INTERACCION ENTRE HORMONAS TIROIDEAS Y EL SISTEMA ...

UNIVERSIDAD COMPLuTENSEDE MADRID

FACuLTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR II

INTERACCION ENTRE HORMONAS TIROIDEAS

Y EL SISTEMA IGFs/IGFBPs:

MECANISMOS MOLECULARES

TESIS DOCTORAL

SONIA RAMOS RIVERO

Madrid, 1999

DEPARTAMENTO DE BIOQUíMICA Y BIOLOGíA MOLECULAR II

UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

INTERACCION ENTRE HORMONAS TIROIDEAS

Y El SISTEMA IGFs/IGFBPs:

MECANISMOS MOLECULARES

Memoria que presentaSONIA RAMOS RIVERO para

optar al gradode Doctor en Farmaciapor la

UniversidadComplutensede Madrid

Madrid, 1999

Estetrabajoseha llevadoa caboen el Grupode Endocrinología

y MetabolismoPerinatal,en el Institutode Bioquímica(Centro

Mixto: F. Farmacia - C.S.I.C.), ubicadoen la Facultadde

Farmaciade la UniversidadComplutensede Madrid.

Ha sido realizadopor Sonia RamosRivero y dirigido por la

Dra. Ana M~’ Pascual-LeonePascual.

Deseoexpresarmi agradecimientoal ProfesorD. ManuelRuiz Amil, Director

del Departamentode Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de

Farmacia,asícomo a la Dra. EvangelinaPalaciosAlaiz, actualDirectoradel

Instituto de Bioquímica,por suacogidaen el mismo.

A la Dra. Ana M8 Pascual-LeonePascual,Directorade estaTesis,mí mayor

y másprofundagratitudpor su orientacióny apoyocientífico constantes,así

comoporel esfuerzoy entusiasmopuestosen la realizaciónde estetrabajode

investigación.

Expresotambiénmi agradecimientoa la Dra. GabrielaMorrealede Escobar

porhaberfacilitadoensu laboratoriola dosificaciónde lashormonastiroideas.

A mis compañerasdel Grupode Endocrinologíay MetabolismoPerinatal:M~

Angeles Martín, María Agote y Ana de la Puentepor su continuo apoyo,

ayuday sumás sinceraamistad.

Agradezco igualmente a mis compañeros Fernando Escrivá, Carmen

Alvarez y, en especiala Luis Goya, sucolaboraciónen el aprendizajede las

técnicasde ‘Western inmunoblot’, dosificaciónde GH y la metodologíade

biología molecular,así como su constanteayuda y amistad.

De la misma forma, agradezcola inestimablelabor de Angel García en el

animalario de] Centro, y la de AdoraciónUrrea y CarmenCarrizosaen la

Biblioteca del Centro.

Porúltimo, quiero hacerconstarmi mássinceroagradecimientoa mi familia

y a mis amigosporsu apoyoincondicionaly muestrasconstantesde ánimo.

INDICE

ABREVIATURAS 17

1. INTRODUCCION 20

1.1. HORMONAS TIROIDEAS 21

1.1.1. Síntesisy secreción 21

1.1.2. Regulacióndel axis tiroideo 21

1.1.2.1. Tirotropina 22

1.1.2.2. Control neuroendocrino 22

1.1.2.2.1.Hormonade liberaciónde tirotropina 22

1.1.2.2.2.Otros factoreshipotalámicos 23

1.1.2.2.3.Hormonastiroideas 24

1 . 1.3. Metabolismoy accionesde las hormonastiroideas 24

1.1.3.1. Metabolismo 24

1.1.3.2. Accionesbiológicasde las hormonastiroideas 25

1.1.4. Interacciónentrehormonastiroidease insulina 25

1.2. FACTORES DE CRECIMIENTO SIMILARES A LA INSULINA

(IGEs) 27

1.2.1. Estructura,síntesisy transporte 27

1.2.1.1. Estructura 27

1.2.1.2. Síntesisy transporte 28

1.2.2. Accionesbiológicasde los IGFs 29

1.2.2.1.Iii vitro 29

1.2.2.2. In vivo 30

1.2.2.3. Acciones autocrinas, paracrinasy endocrinas 31

1.3. PROTEíNASTRANSPORTADORASDE IGFs (IGFBPs) 32

1.3.1. Estructura,síntesisy regulación 32

1.3.1.1.Estructura 32

1.3.1.2. Síntesis 32

1.3.1.3. Regulación 33

1.3.1.3.1. Variaciones diurnas 33

1.3.1.3.2. Nutrición 33

5

341.3.1.3.3. Ejercicio

1.3.1.3.4. Ontogenia

1.3.1.3.5. Hormonas

1.3.2. Tipos de IGFBPs y acciones biológicas

1.3.2.1. Tipos de IGFBPs

1.3.2.2. Acciones biológicas

1.4. FACTORESENDOCRINOSQUEREGULANEL DESARROLLO:

HORMONAS TIROIDEAS E IGFs, SU INTERACCION

1.4.1. Interacciónentre las hormonastiroideasy el axi39 IGFs/IGFBPs.

1.5. TRANSPORTADORESDE GLUCOSA (GLUTs)

1.5.1. Estructura,funcióny expresióntisular

1.5.2. Efecto de] estadotiroideo sobrelos transportadoresde glucosa

1.6. PLANTEAMIENTO DEL TEMA.

2. MATERIAL Y METODOS

2.1. ANIMALES

2.2. COMPOSICIONDE LA DIETA GENERAL

2.3. HIPOTIROIDISMO

2.4. MODELOS DE HIPOTIROIDISMO

2.4.1. Animaleshipotiroideosneonatales

2.4.1.1. Ratasneonatalestiroidectomizadas

2.4.1.2. Ratasneonatalestratadascon MMI

2.4.1.3. Ratasneonatalestiroidectomizadastratadascon STZ

2.4.2. Animaleshipotiroideosdestetados

2.4.2.1. Ratasdestetadastiroidectomizadas

2.4.2.2. Ratasdestetadastiroidectomizadastratadascon insulina

2.4.3. Animaleshipotiroideosadultos

2.4.3.1. Ratasadultastiroidectomizadas

2.4.3.2.Ratasadultastiroidectonizadastratadascon insulina

2.5. MODELOS DE HIPOTIROIDISMO CON REI-LABILITACION

2.5.1. Animaleshipotiroideostratadoscon tiroxina

2.5.1.1.Rehabilitaciónmedianteinyecciónde ‘[4

2.5.1.2.Rehabilitaciónmedianteimplantaciónde pellets

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55

6

552.6. MODELO DE DIABETES POR ESTREPTOZOTOCINA

2.6.1. Tratamientode animalesdiabéticoscon ‘[4

(GLUTs)2.7. ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORESDE GLUCOSA

EN RATAS NEONATALES HIPOTIROIDEAS

2.8. RECOGIDADE MUESTRAS

2.9. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE IGF-I.

2.9.1. Fundamentodel radioininunoanálisis

2.9.2. Filtraciónen gel

2.9.2.1. Fundamento

2.9.2.2.Material y reactivos

2.9.2.3.Calibraciónde la columna

2.9.2.4. Filtraciónde los sueros

2.9.3. Marcajeradiactivode IGF-I y II

2.9.3.1. Fundamento

2.9.3.2. Material y reactivos

2.9.3.3. Procedimiento

2.9.3.4. Cálculo del rendimientoy la actividadespecífica

2.9.3.5. Perfil de elución de radiactividad

2.9.3.6. Repurificacióndel IGF marcado

2.9.4. Desarrollodel RIA de IGF-I

2.9.4.1. Material y reactivos

2.9.4.2. Preparaciónde las muestras

2.9.4.3.Procedimiento

2.9.4.4. Cálculos

2.10. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE T, Y ~.

2.10.1.Marcajeradiactivo de T3 y T4



2.10.1.3.Perfil de eluciónde radiactividad

2.10.2.Desarrollodel RIA de ‘[3



2.10.2.3.Cálculos

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2.10.3. Desarrollo del MAde 14. . . . 69

2.10.3.1. Material y reactivos. . 69

2. 10.3.2. Procedimiento 70

2.10.3.3. Cálculos 70

2.11. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE INSULINA. ... 70

2.11.1.Material y reactivos 70

2.11.2.Procedimento 71

2.11.3.Cálculos 71

2.12. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE HORMONA DE

CRECIMIENTO (GH) 71

2.12.1. Preparacionde las hipófisis parael MA 71

2.12.2. Marcajeradiactivo de Gil 71

2.12.2.1.Material y reactivos 72

2.12.2.2.Procedimiento 72

2.12.2.3.Cálculo del rendimientoy la actividadespecífica 72

2.12.2.4. Perfil de elución de radiactividad tras el marcaje radiactivo de

Gil 72

2.12.2.5.Repurificaciónde la GEl marcada 73

2.12.3.Desarrollodel RíA de GH 73

2.12.3.1.Material y reactivos 73


2.12.3.3.Cálculos. 74

2.13. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION SERICADE IGF-II

POR ANALISIS DE RADIORECEPTOR(RRA) 74

2.13.1. Fundamento 74

2.13.2.Preparaciónde membranaplasmáticaparticuladade hígadode rata. 74

2.13.3.Desarrollodel RRA de IGF-II 75

2.13.3.1,Material y reactivos 75


2.13.3.3.Cálculos 76

TECNICAS ELECTROFORETICAS 76

2.14. ANALISIS DELAS PROTEíNASLIGADORAS DE IGF: WESTERN

BLOT 76

8

2.14.1. Fundamento

2.14.2. Electroforesis

2.14.2.1.Preparacióndel gel

2.14.2.2.Preparaciónde las muestras.

2.14.2.3.Condicionesde electroforesis.

2.14.3. Electrotransferencia

2.14.4. Westernligand blot

2.14.4.1.Reactivos

2.14.4.2.Preparaciónde la membrana. .

2.14.4.3.Incubacióncon el radioligando.

2.14.4.4.Lavado y detecciónde las IGFBPs.

2.14.5.Westerninmunoblot

2. 14.5.1. Reactivos

2.14.5.2. Preparaciónde la membrana

2.14.5.3.Incubaciónconel primer anticuerpo.

2.14.5.4.Incubacióncon el anticuerposecundario.

2.14.5.5.Detecciónde las IGFBPs

2.14.6. Westerninmunoblot

2.14.6.1.Reactivos

2.14.6.2.Preparaciónde la membrana

2.14.6.3.Incubaciánconel anticuerpoprimario

2.14.6.4.Incubacióncon el anticuerposecundario

2.14.6.5. Detecciónde las IGFBPs

2.15. ANALISIS DE LOS TRANSPORTADORESDEGLUCOSA(GLUTs):

WESTERNINMUNOBLOT

2.15.1. Preparaciónde las muestras

2. 15.1.1. Reactivos

2.15.1.2.Extracciónde las membranasde tejidos muscularesy corazon.

2. 15.1.3. Extracciónde las membranashepáticas

2.15.2.Westernimnunoblot

2.15.2.1.Reactivos

2.15.2.2.Preparaciónde la membrana

2.15.2.3.Incubacióncon el anticuerpoprimario

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9

2.15.2.4. Incubación con el anticuerpo secundario. 86

2.15.2.5. Detección de los GLUTs

E IGFBPs: ENSA2.16. ANALISIS DE EXPRESION DE IGFs

PROTECCIONDE RIBONUCLEASAS. ...

2.16.1. Extracción del ARNtotal

2.16.1.1. Preparación de las muestras

2.16.2. Ensayo de protección de ribonucleasas.

2.16.2.1.Fundamento

2.16.2.2.Preparaciónde las muestras

2.16.2.3. Síntesisde la ribosonda

2.16.2.3.1.Reactivos

2.16.2.3.2.Obtencióndel plásmido

2.16.2.3.3.Linearizacióndel plásmido

2. 16.2.3.4.Marcajede la ribosonda

2.16.2.3.5.Hibridación en solucion

2.16.2.3.5.1.Reactivos

2.16.2.3.5.2.Hibridaciónde la ribosonda

2. 16.2.3.5.3.Digestiónde la ARNasa

2. 16.2.3.5.4.Electroforesis

2.16.2.3.5.5.Cuantificacióndensitométrica

2.17. OTRAS DETERMINACIONESANALíTICAS.

2.17.1.Análisis de la glucemia

2.17.1.1. Glucosa en sangre

2.17.1.2. Glucosa en sangre desproteinizada

2.17.2. Determinación de las proteínas

2.18. CALCULOSESTADíSTICOS

2.18.1. Análisis de la varianza

2.18.2. Regresión lineal y correlación

3. RESULTADOS

3.1. TIROIDECTOMIA (T> Y TRATAMIENTO

EN PERIODONEONATAL

3.1.1. Evolución del pesocorporal

YODE

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CON METIMAZOL (MMI>

97

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3.1.2. Niveles séricosde ‘[3 y ‘[4 y plasmáticose hipofisariosdeGil 98

3. 1.3. Glucemiae insulinemia 101

3.1.4. Factoresde crecimientosimilaresa la insulina (IGFs): nivelesséricos

y expresióndel ARNm hepático 101

3.1.4.1. Niveles séricos 101

31.4.2. Expresiónde] ARNm hepático 103

3.1.5. Estudio de regresiónlineal y correlación 105

3. 1.6. Proteínasligadorasde IGFs (IGFBPs): nivelesséricosy expresióndel

ARNm hepático 105


3.1.6.1.1.Westernligand blot 105

3.1.6.1.2.Westerninmunoblot 108

3.1.6.2.Expresióndel ARNm hepático 108

3.2. TRATAMIENTO CON ESTREPTOZOTOCINA(STZ) DE RATAS

NEONATALES TIROIDECTOMIZADAS 111

3.2.1. Evolución del pesocorporal 111

3.2.2. Niveles séricosde T3 y ‘[4 y plasmáticose hipofisariosde Gil 111

3.2.3. Glucemiae insulinemia 113

3,2.4. IGFs: niveles séricosy expresióndel ARNm hepático 113

3.2.4.1.Niveles séricos 113

3.2.4.2. Expresióndel ARNm hepático 113

3.2.5. Estudiode regresiónlineal y correlación 115

3.2.6. IGFBPs:nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 115





3.2.7. Resumende los resultadosdel estudiode la tiroidectomiay la

administración de MMI en ratas neonatalesy de las ratas

neonatalestiroidectomizadastratadascon STZ 119

3.3. TIROIDECTOMIA EN PERIODODE DESTETEY ADULTO 121

3.3.1. Evolucióndel pesocorporal 121

3.3.2. Niveles séricosde T3 y T4 y plasmáticose hipofisariosde Gil 121

11


3.3.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 125




3.3.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 128




3.3.6.2. Expresióndel ARiNm hepático 131

3.4. TRATAMIENTO CON INSULINA DE RATAS

TIROIDECTOMIZADAS DESTETADAS Y ADULTAS 131

3.4.1. Evolución del pesocorporal 131

3.4.2. Niveles séricosde ‘[3 y T4 y plasmáticose hipofisariosde Gil 134


3.4.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 134




3.4.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 137


3.4.6.1.1. Westernligand blot 137

3.4.6.2. Expresióndel ARNm hepático 140

3.4.7. Resumende los resultadosdel estudiode la tiroidectomíaenratas

destetadasy adultasy de animalesdestetadosy adultosoperados

tratadoscon insulina 140

3.5. TRATAMIENTO CON ‘[4 DE RATAS TIROIDECTOMIZADAS

NEONATALES, DESTETADAS Y ADULTAS 142

3.5.1. Tratamiento con ‘[4 de las ratas neonatales tiroidectomizadas.

Comparaciónentredosis inyectadasy pellets 143

3.5.1.1. Evolucióndel pesocorporal 143

3.5.1.2. Niveles séricosde ‘[3 y ‘[4 y plasmáticose hipofisariosde Gil. . . . 143

3.5.1.3.Glucemiae insulinemia 145

12

3.5.1.4. IGFs: niveles séricos y expresión del ARNmhepático 145

3.5.1.4.1. Niveles séricos 145

3.5.1.4.2. Expresión del ARNmhepático 147

3.5.1.5. Estudio de regresión lineal y correlación 147

3.5.1.6. IGFBPs: niveles séricos y expresión del ARNmhepático 147

3.5.1.6.1. Niveles sericos 147

3.5.1.6.1.1. Western ligand blot 147

3.5.1.6.1.2. Western inmunoblot 150

3.5.1.6.2. Expresión del ARNmhepático 150

3.5.1.7. Resumen de los resultados del estudio del tratamiento con ‘[4

en ratas neonatales tiroidectomizadas 152

3.5.2.Tratamiento con ‘[4 de las ratas destetadasy adultastiroidectomizadas.

Comparaciónde dosisinyectadasy pellets 153

3.5.2.1. Evolucióndel pesocorporal 153

3.5.2.2. Niveles séricosde T3 y ‘[4 y plasmáticose hipofisariosde Gil. . . . 155

3.5.2.3. Glucemiae insulinemia 157

3.5.2.4.IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 157

3.5.2.5. Estudiode regresiónlineal y correlación 159

3.5.2.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 159

3.5.2.6.1.Niveles serícos 159

3.5.2.6.1.1.Western ligand blot 159

3.5.2.6.1.2. Western inmunoblot 163

3.5.2.6.2.Expresióndel ARNm hepático 163

3.5.2.7. Resumende los resultadosdel estudiodel tratamientocon T4

en ratasdestetadasy adultastiroidectomizadas 165

3.6. DIABETES EN PERIODO NEONATAL Y ADULTO Y

REHABILITACION CONT4 166

3.6.1. Evolución del peso corporal 166

3.6.2. Niveles séricos de ‘[3 y T4 y plasmáticos e hipofisarios de Gil 168

3.6.3. Glucemia e insulinemia 169

3.6.4. IGEs: niveles séricos y expresióndel ARNm hepático 169


3.6.4.2. Expresión del ARNmhepático 169

13

3.6.5. IGFBPs: niveles séricos y expresión del ARNmhepático 171


3.6.5.1.1. Western ligand blot 171

3.6.5.1.2. Western imnunoblot 171


3.6.6. Resumen de los resultados del estudio de la diabetes y el

tratamiento con 14 en ratas neonatales y adultas 174

3.7. HIPOTIROIDISMO, IGFs, IGFBPs Y TRANSPORTADORESDE

GLUCOSA(GLUTs) EN PERIODONEONATAL 175

3.7.1. Evolución del peso corporal 176

3.7.2. Niveles séricos de T3 y ‘[4 y plasmáticos e hipofisariosde GH 176

3.7.3. Glucemia e insulinemia 176

3.7.4. IGFs: niveles séricos y expresión del ARNmhepático 178



3.7.5. Estudio de regresiónlineal y correlación 180

3.7.6. IGFBPs:nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático 180




3.7.6.2. Expresiónhepática 183

3.7.7. Niveles de GLUTs en membranacruda 185

3.7.7.1. Corazón 185

3.7.7.2. Hígado 185

3.7.7.3.Músculosesqueléticos:cuadricepsy gastrocnemius 187

3.7.8. Resumende los resultadosdel estudio del hipotiroidismo en ratas

neonatales 187

3.7.9. Resumende los resultadosde las variacionesde los transportadoresde

glucosa(GLUTs) en ratashipotiroideasneonatales 189

4. DISCUSION 190

4.1. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONESDEL AXIS IGFs/IGFBPsEN

SITUACIONES DE HIPOTIROIDISMO DESDE LA ETAPA

14

NEONATALA LA ADULTA 191

4.1.1. Niveles de lOEs en suero y expresión de su ARNmen hígado en

animales neonatales hipotiroideos 191

4.1.2. IGFs en animales detetadosy adultos tiroidectomizados 195

4. 1.3. IGFs en animales tiroidectomizados neonatales tratados con

estreptozotocina (STZ) y en detetados y adultos tratados con

insulina 195

4.1.4. Consideracionesfinalesdel estudiode las variacionesde los IGFs. . . 196

4.1.5. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepáticoen animales

hipotiroideosneonatales 197

4. 1.5.1. IGFBPs en los animales neonataleshipotiroideos y tratados con

STZ 198

4.1.5.2. Consideracionesfinales del estudio de las variaciones de las

IGFBPs 200

4.1.6. IGFBPsen animalesdestetadosy adultostiroidectomizadosy tratados

con insulina 201

4.1.6.1.Consideracionesfinalesdel estudiode las variacionesde las IGFBPs

en animaleshipotiroideos 202

4.2. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES DEL AXIS IGFs/IGFBPsEN

SITUACIONES DE HIPOTIROIDISMO (TIROIDECTOMIA) DESDE

LA ETAPA NEONATAL A LA ADULTA DESPUES DE LA

REHABILITACION CON ‘[4 202

4.2.1. lOEs e IGFBPs en neonatos 204

4.2.2. lOEs e IGFBPs en destetadosy adultos 206

4.3. ESTUDIO DE LA REilABILITACION CON T4 EN SITUACIONES

DE DIABETES EN PERIODONEONATAL Y ADULTO 208

4.3.1. lOEs e IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático. . . . 209

4.4. ESTUDIODE LAS VARIACIONES DE LOS TRANSPORTADORES

DE GLUCOSA (GLUTs) EN ANIMALES NEONATALES

HIPOTIROIDEOS. POSIBLE CORRELACION ENTRE LAS

ACCIONES DE LAS HORMONAS TIROIDEAS, GLUTs Y EL

AXIS IGFs/IGFBPs 213

4.4.1. IGFs e IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático. . . . 214

15

4.4.2. GLUTs: nivelesen membranacrudade corazón,hígado,cuadricepsy

gastroenemius 216

CONCLUSIONES 219

BIBLIOGRAFíA 224

16

ABREVIATURAS

ACTI-I

ADN

ADNasa

ALS

ANOVA

APS

ARN

ARNasa

B

BCIP

BSA

DA

DEPC(il20)

DIT

DS

DTT

ECL

EDTA

FG

FGF

FSil

Gil

GLUT

HEPES

Hormona corticotrópica

Acido desoxirribonucleico. Sufijos: c, complementario

Desoxirribonucleasa

Subunidad ácido lábil (Acid labile-subunit)

Análisis de la varianza

Persulfatoamónico

Acido ribonucleico.Sufijos: m, mesanjero;t, transportador

Ribonucleasa

Concentraciónde ligandounido a su receptor

Ligamiento inespecífico

Fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo

Albúmina séricabovina

Dopamina

Dietilpirocarbamato

Diyodotirosina

Desviaciónestándar

Ditiotreitol

Técnica de quimioluminiscencia (TMEnhanced

chemiluminiscence)

Acido etilenaminotetracético

Filtración engel

Factor de crecimiento de los fibroblastos

growth factor)

Hormona estimulante del folículo (Folicle

hormone)

Hormonade crecimiento(‘Growth hormone’).Prefijo: r,

rata

Tansportadorde glucosa(‘Glucosetransporte?)

ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfónico

( Fibroblast

stimulating

17

IGF

IGFBP

ip

iv

Kav

LBB

MIT

MMI

MOPS

N

NBT

Nonidet-P40

NT

PAGE

PBS

PDGF

PEG

PMSF

PTU

PVDF

lilA

rpm

RRA

sc

SCN

Factor de crecimiento similar a la insulina (“Insulin-like

growth factor”). Prefijos: r, rata; h, humano; br, humano-

recombinante; tr, des(1-3) IGF-I (IGF-I truncado)

Proteína ligadora de IGF (“Insulin-like growth factor

binding protein”). Prefijos: r, rata; h, humano; b, bovino;

rh, humano-recombinante

Administración intraperitoneal

Administración intravenosa

Coeficientede disponibilidad

Tampónde “ligand blotting”

Monoyodotirosina

2-mercapto-1 -metilimidazol (metimazol)

Acido 3-(N-morfonilol)propinosulfónico

Ligamiento inespecífico

Nitroazul de tetrazoilo

Oxido de octilfenol-etileno

Neurotensina

Electroforesisen geldepoliacrilamida(“polyacrylamidegel

electrophoresis”)

Tampónfosfato (‘Phosphatebuffer salme”)

Factorde crecimientode derivadode plaquetas(“Platelet-

derivedgrowth factor”)

Polietilenglicol

Fluoruro de fenil-metil-sulfonio

Propiltiouracilo

Difluoruro de polivinilideno

Radioinmunoanálisis(“Radioimmunoassay9Revolucionespor minuto

Radioanálisisde receptor(‘Radiorreceptorassay‘9

Administraciónsubcutánea

Isotiocianato

18

SDS Dodecilsulfatode sodio

SRJH Somatostatina

STZ Estreptozotocina

T Concentración de ligando total

Diyodotironina

Triyodotironina. Prefijos: r, rata; r: rT3 (‘[3 inversa,

“reverse-T3”)

‘[4 Tetrayodotironinao tiroxina. Prefijo: r, rata

‘[BA Albúmina fijadora de tiroxina (“Thyroxine-binding

albumin”)

TBG Globulina fijadora de tiroxina (“Thyroxine-binding

globulin)

TBPA Proalbúminafijadora de tiroxina (II Thyroxine-bindingpre-

albumin)

TBS SoluciónsalinatamponadaconTris (‘Tris-bufferedsalme’)

TE Tris basey EDTA

TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina

Tg Tiroglobulina

TPO Tiroperoxidasa

TRH ilormomadeliberacióndetirotropina(“Thyrotropin-release

hormone)

Tris Tris(hidroximetil)an-iinometano

TSH Tirotropina (‘ Thyroid-stimulatinghormone‘)

Tween-20 Monolaurato de polioxoetilenosorbitano

UI Unidades internacionales

V Volumen de elución de una sustanciadeterminadopor

filtración en gel

19

iNTRODUCCION

Introducción

1. INTRODUCCION.1.1. HORMONAS TIROIDEAS.

1.1.1. Síntesisy secrecion.

Las células productoras de las hormonas tiroideas 3, 5, 3’-L-triyodotironina

(T3) y 3, 5, 3’, 5’ -L-tetrayodotironina (‘[4) se organizan en folículos en el interior de

la glándula tiroidea; dichos folículos rodeanuna cavidadque contieneuna sustancia

viscosa denominadacoloide y que constituye el almacénpara la glicoproteina

tiroglobulina(Tg). Así pues,la síntesisde las hormonastiroideasseinicia mediante

la captaciónde yoduro por partedel tiroides medianteun mecanismode transporte

activo, a continuación,seproducela yodaciónen los gruposde tirosina de la Tg y,

mediante un acoplamiento intramolecular en una reacción catalizada por la enzima

tiroperoxidasa (TPO), se forman unos yodoaminoácidos precursores de las hormonas

tiroideas:monoyodo-y diyodotirosina(MIT y DIT, respectivamente).La Tg yodada

se almacenaen el coloide,y sirve de reservade ‘[3, ‘[4 y de yodo, perono pasacomo

tal a la sangrecirculante, sino que la secreciónde las hormonastiroideasconlíeva

una degradaciónde la Tg por partede la yodotirosinadesyodasa(hidrolasaácida),

que libera ‘[3, ‘[4, MIT y DIT y yodo, que se reciclaenel folículo (Guyton, 1986).

El productomayoritariode la secrecióntiroideaes la tiroxina, aunquela formaactiva

es la triyodada (‘[3), y estase generatanto en la glándula (en baja proporciónen

condicionesnormales)comoen tejidos extracelularespor pérdidade un átomo de

yodo de la T4 (desyodación).La ‘[3 tiene unaafinidad 10 vecesmayorporel receptor

que la T4 (St Germain, 1994).

Las hormonastiroideas,debido a su bajasolubilidaden solucionesacuosas,

circulanpor la sangreen una pequeñafracción (menosdel 1 %) en forma libre, y la

mayor parte de ellas lo hacenunidas a unas proteínastransportadorasque se

sintetizanen el hígado: globulina fijadora de tiroxina (TBG), albúmina (‘[BA) y

proalbúmina(TBPA>.

1.1.2. Regulacióndel axis tiroideo.

La síntesis y secreciónde las hormonastiroideas, expuestasde un modo

simplista, estánreguladasporun sistemacomplejoen el cual sepuedenconsiderar

tres nivelesdiferentes.La hipófisis sintetizay segregala hormonatirotropa (‘[Sil),

principal estimulo de la función tiroidea. Dicha secreción está sujeta a dos

influencias,dadoqueel hipotálamoproducedoshormonas,la hormonaliberadorade

21

Iniroducck5n

tirotropina (TRH), que estimula la síntesis y secreciónde TSil en la hipófisis, y la

somatostatina (SRIH), que la inhibe. Sin embargo el sistemade contrarregulación

positivo más importante se establecea un tercernivel, mediantela acciónsupresora

que las hormonastiroideasejercensobrela síntesisy secreciónde TSil.

Este esquemaelemental se ve complicado por las diferentes acciones,

inhibidoras o estimuladoras,que a los distintos niveles ejercenotras hormonasy

neurotransmisores.

1.1.2.1.Tirotropina.(TSH, ‘thyroid-stimulatinghormone).

La TSil esuna glucoproteinay su regulaciónpor las hormonastiroideases

un sistemade retroalimentaciénnegativaa nivel de la hipófisis; numerososestudios

han demostradoque un aumentoen los nivelesde las hormonastiroideasdisminuye

la secreciónde TSil y que el déficit de hormonastiroideasaumentasu secreción

(Belchetz, 1978). Así pues, se ha visto que en situacionesde hipotiroidismoa corto

plazo, la administraciónde ‘[3 puede inhibir la síntesis y liberación de ‘[Sil de

maneradosis-dependiente,vía retroalimentación. Porotro lado, en situacionesde

hipotiroidismo prolongado, cuando la síntesis proteica está considerablemente

disminuida, la administraciónde hormonatiroideaestimulala síntesisde proteínas,

incluida la ‘[Sil. Este efecto predominacuando la dosis de ‘[3 dadaes pequeña,

mientras que dosis altas de dicha hormonaharíanmás evidente la inhibición por

retroalimentación(Magner, 1990).

Además,estaregulacióntambiénocurrevía hipotalámica,porhormonasque

estimulano inhiben(TRH y DA, respectivamante)los nivelesde TSH. Así pues,las

hormonas tiroideas e hipotalámicas interactúanpara modular tanto los niveles

circulantesde ‘[Sil como la transcripciónde los genescodificadoresde la hormona

(Morley, 1981; Gershengorn,1986).

1.1.2.2.Controlneuroendocrino.

1.1.2.2.1. Hormona de liberación de tirotropina. (‘[RU, ‘thyrotropin-

releasehormone”).

El ‘[RU esun tripéptidoque poseeun efectopositivo enel hipotálamosobre

la función tiroidea, y aunquese encuentraampliamentedistribuido por el cuerpo,

pareceserque la regióndel núcleoparaventricularestáparticularmenteinvolucrada

en el axis TRH-TSH (de Greef, 1992). No obstante,estarespuestapositiva en el

hipotálamo puede ser abolida por lesiones hipotalámicasy estímulos externos

22

Introducción

(cambiosen la temperaturaambiente,stress,ciclo día-noche).

La liberacióndel ‘[RU estáreguladade forma negativapor las hormonas

tiroideas, y aunque sobre esta retroalimentación existen grandes lagunas, se sabe que:

en las ratas hipertiroideas,la liberaciónde ‘[RU está disminuida en un 30-40%,

mientras que el hipotiroidismo inducido por tiroidectomíao la administraciónde

drogas tirostáticas se asocia con un aumentoen el contenidohipotalámicodel ARNm

de pro-’[RH (de Greef, 1992). No obstante, el tratamiento con MMI, que induce

también un aumento del contenido de ARNmde pro-TRU en el hipotálamo, no altera

la liberación de ‘[Ril a nivel de este órgano (Rondeel, 1988; Rondeel, 1990) y sólo

cuando el hipotiroidismo se induce mediante tiroidectomía o la administración de

PTU, se aumenta moderadamente el nivel de ‘[RU en la sangre portal hipofisal

(Rondeel, 1992).

1.1.2.2.2. Otros factores hipotalámicos.

1. Somatostatina (SRIH).

La somatostatina inhibe la secreción de Gil, pero también la liberación de

‘[Sil. En la rata, la somatostatinano afectaa los nivelesbasalesplasmáticosde TSR,

pero sí inhibe la respuestade ‘[Sil a TRH de maneradosis-dependiente,e incluso,

se ha sugeridoque in vivo, partede la retroalimentaciónnegativaque ejercenlas

hormonastiroideasestámediadapor el aumentode la sensibilidadde las células

tirotropasa la somatostatinahipotalámica(Spira, 1986).

En situacionesde hipotiroidismoinducidaspor la administraciónde PTU se

ha visto que seduplica la capacidadde los extractoshipotalámicospara inactivara

la SRIil, y se disminuye en el mismo grado el contenido hipotalámicode SRIH

(Berelowitz, 1980).

2. Neurotensina(NT).

La neurotensinaafecta a los niveles plasmáticosde ‘[Sil; algunos estudios

sugierenque una inyecciónintravenosade NT eleva la concentraciónplasmáticade

‘[SU en la rata, mientras que en otros una inyección de este factor en el tercer

ventrículo de la rata no cambia los nivelescirculantes de ‘[SU, o incluso los

disminuye(Vijayan, 1980).

3. Momoaminas

.

En la rata,la norepinefrinaestimulala secreciónde ‘[SU por la activaciónde

los receptoresa, mientrasque la dopaminainhibe su secreción(Spira, 1986).

23

Introducción

1.1.2.2.3.Hormonastiroideas.

La administraciónde hormonastiroideas,comoseha mencionado,inhibe los

niveles plasmáticos de ‘[SN basal y la estimulación de la liberación de la TSH

inducidapor ‘[Ril, como consecuenciade la reduccióndel númerode receptoresde

TRH en células que secretan hormona tiroestimulante.

1.1.3. Metabolismoy accionesde las hormonastiroideas.

1.1.3.1.Metabolismo.

El metabolismode las hormonastiroideasen tejidos extratiroideosinvolucra

a unaseriede reaccionesenzimáticascomplejascomoson: desyodación,conjugación

y/o desaminacióny descarboxilaciónoxidativa. No obstante, la principal ruta

metabólicaes ladesyodación,queestámediadaporuna familia de enzimaspresentes

en la glándula tiroidea y en tejidos extratiroideos (Leonard, 1990). Se han

identificadodos reaccionesgeneralesde desyodación:pérdidade un átomo de yodo

del anillo fenólico (externo), recibeel nombrede 5’-desyodación,y si el átomo de

yodo se libera del anillo tirosilo (interno) se denomina 5-desyodación.La 5’-

desyodaciónseconsideracomo unarutade activaciónporquegeneradirectamenteel

metabolitoactivo (‘[3) a partir de la “prohormona inactiva (‘[4) y, por el contrario,

la 5-desyodaciónes una ruta de inactivación porque da lugar a un metabolito

biológicamenteinerte (rT3). Se conocentres tipos de desyodasas:

1. Desvodasatipo 1: Estápresenteen tejidostiroideosy extratiroideos(riñón,

hígado, pulmón, músculo, piel) y poseeprincipalmenteactividad 5’-desyodasa,

aunqueen menormedidatambiéndesyodael anillo tirosilo (actividad5-D), genera

la mayorpartede la T~ liberadaa la circulación.

2. Desvodasatino II: Sóloposeeactividad5’-desyodasa,sehallapresenteen

el cerebro pituitaria y tejido adiposomarrón,y es la responsablede la mayoríade

la ‘[3 producidaa partir de la ‘[4 dentrode las células.

3. Desvodasatino III: Tiene sólo actividadsobreel anillo tirosilo y se expresa

en el córtexcerebraly piel de ratasadultasy en placentay otros tejidos fetales(St

Germain, 1994).

La importancia fisiológica de la desyodaciónsobre la economíade las

hormonastiroideasesgrande,y así, diversosestudiosenratasneonatalesy fetoshan

demostradoque, en situacionesde déficit de hormonastiroideas, se favorece la

conversiónde ‘[4 a ‘[3 en órganoscomo el cerebro lo que constituyeun mecanismo

24

Introducción

deprotecciónmuyeficaz,especialmenteduranteperiodoscríticosdel desarrollocomo

el perinatal, en el que el desarrollodel cerebrodependeen gran medida de las

hormonastiroideas(Ruiz de Olla, 1988; Aláez, 1992b; Porterfield, 1993).

1.1.3.2.Accionesbiológicasde lashormonastiroideas.

La primera acciónreconocidade las hormonastiroideas fue su efectoen la

generación de calor, que se refleja en un aumento del consumo de oxígeno y del

metabolismobasa);así, activanlos mecanismosoxidativosmitocondrialesen hígado,

riñón, músculosy corazón(vanHardeveld,1986).

Las honnonastiroideas intervienentambiénen la regulación de procesos

metabólicos como la síntesis y degradación de proteínas, tanto estructurales como

enzimáticas (a-glicerolfosfato deshidrogenasamitocondrial, enzima málico...),

incrementanel metabolismolipídico, afectandomásala degradaciónquea la síntesis,

intervienen en la regulación del metabolismo de carbohidratos (aumentan la

gluconeogénesisy la utilizaciónde la glucosa)y también,participanen la síntesisy

el mantenimientodel nivel adecuadode algunasvitaminas,y en su transformaciónen

cofactoresenzimáticos(Freake,1995; Venditti, 1997).

Además,entre los efectosque ejercencabedestacarel papelquejueganen

procesosde crecimiento, diferenciacióny desarrollo, y entre ellos cabe citar la

metamorfosisde los anfibios (Nikodem, 1990) o su actuacióndirectasobreel gen de

Gil (Yaffe, 1984).

La falta de hormonastiroideasduranteel desarrollode los mamíferoslleva

asociadamúltiples alteracionesen el crecimiento y maduraciónde muy diversos

tejidos. En etapastempranas,en el sistema nervioso central durante el periodo

crítico del desarrolloembrionarioy perinatal, la falta de hormonastiroideaspuede

producir dañosseverose irreversibles (Eayrs, 1968 ; Timiras, 1989), que en el

hombre conducena un retraso mental profundo (Dobbing, 1977; Morreale de

Escobar,1983; Legrand,1986).Esteperiodo, en el queel cerebroesmuy vulnerable

se denominacrítico, coincideconuna etapade mitosis activasy diferenciaciónde las

células nerviosas,y en el hombrese sitúaentreel final de la gestacióny los 2 años

de edad.

1.1.4. Interacciónentrehormonastiroidease insulina.

Las hormonastiroideasy la insulinaejercenaccionesmetabólicascontrarias,

no obstante,aún no se conocebien el efecto que ejercen la ‘[3 y la 1’4 sobre el

25

Introducción

metabolismo de la insulina. En trabajos anteriores, se ha mostrado que el

hipertiroidismo puedeaumentar(Beer, 1989; O’Meara, 1993), disminuir (Ikejiri,

1978; Escrivá, 1981>, o incluso, no alterar (Taylor, 1985> los niveles de insulina. El

hipotiroidismotambiénsemuestracomoun cuadrocontrovertido,aunqueaúnmenos

estudiado que el hipertiroidismo.

En el hombre, el hipotiroidismo usualmente se presenta con unas

concentracionesbasalesde insulina normalesy, raramentedisminuidas (Lenzen,

1984). Por otro lado, el hipotiroidismo experimentalpuedeir acompañadode una

variabilidad similar a la del hipertiroidismo en cuantoa los nivelesplasmáticosde

insulina. John y col. (1970) observaron en la rataquela induccióndel hipotiroidismo

mediantela tiroidectomíao la administraciónde ciertosgoitrógenos(C104, ReO¿,

MMI) disminuían los valores circulantes de insulina frente a los controles, mientras

que si se le administraba a las ratas fármacos antitiroideos como propiltiouracilo

(PTU) y SCN (isotiocianato), se producía un aumento en la insulinemia de estos

animales respecto a sus controles. Montes y col. (1977) indujeron en la rata un

hipotiroidismo experimental mediante tiroidectomia, e inicialmente observaron, a los

5, 10 y 15 días después de la operación, que los niveles circulantes de insulina no se

alteraban, mientras que si se prolongaba más el déficit de las hormonas tiroideas los

valores plasmáticos de esta hormona disminuían respecto a sus animales control. La

terapia de reemplazamiento con dosis fisiológicas de ‘[4, al igual que la

administración de Gil, normalizó los bajos niveles de insulina de estos animales

hipotiroideos(John, 1970; Montes, 1977).

A pesarde quela velocidadde secreciónde la insulinapuedeestaraumentada

(Lenzen,1984) o no alterada(O’Meara, 1993)en situacionesde excesoy déficit de

hormonastiroideas, pareceque en los pacienteshipertiroideos la respuestade la

insulinaala administraciónde glucosaintravenosau oral estámuy exagerada(Ahrén,

1981; O’Meara, 1993>, mientras que el hipotiroidismo produceun aumento,una

disminucióno no alteradicharespuesta.

La velocidad de desapariciónde la insulina aumentapor el exceso de

hormonastiroideas(Moghetti, 1994)y disminuyeporel déficit (Lenzen, 1984),con

lo que la duraciónde la acciónde la hormonase ve alteradapor el estadotiroideo.

Estas alteracionesen la secreciónde la insulina podrían hacer pensaren

cambiosa nivel de los islotespancreáticos,y así, se ha observadoque la hipotrofia

26

Introducción

de los islotes parece ser un efecto directo de las hormonas tiroideas sobre el páncreas

endocrino que resulta de unos cambios degenerativos tras situaciones de

hipertiroidismoprolongado(Lenzen 1976; Lenzen, 1978).En estesentidotambién,

Morovat y col. (1998) apuntanque los altos niveles plasmáticosde insulina

encontradosen cerdosjóvenestiroidectomizadospuedenser debidos,al menosen

parte, a un descensoen la sensibilidad de los tejidos a esta hormona, como

previamente se había sugerido en situaciones de hipertiroidismo (Abrén, 1981;

Mdller, 1988) e hipotiroidismo(Jayendra,1972; Katsilambros, 1972).

Como hemos visto, el estadotiroideo afecta a la secreción normal de la

insulina, así como a su metabolismo (Foss, 1990) y contenido pancreático

(Katsilambros,1972), lo queconducea unamodificaciónde la homeostasisglucídica

que podría llevar al desarrollo de una diabetes (más comúnmente en el

hipertiroidismoque enel hipotiroidismo).

1.2. FACTORESDE CRECIMIENTO SIMILARES A LA INSULINA (IGFs).

Los factores de crecimientosimilares a la insulina (“insulin-like growth

factors>IGF-I y II son polipéptidossimilaresestructuralmentea la proinsulina, de

hecho, aunqueson codificadospor genes individuales,se encuentranrelacionados

ancestralmentecon el gende la insulina y poseenefectosmetabólicossimilaresa esta

(ilumbel, 1990). Se sintetizanen numerosostejidos sobrelos que ejercenacciones

a nivel de los procesosde proliferacióny diferenciación, tanto locales (auto y

paracrinas)comoendocrinaspor la unión a receptoresespecíficosde membrana.

En la sangrey otros fluidos extracelulares,los IGFs forman complejoscon

unasproteínasespecíficas(‘insulin-like growth factor-bindingproteins’, IGFBPs),

que constituyenuna familia de péptidosrelacionadosestructuralmenteentre si.

1.2.1. Estructura,síntesisy transporte.

1.2.1.1.Estructura.Los IGFs son polipéptidos de cadena única de 70 y 67 aminoácidos (IGF-I y

JI, respectivamente>, con tres puentes disulfuro, y comparten entre sí una homología

del 62%, y con la proinsulina del 42% (Sara, 1990). En la estructura de estas

proteínas se han caracterizado varios dominios: A y B (similares a la insulina), C

(análogo al péptido de conexión de la proinsulina) y D (no está presente en la

insulina).

27

Introducción

La estructura primaria de los IGFs está altamente conservada entre especies.

El IGF-I de rata difiere del humano en tres aminoácidos, y el IGF-II tan solo muestra

cuatro sustituciones conservativas respecto al péptido humano (Daughaday, 1989). No

obstante, en el suero humano se han identificado variantes de estos péptidos de

distinta longitud, se han detectado formas truncadas y de alto peso molecular de

ambos IGFs, probablemente generadas por un procesamiento post-traduccional, dado

que no se han identificado ARNmque codifiquen para esas primeras formas.

Los genes que codifican para IGF-I y II en el hombre y en la rata comparten

numerosos elementos estructurales.

El gen que codifica para el IGF-I está compuestopor 6 exonesseparadospor

5 intrones de un tamaño de 1.9 a 5OKb. Los exones1 y 2 codificanel péptidoseñal

y una región 5’ no traducida; estos exones sufren un acoplamiento alternativo con el

exón 3 que codifica el resto del péptido señal y la mayoría del dominio B. El exón

4 codifica el resto del dominio B, C, A y D y los 16 primeros aminoácidos del

péptido E. El exón 5 codifica parte del péptido E, y el exón 6 el resto del péptido E

y una secuencia de la región 3’ no traducible (Lund, 1994). Este gen está regulado

por dos promotores, y como consecuencia de diferentes empalmes alternativos y de

quien lidera la transcripción, se generan dos tránscritos de IGF-I: ARNmde IGF-Ia

(carece de la secuencia del exón 5 que codifica para el péptido E) y ARNmde IGF-Ib

(contiene las 52 bases del exón 5 que codifican para el péptido E) (Hall, 1992).

El gen de IGF-II consta de 9 exones y excepto los exones 7, 8 y parte del 9,

que codifican para el péptido maduro, son exones no traducidos. Este gen está

controlado por cuatro promotores y, como consecuencia de la activación diferencial

de esos promotores y de los diferentes emplames alternativos se generan tres

tránscritos de IGF-JI.

1.2.1.2. Síntesis y transporte.

La expresión de los genes de los IGFs es muy ubicua, se ha detectado su

ARNm en diversostejidos como: hígado,pulmón, hipófisis, bazo, riñón, corazón,

músculo esquelético, ovario, útero, testiculo, cerebro, glándula mamaria y otros

(ilalí, 1992 y Lund, 1994), en medioscondicionadosde muchascélulas (ilumbel,

1990) y en la sangre. También se ha descrito la presencia de IGF-I y II o ambos en

otros líquidos corporales como orina, linfa, líquido cefalorraquideo, semen, saliva,

leche o líquido folicular. No obstante, el mayor productor de IGEs es el hígado, que

28

introducción

secreta más del 90% del IGF total circulante (Móller, 1991).

