM.


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4. Reacción de color: A un volumen de 1.5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml de reactivo de Erhlich. Mezclar en Vórtex y leer luego de 10 minutos las absorbancias respectivas contra reactivo de Erhlich a 555 nm.

Expresión de resultados: Act delta ALA DEHIDRATASA = Abs x 100 x f x D

Hto x t x m donde: Abs. Es la absorbancia de la muestra menos la Absorbancia del blanco

m: coeficiente de extinción molar en l / mol. cm = 0.062 Act ALA DEHIDRATASA: en U/ L de hematíes f: factor de conversión de deltaALA a Plomo = 2 D: factor de dilución = 35 t: tiempo de incubación.

Valor de referencia para la actividad enzimática en sujetos sanos no expuestos al plomo: mayor a 20 U / L hematíes

Determinación de Plomo en una muestra de alimentos de origen vegetal por el método de absorción atómica La determinación de la concentración de Plomo se puede realizar sobre cualquier tipo de una muestra de alimentos, en este caso se presenta el protocolo ya puesto a punto para el caso de muestras de producto vegetales y en particular tomate enlatado.

El primer paso del análisis, consiste en una digestión de la materia orgánica (DMO) para volver más sencilla la matriz que contiene el analito, así como obtener una solución límpida y más fluida que la muestra original, hecho que facilita el proceso de inyección de la muestra.

Reactivos. Ácido nítrico concentrado libre de plomo.

Equipos. En este caso se describe el procedimiento para un equipo Shimadzu AA-6701F provisto de un quemador con cámara de premezclado y horno de grafito. Digestor de microondas ―CEM modelo MDS 2100‖.

Procedimiento. La DMO se realiza en un digestor de microondas especialmente diseñado. Se pesan 0,5

gr. de la muestra a digerir, y se colocan dentro de un vaso especial, junto con 5 ml de ácido nítrico concentrado de calidad pro-análisis, mas 1 ml de agua desionizada.

Los tubos de digestión y la tapa de ellos son de teflón. En la tapa se distingue una válvula de seguridad, a la cual debe acoplarse un tubo que conecta el vaso con un recipiente situado en el centro del aparato, este recipiente sirve como trampa para los vapores nitrosos que salen del vaso, y/o para recibir cualquier sustancia que salga del vaso. La válvula de seguridad debe revisarse en cada utilización del aparato, esta consiste en una membrana, semipermeable, que permite la salida del vapor contenido en el vaso si la presión desarrollada dentro de este resulta excesiva. La tapa se ajusta al vaso, por medio de un cierre a rosca hecho de keblar. Una vez cerrado el vaso, se encamisa con un tuvo hecho del mismo material que el cierre.

Luego de armar los vasos con las muestras a digerir, se disponen en un carrusel situado dentro del horno, y se conecta el tubo de seguridad que corresponde a cada uno. Uno de los vasos que se utiliza tiene una tapa diferente a las otras. Esta estará provista de tres salidas, una se usa para introducir una fibra óptica que hace las veces de sensor de temperatura, a otra de las salidas se conecta el sensor de presión, y la última se utiliza para acoplar el tubo de seguridad. Una vez que se introdujeron todos los vasos a utilizar, se procede a la programación del esquema de calentamiento. Se elige es la presión y temperatura usada durante ese proceso. Antes de comenzar la digestión, limpiar escrupulosamente los vasos, las tapas, los cierres, y las camisas de los vasos, con un paño limpio y seco.


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Al terminar el proceso, se debe esperar a que se enfríen los vasos para que disminuya la presión en ellos, luego, se retiran los vasos, se trasvasa su contenido a un matraz de 10 ml y se lleva a volumen con ácido nítrico 15%. La digestión debe ser evaluada por el operador, considerándose terminado el proceso, cuando el producto sea una solución límpida, sin residuos sólidos. Si esto no sucede, se debe someter la muestra a un nuevo ciclo de digestión.

Curva de calibración: La determinación de la cantidad de Plomo en la muestra se realizara en base a una curva de calibración que se confecciona con una serie de soluciones estándar. Estas soluciones son preparadas a su vez, a partir de una solución madre comercial pro-analisis cuya concentración es 1000 mg/L, o 1000 ppm. El metal se encuentra por lo general en forma de nitratos o sulfatos solubles, esta solución esta casi libre de la presencia de otros metales. Las soluciones que se recomiendan en general son: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30 ppm, 50 ppm. Estas soluciones se prepara tomando 50 ml de la solución madre, que se llevan a 500 ml con agua destilada desionizada. Con eso se tiene una solución de concentración igual a 100 ppm de plomo. De esta se preparan las soluciones estándar, tomando 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml, 3 ml, 5 ml, para luego llevar a un volumen final de 100ml con ácido nítrico 15%. Además se usara una sexta solución patrón para definir el 0 de concentración, este no es mas que una solución de ácido nítrico 15%.

Cálculos: La concentración en la muestra se determina mediante la siguiente expresión:

02.0*.leidappbppm

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Intoxicacion por metales y no metales

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