Los IGFs, a diferencia de la insulina, circulan por la sangre unidos,

prácticamente en su totalidad,aunasproteínastransportadorasespecíficas(IGFBPs)

formando dos complejos de unos 150 y 5OkDa,aproximadamente. Estas proteínas se

encuentran presentes también en el espacio extracelular y pueden controlar la

distribución tisular o celular de los IGFs, modificando su acción y su

biodisponibilidad; también pueden participar en la unión de los IGFs a su receptor.

1.2.2. Acciones biológicas de los IGFs.

1.2.2.1. Iii vitro.

Los efectos de los IGFs ¡it vitro pueden ser a corto plazo, como las acciones

metabólicas sobre las proteínas y carbohidratos, o a largo plazo, como las acciones

sobre el crecimiento y la diferenciación celular.

1. Efectos sobre la progresión del ciclo celular: El IGF-I funciona como un

factor de progresión del ciclo celular junto con los factores competentes que lo inician

y capacitan a las células para respondera los factoresdeprogresión.

Se ha visto que células quiescentes en G0 pueden ser inducidas a entrar en G1

por los llamados factores competentes (PDGFy FGF); sin embargo,el tratamiento

de estas células con dichos factores de competencia y otros de progresión como el

IGF-I, permite el avance hacia G1 y la continuación del ciclo celular, produciéndose

la síntesis de ADNy la proliferación celular (Jones, 1995).

2. Efectos sobre la vroliferación ce]u]ar: Los IGFs poseenuna actividad

mitogénica sobre una gran variedad de células (fibroblastos, condrocitos,

osteoblastos, células foliculares tiroideas, células neuronales, adipocitos, líneas

tumorales...) de ahí queparticipen en el crecimiento del embrión, feto y neonato, en

fenómenos de hipertrofia fisiológica o compensadora de ciertos órganos, en

reparación de heridas en nervio músculo y células endoteliales (ilunziker, 1994;

McCarthy, 1994).

3. Efectos sobre la muerte celular: Los IGFs poseen la capacidad de inhibir

la muerte celular por apotosis en ciertas células (hematopoyéticasy células de

carcinoma humano de pecho MCF-7); sin embargo, morfológicamente las células

mueren por necrosis más que por apoptosis, y en esos casos, los IGFs no han

demostrado aumentar la supervivencia celular de otros tumores (MDA-23 1, HEP-2

y KB).

29

Introducción

4. Efectos sobre la diferenciación celular: Los JGFs estimulan la

diferenciación de los mioblastos, osteoblastos, adipocitos y oligodendrocitos

(Hunziker, 1994; McCarthy, 1994); además,intervienenen la maduraciónde la

funcióntesticulary ovárica,inducenla eritropoyesis,estimulanel crecimientode las

neuritasy estánimplicadosen la sinaptogénesis.

5. Efectossobrela funcióncelular: Los IGFs regulanla secreciónhormonal

de un numerosotipo de células.

IGF-I y II estimulanla síntesisy secreciónhormonalde las células ováricas

y muestranefectossinérgicosen combinacióncon FSH y estrógeno,aumentanel

númerode receptoresde ACTH y en cultivos de célulassomatotropasde pituitaria,

inhiben la secreciónde Gil (Melmed, 1986). Tambiénposeenimportantesefectos

sobreel sistemainmune: potencianla función citotóxica de las células T (Clark,

1997).

1.2.2.2. lía vivo.

La administraciónde IGFs provocauna seriede efectosmetabólicosa corto

plazoy, crecimientoa largo plazo.

1. Efectosde la administraciónde IGFs en animales: En ratasneonatales,la

infusión de IGF-I provoca hipoglucemia por la estimulaciónde la captaciónde

glucosaen la periferia pero sin afectara su producciónhepática,y no altera la

concentraciónde los ácidos grasoslibres al contrario que la insulina. Recuperala

función renal y aumentalas proteínascorporalestotales y, a pesar de que no

incrementael pesode la carcasa,si aumentael del bazo, riñón, timo e intestino

(Gargosky,1994).

A nivel hormonal, la administraciónde IGF-I disminuye los nivelesde Gil,

pero aumenta el de catecolaminas (Glasscock, 1992).

Los efectos de las altas concentraciones de IGF-II no alteran el peso corporal

ni la longitud de los animales control, aunque la concentración sérica de IGF-I

disminuye (Glasscock, 1992>. Por el contrario, en las ratas hipofisectomizadas,

aumentasu pesoy longitud a la vez que desciendela urea en el suero(ilumbel,

1990).

2. Efectosde la administraciónde IGF-I enhumanos:Serecogenen la Tabla

1:

30

Introducción

Tabla 1.- Efectos de la administraciónde IGF-I iii vivoen humanos.

FUNCION

Metabolismode la glucosa

Metabolismolipídico

Anabolismoproteico

Punciónrenal

Hormonascontrarregulatorias

Crecimientolineal

Miscelánea

EFECTODEL IGF-I

captación de glucosa

producciónhepáticadeglucosa(humanos)

sensibilidadaparentea la insulina

Hipoglucemia(especialmentecon administracióniv)

cetonasséricas

4 ácidosgrasoslibres séricos(humanos)

4 triglicéridos

1 síntesisproteica

4 excreciónde nitrógeno

proteínascorporalestotales

pesocorporal/órgano,especialmentedetimo, riñón,bazo

e intestino

Mejorala cicatrización

1 velocidadde filtración glomerular

flujo plasmáticorenal

velocidad de recuperaciónde un fallo renal agudo

isquémico

4 GH

4 Glucagón

1 Catecolaminas

en hipopituarismoy sujetosinsensiblesa GH

Taquicardia,edemaperiférico, aumentode las parótidas

y pérdidade sensibilidad

(Jones,1995)

1.2.2.3.Accionesautocrinas,paracrinasy endocrinas.

Aunque el hígado es la principal fuente de RiUs, muchosórganosexpresan

estos factores (Hall, 1992; Lund, 1994). La ubicuidad de los IGFs sugiereunas

accionesautocrinas/paracrinasque puedensermuy relevantesparala diferenciación

y proliferación celular.

La importancia de estos efectos locales es más evidente en aquellos órganos

y tejidos con mayor expresión y concentración de IGFs como el hígado, riñón,

testiculo, células de la granulosa y sistema nervioso central, mientras que las acciones

endocrinas participarían en el crecimiento corporal global integrado (Daughaday,

31

Introducción

1989). No obstante, la importancia relativa de cada modode acciónvaríade un tejido

a otro y con la etapa de desarrollo.

En la etapafetal, seha sugeridoun papelpredominantede las accionesauto

y paracrinassobrelas endocrinas(Daughaday,1989).En el feto, los genesde IGF-I

y II se expresanen muchostejidos, pero sus niveles circulantesson bajos (Lund

1986). Porotro lado, en la etapapostnatal,existela posibilidadde una interacción

entrelas accionesauto/paracrinasy endocrinasde IGF-I, ya que tras el nacimiento

aumentanprogresivamentelos nivelesde IGF-I a la vezqueel númerode receptores

hepáticos de GH, mientras la expresión del gen de IGF-I se reduce (Rotwein, 1993).

1.3. PROTEINASTRANSPORTADORASDE IGFs (IGFRPs).

1.3.1. Estructura, síntesis y regulación.

1.3.1.1. Estructura.

Los IGFs circulan por el plasma unidos a una familia de proteínas

transportadorasrelacionadasestructuralmente,las IGFBPs. Se han donado y

secuenciadosiete polipéptidos (IGFBP-1 a 7), pero sólo se han estudiadoseis

(IGFBP-1 a 6), y 4 de ellos (IGFBP-1 a 4) seencuentranen el sueroen cantidades

importantes(Rechíer, 1998). Se trata de unas proteínas de un tamaño similar (201 a

289 aminoácidos)y de un pesomolecularentre21.5 y 31.4kDa.

La analogíamás destacadarespectoa la estructurade estos péptidoses la

conservaciónde 18 residuosde cisteinatantoen el extremocarboxicomoen el amino

terminal. Además, en el extremo C-terminal de todas las IGFBPs existe una secuencia

conservada arg-gly-asp que parece ser la secuencia mínima requerida en muchas

proteínas de matriz extracelular para unirse a receptores de membrana (Rosenfeld,

1990).

A pesar de estos aspectossimilares,hay variasdiferenciasentrelas secuencias

de aminoácidos de las IGFBPs, como el hecho de que las secuencias espaciadoras

existentes entre los residuos de las cisteinas no estánbienconservadas,la variabilidad

en la secuencia del péptido señal o la diferente glicosilación de las IGFBPs.

1.3.1.2. Síntesis.

Las IGFBPs son producidas por una gran variedad de tejidos y se encuentran

en varios fluidos biológicos.

En el suero, las IGFBPs circulan en forma de dos complejos, uno de 150-

32

Introducción

200kDa que contiene en cantidades equimolares la IGFBP-3 (GH dependiente) y una

proteína (subunidad ácido-lábil, ALS), y el complejo de 3OkDa que contieneotras

formas de IGFBPs (IGFBP-1 y 2).

Se han hallado también diversasformas de IGFBPsen numerososlfquidos

corporales: linfa, leche, liquido cefalorraquideo, líquido amniótico, plasma seminal,

líquido folicular, humor acuoso y vítreo, orina, así como en el medio condicionado

de numerosos cultivos celulares (Rosenfeld, 1990; Rajaram, 1997). En la leche

humana, por ejemplo, se han encontrado IGFBP-1, 2 y 3, mientras que en la de rata

también está presente la IGFBP-4; no obstante, en ambos casos, la proteína

predominante, como en el suero,es la IGFBP-3. En el fluido cerebroespinal,sin

embargo, la forma predominante es IGFBP-2, al igual queen la linfa, e IGFBP-1 es

la proteína mayoritaria en el líquido amniótico.

Las IGFBPs también se sintetizan en múltiples órganos y tejidos (Straus,

1991; Babajko, 1993; Gosteli-Peter, 1994); IGFBP-1 se expresaen hígado,placenta

o endometrio; IGFBP-2 abunda en hígado, riñón, intestino y pulmón, pero donde

mantiene unos niveles altos es en el cerebro (plexos coroideos). IGFBP-3, por su

parte, se expresa en hígado, placenta y riñón, mientras que el ARNmde IGFBP-4

se encuentra de manera abundante en hígado y los de IGFBP-5 y 6, en riñón y

pulmón, respectivamente.

1.3.1.3. Regulación.

1.3.1.3.1.Variaciones diurnas.

Los valores plasmáticos de IGFBP- 1 estánsujetosa variaciones diurnas que

se relacionan con los niveles de insulina; las cifras circulantes de esta proteína

transportadora son muy bajas por la tarde y a media noche, y muy altas por la

mañana; además, parece ser que este aumento coincide con un incremento en los

niveles de IGF-I (Holly, 1988).

IGFBP-2 y 3 son más estables y no muestran variaciones diurnas ni están

sujetas a cambios postprandiales.

1.3.1.3.2. Nutrición.

El efecto de la restricción proteico-calórica altera los niveles séricos y de

expresión de las IGFBPs, incluso en los fetos de madres ayunadas (Straus, 1991). En

las ratas neonatales, la malnutrición aumenta la expresión de IGFBP-1 y 2 en hígado,

aunque la realimentación reduce los niveles del ARNmde ambas proteínas a los

33

Introducción

valores control. La expresión hepática de IGFBP-3 disminuye ligeramentecon la

malnutrición, y la realimentación eleva sus niveles por encima de los control (Rivero,

1995; Goya, 1996).

1.3.1.3.3. Ejercicio.

En el hombre adulto, el ejercicio se acompaña de un aumento en los niveles

circulantesde IGFBP-1 y 3 y un descensoen los niveles de insulina e IGF-I

(Rajaram,1997).

1.3.1.3.4.Ontogenia.Durante el periodo fetal, IGFBP-1 y 2 son las proteínas transportadoras

predominantes en el hombre y la rata, se conservan altos niveles durante el periodo

neonatal, disminuyendo progresivamente a la vez que empieza apredominarIGFBP-3

que es la abundante en adulto (Babajko 1993).

En la pubertad, IGFBP-3 alcanza un pico, y disminuye durante el periodo

adulto. Por el contrario, IGFBP-1 y 2 muestran unos niveles altos en el nacimiento

y la senescencia y bajos durante la pubertad (Rosenfeld, 1990).

1.3.1.3.5.Hormonas.

El nivel de influencia de las hormonas sobre los valores de las IGFBPs

depende de: la magnitud de cambio en la producción de la correspondienteproteína

transportadoraen el/los tejido/s diana/sy de la contribuciónde ese/esostejido/s en

la secreciónde la proteínatransportadoray, además,las hormonaspuedenafectara

los nivelesséricosde unao másproteínastransportadoras.La insulina, porejemplo,

pareceser la principal reguladorade la producciónhepáticade IGFBP-1, mientras

que la GH parecealterar los nivelescirculantesde IGFBP-3 (aumentalos niveles

séricosde IGFBP-3e inducelaproducciónde ALS), al igual que los glucocorticoides

(disminuyen los niveles de IGFBP-1 y 2, pero aumentanlos de IGFBR3) (Luo,

1990). Las hormonastambiénregulanla expresiónde las proteínastransportadoras

por uno o múltiples mecanismos.

1.3.2. Tipos de IGFRPsy accionesbiológicas.

Los IGFs no sólo estánpresentesen la circulación,sino tambiénen el espacio

extracelular unidos a las IGFBPs (Baxter, 1993; Jones,1995; Rechíer, 1998). Las

IGFBPs ligan IGF-I e IGF-II, pero no insulina y así pueden controlar su distribución

tisular o celular, participar en su unión a sus receptores o regular su acción por la

degradación de estas IGFBPs por parte de unas proteasas (Fowlkes, 1997).

34

Introducción

1.3.2.1.Tipos de IGFBPs.

1. IGFBP-1: Es una proteína de 25kDa que se sintetiza de manera

predominanteenel hígado.Presentaunaforma desfosforilada,conbajaafinidadpor

IGF-I, que se cree que potencia la acción de IGF-I, y otra fosforilada,que inhibe las

acciones mitogénicas de este factor de crecimiento.Además,IGFBP-1 secomporta

como inhibidor de IGF-I cuando este factor se presenta en altas concentraciones, pero

actúa como estimulador si está presente en el mediode cultivojunto conbajosniveles

de plasma pobreen plaquetas(Jones,1995; Rechíer, 1998).

Las principales señales reguladoras de la IGFBP-1 son metabólicas; diversos

estudios han demostrado que la combinación insulina/glucosa es el mayor

determinante de sus niveles. Las concentracionescirculantesde IGFBP-1 están

elevadas en el ayuno, la malnutrición y la diabetes mellitus de ambos tipos (Cotterill,

1988; Suikkari, 1988; Yeoh, 1988; Straus, 1994; Rivero, 1995; Goya, 1996). Por el

contrario, la realimentación o la ingesta de carbohidratos y la infusión de insulina

durante el “clamp” de glucemia en pacientes de diabetes tipo II o el tratamiento de

las ratas diabéticas con insulina se acompaña de un rápido descenso de los niveles de

IGFBP-1 (Cotterill, 1988; Suikkari, 1988; Yeoh, 1988; Lewitt, 1994; Goya, 1996).

Este patrón de regulación es similar al de las hormonas contrarreguladorasde la

insulina, como el glucagón, lo que ha hecho que se sugiera que la IGFBP-1 podría

desempeñar un papel contrarregulador en el mantenimiento de la homeostasis

glucídica (Lewitt, 1991; Baxter, 1995). Además,en el suero humano, IGFBP-1

muestra, a diferencia del resto de las proteínastransportadorasbien caracterizadas,

un ritmo circadiano marcado que no depende del estatus secretor de Gil, sino que

está regulado por el metabolismo, probablemente por la secreciónde insulina(ilolly,

1988).

En la rata, se ha descrito una regulación similar en ciertos estados catabólicos

como la malnutrición y la diabetes; en ambas situaciones, los niveles de insulina y

Gil son bajos, pero se produce un incremento en los niveles hepáticos del ARNmde

IGFBP-1, lo que sugiere que, al menos durante la etapa neonatal en que la Gil no

ha establecido totalmente sus conexiones neuroendocrinas,es la insulinemia la

responsable del aumento en los tránscritos de IGFBP-1 (Rivero, 1995; Goya, 1996).

2. IGFBP-2: Esta proteína de bajo peso molecular (31-36kDa) ha sido menos

estudiada que la IGFBP-1. Su acción predominante es la inhibición de la acción de

35

Introducción

IGF-I e RIF-II, aunqueen ciertos tipos de células puedecomportarsecomo un

estimulador débil de la acción del IGF-I (Baxter, 1993; Jones, 1995; Rechler, 1998).

A pesar de que los niveles circulantes de IGFBP-2 son menos sensibles a los

cambios metabólicos agudos que IGFBP-1, se ha descrito una regulación por el

estadonutricional.En situacionesde malnutrición,en la rata,seproduceunaumento

tantoa nivel séricocomo de expresióndel ARNm hepáticode estaproteína(Straus,

1994; Rivero, 1995>; por el contrario, la realimentacióny el tratamientode los

animales diabéticos con insulina se acompaña de un descenso en las concentraciones

circulantes y los niveles de ARNmhepático de IGFBP-2 (Goya 1996), lo que ha

llevado a sugerir a ciertos autoresun importantepapel en la regulación de esta

proteína por parte de los nutrientes (Thissen, 1994).

3. IGFBP-3: Es la proteína transportadora predominante en el suero de rata

adulta y su peso molecular oscila entre 38 y 43kDa dependiendo del número de sitios

glicosilados. En la circulación, la IGFBP-3 se asocia con una proteína de 8OkDa

llamada ALS (“acid-labile subunit) y una molécula de IGF para formar un complejo

de l5OkDa. Este complejo consta de IGFBP-3 e IGF-I y II en una proporción

equimolecular, lo que sugiere que la mayor parte de esta proteína transportadora está

saturada en el suero (Rajaram, 1997).

La expresión tisular de IGFBP-3 es muy ubicua; los tejidos con mayor

abundancia de esta proteína transportadora son hígado, riñón, placenta, útero, ovario,

testículo, bazo, páncreas, estómago y corazón (Rajaram, 1997).

Existen evidencias que demuestran que IGFBP-3 puede potenciar e inhibir las

acciones de IGF-I iii vitro, indicando que esta proteína transportadora puede ser un

importante modulador de las acciones de IGF-I in vivo (Gargosky, 1994). La

presenciade IGFBP-3 en suero puede tener también un papel muy importante

aumentando la vida media de los IGFs, sin olvidar que esta proteína transportadora

está sujeta a una regulación por la acción de ciertas proteasas (Fowlkes, 1997).

El principal regulador hormonal de IGFBP-3, y por consiguiente del complejo

ternario, es la Gil. Se ha observado que los nivelescirculantesy de expresión

hepática de esta proteína transportadora son dependientesde GH, dado que ambos

valores se reducen tras la hipofisectomía de las ratas y aumentan despuésdel

tratamiento con Gil (Glasscock, 1991; Gargosky, 1994; Gosteli-Peter, 1994>. No

obstante, estudios más recientes han mostrado que el tratamiento con insulina de ratas

36

Introducción

deficientes en GH puede aumentar los niveles circulantes de esta proteína

transportadora(Butíer, 1996). Además,seha observadoque el ayunoprolongado,

la subnutrición y la diabetes provocada en la rata por la administración de STZ

causan una reducción de los valores séricos de IGFBP-3 (Rivero, 1995).

4. IGFBP-4: Es una proteína no glicosiladade 25kDay 32-36kDaque fue

aislada por primera vez en células de osteosarcoma, aunque está presente en otras

líneas celulares dondese han descritodistintas isoformas(Rajaram,1997). Se trata

de una proteína fundamentalmente inhibidora de las acciones de los IGFs, lo que

protege a las células de una sobrestimulación por parte de los factores de crecimento,

o permite una activación de rutas de señales transmembrana alternativas que son

inhibidas por la exposición a los IGFs (Rechíer, 1998).

5. IGFBP-5: Esta proteína se purificó primero a partir de suerode rataadulta,

y presenta la capacidad de unirse a la matriz extracelular. Su principal acción es

potenciarel efecto de los IGFS (Jones,1995).

6. IGFBP-6: Se expresaen múltiplestejidosy en suero,y su principal acción

es la inhibición de los efectos del IGE-Il.

1.3.2.2. Acciones biológicas.

Las IGFBPs parecen modular las acciones de los IGFs, dado que regulan su

disponibilidad en los tejidos diana. En este sentido, los niveles séricos de las

proteínastransportadoraspuedenjugar un importantepapel regulandolas acciones

endocrinas de los IGFs.

1. Modular las acciones de los IGFs: La actividad de los IGEs es neutralizada

como consecuencia de su unión a las IGFBPs, de ahí que se diga que estas proteínas

transportadorasposeenuna función puramenteinhibidora (Jones, 1995; Rechíer,

1998). No obstante la ausenciade las IGFBPsaumentaríael efecto de los IGFs y

desequilibraría la homeostasis glucídica, puesto que los IGFs no parecen estar

controlados por la glucemia. Sin embargo, se han descrito varios mecanismos capaces

de liberar a los IGEs de sus proteínastransportadoras,principalmentemedianteel

descenso de la afinidad de los factores de crecimiento por sus IGFBPs. Este

mecanismo incluye la unión de las IGFBPs a moléculas de la matriz extracelular

(Rajaram, 1997>, fosforilación de las proteínastransportadoras(Coverley, 1995) y

degradación proteolítica de las IGFBPs (Fowlkes, 1997).

2. Aumentar la semivida de los IGFs: Las IGFBPs pueden facilitar las

37

Introducción

acciones endocrinas de los IGEs por el aumento de su vida mediaen la circulación.

Esta estabilización de los IGFs dependefundamentalmentede la IGFBP-3, y aunque

otras proteínas transportadoras, como IGFBP-1 y 2 también participan sobre todo en

periodosinmaduros,desempeñanunpapelmenorporquepresentanunasvidasmedias

más cortas que la proteína transportadora de alto peso molecular (Rosenfeld 1990).

Así pues, la IGFBP-3 es la proteína que alterala relaciónde IGFs libres y ligados,

lo que indirectamente prolonga la semivida de estos factores de crecimiento o los

protege de su rápida degradación, y por tanto, a la vez, regula sus acciones

metabólicas.

3. Controlar el transporte de los IGFs desde el espacio vascular: Para obtener

la respuesta que estimula el crecimientoporpartede los IGFs, se necesitaque estos

factores séricos sean transportados desde los vasos al líquido extracelular, y para ello,

se requiere que las IGFBPs que llevan unidos a ellas IGFs, sean degradadas o

puedan cruzar la barrera endotelial.

La mayor parte de los IGFs circula unida al complejo de l5OkDa (ALS-

IGFBP-3-IGF) lo que hace que sea considerado como un reservorio de IGFs y cobre

gran importancia en el transporte de los factores de crecimiento fuera del

compartimento vascular (Rajaram, 1997). Así pues, para que esta salida se produzca,

y dado que el complejo no es capaz de atravesar el endotelio vascular, se necesita la

presencia de unas proteínas capaces de reducir la afinidad de la IGFBP-3 por los

IGFs (Fowlkes, 1997), o también se ha apuntado hacia una reducción en la afinidad

para la fonnación del complejo por la unión a esta proteína transportadora de alto

peso molecular de glucosaminoglucanos presentes en la superficie de las células

endoteliales (Jones, 1995).

El porcentaje de IGEs que no circulan unidos a la IGFBP-3 lo hacen unidos

a la fracción de 3OkDa que sí atraviesala barreracapilar, porello la abundancia de

estas proteínas en periodos inmaduros parece estar dirigida a facilitar el paso del

endotelio a los IGFs en momentos de desarrollo.

1.4. FACTORES ENDOCRINOS QUE REGULAN EL DESARROLLO:

HORMONAS TIROIDEAS E IGFs, SU INTERACCION.

Los niveles circulantes de los IGFs, como hemos venido viendo, están

influenciados por multitud de factores,entre los que se incluyen Gil, edad, nutrición,

38

Introducáón

sepsis, hormonas tiroideas y esteroides (Daughday, 1989; Sara, 1990), y están muy

implicados regulando el desarrollo en etapas inmaduras de los mamíferos. La

importanciade las hormonas tiroideas sobre el SNCes sobradamenteconociday ha

sido ya someramenteexpuesta.Por ello, el estudiode la interacciónde estosfactores

endocrinos con las hormonas tiroideas tiene una gran relevancia en estudios

perinatales.

1.4.1. Interacción entre las hormonas tiroideas y el axis IGFs/IGFJIPs.

En el hombre, el hipotiroidismo disminuye los niveles circulantes de IGF-I,

y tambiénsu actividadbiológica (Chernausek,1983; Cavaliere,1987; Mielí, 1993).

En la rata, este descenso del IGF-I aparece asociado a una disminución de la

expresión hepática del gen de este factor de crecimiento (Burstein, 1979; Gallo,

1991). Por el contrario, los pacienteshipertiroideosmuestranunosvalorescirculantes

de IGF-I altos o normales junto con una baja actividad biológica (Westermark, 1988;

Mielí, 1993). Sin embargo, estudios más recientes con ratas han demostrado que el

hipertiroidismono altera los nivelesséricostotalesde IGF-I, pero si disminuyesus

valores libres (Frystyk, 1995).

Entre el periodo adulto y el neonatalexistendiferenciasfundamentalesen

cuanto a la regulación del axis IGFs/IGFBPs. Se ha establecido que, en periodos

fetales, la secreción de IGFs en hígado es independiente de Gil, y en la etapa

neonatal de la rata, esta secreción parece regida también por un equilibrio

insulina/nutrientes de forma independiente de Gil (Rivero, 1995; Goya, 1996)

finalmente, en periodo adulto, aunque es indudable que la hormona de crecimiento

es el regulador principal (Straus, 1994; Thissen 1994), el equilibrio insulina/

nutrientestambiénparecejugarun papel(Goya,1996; Goya,en prensaenLife Sci.).

En este contexto, las acciones de las hormonas tiroideas sobre la secreción de los

IGFs estarán,sin duda en adulto, mediadaspor la Gil, ya que esconocidoque las

hormonas tiroideas son necesarias para la expresión normal de la Gil in vitro

(Shapiro, 1978; Geary, 1989; Ezzats, 1991; Ceda,1992) e in vivo (Hervás, 1975;

Samuels, 1989). Todo ello sugiere “a priori” que las hormonas tiroideas van a incidir

sobre la secreción de los IGFs de forma distinta en periodos inmaduros y en periodo

adulto segúnla secreciónde IGFs seamáso menosdependientede Gil (Glasscock,

1990; Glasscock, 1991; Kim, 1993). En cualquier caso, no se puede excluir un efecto

directo de las hormonas tiroideas sobre la secreción del IGF-I e independiente de Gil,

39

Introducción

puesto que la ‘[3 es capaz de incrementar la secreción de este factor de crecimiento

enhígadode rataperfundido(Ikeda, 1989); así pues,las accionesde las hormonas

tiroideas sobre la regulación del axis IGFs/IGFBPs presenta muchas lagunas de

conocimiento.

De igual forma se ha descrito que los desórdenes tiroideos son capaces de

inducircambiosen los nivelesde las IGFBPs.Se ha demostrado que, en el hombre,

el hipotiroidismo disminuye los nivelesde IGFBP-l y 3, y aumenta los de IGFBP-2

(Mielí, 1993; Mielí, 1994), mientras que la tirotoxicosis incrementalos niveles

circulantes de IGFBP-1 y 3 (Mielí, 1993).

Sehaestablecido que el efecto de las hormonas tiroideas sobre los IGFs y sus

proteínas transportadoras depende del estado de desarrollo en la rata (Nanto-Salonen,

1992).Duranteel periodoperinatal,las ratashipotiroideasmostraronun aumentoen

los niveles séricos y de su ARNmhepático para la IGFBP-2 que se normalizó por el

reemplazamientotemprano con hormona tiroidea (Nanto-Salonen,1991; Nanto-

Salonen,1992).

En las ratashipotiroideasadultas,los bajos nivelescirculantesde IGFBP-3 e

IGFBP-4 se asociaron a un descenso del ARNmde IGFBP-3 y a un aumento

paradójico del ARNmde IGFBP-4 (Nanto-Salonen, 1992). Este descenso en la

expresión hepática de IGFBP-3 de las ratas hipotiroideas se ha confirmado en otros

estudios en los que además se encontró un aumento en la abundancia del ARNmde

IGFBP-1 y 2 (Rodríguez-Arnao,1993a;Rodríguez-Arnao,1994).

El tratamiento de las ratas hipotiroideascon Gil normalizó los niveles de

IGFBP-3 sin afectara la expresiónde IGFBP-2e IGFBP-4 (Nanto-Salonen,1993),

lo que sugiere,de nuevo,que estosefectosde las hormonastiroideassobrelos genes

se producenpor mecanismosindependientesy que algunasvecessonmediadospor

la Gil.

Recientemente,se ha mostradoque las ratashipertiroideasincrementanlos

niveles séricos de IGFBP-1 e IGFBP-4 (Frystyk, 1995). Finalmente,no sepuede

excluir una acción directa de las hormonas tiroideas sobre las JGFBPs. Se ha visto

que la ‘[3 estimula, a nivel transcripcional, la formación de IGFBP- 1, 2 y 3 (Ceda,

1992; Schmid, 1992; Angervo, 1993a). Además, se ha demostrado en cultivos de

hepatocitos de ratas adultas que la T3 induce un efecto directo positivo sobre la

expresión de IGFBP-4 y, como consecuencia, sobre la actvidad de los IGFs (Demori,

40

Introducción

1997).

La importancia de las hormonas tiroideas durante el desarrollo es conocida,

y dada la implicación del axis IGFs/IGFBPs en la proliferación y diferenciación

celular,el estudiode la interacciónentreestashormonasy dichosfactoresposeeuna

importancia relevante en la regulación endocrina del desarrollo; sin embargo, como

se ha expuesto, dicha interrelación muestra numerosos aspectos desconocidos.

1.5. TRANSPORTADORESDEGLUCOSA(GLUTs).

La glucosa es la principal fuente de energíametabólicapara las células. El

carácter hidrofilico de esta moléculaimplica la necesidadde que existanproteínas

transportadoras, para que atraviese la bicapa lipídica, que constituyen los sistemas de

membrana. En el túbulo proximal del riñón y el lumen intestinal, la captación de

glucosa es activa porque se mueve en contra de gradiente, por lo que el proceso se

lleva a cabo mediante un cotransportador Na~/glucosa. En los restantes tejidos, el

transporte serealizapordifusión facilitada,y en esteprocesointervieneunafamila

de proteínas estructuralmente relacionadas llamadas GLUTs.

1.5.1. Estructura, función y expresión tisular.

En la actualidad, se han identificado seis isoformas de GLUT producto de

diferentes genes. Sus pautas de expresión son también distintas, tanto en lo que se

refiere al tejido en dondese encuentrancomo a su concentración.

Todos los transportadoresde glucosa tienen un tamaño similar (492-524

aminoácidos)y suestructuraaparecebastanteconservadaentrelas distinasisoformas

y entrediferentesespecies,si bien las regionesmásdivergentescorrespondena sus

extremosC y N (Gould, 1990>.Se trata de proteínasmuy hidrófilas; casi la mitad

de su secuenciaestá inmersa en la bicapalipídica, y allí forman 12 dominios

transmembranososconectadospor bucleshidrofílicos por fuera y por dentro de la

célula. Los extremosC y N soncitoplasmáticos.

- GLUT-1: Se expresaen mayor medida en los tejidos fetales (menos en

adultos), placenta y cerebro; en este último, facilita el paso de la glucosa a través de

la barrera hematoencefálica.También es la isoforma predominante en céiulas

cultivadas y en muchos tumores dado que prácticamente todos los mitógenos

estimulansu expresión(Hiraki, 1988). A pesarde queen algunode ellos lo estáen

cantidadmínima, el GLUT-1 se encuentracasi en todos los tejidos, por lo que se

41

Introducción

considera el responsable de la captaciónconstitutivade glucosa.

- GLU’[-2: La expresión de este transportador es más restringida: hígado

(media la captación y liberación por el hepatocito), membranas basolateralesdel

intestino delgado y riñón (participa en el transporte transepitelial de glucosa) y células

/3 (participa en la secreción de insulina inducida por glucosa).

- GLU’[-3: Su mayor expresión se produce en el tejido nervioso, y

concretamente en el cerebro, esto es, en células con un alto requerimiento de glucosa.

Se cree que este transportador es el que media el paso de esta hexosa a las neuronas

(Maher, 1993). Se encuentra también, pero en cantidades menores, en placenta,

hígado, riñón y corazón,pero no enmúsculoesquelético.La ubicuidad del GLUT-3

ha sugeridoque, junto con el GLUT-1, participeen el transporteconstitutivode la

glucosa.

- GLU’[-4: Su localización tisular es muy restringida, se encuentraen los

tejidosadipososblanco y marrón, músculo cardíaco, diafragma y músculo esquelético

(tejidos sensiblesa la insulina).

Se trata de un transportador insulino-sensible; el GLUT-4 se localiza en

vesículasintracelularesen situaciónbasal,pero la presenciade insulina provocasu

translocacióna la membranaplasmática(Barnard, 1992; Stephens,1995).

- GLUT-5: Es la isoforma más diferente en cuanto al grado de homología

(Gould, 1990) y presenta mayor afinidad por la fructosa que por la glucosa,por lo

que se cree que es el transportadorde la cetohexosade la dieta. Se expresa

mayoritariamenteen la membranaapical de los enterocitosdel yeyuno, aunque

tambiénsedetectaen los tejidos insulino-sensiblesmencionadosanteriormente,tejido

adiposoy cerebro.

- GLUT-6: No existe como proteínafuncional. Su pseudogenorigina un

tránscritohomólogoal del GLU’[-3, de expresiónubicua,peroconmúltiplescodones

stop y desplazamientosde la pautade lectura(Gould, 1993).

- GLUT-7: Este transportadorfacilita el paso de la glucosa-6-fosfato,

procedentede la glucogenolisisy la gluconeogénesis,desdeel citoplasmaal retículo

endoplásmatico.Selocalizaespecíficamenteen el retículodel hígadoy poseemuchas

concordanciascon la estructuradel GLUT-2.

1.5.2. Efecto del estadotiroideo sobrelos transportadoresde glucosa.

La expresión de los GLUTs, que se produce de manera específica en los

42

Introducción

tejidos, puede ser alterada por multitud de factores, y entre ellos se incluyen glucosa,

insulina, hormonas tiroideas,factoresde crecimientoy edad(Burant, 1991).

Las hormonas tiroideas aumentan la actividad metabólica tisular. Las ratas

tratadas con ‘[3 y ‘[4, en músculo y tejido adiposo, aumentan el metabolismo de la

glucosa, la velocidad de su captación y su transporte basal, debido al menos en parte,

al incremento del contenido de GLU’[-4, tanto en la membrana plasmática como en

fraccionesinternas,y tambiénse incrementala expresióndel transportador(Casia,

1990; Weinstein, 1991). No obstante,esteaumentode la velocidadde transporteen

el hipertiroidismo no sólo se asocia con un aumento en el número de transportadores

GLU’[-4, sino tambiéncon un aumentode su actividad funcional, al menosen los

adipocitos (Matthaei, 1995). Estos aspectosse han corroboradotambién in vitro:

célulasderivadasde hígado de rata ARLíS (Weinstein, 1990), en cardiomiocitos

(Gosteli-Peter,1996) y célulasClone 9, que sólo expresanGLUT-1 (Shetty, 1996).

El hipotiroidismo neonatal experimental,por el contrario, disminuye la

expresión de GLUT-4, así como de GLUT-1 tanto en el músculo esquelético como

en el adipocito (Weinstein, 1991; Matthaei, 1995). El hipotiroidismo, a pesardel

marcado descenso del contenido de GLU’[-1 y 4, no disminuye el transponede

glucosa estimulado por la insulina al menosen el adipocito(Matthaei, 1995), lo que

implicaría un aumento en la actividad funcional de los transportadores de glucosa.

En contra de las observacionesprevias en el músculo esquelético, el

hipotiroidismo aumenta la expresión y el contenido cardiaco de GLUT-1, y disminuye

el ARNmde GLUT-4, aunque mantiene los niveles en la membrana de esta proteína

transportadora. La administración de ‘[3 suprime el aumento de GLU’[-1, incrementa

la expresión de GLUT-4 y mantiene su contenido en los extractos membranosos

(Weinstein, 1992).

La expresión de los transportadores de glucosa se encuentra reguladapor la

edad. Durante la etapa fetal y al principio de la postnatal, el GLU’[-1 es la isoforma

predominantey se expresaen músculo,tejido adiposomarróny corazón(Santalucía,

1992; Postic, 1994). Después,en la vida postnatal,se produce una represióndel

GLU’[-1 en músculo y tejido adiposo marrón, que es concomitante con un aumento

en la expresión del GLUT-4 (Santalucía, 1992; Postic, 1994). Esta represión del

GLU’[- 1 y la inducción del GLUT-4 pueden estar mediadas por diferentes

mecanismos,entreellos, las hormonastiroideas. Se ha visto que el hipotiroidismo

43

Introducción

altera la transiciónnormal de GLUT-1 a GLU’[-4 desde los niveles fetales a los

neonatales en corazón y tejido adiposo marrón (Castelló,1994).Esteefectosepodría

producir de una manera directa puestoque seha descritola existenciadeunelemento

de regulación positiva en el gen de GLU’[-4 capaz de responder a las hormonas

tiroideas(‘[orrance, 1997b),resultadoquepodríaexplicarlos obtenidosin vivo, antes

mencionados.

El hígado juega un papel central en la regulación de la homeostasis glucídica

y tiene capacidad para almacenar glucógeno y para liberar glucosa a la circulacion.

El hígado es también el principal sitio gluconeogenético y el único tejido en que la

concentración intracelular de glucosa puede exceder a la de la circulación. La

isoformatransportadorade glucosapredominanteen el hígadoes el GLU’[-2, como

hemosvisto, y es la encargadade captary liberar la glucosa. La alteraciónde la

expresiónde estetransportadorde glucosamodificaríaengranmedidael metabolismo

de los carbohidratos,al igual que lo altera el estadotiroideo. El hipotiroidismo

experimentaldisminuyeel contenidoy la expresiónhepáticadel GLU’[-2, mientras

que el hipertiroidismolos incrementa(Weinstein, 1994).

Con respectoaotras influenciasendocrinassobrela expresiónde los GLU’[s,

la insulina parecejugar un papelcrucial. En el músculoesqueléticode la rata, la

hipoglucemiacrónica (subnutrición)aumentael contenidode GLUT- 1 sin alterarel

de GLU’[-4 (Rubio, 1996); sin embargo,el GLUT-4 también responde a los

estímulos insulinicos, y se ha visto que las ratas subnutridas presentanuna

translocaciónde estetransportadorpor la insulina en músculo más eficaz que los

animalescontrol (Escrivá,en evaluaciónenDiabetología).Encuantoal GLUT-2, la

insulina inhibe suexpresión(Postic, 1993a;Colomb, 1995)y la glucosala estimula

(Postic, 1993b; Rencurel,1996). No obstante,los cultivos de islotesde Langerhans

procedentesde ratas neonatalesy adultassubnutridasno alteransu contenido en

GLU’[-2, aunquesí aumentael de GLUT-1 (Martin, 1995).

Enestetrabajose intentaaclararsi la posibleregulaciónde los transportadores

de glucosapor las hormonastiroideas tendríamecanismossimilaresa los que rigen

la regulaciónde la secrecióndel axis IGFs/IGFBPspor dichashormonastiroideas.

1.6. PLANTEAMIENTO DEL ‘[EMA.

El programagenético rige el desarrollo de los mamíferos en periodo

44

Introducción

embrionario,pero después,factoresexternos,llamadosambientales,modulandicho

desarrollo de forma decisiva. Estos factores son estudiados en las llamadas

alteracionesadquiridasdel desarrollo,a las que nuestrogrupo de investigaciónha

dedicado su trabajo desde1970. Entre estos factores ambientaleslos nutrientes

ocupan un lugar preponderante no sólo por ser el sustrato energético para crecer,sino

porque modulan factores endocrinosgenéticamenteestablecidosque regulan el

crecimiento como son: la insulina, las hormonastiroideasy los lOEs (Aláez,1992b;

Escrivá, 1992; Rivero, 1995; Goya. 1996; Alvarez, 1997; Martín, 1997).

El trabajoquesepresentaenestatesisesun intentode estudiode las posibles

interaccionesque puedenexistir entrelas hormonastiroideas, insulina e lOEs enun

modelo de hipotiroidismo por tiroidectomiay en tres etapasde vida de la rata

(neonatal,destetaday adulta).

Los lOEs son polipéptidoscon accionesendocrinas,autocrinasy paracrinas

(Daughday, 1989), si bien su función pareceestar moduladapor sus proteínas

transportadoras(IGFBPs). Ambos, lOEs e IGFBPsson secretadospor el hígado,y

dicha secreciónestámoduladapor el estadonutricional y la 01-1 (Straus, 1994;

‘[hissen, 1994>. El axis IGFs/IGFBPsconstituyeun sistemaregulatoriocomplejoque

poseeun importantepapelenel crecimientoy la diferenciacióntisulares,y que está

implicadoennumerososprocesosduranteel crecimientoy tambiénduranteelperiodo

adulto.

En periodosinmadurosdeldesarrollo,seexpresanmayoritariamenteel lOE-II

y el complejo de IGFBPs de 3OkDa (IGFBP-1 y 2), pero despuéseste perfil es

reemplazadoen el animal adulto, mostrandoaltosniveles de IGF-I e IGFBP-3, y

reducidosde IGF-II, IGFBP-1 y 2. Seha descritoque estoscambiosseretrasanpor

la falta dehormonastiroideas(Gallo, 1991; Nanto-Salonen,1991), lo quesugiereque

la influenciade la ‘[3 y la ‘[4 sobreel complejoIGFs/IOFBPsesedad-dependiente

(Nanto-Salonen,1992).

Las hormonas tiroideas juegan un papel fundamental en el inicio y el

mantenimientodel crecimiento de los mamíferos en etapas inmaduras. Estas

hormonas,tambiénafectanacasi todoslos aspectosdel metabolismoy así, suacción

estimulalas rutascatabólicasy oxidativas porque modifican la síntesisde enzimas

clave del metabolismode lípidos y carbohidratoso porquealteran las accionesde

otras hormonasreguladoras(insulina, glucagón, catecolaminas)(Okajima, 1978;

45

Introducción

Venditti, 1997).Las hormonastiroideasy la Gil, a travésdelos IGFs, sonesenciales

para un crecimiento normal, no obstante,el contenido hipofisario y los niveles

circulantes de GHestán regulados por las hormonas tiroideasin vivo (Hervás, 1975;

Samuels,1989)e in vitro (De Fesi, 1984) y, además,tambiéncontrolanla expresión

del gen de Gil (Evans, 1982; Yaffe, 1984>. Por otra parte, se sabe que el axis

GI-I/IGFs actúacomoprincipal mecanismoparael crecimiento,ya que el efectorde

las accionesde la Gil sobreel desarrolloson los IGFs (Daughday,1989; Jones,

1995), por tanto, las accionesde la ‘[3 y la T4 sobreel sistema IGE se podrían

explicarporel efectodirecto de estashormonastiroideassobrela secreciónde Gil.

Sinembargo,hay indicios experimentalesque muestranqueno todaslas accionesde

las hormonastiroideassobrela secreciónde IGFs estánmediadaspor la Gil. La

perfusiónde honnonatiroideaenhígadoaumentala secreciónde IGFs (Ikeda, 1989),

y las dosis de Gil dadasa hipotiroideosno restauranlos bajos niveles de IGFs

(Nanto-Salonen,1993). Nuestro grupo,junto con otros autores,ha establecidoque

en periodos de inmadurez,el sistemaIGFs/IGFBPspareceestar reguladopor el

balanceinsulina/nutrientesmás que por la Gil (Rivero, 1995; Goya, 1996), ello ha

sido estudiadoen animalessubnutridosy diabéticos,y se ha establecidola existencia

de undescensoen los nivelescirculantesy de expresiónhepáticade los lOEs de estas

ratas(Rivero, 1995; Goya, 1996).

Las hormonastiroideasafectanglobalmenteal metabolismo,propiciandouna

compleja regulaciónen los niveles de insulina, no obstante,nunca había sido

estudiadala insulina como posible mediadorade las acciones de las hormonas

tiroideassobreel axis IGFs/IGFBPs.Se ha descritoque el hipotiroidismoproduce

un descenso en los nivelesde IOFs y que disminuyela biodisponibilidadde dichos

factores (Burstein, 1979; Mielí, 1993), mientrasque el hipertiroidismo produce un

aumentode los IGFs, aunquetambiéndisminuyesu biodisponibilidad(Mielí, 1993).

Dicha biodisponibilidaddepende,sin duda, de las variacionesen las IGFBPs,luego

las hormonas tiroideas parecen alterar el axis IGFs/IGFBPs;sin embargo,quedapor

aclarar si el mediador de sus acciones es siempre la GH, si se trata de una acción

específica de las hormonastiroideaso sonotras hormonaslas que mediansuacción.

La insulina parecetenerun papelcomo reguladoradel axis IGFs/IGFBPsen

etapasinmaduras,por ello, enestetrabajo, nospropusimosestudiar,en un mismo

modelo de hipotiroidismopor tiroidectomía,las variacionesa nivel circulantey de

46

Introducción

expresiónhepáticadel ARNm de IGFs e IGFBPsen tres poblacionesde animales:

neonatos(10-20 días), destetados(27-37 días) y adultos (77-87 días), y en él,

dosificamos además, la insulina, Gil y glucemia.El trabajose divide en tres partes:

1. Estudio de las alteracionesdel axis IGFs/IGFBPs en situacionesde

hipotiroidismo (tiroidectomía o tratamiento con MMI) desde la etapa neonatala la

adultay la posible implicaciónde la insulina como mediadorade ellas.

2. Estudiode la repercusiónsobreel axis IGFs/IGFBPs,a nivel circulantey

en la expresión hepática de su ARNm, de las mismas tres poblaciones

tiroidectomizadasdespuésde la rehabilitación con hormona tiroidea por dos vías:

inyección intraperitoneal de ‘[4 e implante de pellet subcutáneo para una absorción

continuada.

También se intenta, en una población de ratas diabéticas, la rehabilitaciónde

los IGFs y las IGFBPs por la administración de tiroxina, como estudio

complementario al anterior.

3. Estudio de las variaciones de los transportadores de glucosa en animales

neonatales hipotiroideos para establecer la posible existencia de correlación entre las

accionesde las hormonastiroideassobredichostransportadoresde glucosay sobre

el axis IGFs/IGFBPs.

47

MATERIAL YME TODOS

Materialy métodos

2. MATERIAL Y METODOS.2.1. ANIMALES.

A lo largo del trabajo que constituye la presente tesis, se han utilizado ratas

de la raza Wistar obtenidas del propio criaderodel Instituto de Bioquímica (Centro

mixto CSIC-UCM, ubicado en el departamento de Bioquímica y Biología Molecular

II de la Facultadde Farmacia).Criar nuestrospropios animalesha permitidoejercer

un estrictocontrol de sus condicionesnutricionalesy generales,tanto en las etapas

gestacionaly lactantecomo en la adulta; dicho control es imprescindibleen los

modelosexperimentalesque han sido objeto de este trabajo.

En el mencionadocriadero existe un acondicionadorde temperaturaque

mantieneestavariableambientalconstanteentre22 y 240C. Porotra parte,las ratas

estánsometidasaun ciclo de luz/oscuridadautomático,graciasaun reloj controlador

que ilumina la estanciaa las 7:00 h y la oscurecea las 19:00 h.

El inicio de la gestaciónfue establecidomediantela observación,por frotis,

de la presenciade espermatozoidesen la vaginade la rata(180-200g)al día siguiente

de su apareamientocon el macho(300-400g);dichacondición se confirmó a los 14

díasporpalpaciónabdominal.El díadel nacimiento(díaO de vida) todaslas camadas

se uniformaron,disponiéndose8 crías,con númeroequivalentede machosy hembras

encadauna. Las ratassedestetaronel día 22 de vida y se agruparonen jaulasque

contenían4 animales.

2.2. COMPOSICIONDE LA DIETA GENERAL

El alimento suministradofue el pienso SANDERMUS S-10, adquirido en

SANDERS; se presentaen forma de porcionesprensadascuya composición, en

gramos por ciento, es la siguiente:

Proteínas 18

Grasas 2.5

Almidón 35

Azúcarestotales 3.5

Cenizas 8

Fibra 5.5

Humedad 13

49

Materialy métodos

Calcio 1.2

Fosfato 0.65

NaCí 0.6

El resto de los ingredientesestáconstituidopor una mezclade mineralesy

vitaminas,cuya composiciónes la siguiente:

MINERALES (mg/Kg de pienso)

Cobalto 0.6

Yodo 1.5

Selenio 0.3

Cobre 15

Hierro 25

Zinc 50

Manganeso 80

VITAMINAS (porKg de pienso)

Vitamina A 10000 U.l.

Vitamina D3 2000 U.I

VitaminaE 15 mg

Vitamina K 1 mg

Vitamina Bí 1 mg

Vitamina B2 3.5 mg

Vitamina Bá 1 mg

Vitamina B12 15 gg

Acido fálico 0.3 mg

Biotina 15 ~g

Acido nicotínico 30 mg

Pantotenato cálcico 10 mg

Colina 250 mg

Considerandolas cifras convencionalesde equivalenciacalóricade los tres

principios inmediatos(4.1 Kcal/g paralos glúcidosy prótidos y 9.0 Kcal/g paralos

50

Materialy métodos

lípidos>, la mezcla descrita posee un valor de 2.54 Kcal/g.

2.3. HIPO’[IROIDISMO.

Se estudiaronde maneracomparativadospoblacionesde animales,controles

e hipotiroideas, compuestas por ratas de diferentes edades, que abarcarondesdela

etapa neonatal a la adulta. El estudio comprendió animales neonatales hasta 20 días

de vida, destetadas de 22 a 37 días, y adultas, hasta 87 días de edad.

Ratascontrol: Los animalescontrolprocedíande progenitoresalimentadosad

libitum en todo momento.Las controles-lactantesfueron amamantadaspor ratasque

dispusieronde piensolibremente,y lascontroles-adultasrecibierondirectamenteeste

tipo de dieta a partir del destete.

Estosanimalesno fueronsometidosa ningúntipo de tratamiento.No obstante,

a un grupo de estasratascontrol se les practicóuna operaciónsimuladapara que

pudierancompararsecon los animalestiroidectomizados,eliminando así en dicha

comparaciónposiblesconsecuenciasdebidasal stressde la intervención.

Ratashipotiroideas:El hipotiroidismoseprodujoportiroidectomíaquirúrgica,

aunquecon el fin de facilitar estaoperaciónsesuministróen el aguade bebida,y en

una proporción del 0.02% (p¡’v), 5-mercaptoimidazol(MMI) días antes de la

operaciónen las tres poblacionesestudiadas(neonatos,destetadasy adultas),lo que

provocó la hipertrofia de la glándulay posibilitó su eliminación. Se continuó con

dicho tratamientohastael momentodel sacrificio de los animalescon el fin de

mantenerunosnivelesbajos de hormonastiroideasy prevenirsu renovaciónpor ¡a

posibleexistenciade tejidos tiroideos residuales.

2.4. MODELOS DE HIPOTIROIDISMO. (Figura 1).

2.4.1. Animaleshipotiroideosneonatales.

En los estudiosrealizadosen periodoneonatal,el MMI se suministróen el

aguade bebida materna,con lo que los animaleslactanteslo recibieron por vía

indirecta a travésde la leche.

2.4.1.1.Ratasneonatalestiroidectomizadas.(Ti, Figura 1).

A estosanimales,a los 2 díasde vida, se les administróMMI en el aguade

bebida(0.02%,p/v), setiroidectomizarona los 5 díasde viday se sacrificarona los

5,10 y 15 díasdespuésde la operación(10, 15 y 20 díasde vida, respectivamente).

51

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Material y métodos

El suministrode estebociógenose realizó en los animalestiroidectomizadospara

asegurarel hipotiroidismoen ellos, aunen casode la existenciade posiblesresiduos

deglánduladespuésde la operación.

Los animalestiroidectomizadosrecibierondesdeel díade suoperaciónlactato

de calcio al 1 %en el agua de bebida, junto con el MMI, para evitar la hipocalemia

debida al posible daño o extirpación que pudo sufrir la glándula paratiroides durante

la tiroidectomia.

2.4.1.2. Ratas neonatales tratadas con MMI. (Hipotiroideas-MMI, Figura

1).

En la población neonatal, se estableció también un segundo modelo de

hipotiroidismo que consistió tan solo en la administración de MMI al 0.05% (p/v>

desde el segundo día de vida hasta e! momento del sacrificio (10, 15 y 20 días de

vida). En este caso, no se sometió a los animales a la tiroidectomía,con lo que se

consiguió un hipotiroidismo que podría parecer más suave, aunque los niveles de las

hormonastiroideasfueronigualmentebajos respectoa las ratascontrol.

2.4.1.3.Ratasneonatalestiroidectomizadastratadascon STZ.

(T5 + S’[Z, Figura 1).

A un grupo de animalesneonatalestiroidectomizados,a los 10 días de la

operación(15 días de vida), se les bloqueó la secreciónde insulina mediantela

administraciónintraperitonealde una solución de estreptozotocina(STZ, Upjohn

Farmoquimica,SA, Madrid) en tampóncitrato0.OSM pH 4.5. La dosisadministrada

ffie de 7Omg/Kg de pesoy los animalessesacrificarona los 15 díasdespuésde la

tiroidectomía(20 díasde vida), esto es, a los 5 díasde la administraciónde S’[Z.

La comprobaciónde la falta de insulina en estapoblaciónse llevó a cabo

mediantela determinaciónde la glucemiae insulinemía.

2.4.2. Animaleshipotiroideosdestetados.

2.4.2.1.Ratasdestetadastiroidectomizadas.(‘[22, Figura 1).

En estapoblación de animales, la administraciónde MMI (0.02%,p/v) se

inició una semanaantesde] destete(15 díasde vida>. Posteriormente,a los 22 días

de vida, se tiroidectomizaron,y se sacrificarona los 5, 10 y 15 díasdespuésde la

operación(27, 32 y 37 días de vida, respectivamente).

53

Material y métodos

2.4.2.2.Ratasdestetadastiroidectomizadastratadascon insulina. (‘[22 +

1, Figura 1).

La glucemia de las ratas hipotiroideas destetadas, que estaba disminuida

respectoa las controles,sele normalizómediantelaadministraciónde insulinaLente

(mono componente de páncreasporcino y bovino) de Novo (amablemente

suministradapor Novo Nordisk PharmaSA, Madrid). Esta insulina esuna mezcla

formadaporun 30% de insulina de páncreasporcinoen estado“amorfo” y un70%

de insulina de páncreasbovino en forma cristalina.Su acciónes lenta, comenzando

a las 2.5 horas de su administración,alcanzandoun máximo a las 7-15 horas y

finalizandosu accióna las 24 horas.

Las dosisde insulina administradasy la pautaconcretade tratamiento,que se

describea continuación,se determinópor tanteo, aunquese consideróadecuadala

dosiscapazde mantenerla glucemiaenun rangonormal(80-l2Omg¡ml).

El tratamientose inició a los 10 díasde la tiroidectomía(32 díasde vida) y

consistióen la administracióndurante5 díasde 1 UI de insulina vía subcutáneapor

la mañana(9h). Seefectuaronmedidasdiariasde la glucemiaantesde administrarla

insulinaparacomprobarla evolucióndel tratamiento.Finalmente,los animalesfueron

sacrificadosa los 37 díasde vida (15 díasdespuésde la tiroidectomía).

2.4.3. Animaleshipotiroideosadultos.

2.4.3.1.Ratasadultastiroideetomizadas.(T72, Figura 1).

La pautaseguidacon estosanimalesfue la mismaqueen las ratasdestetadas,

peroenestecasose tomócomodíauno del experimentoaquelenel quelos animales

alcanzaronlos 120gde peso(65 díasde vida), iniciándoseentoncesla administración

del MMI (0.02%, p/v). Se sacrificaron a los 5, 10 y 15 días despuésde la

tiroidectomía(77, 82 y 87 díasde vida, respectivamente).

2.4.3.2.Ratasadultastiroidectoinizadastratadascon insulina. (‘[72 + 1,

Figura 1).

En estapoblación,comoen el casode las ratasdestetadastiroidectomizadas,

que también recibieron el tratamiento hormonal, la pauta de administraciónse

determinópor tanteoy teniendoencuentalos valoresde glucemia.

El tratamientose inició a los 10 días despuésde la tiroidectomía(82 díasde

vida). En estecaso, a los animalesse les administraron2 UI de insulina por vía

subcutáneadurante5 díasrepartidasendosdosis, unapor la mañana(9h) y otra por

54

Materialy métodos

la tarde (17h). También, como con los animalesdestetados,antesde procedera la

administración de insulina, se midió la glucemia. Al finalizar el tratamiento, los

animales fueron sacrificados (15 días después de la tiroidectomía, es decir a los 87

díasde vida>.

2.5. MODELOSDEHIPO’[IROIDISMO CON REHABILITACION. (Figura2).

2.5.1. Animaleshipotiroideostratadoscon tiroxina.

Una vez establecido el cuadro de hipotiroidismo en los animales neonatales,

destetadosy adultos, fueron tratadoscon ‘1’4 segúnlas pautasque se especificana

continuación.

En principio, la recuperacióncontiroxina serealizó mediantela inyecciónde

la hormona,pero con el fin de conseguirunaabsorciónmásgradual,y por tanto, una

rehabilitaciónmás fisiológica, se recurrióa la implantaciónde pelletsbajo la piel.

2.5.1.1.Rehabilitaciónmedianteinyecciónde ‘[4. (‘[5 + ‘[4 (R>, Figura2).

A los 10 días despuésde la operación,y con una población de animales

neonatalestiroidectomizados(‘[~), destetados(T22) o adultos(‘[72), seinició una pauta

de recuperaciónque consistíaen administrardurante5 días una dosis diaria, vía

intraperitoneal,de ‘[4 (1.Sgg/lOOgde pesopara las ratasneonatalesy 1 .75~íg/100g

de pesoparalos animalesdestetadosy adultos).

2.5.1.2. Rehabilitaciónmedianteimplantaciónde pellets.(T5 + T4 (RP),

Figura 2).

Otro grupodiferentede ratas neonatales,destetadasy adultasfue sometido a

un procesode rehabilitacióncon T4 por implantaciónde pellets(IRA, Sarasota,FL,

USA). Este dispositivo, que libera la hormona de forma continuada,se implantó

subcutáneamenterealizandouna pequeñaincisión en el lomo del animal. La dosis

administradaen esteprocesode rehabilitaciónfue la misma que enel caso anterior

(1 .Sgg/lOOgde pesoparala poblaciónneonataly 1 .75pg/lOOgdepesopara lasratas

destetadasy adultas,respectivamente),sin embargo,en el caso de las animales

destetadosy adultosel tratamientoserealizódurante5 ó 10 días.

2.6. MODELO DE DIABETES POR ESTREPTOZOTOCINA.(Figura 3).

El cuadro de diabetes mellitus se provocó mediante la inyección vía

intraperitoneal(ip) de una soluciónde STZ (Upjhon Farmoquimica,5. A., Madrid)

55

Población Días de vida Condición

0 2 5 15 20

N MMI(O•02p/v)N

T5

U------ 1~-i-14+T41 s

a----- - T5±14a

N

N

N

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y — — — -

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S

SS

0 65 72 82 87 92

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y — — -

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a

a a

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14 (RF~’0)

o

F¡g 2 Diseño experimentaldel estudioderehabilitacióncon T4 de ratas neonarales(N),destetadasCD) y adultas<‘A). Las abreviaru;asde las distintaspoblacionesson: 7’~+ T4 (7?), ratas neonatalestiroidectonilzadasy tratadascon 1.Sgg/lOOgdepesodeT4defonnadiaria vía IP; T~ + 714 (Rl’,), ratasneonata/esoperadasy tratadasconJ.Sgg/lOOgde pesode 714 <‘pc/id); 71,, + 71, (RL ratas destetadasoperadasytratadas con una inyecciónde 1. 75gg/lOOgde pesode T,,~ T,,±7% (Rl’), ¡-atasdestetadasoperadas, tratadascon 1. 7Spg/IOOgde pesode 714 (pellet) durante 5días;T,2 +71, (Rl’1<>), ratasdestetadasti¡-oidectomizadasy tratadascon 1. 7Sgg/]OOgdepesode T, (pc/leí) durante 10 días,~ T~, + 714 fl), ratas adultasoperadasa los72 díasy tratadas con una dosis ip de 1. ZSgg/lOOgde pesode 714 durante5 días;T~ + T, (Rl’), ratasadultastiroidectomizadasy ti-atadascon 1. 75ug/lOOgdepesode T

4 (pellet) durante 5 días,~Tr + 714 (RP

1~0, amínalesadultos tiro idectomizadosy tratadosdm-ante 10 días con 1 75pg/lOOgde pesodc 71, <‘pc/leQ; C animalescontrol; A, nacimiento;71, tiroidectomía;MMI, nwtimazoí;S, sacúficio.

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Materialy métodos

en tampón citrato 0.05M pR 4.5. Se estudiaronanimalescontrolesy diabéticosde

las poblacionesneonataly adulta.

La adminstraciónde la STZ (7Omg/Kg peso)serealizó a los 10 díasde vida

enel casode las ratasneonatales,o a los 72 días de vida, en las ratasadultas;tres

días más tarde se comprobóel estadode diabetesde dichos animalesmediantela

determinaciónde la glucemiay, posteriormente,de la insulinemia. Los animales

fueron sacrificadosa los 20 y 87 días de vida, respectivamente.

2.6.1. Tratamientode animalesdiabéticoscon T4. (D + ‘[4, Figura 3).

Con el fin de observarel efecto de las hormonastiroideas en los animales

diabéticosrespectoal axis IGFs¡IGFBPs,se administró‘[4 a unaspoblacionesde ratas

diabéticasneonatalesy adultas.

El tratamientohormonalde los animalesdiabéticosneonatalesy adultos,que

se realizómediantela implantaciónde pellets, se inició en el casode los primerosa

los 15 días de vida, y en el de los segundos, a los 82 días de vida, y las dosis

administradasfueronde 1 .5¡íg/lOOgdepesoy 1.75~g/100gdepeso,respectivamente.

La duracióndel tratamientofue de 5 días,con lo que los animalessesacrificarona

los 20 y 87 díasde vida, respectivamente.

2.7. ESTUDIO DE LOS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA (GLU’[s) EN

RATASNEONATALESHIPOTIROIDEAS. (Figura 3).

El estudio de los GLUTs durante el desarrollo de la rata se llevó a cabo en

poblacionesneonataleshipotiroideasy controles,desdelos 2 a los 20 díasde edad.

La pautaque se siguió comenzócon la administraciónde MMI (0.02%,p/v)

enel aguade bebidade las rataspreñadasa partir del día 14 de gestación;las crías

fueron sacrificadasa los 2 y 4 díasde vida (hipotiroideas-MMI).

Por otro lado, los animalesneonatalesde 8 y 20 díasde edad(T5), que se

incluyeron en este estudio, fueron sometidosa la misma pauta que las ratas

neonatalestiroidectomizadas,esto es, se inició la administracióndel fármaco

bociógenoa los 2 días de vida (0.02%,p/v), se tiroidectomizarona los 5 días de

edady se sacrificarona los 3 y 15 díasdespuésde la operación(8 y 20 díasde vida,

respectivamente).

58

Material y métodos

2.8. RECOGIDA DE MUESTRAS.

Los animales neonatales y adultos empleados en el estudio fueron sacrificados

entre las 09:00 y las 11:00 horas, aunque para las ratas hipotiroideastratadascon ‘[4

seestablecióla hora del sacrificioen las 11:00 horas.

Las muestrasde sangre(mezclaarterialy venosa)se obtuvierondel tronco

del animal tras la decapitación y se recogieron en tuboseppendorfcon y sin heparina

para obtener suero y plasma, respectivamente. Se dejaroncoagularen hielo durante

30 minutos, y a continuación fueron centrifugados 10 minutos a 12.OOOrpm

(Microfuge 11, Beckman); el suero y el plasma se trasvasaron a otra serie de tubos

eppendorf que se conservaron a -800C hasta su posterior análisis.

Las muestras de tejidos (hígado, hipófisis, corazón, cuadriceps y

gastroenemius)se extrajeron inmediatamentedespués de la decapitación, se

sumergieronen N2 líquido y se conservarona -80

0C hasta el momento de su

valoración.

2.9. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE IGF-1.

2.9.1. Fundamentodel radioinmunoanálisis.

El RIA es un caso particular del radioanálisiscompetitivo basadoen una

reacciónde competiciónentreun ligando dadoque actúacomo antígeno(hormona,

Ag) y otro antígeno marcado (hormona’, Ag’) por la unión a un receptor específico,

su anticuerpo (Ac). En esquema:

Ag’ + Ac > Ag’ - Ac.

+ Ag > Ag - Ac.

Esta reacción de competición tiene lugar durante la incubación de ambos

antígenos, marcado y no marcado (frío), con el anticuerpo, produciéndosela unión

del antígeno marcado al anticuerpo en proporción inversa a la concentración de

antígenofrío quelo desplazade la unión, ya que el antígenofrío presentaunamayor

afinidadporel anticuerporespectoal antígenomarcado,estoes,el antígenofrío tiene

mayor actividad biológica. Así pues, el grado de competición, y por tanto la

concentracióndel ligando a valorar, puede conocersepor los cambios en la

concentracióndel antígenomarcadolibre o del complejoantígeno - anticuerpo.A

continuación,se procedea la separaciónde la radiactividad libre del complejo

inmunológico para valorar la radiactividad ligada, y por comparacióncon la

59

Materialy métodos

radiactividad ligada en presenciade cantidadesconocidasy crecientesde antígeno

(curva patrón), puede conocerse su concentración en una disolución problema.

Este análisis presenta la sensibilidad de las técnicas isotópicas y posee la

especificidadpropia de los métodos inmunológicos, lo que pennite valorar un

componenteen una muestrade grancomplejidadcon un mínimo de interferencias.

Para obtener resultados fiables se debe tener en cuenta las siguientes

condiciones:

1. Que el anticuerpo obtenidoseaespecíficodel antígeno<sustanciaproblema)

y que sus diluciones sean adecuadas.

2. Que el antígeno se pueda marcar con un isótopo radiactivo de manera que

se consiga una alta actividad específica sin una disminución de su actividad biológica.

3. Que el método de separación de la radiactividad libre de la ligada en forma

del (complejo Ag-Ac) sea adecuado.

2.9.2. Filtración en gel.

Esta técnica permite la separación de las IGFBPs del suero y constituye el

paso previo para la determinación de la concentraciónde IGF-I medianteRIA y de

IGF-II por radiorreceptor (RRA). Además, este procedimientofue mostradocomo

el idóneo por nuestro grupo de investigación frente a la extracción en ácido fórmico-

acetona y a la de ácido-etanol con crioprecipitación, sobre todo para el caso de

muestras procedentes de ratas neonatales (Rivero, 1994).

2.9.2.1. Fundamento.

La cromatografía de permeabilidad o de tamiz molecular separa las moléculas

en función de su tamaño, forma y peso molecular mediante el paso de las muestras

a través de una matriz de pequeñas esferas de material inerte que está englobada en

una columna.

Esta técnica constituye el método de elección para la eliminación de

interferentes indeseables de distinto peso molecular respecto a los problemas por

diferentes razones:

a) es la cromatografía más sencilla,

b) no requiere muestras muy puras,

c) no se presentan fenómenos de adsorción, lo que la hace ideal para muestras

biológicas lábiles,

d) permiteseparacionesrápidassin necesidadde unosgradientesde elución,

60

Materia/y métodos

e) produce bandas estrechas en el cromatograma y, finalmente,

O permite correlacionar fácilmente el peso molecular con el volumen de

elución.

Entre los parámetrosa teneren cuenta en este tipo de cromatografíase

encuentra el coeficiente de disponibilidad(Ka) de una molécula, dado que representa

la fracción de la fase estacionaria accesible para la difusión de dicha molécula. Se

expresa como:

y-ye O

ve—ve

donde:

Ve (volumen de elución): volumen necesario para eluir una molécula

determinada.

V0 (volumen vacío): volumen de la fase móvil en el que se distribuyen las

moléculas de peso molecular suficientemente elevado como para no penetrar por el

tamiz molecular.

V, (volumen total): volumen de la columna (fase móvil y estacionaria) en el

que se distribuyen las moléculas de peso molecular muy bajo.

El K~ de una molécula es independiente de las dimensiones de la columna y

se relaciona de forma constante con su coeficiente de difusión.

2.9.2.2. Material y reactivos.

Columna. Se utilizaron columnas de vidrio borosilicado XK 16/100

(PharmaciaLKB Biotechnology,Uppsala,Suecia)de 100cm de altura y lámm de

diámetro.

Fase móvil. Está formada por ácido acético 1M y cloruro sódico 0.02M en

agua; se emplea para el equilibrado de la columna y como eluyente.

Fase estacionaria. Se utiliza Sephadex G-50 Fine (Pharmacia Fine Chemicals,

Uppsala, Suecia). Posee un rango de fraccionamiento de 1.600 a 30.OOODa, adecuado

por tanto, para la separación de IGFs (7.áOODa) de sus proteínas ligadoras

(aproximadamente 50. OOODa).

2.9.2.3. Calibración de la columna,

Para determinar con exactitud en qué fracciones eluyen los IGFs y sus

61

Materialy métodos

proteínasligadorasunas vez separadas,se filtré una alícuotade IGF marcado

radiactivamente con 21, se recogieron fracciones de unos 2m1 y, a continuación, se

procedió a su contaje en un contador PackardAuto-GammaCobra II. En las tres

columnas empleadas el IGF eluyó con un K,~ de 0.22.

El perfil de elución del péptido marcado mostró claramente dos picos de

radiactividad de IGF, el primerocorrespondíaa las IGFBPsy el segundoalos IGFs.

2.9.2.4.Filtración de los sueros.

Se diluyó la muestrade sueroenuna proporción1:1 enácidoacético2M, de

forma que la concentración final de ácido en la muestra fuera 1M, y para disociar los

complejos IGF/IGFBP se mantuvo la mezcla durante una hora a temperatura

ambiente. A continuación, la muestra se filtró por la columna a un flujo de 4m1/h y

se utilizó como eluyente ácido acético XMy clomro sódico O.02M. Finalmente, las

fracciones correspondientes a IGF se reunierony se liofilizaron. El liofilizado se

resuspendió en tampón de RIA y se repartió en alícuotas que se conservaron a -200C

hasta su análisis.

2.9.3. Marcaje radiactivo de IGF-I y II.

2.9.3.1. Fundamento.

Se persiguela obtenciónde péptidoscon suficienteradiactividadespecífica

pero sin una actividad biológica disminuida, de forma que la cuantificación de IGF

en la muestra posea una adecuada sensibilidad.

Para el marcaje radiactivo de IGFs se utilizó una modificación del método de

la cloramina‘[ (Hunter, 1962) que es ampliamente utilizado para marcar pequeñas

cantidades de proteína con una alta radiactividad específica que se empleará como

radioligando en el radioanálisis competitivo. La reacción que tiene lugar es una

oxidacióndel Na’251 en presenciade unaproteínaquecontieneresiduosde tirosina,

con la subsiguiente incorporacióndel radioyodoa dichosresiduos.La cloraminaT

es la sal sódica del ligando N-monocloro de la p-toluenosulfonamida y en disolución

acuosa se degrada lentamente formando ácido hipocloroso que es un agente oxidante.

Así, el Nal en presencia de cloramina T y a pH ligeramente básico (pH 7.5> es

oxidado, se generan iones yodinio (I~) que reaccionan con el anillo fenólico de la

cadena lateral de la tirosina y que se incorporan en orto respecto al hidroxilo.

El proceso se detiene por dilución de la mezcla de reacción en presencia de

una alta concentración de ESA (albúmina sérica bovina), ello altera las condiciones

62

Materialy métodos

de reaccióny haceque se incorporeel 1251 al BSA, que por ser una proteínade alto

pesomoleculares fácilmenteseparabledel IGE. Finalmente,se separala proteína

marcada del yodo radioactivo no incorporado,así como de la albúminamarcada

mediantefiltración engel.

2.9.3.2.Material y reactivos.

Hormona.SeutilizaronrhIGF-I y rhIGF-II (IGF-I y II humanorecombinante)

de Boehringer Mannheim (Leverkusen, Alemania) que vienen liofilizados. Se

reconstituyeron en ácido acético 0. 1M y se liofilizó una alícuota. Estos péptidos

tambiénseemplearonen la elaboraciónde la curvapatrónenel ensayode RIA y en

el de RRA.

Na’251. Se presenta a una concentración de lOOmCi/ml y es suministrado por

Amersham(AmershamIbérica SA., Madrid).

Columna. Se emplearon columnas de Sephadex G-50 Fine equilibradas antes

del marcaje con PBS 0.03M (tampón fosfato), BSA al 0.25% (p/v) y azida sódica

0.02% (plv) para el marcaje de IGF-I, o con ácido acético 1My USAal 0.25% (plv)

en el caso del marcajedel IGF-II.

2.9.3.3. Procedimiento.

La reacción se desarrolló en el mismo tubo donde se liofilizó el péptido que

se resuspendió en PBS 0.5M (tampón fosfato). A continuación,se añadióel yodo

radiactivo (Na125I) y la disolución de cloramina T (lmg/ml en PUS 0.O1M) recién

preparada y se dejaron transcurrir 30 segundos para que se produjera la yodación del

péptido.

La reacción se detuvo por la adición de USAal 5% (p/v) en PBS 0.O1M para

el marcaje de IGF-I, y con USAal 5% (p/v) en ácido acético LM en el marcaje de

IGF-II. A continuación,se transfirió la mezcla de reacción a la columna y se

recogieron fracciones de imí a un flujo de unos 30m1/h. Se contó una alícuota de

cadafracciónenun contadory (PackardAuto-GammaCobraII) paraconservarlas

fracciones interesantes que se mantuvieron congeladas a -20W y divididas en

alícuotas -

2.9.3.4. Cálculo del rendimiento y la actividad específica.

El rendimiento es el porcentaje del total de radiactividad presente en el tubo

de reacción que se incorpora al péptido, y se calcula como el cociente entre las cpms

del pico de IGF-I ó II y las cpms totales eluidas de la columna. (Osciló entre 47-78%

63

Materialy métodos

para el IGF-I y 45-81% para el IGE-Il).

La radiactividad incorporada al péptidose obtieneal multiplicar el rendimiento

y la radiactividad añadida al tubo de reacción corregida a la fecha del marcaje.

Finalmente,el cocientede la radiactividadincorporaday la masadel polipéptidonos

permite conocer la actividad específica en ¡íCi/¡xg. (Osciló entre9O-160gCi/~gpara

IGF-I y 9O-l74~tCiI~gpara el IGF-II).

2.9.3.5.Perfil de elución de radiactividad.

El perfil obtenido por el método de la cloramina ‘[ muestra tres picos de

radiactividad:el primerocorrespondeal USA que se yoda al detenerla reacción,el

segundo, es la hormona marcada y, por último, el tercero, se identifica con el yodo

libre que no ha reaccionado ni con la hormona ni con el BSA (Figura 4).

2.9.3.6. Repurificación del IGF marcado.

El péptidomarcadoconservasu actividadbiológicadurantemásde dosmeses.

Sin embargo,el ligamiento inespecíficoenel RIA aumentaal transcurrirel tiempo,

aunque este inconveniente se evita repurificando ciertas fracciones del marcaje; de

esta manera, se consigue separar la hormona marcada íntegra de la deteriorada por

la radiactividady del yodo radiactivodesprendidodel péptido.

La repurificaciónseefectúaen las mismascondicionesque el marcajey su

perfil de elución tambiénmuestratres picos: el primero probablementese debea

polímerosde IGF-I, el segundo,que es el mayor, se correspondecon la hormona

marcaday, finalmente,en tercer lugar, eluyeel yodo libre, desprendidodel péptido

marcado.

2.9.4. Desarrollo del RíA de IGF-I.


Patrón. Se empleó IGF-I humano recombinante (rhIGF-I) de Boehringer

Mannheim que viene liofilizado. Se obtiene de E. coli y presenta una pureza superior

al 95%. También se utiliza estahormonaen los marcajes.

‘[ampón. Está compuesto por tampón fosfato 0.O1M pH 7.5, cloruro sódico

O.15M, azida sódica al 0.02% (p/v) y BSA al 0.5% (p¡v). Se utilizó para diluir el

patrón, las muestras filtradas, el radioligando, el primer anticuerpo y también para

reconstituirlas muestrasfiltradas despuésde su liofilización.

Radioligando.Se empleó 1251-IGF-I que sediluyó con tampónde RíA para

obtenerde 8.000 a 10.OOOcpm/tubo.

64

MARCAJE IGF-Icpm x 1000

o

epm x 1000

o

JGF~IJ*

1251

10 20 30 40 50 60 70

Fracc¡ones

Fig 4 Perfil de elución de radiactividaden columnade SephadexG-SO tras el marcajede

A3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

o

RW-1 *

BSA 1251

B

10 20 30 40 50 60 70

Fracciones

MARCAJE IGF-II

3500

3000 -

2500 -

2000 -

1500-

1000 -

500 - PSAJA’

o

IGF-I (A) o IGF-II (B) con por el métodode la cloramnia 71 modificado.

Materialy métodos

Primeranticuerpo.Se utilizó un antisueropoliclonal (fracción globulínica)

anti-IGF-I obtenido en conejos inmunizados con hIGF-I y el fragmentoC-terminal

(residuos 5-57) de KabiGen AB (Estocolmo,Suecia)que sepresentaen forma de

liofilizado. La dilución empleada fue de 1:1.000.

Segundo anticuerpo. Se empleó una suspensión de complejos de anticuerpo

y microsefarosaobtenidosenovejay queprecipitaanticuerposde conejo(Pharmacia

DecantingSuspension3).

2.9.4.2.Preparaciónde las muestras.

Las muestrasde suerose analizarondespuésde ser sometidasa la filtración

en gel para separarlas proteínasligadorasde IGF. Se evaluarona unadilución 1:40.

2.9.4.3.Procedimiento.

La curvapatrónabarcaun rangode concentracionesde 100 a 02ng/mly se

analizópor duplicadoal igual que las muestras.

Parallevar a caboel análisis, se añadióel primer anticuerpoa los tubos de

las muestrasy a los patronesy, a continuación,el radioligando. Despuésde una

incubacióna 4W de 16-20h, se adicionó la suspensióndel segundoanticuerpo,se

volvieron a incubar durante 30 minutos ahora a temperatura ambiente y se les añadió

agua destilada (OSmí). Finalmente, los tubos secentrifugarondurante10 minutosa

1 .500g y 4”C, se descarté el sobrenadante y se procedió al contaje del precipitado

durante dos minutos en un contador de radiactividady (PackardAuto-GammaCobra

II).

2.9.4.4. Cálculos.

Para calcular la concentraciónde IGF-I en las muestrasse empleó un

programa en el que se construye la curva patrón según una representación

logarítmica,poniendoen abscisasel logaritmode la concentraciónde hormona,y en

ordenadas la función logarítmica de la proporción de ligamiento U/U0.

Esta proporción se calcula por la expresión:

E/Ej 8-

»

30—A’

donde, U es la radiactividad ligada de la muestrao patrón correspondiente,U0, la

media de la radiactividadde los tubosdondeel ligamientoesmáximo, y N, la media

66

Materialy métodos

de la radiactividad ligada a los tubos donde el ligamiento es inespecifico

La funciónlogarítmicaseexpresacomo:

logitR/B0=In B/B1—

Se calculó para cada muestralogit BIB0, se interpoló en la curvapatrón la

concentracióncorrespondientey se calcularonlas mediasde los duplicados.Por

último, el resultado se multiplica por el factor de dilución de cada caso.

2.10. DETERMINACIONRADIOINMUNOLOGICA DE 13 Y ‘[4.

La valoración de ‘[3 y ‘[4 en suero se realizó en el Centro de Investigaciones

Biomédicasdel CSIC, enel laboratoriode la Dra. GabrielaMorreale,mediantelos

RIAs específicosde alta sensibilidaddescritos por Weeke y Orskov (1975) y

modificadosparala ratapor Obregóny col. (1979).

Denuevo,damoslas graciasa la Dra GabrielaMorrealey a sus colaboradores

por la ayudaque nosprestaron.

2.10.1.Marcaje radiactivo cte ‘[3 y ‘[4.

El método se basa en una reacciónde oxidacióncon cloraminaT (Kjeld,

1975), dondeel sustrato(3’3 o ‘[2) se yoda con 1251 o 11311 a una yodotironinade un

grado superior de yodación. La reacciónse detienecon metabisulfito sódico y la

separaciónde las diferentesyodotironinas y el yoduro se lleva a cabo mediante

filtración en gel (SephadexG-25).


Hormona. Se emplearon ‘[2 y ‘[3 reconstituidasenhidróxido sódico 0.05M,

de forma que se consiguierauna concentraciónfinal de íOpg/ml. Estos péptidos

tambiénseemplearonparaelaborarla curvapatrónde ¡os RIAs.

Na1251. Se presentacon una concentraciónde IOOmCí/ml y es suministrado

por Amersham(AmershamIbérica S.A., Madrid).

Columna. Se emplearon columnasde SephadexG-25 equilibradascon PUS

0.OSM pH 11.9.


FI procesose llevó a cabo a temperaturaambiente.A una alícuotade la

67

Materialy métodos

hormonase le añadióla solución de Na’251 y la de cloramina‘[ (4mg/ml en PUS

0.OSM pH 7.6). ‘[ranscurridos 20 segundosseparó la reacciónconuna disolución

de metabisulfito (2.Smg/ml en PBS 0.05M pH 7.6), se transfirió la mezcla de

reaccióna la columnay seeluyó con PBS 0.05M pH II» a un flujo de 40m1/h.

Se recogieronfraccionesde 2m1, y a cadauna deellasse les añadióuna gota

deácido clorhídrico 6N para queel pH final fuera neutro.A continuación,secontó

una alícuota de cadafracción en un contadorde radiactividad y (PackardAuto-

GammaCobra II). Los tubos de interés se protegieron con 2m1 de metanol y se

conservarona 4W.

2.10.1.3.Perfil de elución de radiactividad.

El perfil de elución tras el marcajeradiactivo de la hormonapresentótres

picos de radiactividad: el primero de ellos correspondióal yodo que no se ha

incorporadoal péptido,el segundo,a la T3 marcaday el tercero,a la 14 yodada.

2.10.2.Desarrollodel RíA dc ‘[3.


Patrón.La hormonaempleadacomo standardfue la rT3 (T3 de rata)que se

resuspendióen hidróxido de sodio 0.05N para proporcionaruna concentraciónde

4~gIml.

‘[ampón. Seutilizó para la elaboraciónde la curva patrón y sirvió como base

parala preparaciónde otrostamponesdel análisis. Estáformadopor fosfatodisódico

0038M, fosfatosódico0.002M, mertiolato ft6mM y USA al 0.22% (tampónA).

En el ensayo,se empleótambiénestetampónsin albúmina(tampónC) y otro

quetienecomobaseal tampónA, peroqueademásincluye en su composiciónlOOmg

de cisteinay 600mgde ANSA (competidorde proteínas),esel tampón B.

Radioligando. Seutilizó 12511 quesediluyó en tampónU paraproporcionar

6.000-7.OOOcpm/tubo.

Primer anticuerpo. Se trata de un antisuero de conejo obtenido de Henning

Uerlin GMBH (Alemania). Se diluyó con tampón A para conseguir un título de

1:50.000.

Segundo anticuerpo. Para precipitar el complejo antígeno-anticuerpo, se

empleóunamezclaformadaporsuerode ternera,tampónC y polietilenglicolal 30%

diluido en tampónC en las proporciones:5:28:67.

68

Materialy métodos


La curva patrón abarcaun rango de concentracionesde O a Sng/ml y se

analizópor triplicado, al igual que las muestras.

En el análisis,paraigualarproteínas,se les añadióa los patrones,un volumen

desuerolibre de T3 (1O~l), y a las muestras,un volumende tampónA. Despuésse

adicionaron la hormona marcaday el primer anticuerpo. Tras una noche de

incubación,se les adicionóel segundoanticuerpo(1 <SmI), secentrifugóy seprocedió

al contajedel precipitado.

2.10.2.3.Cálculos.

Los niveles de T~ se conocieronpor la representacióndel logaritmo de la

concentraciónfrente a la relación BIT y la correccióndel valor por el factor de

dilución de las muestrasque fue 10.

*100cs

donde,C1 es la radiactividadde un tubo problema,Ch, la radiactividadde los blancos

y C~, la de los standardsde contaje.

2.10.3.Desarrollodel RIA dc ‘[4.


Patrón. El standard empleado fue la rT4 (T4 de rata) que se disolvió en

hidróxido de sodio 0.OSN paraobtenerunaconcentraciónfinal de lOggIml.

Tampón. Está formado por fosfato sódico O.002M, fosfatodisódico0.038M,

mertiolato 0.6mM y USA al 0.05% (tampónA). Estetampón sin USA (tampónU)

se diluyó enunaproporción1:4 (tampónA: tampónU) y se empleóparaelaborarla

curva patróny diluir las muestras(tampónC). Así mismo,enel análisis se utilizó

otro tampónque se preparóa partir del tampónA con USA al 0.22%,y no 0.05%,

por la adición de lOOmg de cisteína/l y 600mg de ANSA!> (TampónD) y otro, a

partir del tampónC, al que sele añadieronlOOmg de cisteína/l (tampónE).

Radioligando. Se utilizó ‘251-T

4 diluida en tampón para conseguir 6.000-

7.Ooocpmltubo.

Primer anticuerpo. Se empleó una y-globulina de conejo a un título de

1:30000diluido en tampónC.

69

Material y métodos

Segundoanticuerpo.Consisteen unamezclade suerode ternera,tampónE

y polietilenglicol (PEG) al 30% diluido en tampónD (5:28:67).


La curva standardabarcaun rangode concentracionesde 0-12.Sng/mly, al

igual que los problemas,se analizópor triplicado. A los patronesseles añadióun

volumende standardy otro de suerolibre de ‘[4 (25~l), mientrasquelas muestrasse

diluyeron en tampón C en una proporción 1:33; a continuaciónse adicionaronel

radioligandoy el antisueroy se incubaronuna nocheenoscuridad.Al día siguiente,

tras la adición del segundoanticuerpo(1 SmI) y la centrifugaciónde los tubos, se

obtuvo un sedimento,cuya radiactividadse contó enun contador-y (PackardAuto-

GammaCobraII).

2.10.3.3.Cálculos.

La concentraciónde ‘1’4 se obtuvopor la interpolaciónen la rectaque resulta

al representarel logaritmode la concentraciónfrentea la relaciónU/T de los valores

obtenidostras el contaje.El factor de correcciónde los datosdebidoalas diluciones

fue 0.0667.

2.11. DETERMINACION RADIOINMIJNOLOGICA DE INSULINA.

La determinaciónde la insulina en muestrasde plasmase realizópor medio

de unoskits comercialesde la casaIncstar.

2.11.1.Material y reactivos.

Patrón.Estáconstituidopor insulinaporcinaliofilizada prediluidaentampón.

‘[ampón. Es un liofilizado compuestoporBSA, tampónboratoy que incluye

timerosalcomo conservante.

Radioligando.Se utilizó insulinaporcinamarcadacon 1251 y diluidaenBSA-

tampónboratoque ademáscontieneEDTA (ácidodianiinotetracético)y timerosal.

Antisuero.Se empleóun liofilizado de antisuerode insulinade cobayadiluido

enel tampóndel ensayo.

Complejo precipitante(GAGP-PPT).Estáformadopor un liofilizado quecontieneen su composiciónsuerode cobayanormal, precipitadocon antisuerode

cobayamachoy PEG. Al igual queen el casode los otros reactivos,se resuspendió

en aguadestiladaen el momentoen que se realizó el ensayo.

70

Material y métodos

2.11.2.Procedimento.

El primer día se preparó la curva standard, que abarca un rango de

concentracionesde 4 a lOOgU/ml (0.16-4ng/ml) y las muestras.A continuación,se

adicionóa todos los tubos primeroel antisuero(exceptoa los tubos que contenianla

radiactividadtotal -T- y a los del ligamiento inespecífico-NSB-) después,la insulina

marcada y se incubaron a 4W durante 16-20 horas. Se añadió el complejo

precipitantea todos los tubos exceptoa los T, semantuvieronunos15-20 minutosa

20-25W y transcurridoeste tiempo se centrifugarona 760g y 20-25W durante20

minutos.Porúltimo, secontóelprecipitadoen un contadory (PackardAuto-Gamma

CobraII) duranteun minuto.

2.11.3.Cálculos.

Al igual que en los otros RíAs descritos,en estecaso, se llegó a conocerla

concentración de insulina mediante la representacióndel logaritmo de la

concentración (abscisas) frente a la relación U/U0 (ordenadas) y la posterior

interpolaciónenestagráfica de los valoresde las muestras.

2.12. DETERMINACION RADIOINMUNOLOGICA DE HORMONA DE

CRECIMIENTO (GH).

2.12.1.Preparacionde las hipófisis parael RíA.

Para llevar a cabo el análisis de los niveles de GH en las hipófisis, sedebe

homogenizarpreviamenteel tejido. La homogenizaciónde las hipófisis se realizó

manualmentecon ayuda de un potter de vidrio en PUS 0.O1M pH 7.6 y el

homogenadoresultantede estaoperaciónse conservóa -20W. Las muestrasse

diluyeronen PUS 0.O1M pH 7.6 con USA al 1% en las proporcionesdeterminadas

por tanteoque ahorase detallanen funciónde la edady condicióndel animal:

- ratasneonatales:hipotiroideas,1:100y 1:250 y controles,1:250;

- ratasdestetadas:hipotiroideas,1:500 y 1:1.000y controles, 1:1.000;

- ratasadultas:hipotiroideas,1:5.000y 1:10.000y controles, 1:10.000.

2.12.2. Marcajeradiactivode GH.

El marcajeradiactivode la hormonade crecimientose llevó a cabosiguiendo

el método de la cloraminaT (Hunter, 1962). Como ya se explicó en el marcaje

radiactivode IGF-I, la reacciónquímicaque tienelugares la oxidacióndel Na’251 en

presenciade unaproteínaque contienerestostirosina, y es en estos residuosdonde

71

Materialy métodos

se incorpora el radioyodo. El procesose detienepor la adición a la mezcla de

metabisulfito,y a continuación,seseparala proteínamarcadadel yodoradiactivono

incorporadomediantefiltración engel (Sephadex0-50).


Hormona:SeempleórGH (Gil de rata),queal igual quetodos los reactivos

(marcaje y RIA), son suministradospor el National Institute of Diabetes and

Digestiveand Kidney Diseases(NIDDK, California, USA). La rGH sereconstituyó

en NaHCO30.01N(lOOgg/ml>y serepartióen alicuotasde 25g1 que seconservaron

a -20W. Estepéptido tambiénse utilizó paraelaborarla curvapatrónen el MA.

Na125I: Se presentaconuna concentraciónde lOOmCi/ml y es suministrado

por Amersham(AmershamIbérica, SA, Madrid).

Columna:Seemplearoncolumnasde ScphadexG-50equilibradasconveronal

0.02M.

2. 12.2.2.Procedimiento.

El procesose llevó a cabo a temperaturaambiente.Así, a una alícuotade la

hormona,se le añadióla soluciónde Na’251 y la soluciónde cloraminaT (3 .Smglml

en PUS 0.05M) reciénpreparaday seagitó el tubo durante90 segundos,momento

enel que se produjo la yodacióndel péptido.La reacciónse detuvopor la adición

de una disolución de metabisulfito (1 .Ymg¡ml en PBS O.05M) que se preparó

extemporáneamente.La mezclade reacciónse transfirió a la columnapreviamente

equilibradacon veronal, tampónque seempleó paraeluir las fraccionesa un flujo

aproximadode 30m1/h. Se recogieronfraccionesde 0.5m1,sobreOlmí de BSA al

2% en PBS0.OIN, y de estasse contóunaalícuotaen un contadorde radiactividad

-y (PackardAuto-GammaCobraII). Las fraccionesde interésseconservarona -20W

en PBS-BSAal 2% (dilución 1:5>.

2.12.2.3.Cálculo del rendimientoy la actividadespecífica.

El cálculo del rendimiento y de la actividad específicase llevó a cabo

siguiendolo ya descritoparael marcajeradiactivode IGFs. El rendimientoobtenido

en los marcajesde Gil osciló entre un 85-95%, y la actividad específicade la

hormonase situó en torno a 75-S0~Ci/pg.

2.12.2.4.Perfil de elución de radiactividadtrasel marcajeradiactivode

OH.

El perfil de elución obtenidotrasel marcajeradiactivode la hormonapresenta

72

Materialy métodos

dospicos de radiactividad:el primero de ellos correspondea la hormonamarcada,

y el segundoal yodo libre que no ha llegadoa incorporarseal péptido.

2.12.2.5.Repurificaciónde la GH marcada.

La Gil marcadaconservasuactividadduranteunosdosmeses,sin embargo,

con el tiempo se produceun aumentodel ligamiento inespecíficoen el RIA. No

obstante,este inconvenientese superarepurificandolas fraccionesresultantesdel

marcaje.

La repurificación se realizóen las mismascondicionesen que se efectuóla

purificacióntras el marcaje,pero se empleóen este casouna columnade Sephadex

G-100y se recogieronfraccionesde mayorvolumen(2.5m1). Con estaoperaciónse

consiguió la separaciónde la hormona intacta (segundopico) de la deteriorada

(primerpico) y del yodo radiactivo(tercerpico) que liberael péptido conel pasodel

tiempo.

2.12.3.Desarrollodel RíA de GH.


Patrón.La hormonautilizada como standardfue rGIvI que se presentóen

formade liofilizado y fue proporcionadaporel NIDDK, al igual que el primer y el

segundoanticuerpo.Seresuspendióen aguaparaproporcionarunaconcentraciónde

lOpg/pl.

Tampón.EstáconstituidoporPUS 0.O1M pH 76, EDTA O.025My USA al

1% (plv) y se empleó para diluir las muestras,la radiactividad,el primer y el

segundoanticuerpo.

Radioliganclo. Se utilizó ‘251-GH que se diluyó en el tampón del RIA para

proporcionarunas8.OOOcpm/tubo.

Primer anticuerpo. Se presentó como un liofilizado que sereconstituyó en

agua(dilución 1:50>. Se trata de un antisueroextraídode glándulapituitaria de rata

con aguay sulfato de amonio. Se diluyó en suerode mono al 1 % a un título de

1:500.000.

Segundo anticuerpo. Se utilizó una gamma-globulina antimono que fue

proporcionadapor el NIDDK por Antibodies, Inc. (California, USA). Precipitael

sueronormal de mono y estádisuelto en PUS.


El primerdíaseprepararonlas muestrasy la curva patrón,que se analizópor

-73

Materialy métodos

triplicado y abarcóun rango de concentracionesde 0.03 a l6ng/ml. Las muestrasse

analizaronporduplicado,y en el casode las hipófisis, a las diluciones reseñadas.

Los problemasy los patronesseincubaroncon los reactivos: se les añadió

la dilución del antisuero y el tampón, y se mantuvieron 6 horas a 37”C. A

continuación,se adicionóa los tubosel radioligandoy seincubaron18 horasa370C.

Al día siguiente,se añadióel segundoanticuerpoy se incubarondurante18 a 24

horasa 40C. Finalmente,el tercerdía, se lavaroncon 2m1 de PUS O.O1M pH 7.6,

se centrifugaron40 minutos a 760g, y se procedióal contajede radiactividaddel

precipitadodurante2 minutosen el contador-y (PackardAuto-GammaCobraII>.

2.12.3.3.Cálculos.

Como enel casode los otros RIAs, los valoresde Gil se llegarona conocer

por la representacióndel logaritmode la concentración(abscisas)frentea la relación

U/U0 (ordenadas) y la posterior corrección por el factor de dilución de las muestras;

en el caso de las hipófisis, los cálculosserefirieron a mg de tejido.

Destacamosque las determinacionesde GH fueron realizadas con la

colaboraciónde la Dra. CarmenAlvarez Escolá, miembro de nuestrogrupo de

investigación,y a quienreitero mi agradecimientoporsu ayuda.

2.13.DETERMINACION DELA CONCENTRACION SERICA DE IGF-II POR

ANALISIS DE RADIORECEPTOR (RRA).

2.13.1. Fundamento.

Al igual que el RIA, el RRA es un caso particular del

competitivo. La competiciónse estableceentreuna hormona(IGE—IL)

misma hormonasin marcarpor la unión a un receptorespecífico.

Los receptoresse obtuvierona partir de hígadode rata adulta

receptoresde IGF tipo II, y prácticamentecarecede receptorestipo 1.

2.13.2. Preparación de membrana plasmática particulada de hígado de

rata.

Se homogeneizaronlos hígadosde rataenunasoluciónde sacarosa0.25Mcon

PMSF 0.SmM en una proporción de 3.5mlIg de tejido. Se reunieron los

homogenadosy se filtraron a travésde una gasa. A continuación,se centrifugaron

durante10 minutos a 600g y 4W, se recogieron los sobrenadantesy de nuevo se

radioanálisis

marcaday la

que contiene

74

Materialy métodos

centrifugarona 17.OOOgdurante30 minutosa 40C. Los sobrenadantesqueresultaron

sereunierony seles adicionócloruro sódicoy sulfatode magnesiohastaalcanzaruna

concentraciónfinal de 0.1 y 1M, respectivamente.Despuésse llevaron a cabo dos

centrifugacionesa 40.OOOgdurante40 minutosy a 4W, y el sedimentoobtenidose

resuspendióy homogeneizóentampónTris 5OmM PH 7.7. Porúltimo, seseparóuna

alícuotade la preparaciónpara determinarla concentraciónde proteínassegúnel

métodode Uradford. Estapreparaciónse conservóa -80”C repartidaen alícuotas.

2.13.3.Desarrollodel RRA de IGF-II.

2.13.3.1.Materialy reactivos.

Patrón. Se empleó rhIGF-II (IGF-II humano recombinante) de Uoehringer

Mannheimque sepresentaen forma de liofilizado. Se obtiene de E. coli, presenta

una purezasuperioral 95% y seutilizó en los marcajes.

Tampón. Se empleó el tampón del RIA (PUS 0.O1M pH 7.5 con cloruro

sódico 0.15M, azidasádica0.02%y USA 0.5%). Se utilizó paradiluir el patróny

reconstituirlos liofilizados de las muestrasde suerosometidasa la filtración engel.

‘[ampón ‘[ris-HCl. Incluye en su composición Tris base 0.05M y USA al

0.5% (p/v) y su pH es 7.7. Seempleóparadiluir la preparaciónde membranasy el

radioligando,así como parael lavado de los tubos.

Radioligando.Se empleó‘251-IGF-II, marcadoporel métodode la cloramina

T (Hunter, 1962)y sediluyó en tampón‘[ris-HCí paraobtenerunas10.OOOcpm/tubo.

Membrana.Se utilizarondiluidasaunaconcentraciónde lmg proteína/mlen

tampónTris-HCI.


Este método se llevó a cabo en dos días. El primer día se prepararonlas

muestras,la curva patrón y se incubaron los reactivos, y en el segundodía, se

procedióa la separaciónde la radiactividadlibre y al contajede los tubos.

La curva patróncomprendeun rango de concentracionesde 100 a 0.2ng/ml

y, al igual que las muestras,se analizópor triplicado. A los tuboscon las muestras

y los patronesse les añadiósucesivamentela dilución del radioligandoy la de las

membranasy se incubaron20 horas a 40C. Al día siguiente, se centrifugaron10

minutosa 12.OOOrpmy 4W y seaspiróel sobrenadante.Se lavó el precipitadocon

tampón Tris-HCI frío (200~l), y de nuevo se centrifugaronlos tubos durante 5

minutosa 4W y l2.OOOrpm. Finalmente,secontó el precipitadoen un contadorde

75

Materialy métodos

radiactividad-y (PackardAuto-GammaCobraII).

2.13.3.3.Cálculos.

La concentraciónde IGE-lí en las muestrasse calculó por el procedimiento

usadoenel MA de IGF-I.

‘[ECNICAS ELECTROFORETICAS.

Bajo esteepígrafesereunenunaseriede técnicasbasadasen lamigraciónque

experimentanlas especiesiónicas en un solvente(en un medio líquido) por la acción

de un campoeléctrico.

v~g.E

donde, y1 es la velocidadlineal de migración, ji, la movilidadiónica y, finalmente,

E, el campoeléctricocontinuo.

Así pues, los diferentes iones de una muestrase desplazanbajo el efecto

continuodel campoeléctrico, haciael cátodoo el ánodosegúnel signo de su carga

y a una velocidadpropia de cadauno.

Parael análisisde las muestrasse empleansoportesinertes(gelesde agarosa,

poliacrilamida...)que posibilitan:

a) la utilización de pequeñascantidadesde muestras(del ordende jil) y su

clara visualización;

b) separaciónde los componentesde la muestracon gran resolución;

c) y, tiemposde análisiscortos.

2.14. ANALISIS DE LAS PROTEINAS LIGADORAS DE LGF: WES’[ERN

BLOT.

2.14.1.Fundamento.

En el ‘Western blot”, en primer lugar se lleva a cabouna electroforesisen

condicionesno reductoraspara no desnaturalizarlas proteínas(transportadorasde

glucosa o de IGEs), para separarlas distintas IGFBPs, y a continuación,dichas

proteínassetransfierenaunamembrana(de PVDF o nitrocelulosa)que se incubará

conanticuerposespecíficoscontradeterminadasIGFBPs(‘inmunoblot’) o con 1251

IGF-I ó II (“ligand blot”, Hossenlopp,1986).

2.14.2.Electroforesis.

Se realizó con el sistemaMini ProteanII de Bio Rad(Richmond,California).

76

Materialy métodos

2.14.2.1.Preparación del gel.

El gel de poliacrilamida tiene dos zonas diferentes: una breve con una

concentraciónde acrilamidadel 5% llamadagel acumulador(almea las muestras

aplicadas)y otra que contieneun 12% de acrilamidaque separalas proteínas(gel

separador)que correna sutravés.La composicióndel gel separadores la siguiente:

agua,‘[ris-HCI 0.375M pH 8.8, SDS 0.1% (p/v), acrilamida/bis40%, APS 0.05%

(p/v) y TEMED. El gel acumuladorincluye en su composiciónlos mismosreactivos

que el separador, sólo difieren en el porcentaje de poliacrilamida y en la

concentracióndel Tris-HCI empleado,0. 125M pH 6.8 en el gel acumuladorfrente

a 0.375M pH 8.8. enel gel separador.

2.14.2.2.Preparaciónde lasmuestras.

Las muestrasse prepararonmomentosantesde su aplicación. Se diluyeron

1:10 (Westernligand blot e “inmunoblot”) (Figura5) entampónLSB 2x (Laemmli

samplebufffer, Laemmli, 1970>queestáconstituidoporTris-ilCí 0.0625MpH 6.8,

glicerol 10% (y/y), SDS 2% (p/v) y como coloranteazul de bromofenol 0.005%

(p/v). A continuación,se calentaron5 minutos a 95W, y se dejó que tomaranla

temperaturaambienteantesde su aplicación.

Comomarcadorde pesomolecularseempleóun patrónde amplio rango(6.5-

200kDa)de BioRad.

Finalmente,seaplicaronal gel las muestrasy el patrón.

2. 14.2.3.Condicionesde electroforesis.

La electroforesisse efectuóen el senode unadisolución fonnadapor glicina

192mM, Tris base 2SmM, SDS 0.1% (p/v) en aguadestiladabajo una corriente

continuade 125 V que seprolongó hastaque el frente de tinción alcanzóel borde

inferior del gel.

2.14.3.Electrotransferencia.

La transferenciaelectroforéticase realizó en el sistema Mini-trans-blot de

BioRady se utilizó como soporteparala transferenciaunamembranade nitrocelulosa

de 0.2gm de tamañode poro.

Una vezconcluidala electroforesisseextrajeronlos gelesy se sumergieron

enel tampónde transferencia(Tris base2SmM, glicina 192mM y metanol20% (p/v)

en aguaa pH 8.3). A continuación,cadage] sepusoen contactocon la membrana

de nitrocelulosay se situaronentredos láminas de papelWhatmamm3MM y dos

77

CURVA DE CALIBRACION DE IGFBP-2

- ea

1.25 2.5 5 10 ji1 suero

1200-

9

OcJ

y,

a-a-4-,

a-

y,

=

1000-

800 -

600 -

400 -

200 -

0-o

e

e

e

200 400 600

gI suero800 1000 1200

Fig 5 Curva de calibraciónde IGFBP-2.

Materialy métodos

almohadillas.Estemontaje se colocósobreun soporteparagelesque se introdujo en

la cubetade transferencia.El procesode transferenciase efectuóa 100 V durante2

horasenel tampónya señalado.

2.14.4.Western ligand blot.

2.14.4.1.Reactivos.

Los tratamientosposterioresde la membranase realizaronen un tampón

(“ligand blot buffer”, LUU) que estáformadopor ‘[ris-HCl 0.O1M pH 7.55, cloruro

sódico 0. 1SM, azidasódica0.1% (p/v) en agua. Estadisolución fue la basepara la

preparaciónde otras:

1. Solucionesparala preparaciónde la membrana:

a) Soluciónde Nonidet-P40 3% (y/y) en LBB.

b) Soluciónde USA al 1% (p/v) en LUB.

e) Solución de Tween-20al 0.1% (y/y) en LBB.

2. Solución para la incubación de la membrana. En ella se diluyó el

radioligandoy estuvoconstituidaporBSA al 1 ¼(p/v) y Tween-20al 0. 1 ¼(y/y> en

LBB.

3. Solucionesparael lavadode la membrana.

a) Solución de Tween-20al 0.1% en LBU.

b) LBB.

2. 14.4.2.Preparación de la membrana.

Antesde incubarla membranacon el radioligandosesometió a una seriede

lavadoscon los que se bloquearonsus sitios de unión libre por la exposicióna una

alta concentraciónde BSA. Así pues, la membranase lavó en primer lugar con

Nonidet-P40 a temperatuaambiente durante 30 minutos y ligera agitación, a

continuacióncon una solución de BSA durante2 horas, y finalmente, con una

disoluciónde ‘[ween-20 (10 minutos).

2. 14.4.3.Incubacióncon el radioligando.

Una vezfinalizadoslos lavados,la membranaseincubósin agitacióncon una

alícuotade unasoluciónde radioligandopreparadamomentosantes(1.5.1O~ cpm 1251

IGF-I ~ II> durante18-20horasa 4W.

2.14.4.4.Lavado y detecciónde las IGFBPs.

Finalizadala incubación,se procedióal lavadode la membranacon ligera

agitaciónparaeliminarel excesode radioligandono incorporado,primerocon LUB

79

Materialy métodos

y Tween-20(dosveces)y despuéscon LUB (3 veces)durante15 minutosa 4W. A

continuación,y una vez secala membrana,sepusoen contactocon una películay

entrepantallasintensificadorasa -800C, procediéndosedespuésa su revelado(Agfa

Curex 60).

La integraciónpor volumen de las bandasobtenidaspor el Densitómetro

Personalde Molecular Dynamics(Sunnyvale,California)se expresócomounidades

arbitrariasde la densidadóptica.

2.14.5.Western ¡nmunoblot.

2.14.5.1.Reactivos.

El posteriorprocesamientode la membranase llevó a caboen tampónTUS

(“‘[ris-buffered salme’)formadoporTris-HCI 0.05M PH 7.4 y cloruro sódico0.2M

en agua destilada.Esta disolución constituyó la base para la preparaciónde los

siguientestampones:

1. ‘[135-’[ween: TampónTUS con Tween-20al 0.75% (y/y).

2. Soluciónbloqueante:TUS-Tweenconlecheenpolvo desnatadaal5% (p/v).

Su preparaciónes extemporánea.

3. Soluciónde preincubación: TUS con 0.OSmg/ml de USA.

4. Anticuerpo primario: Se trata de un anticuerpopoliclonal obtenido en

conejos inmunizadoscontra bIGFBP-2 (de células de riñón). Se empleó al título

recomendadopor el proveedor(UBI, Inc., NY, USA), 1:2000.

5. Anticuerposecundario:Se obtiene en cabrasinmunizadascon anticuerpo

de conejo y es una Inmunoglobulina-G(U +L) conjugadacon fosfatasaalcalina

(BioRad).

6. Solucionesde revelado:

a) TampónTris-MgCI2constituidoporTris-ilCí 0. IM pH 9.5 y MgCI2

0.5mM en aguadestilada.

b) SoluciónNUT: 3Omg/ml enN,N-dimetilformamidaal 70% (y/y, en

aguadestilada).

c) SoluciónBCIP: l5mg/ml en N,N-dimetilformamida.

Las proporcionesutilizadas fueron: 100 ‘[ris-MgCI2: 1 solución NUT: 1

soluciónBCIP.

2.14.5.2.Preparaciónde la membrana.

Al igual que sucedeenel ‘ligand blot”, se debenbloquearlos sitios deunión

80

Material y métodos

libresde la membranaantesde incubaríaconel primeranticuerpo;esto se consiguió

exponiéndolaa una alta concentraciónde proteína,presenteen la lecheen polvo.

Todos los lavadose incubacionesse realizarona temperaturaambientey con

ligera agitación.Así, en primerlugar selavó la membranacon TBS-Tweendurante

5 minutos, para despuéssustituir estetampón por solución bloqueantedonde se

mantuvola membranadurante30 minutosy, finalmente,sehicierondos lavadosde

5 minutoscon ‘[US-’[ween.

2.14.5.3.Incubación con el primer anticuerpo.

Una vez finalizadoslos lavados,se incubó la membranadurante2 horascon

unaalícuotade soluciónde preincubacióndondeestabadiluido elanticuerpoprimario

al título deseadoy TUS-’[ween. Transcurridoel tiempo de incubación,se lavó la

membranauna vez en soluciónbloqueantey tres en TBS-Tween(5 minutos cada

lavado).

2.14.5.4.Incubación con el anticuerpo secundario.

Se incubóahorala membranacon unaalícuotadel segundoanticuerpoy TUS-

‘[ween duranteun tiempo que osciló entre 1 y 3 horas. A continuación,se lavó la

membranatres vecescon ‘[BS-’[ween y doscon TUS (5 minutos cadalavado) y se

secóentrepapelesde filtro.

2. 14.5.5.Detecciónde las IGFBPs.

El revelado se basa en una reacción química catalizadapor la fosfatasa

alcalinaconjugadaal anticuerposecundarioquegeneraun productoinsolubledecolor

púrpurasobrela membrana(Uers, 1985).

La membrana se sumergió en la solución de revelado durante el tiempo que

seconsideróconvenientesegúnel fondoy señaldeseados,y paradetenerla reacción

se mantuvoen un recipientecon aguadestiladadurante10 minutos.Finalmente,la

membranasedejó secarentrepapelesde filtro.

2.14.6. Western inmunoblot.

2.14.6.1.Reactivos.

Los tratamientosposterioresde la membranase realizaronen un tampón

(TUS) constituido porTris-HG lOmM pI-1 8 y cloruro sódico I5OmM. Estetampón

sirvió de baseparaotrasdisolucionesempleadasen el análisis:

1. Soluciónde bloqueo: TUS con lecheen polvo desnatadaal 5% y ‘[ween al

0.05%.

81

Material y métodos

2. Soluciónde bloqueo: Estáconstituidapor TUS y ‘[ween al 0.05%.

3. Anticuerposprimarios: Se trata de anticuerpospoliclonales(SantaCruz

Biotechnology,Inc., USA) obtenidosen carnerosinmunizadoscontrapéptidosque

correspondena los aminoácidos254-272del extremoC-terminaldel precursorde la

IGFBP-1 de ratóno a los aminoácidos288-305del mismoextremodel precursorde

la IGFBP-2 de ratón. Seemplearona un título de 1:100 diluidos enuna alícuotade

soluciónde bloqueo.

4. Anticuerpo secundario: Se trata de un complejo formado por una

Inmunoglobulina-G-peroxidasa(SantaCruz Uiotechnology)quesediluye en solución

de bloqueoa un titulo de 1:1.000.

En estos experimentos,se empleó como marcadorde peso molecularun

patrónpreteñidode amplio rango (4-25OkDa)de Novex.


Parabloquearlos sitios de unión libre de la membrana,estafue tratadacon

una soluciónrica enproteínaslácteasdurante45 minutos,a temperaturaambientey

con ligera agitación.

2.14.6.3.Incubacióncon el anticuerpoprimario.

La incubaciónde la membranacon el correspondienteanticuerpose realizó

duranteuna nochea 40C y con ligera agitación.Despuéssesumergióla membrana

en una solucióncompuestapor ‘[US y Tweenal 0.05%y seefectuarontres lavados

de 5 minutos, a temperaturaambientey con agitación.

2. 14.6.4. Incubacióncon el anticuerposecundario.

La membranase puso en contactocon el segundoanticuerpoa temperatura

ambientedurante60 minutos, con ligera agitación. A continuación,serealizaron4

lavadosigualesa los anteriores,de 5 minutosde duración, a temperaturaambiente

y con agitación; los 3 primeros lavadosse efectuaroncon TUS y Tween al 0.05%,

y el último sólo con TUS.

2.14.6.5.Detecciónde las IGFBPs.

La visualización de las IGFUPs se logró mediante la técnica de

quimioluminiscencia.La peroxidasaligada al segundoanticuerpoen presenciadel

peróxido de hidrógenooxida al luminol; en este proceso se generauna molécula

intermedia emisorade luz que es capaz de impresionaruna película. La señal

obtenidaes proporcionala la cantidadde complejo imnunológicoquehay sobre la

82

Materialy métodos

membrana,esto es, a la cantidadde proteína(IGFBP-1, 2 o como veremosmás

adelante,GLU’[-1, 2 ó 4) previamentetransferidaa esta.

La membranasetratóconlos reactivosde unkit suministradoporAmersham

(ECL), y la intensidadde las bandasobtenidasse cuantificó en un Densitómetro

Personal(MolecularDynamics).

2.15. ANALISIS DE LOS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA (GLUTs):

WES’[ERN INMUNOBLO’[.

El procedimientoseguidofue la técnicadel ‘Western blot”, cuyos detallesse

han descrito en el apartado anterior. En este caso, las condiciones para la

electroforesisy electrotransferencia,al igual que la composiciónde los geles de

poliacrilamida,fueronlas mismasqueallí sedescribieron.No obstante,cabedestacar

varios aspectosque fueron distintosenestecaso:

a) Las muestrasse pusieronen contactocon el LSB a temperaturaambiente

durante30 minutos,no se calentaron.

b) La electrotransferenciano se efectuósobreunamembranade nitrocelulosa

sino sobre una de difluoruro de polivinilideno (Immobilon, Millipore) que

previamentehabíasido sumergidaen metanol(30s)y, a continuación,enagua(60s>.

c) El marcadorde pesomolecularutilizado fue la fumarasa(48.500Da)por

su similitud con el pesomolecularde los GLUTs (Sigma).

2.15.1.Preparación de las muestras.

2.15.1.1.Reactivos.

La extracciónde las membranasse llevó a cabo en distintos tamponesen

funcióndel tejido que se tratara.

1. Tampónde homogeneizaciónde los tejidos muscularesy corazón: Está

constituidoporHEPES2SnM, sacarosa25OmM, EDTA 4mM, benzamidina2SmM,

PMSF 0.2mM, inhibidor de tripsina IU/ml y pepstatina lgM a pH 7.4. Esta

disolución tambiénse empleópara la resuspensiónde estostejidos.

2. Tampónde homogeneizacióndel hígado:EstáformadoporHEPES25mM,

sacarosa2SOmM, EDTA ImM, DTT 3mM, PMSF 0. ImM e inhibidor de tripsina

0.26U/ml a pH 7.4.

3. Tampónde resuspensióndel hígado:Se componede Tris SOmM, sacarosa

25OmM, cloruropotásico lOOmM y cloruro de magnesio5mM a pI-! 7.4.

83

Material y métodos

2.15.1.2.Extracción de las membranas de tejidos muscularesy corazon.

El procesoseguidopara obtenerla fracción membranosacruda (membranas

globales) fue descrito por Santalucíay col. (1992). Los tejidos (0.3-0.5g) se

homogeneizaronen 10 volúmenesde tampónde homogeneizacióny se centrifugaron

a 40C y 15.OOOg,durante20 minutosen el caso de los músculosesqueléticosy a

10.OOOg, 5 minutos cuando se trató de músculo cardíaco. Los sobrenadantes

obtenidosseenriquecieronenclorurode potasiohastaobteneruna concentraciónde

0.8M. Se incubaron 30 minutos a 40C con agitación y, a continuación, se

centrifugaron: el extracto cardíacoa 150.OOOg, durante2 horas, y los extractos

procedentesdel gastrocnemiusy el cuadricepsa 200.OOOg, 1.5 horas.El sedimento

obtenido se resuspendióen el tampón empleadopara la homogeneización,y tras

determinarla concentraciónproteica del extracto se almacenóa -800C hasta el

momentode suanálisis.

2.15.1.3.Extracciónde las membranashepáticas.

El método aplicadoparaextraer la fracciónmembranosafue una adaptación

del descritoporThorensy col. (1988).Separtióde unos0.2gde tejido, que unavez

homogeneizadosen 10 volúmenesde tampón, se centrifugarona 40C y 8.OOOg

durante10 minutos.El sobrenadantese volvió a centrifugardurante20 minutosa la

misma velocidad y el nuevo sobrenadantese centrifugó a 150.OOOg durante40

minutos. El sedimento obtenido se resuspendióen un tampón distinto al de

homogeneizacióny finalmenteseanalizósu concentraciónproteicay se almacenóa -

800C.

2.15.2.Westerninmunoblot. (Figura 6)

2.15.2.1.Reactivos.

1. Soluciónde bloqueo: PUS (NaCí 0.135M,KCl 2.7mM, KH2PO4 1.4mM,

Na2HPO48mM, PH 7.4) con leche en polvo desnatadaal 5%. Su preparaciónes

extemporánea.

2. Anticuerposprimarios: Se trata de anticuerpospoliclonales(Uiogénesis)

obtenidosen conejosinmunizadoscontra:

- un péptido que incluye los 12 aminoácidosdel extremo C-terminal del

transportador(anti-GLU’[-4);

- un péptidosintéticode secuenciabasadaen la previstadel GLU’[ delcerebro

de la rata(anti-GLUT-1);

84

CURVA DE GALIBRACION DE GLUT-1

3000 -~

xx.

o

s7

e—,

.7

5 10 15 20 25

gg proteínas

oo4,

jA

a-a-4-

.0

y,4,

2500 -

2000 -

1500 —

1000 -

500-

Fig 6 Curva de calibración de GLUT-1.

Materialy métodos

- un péptido sintético que incluye los 25 aminoácidosC-terminalesde la

secuenciadel GLUT-2 de rata y otro péptido que contiene los 13 aminoácidos

terminalesdel mismo tramo.

Se utilizaron a un titulo de 1:1.000parael GLU’[-2 y 4 y de 1:5.000 para

GLUT-1 diluidos en PUS con USA al 3% y azidasódicaal 0.02%.

3. Soluciónde lavado: PUS conTweenal 0.1%.

4. Anticuerpo secundario: Consiste en un complejo formado por

Inmunoglobulina-G-peroxidasa(Sigma)que se diluyó en PUS con leche desnatadaal

1% y’[ween al 0.05%.


Despuésde la electrotransferenciase procedióal bloqueode los sitios de

ligadura inespecíficade la membranamedianteel tratamientocon una soluciónrica

enproteínaslácteasdurante2 horas,con ligera agitacióny a temperaturaambiente.

2.15.2.3.Incubacióncon el anticuerpoprimario.

Se incubó la membranaconel anticuerpocorrespondienteduranteuna noche

a 40C y conuna ligera agitación.A continuación,sesumergióla membranaen una

solución de PUS con Tween y se hicieron 4 lavadosde 10 minutos a 370C y con

agitación.

2. 15.2.4. Incubacióncon el anticuerposecundario.

Sepusoencontactoahorala membranaconel segundoanticuerpodurante60

minutos, a temperaturaambientey con ligera agitación.Transcurridoel tiempo de

incubaciónserealizaron4 lavadosigualesa los anteriores(10 minutos,37W y con

agitación).

2.15.2.5.Detecciónde los GLU’[s.

Paravisualizar los GLUTs se utilizó la técnicade quimioluminicencia,y la

cuantificacióndel volumende la manchase realizóen un densitómetro(Molecular

Dynamics).

Destacamosque la puesta a punto del método de determinaciónde los

transportadoresde glucosa fue realizadacon la colaboracióndel Dr. Fernando

EscriváPons,pertenecientea nuestrogrupode investigación,a quienagradecemos

de nuevo su ayudadesinteresada.

86

Materialy métodos

2.16. ANÁLISIS DE EXPRESION DE IGFs E IGFBPs: ENSAYO DEPROTECCION DE RIBONUCLEASAS.

2.16.1. Extracción del ARN total.

2.16.1.1.Preparación de las muestras.

El ARN total se preparóporhomogeneizaciónde los tejidosen tiocianatode

guanidinasegúnel métododescritoporChomczynskiy Sacchi(1987). Separtió así

de una pequeñacantidadde hígadoque se homogeneizóenuna disoluciónformada

porun 45% de soluciónD (tiocianatode guanidina4M, citrato sódico25miM pH 8

y lauril sarcosina0.5%),50% de fenol, 4% de acetatosódico2M y un 10% de CIA

(cloroformoy alcohol isoamílico en una proporción24:1). El ARN así obtenidose

purificó medianteuna segundaextracción,se resuspendióen EDTA 0.5mM y, por

último, seprocedióa su valoracion.

1. Valoracióndel ARN

.

a) Cuantitativa

.

El ARN total secuantificócomparandola absorbanciade la muestracon un

blanco(ED’[A 0.5mM y agua)a tres longitudesde ondadiferentes:260nm(máximo

de absorcióndel ADN y ARN), 2SOnm (máximo de absorciónde las proteínas)y

3 lOnm (máximo de absorciónde impurezas).Estaoperaciónnospermitió conocerla

concentraciónde la muestra (medida de la absorbanciaa 260nm), eliminar las

interferenciasdebidasa las impurezasy tambiénestimarla calidaddel ARN extraído

medianteel cocientede la absorbanciaa 260 y 280mn,de maneraque las muestras

cuya relación 260/280no oscilabaentre 1.7 y 2.2 fueron desechadas.

b) Cualitativa: Electroforesis

.

Las muestrasse sometierona una electroforesisengel de agarosa,lo que nos

permitió confirmar la integridaddel ARN y normalizarsu cantidaden las distintas

calles.

- Preparacióndel gel: Paraprepararel gel se hirvió la agarosadisueltaen la

solucióntamponadora(Mops 2OmM, acetatode sodio 5mM y ED’[A lmM) enuna

proporcióndel 1.1%. A continuación,se le adicionóformaldehído(15%) y seesperó

hastasu compactación.

- Preparaciónde las muestras:Las muestrasseprepararonmomentosantes

de su aplicación. Se tomóel volumennecesarioparaaplicar una cantidadde ARN

determinaday se igualaronvolúmenescon agua.A continuación,se le adicionóun

87

Material y métodos

volumende tampóndesnaturalizante(67% formamida,13% de formaldehídoy 20%

de Mops 0.2M, acetatode sodio 5OmM y EDTA lOmM) y un 4% de bromurode

etidio parateñir las bandasde ARN ribosomal 18 y 28 s. Finalmente,secalentaron

las muestrasdurante5 minutosa65Wy seles añadióun 10%deazuldebromofenol

(colorantede la electroforesis).

- Condicionesde la electroforesis:Paralaelectroforesisseempleóel sistema

SubcellElectrophoresisCelí de BioRad (Richmond,CA) y se empleócomo tampón

electrodo Mops (Mops 2OmM, acetato de sodio SmM, EDTA lmM). La

electroforesisseefectuó concorrientecontinuaa 50 V durante4 horas.

2.16.2.Ensayode protecciónde ribonucleasas.

2.16.2.1.Fundamento.

El análisissebasaen la hibridaciónen solucióndeuna ribosondaconel ARN

de unamuestra,la digestiónde los fragmentosno hibridadosy laposteriorseparación

de esos híbridos en geles de poliacrilamida. Para ello, se parte de un ADNc

plasmídicodonde se encuentrael inserto correspondientea los diferentesIGFs e

IGFBPs.Así, enpresenciade una ARN polimerasa,y a partir del promotordel ADN

plasmídico,se inicia la síntesisde una cadenade ARN marcadaradiactivamentecon32P-U’[P (ribosonda) que va a ser complementariaa la cadena de ADN. A

continuación,se adicionala ribosondaa la muestrade ARN dondehibridarácon los

tránscritosde ARN complementarios.Finalmente, los fragmentosde ARN no

hibridadossondegradadospor las ARNasasy los híbridos (ARN-ARN) seseparan

en gelesde poliacrilamida.

2.16.2.2.Preparaciónde lasmuestras.

Despuésde comprobarla integridaddel ARN y normalizadasucantidadpara

los distintos gruposexperimentales,se prepararonlas muestraspara su análisis.

La cantidadde ARN total hepáticoutilizado paralos diferentesestudiosfue

de 20jtg; se igualaron los volúmenesde las muestrascon aguaDEPC y sedejaron

precipitandoen 0,1 volúmenesde acetatosódico3M y 2.5 volúmenesde etanolpuro

a -20W hastael momentode su análisis.

2.16.2.3.Síntesisde la ribosonda.

2.16.2.3.1.Reactivos.

1. ARNasaA (50u/mg):enzimaextraídade páncreasporcinoy proporcionada

porBoehringerMannheim(Leverkusen,Alemania).

88

Materialy mÉtodos

2. ProteinasaK (20u/mg): se trata de una endopeptidasaobtenida del

Tritiriachum album (BoehringerMannheim).

3. BcoRI (lOu/gl): enzimade restricciónservidaporBoehringerMannheim.

4. Hind III (lOu/¡xl): enzimade restricción obtenidade Boebringer Mannheim.

5. SistemaribosondaGemini III Care: seempleóparagenerarlas sondasde

ARN (Promega, Madison, WI, USA) e incluía los componentesnecesariospara la

reacción de transcripción, como son: ‘[SC (tampón de transcripción), DT’[

(antioxidante),ARNsin (inhibidor de ARNasas),dN’[Ps (nucleótidosno marcados:

dA’[P, dC’[P, dGTP y dU’[P), ARN polimerasas(‘[7 y SP6).

6. ADNasa1 (lOu/gl): enzimaextraídade páncreasporcino, libre de ARNasas

que fue adquiridade UoehringerMannheim.

7. 32P-UTP(lOmCi/ml): nucleótidomarcado(Nuclear Ibérica, Madrid).

2.16.2.3.2.Obtencióndel plásmido.

1. Crecimientode las bacterias

.

Las bacteriasse sembraronenun medio constituidoporagary ampicilina, lo

que nospermitió el aislamientode las cepasde E. coli resistentesa esteantibiótico,

ya que sonestaslas que presentaronel plásmidoque incluía el ADNc de los IGFs y

las IGFBPs.

Una vez aisladas las bacterias, se cultivó una colonia en un caldo LU

(triptona, cloruro sódicoy extractode levadura)con ampicilina (SOgg/ml) a 37W

durante8 horas.

2. Aislamientodel plósmido

.

Paraextraerel ADNc plasmídicose rompió la paredbacterianamediantela

adición de una pequeñacantidadde lisozima, y la membranaplasmática,con ayuda

de la soluciónde lisis (hidróxido sódico2.4mM y SDS 0.12%)y se precipitaronlas

proteínasy el ADN cromosómicocon acetatopotásico 1.SM pH 4.5 y el ADN

plasmidicocon isopropanol.EsteADN plasmídicoasíobtenidose purificó mediante

la adición de ARNasaA (lOmg/ml) y proteinasaK (250gg/ml)que elimininaronel

ARN y las proteínas,respectivamente.Tras la adición de PMSF, se añadiófenol a

la mezcla y se reprecipitó el ADN plasmídicocon acetatosódico 0. I5mM y un

0.38% de etanol.

El ADN plasmídicose resuspendióen TE pH 8 (Tris base lOmM y EDTA

0.lmM) y se procedióa su valoración.

89

Material y métodos

3. Valoración del ADN

.

a) Cuantitativa

.

Al igual queenel casode la valoracióndel ARN, la concentracióndel ADN

secuantificópor la medida de las absorbanciasde la muestra(ADN y agua) frente

a un blanco(TE y agua> a las tres longitudesde ondaya mencionadas:260, 280 y

3lOnm. ‘[ambién, como en el casodel ARN ya mencionado,semostróuna especial

atenciónal cocienteresultantede la relación260/280.

b) Cualitativa: Electroforesis

.

Las muestrasdeADN plasmídicosesometieronaunaelectroforesisengel de

agarosapara confirmar su integridad.

- Preparacióndel gel: Sehirvió unaproporciónde agarosadel 1 ¼en solución

tampón(TAE pH 7.2, Tris base1.6M, acetatosódico0.8M, EDTA 4OmM) y cuando

la mezclaestuvotransparente,sedejó enfriarunosminutosy sevirtió enel soporte.

- Preparaciónde las muestras.Se tomóunapequeñacantidadde muestra(1-

1.5~¿l), se diluyó en el tampón de electroforesis(1:5) y se le adicionó un 10% de

colorante(azulde bromofenol).

En todoslos gelesseincluyó ademásun standard(LambdaDNA-Hind III) que

nos ayudóa conocerla concentraciónde cadabandapor su intensidady su peso

molecular.Estestandardfue tratadode la misma maneraque las muestras.

- Condicionesde la electroforesis: Parala electroforesisseempleóel sistema

Mini-Subcell ElectrophoresisCelí de BioRad (Richmond, CA) y se utilizó como

tampónde electrodoTAE con bromuro de etidio al 0.075%. La electroforesisse

realizócon corrientecontinuaa 70 y duranteuna hora.

2.16.2.3.3.Linearizacióndel plásmido.

Una vez comprobadala integridaddel ADNc se procedió a linearizar el

insertoen el que se encuentrael vectorqueexpresalos IGFs y las IGFUPs. Esto se

consiguióincubandouna cantidadde ADNc plasmidico(2OO~g-1mg)con la enzima

de restriccióny su tampónespecíficospara cadainserto(Tabla 2):

90

Material y métodos

Tabla 2.- Enzimasde restricción.

ADNe INSERTO ENZIMA DE RESTRICCION TAMPON

IGF-I pGEM-3 Hind III B

TOP-II pGEM-3 Hind III B

IOFBP-1 pGEM-3 Hiod III B

IGFBP-2 pOEM-4Z Hiud III B

IGFBP-3 pOEM-4Z EcoRí H

La incubacióncon la enzimase realizó a 37W durante8 horas y en las

proporciones:83 agua: 6 ADN: 10 buffer RE: 1 RE. A continuación,y una vez

terminada la digestión se procedió a purificar el plásmido mediante repetidas

extraccionescon fenol y porúltimo, por precipitacióncon 0.83% de etanol puroy

acetatosódico0. l2mM.

El ADNc plasmídicose resuspendióen TE y se valoró para comprobarsu

correctalinearización.En estecaso,el gel mostróuna únicabandacorrespondiente

al ADN línearizadoy e! standardLambda DNA-fUnd III (49O~g/ml, Promega)nos

permitió comprobarque su peso molecular correspondíaefectivamentea dicho

inserto.

2.16.2.3.4.Marcajede la ribosonda.

Estaetapaincluye dos partes:reacciónde transcripción(síntesisde la sonda

de ARN) y reacciónde la ADNasa (destruccióndel ADNc plasmídico).

1. Reacciónde transcripción

.

Las ribosondasse construyeronsegúnlas técnicasdescritasporLowe y col.

(1987). Segeneraronlas sondasmarcadaspor la incubacióndel plásmidolinearizado

(200-400ng/pl)con 32P-UTP(a) y con los demásnucleótidosfríos (dA’[P, dGTP y

dCTP) en presenciade la ARN polimerasa adecuada(Tabla 3) y de estamanera, se

construyeronribosondasantisentido(complementariascon el ADN).

91

Materialy métodos

Tabla 3.- ARN polimerasas.

RIBOSONDA ARN POLIMERASA TAMAÑO FRAGMENTO PROTEGIDO

IGF-I T7 IGF-Th 224bp y Ib 386bp

¡GE-II T7 500bp

IGFBP-I SP6 300 y lOObp

IGEBP-2 SP6 550bp

IGFBP-3 T7 343bp

2. Reacciónde la ARNasa

.

Se procedióa la eliminacióndel ADN mediantela digestióncon la ADNasa

1 y a continuación,a la purificacióndel ARN pormedio de extraccionescon fenol

y una primeraprecipitacióncon acetatosódico0.O6mM y 70% de etanol. Después

se volvió a precipitarcon acetatosódico0.O4mM y un 98% de etanoly seprocedió

al contajede unapequeñaalícuota(igl) en uncontadorde centelleo(1209Rackbeta

LKU Wallac).

2.16.2.3.5.Hibridación en solución.

2.16.2.3.5.1.Reactivos.

1. ARNasa T1 (l0O.OOOu/ml): enzima obtenida de Aspergillus oryzoe y

proporcionadaporUoehringerMannheim.

2. ARNt: seobtienea partir de la levadurade la cervezay ayudaa precipitar

el ARNm (UoehringerMannheirn).

2.16.2.3.5.2.Hibridación de la ribosonda.

El ARN total hepático(2Opg)obtenidode los diferentesgruposexperimentales

fue hibridadocon 500.OOOcpmde la ribosondamarcadadurante18 horasa 45W en

una solución que conteníaformamida al 75%, Tris SOmM, EDTA 4mM, cloruro

sódico 1.6M y SDS al 0.4%.

2.16.2.3.5.3.Digestión de la ARNasa.

La digestiónde los fragmentosde ARN no hibridados se realizó con 4Opg/ml

de ARNasaA y 2kg/ml de ARNasa‘[~ (Lowe, 1987; Hernández,1990)duranteuna

hora a 37”C. A continuación, se purificaron los fragmentosprotegidos, previa

eliminación de las ARNasascon ayuda de proteinasaK (0.2pg/ml), mediantela

extracción con fenol y cloroformo seguida de una precipitación con etanol.

Finalmente,los híbridosfueron sometidosa la electroforesis.

92

Material ymétodos

2.16.2.3.5.4.Electroforesis.

Los híbridosprotegidos(ARN-ARN) se sometierona electroforesisen gel

desnaturalizantey se empleóel sistemaSequi-genII SequencingCelí de BioRad.

1. Preparacióndel gel

.

La polimerización del gel seprodujo en el aparato, y se llevó a cabo por la

adición a una soluciónformadapor poliacrilamida8%, urea 8M y ‘[BE 5% (Tris

base 1M y ED’[A disódico 2OmM), un 0.037% de TEMED y APS 0.l3mM. El

espesordel gel fue de 0.2 mm.

2. Preparaciónde las muestras

.

Las muestrasfueron tratadasconun tampón que conteníaun colorante de

electroforesisconstituidopor xileno cianol al 1% y azul de bromofenolal 1 %. A

continuación,secalentaron3 minutosa 95Wy se enfriaronen hielo.

En todos los geles se incluyeron, ademásele las muestras,carriles para la

ribosondano tratadaconARNasas(controlnegativo)y parala ribosondadigeridacon

ARNasas(control positivo).

3. Condicionesde la electroforesis

.

Se efectuóen tampón de electrodoTBE (Tris base 1M, ácido bórico 1M,

ED’[A disódico2OmM) a 40 W hastaque el frentede tinción del colorantealcanzó

la parteinferior del gel.

2.16.2.3.5.5.Cuantificación densitométrica.

La autorradiografía serealizó a -800C poniendo en contacto el gel con una

película.Las bandas,querepresentanlos fragmentosprotegidos,secuantificaronpor

densitometría(Molecular Dynamics).

Destacamosy agradecemosde nuevo la colaboracióndel Dr. Luis Goya

Suárez,compañerode nuestrogrupo de investigación,por su ayudaen la puestaa

punto del análisisde protecciónde la RNasa.

2.17. OTRAS DETERMINACIONES ANALíTICAS.

2.17.1.Análisis de la glucemia.

2.17.1.1.Glucosaen sangre.

La determinaciónse realizó en un analizadorReflolux II M (Boebringer

Mannbeim); setratade un aparatoportátil frecuentementeutilizado por las personas

93

Materialy métodos

diabéticaspara el autocontrolde su glucemia. Es un fotómetro de refexión cuyo

funcionamientosebasaen la coloraciónde una tira de plásticoencuyoextremohay

una zona impregnadade reactivo. Dicha zona se divide en dos mitades que se

colorean con distinta intensidady son leídaspor un sistemade doblehaz, lo que

permite un amplio intervalo de medición (10-SOOmg/lOOml). El tiempo total

empleadoen la determinaciónfue de 2 minutos.

2.17.1.2.Glucosaen sangredesproteinizada.

La desproteinizaciónde la sangre(30¡íl) se efectuó conuna mezclaa partes

iguales(150M1) de sulfato de cinc e hidróxido de bario (mezclade Somogyi). A

continuación,se centrifugó durante5 minutos a 13.OOOrpmy se analizóla glucosa

porel métodode la glucosaoxidasa(GOD) en sOgl del sobrenadante.

Este análisis se basa en que la glucosa-oxidasacataliza la oxidaciónde la

glucosaa gluconato,reacciónque se acoplaa una oxidaciónde un cromógenoque

generaun compuestocoloreadopor la acciónde la peroxidasa(POD):

GOD

a) Glucosa + 02 + 1120 > Gluconato+ 11202

POD

b) 11202 + Cromógeno > Compuestocoloreado+ 1120

La medidade la absorbanciaa 420nm(máximodel compuestocoloreado)de

las muestrasse comparócon la ofrecida por una solución patrón de glucosa de

9. lmg/ml (UoehringerMannheim), lo que permitió el cálculo de la concentración

sanguíneade glucosasegúnla expresión:

AproblGma x 100= mg glucosa/loo ml sangreApatr6n

2.17.2.Determinación de las proteínas.

Las proteínasde los diferentesextractoscrudosde membranasedeterminaron

porel métodode Uradford(1976),utilizandounasoluciónde lmg/ml de ‘y- globulina

comostandard(Sigma).Se trata de un ensayocolorimétricobasadoen el cambiode

absorbanciaque experimentauna soluciónácidade CoomassieUrillant Ulue G-250

94

Materialy métodos

(465nm) cuando se pone en contacto con proteínas (595nm).

Se preparó una curva patrón a partir de la solución standard que abarcó desde

O-4Omg/ml. A continuación, a los tubos de la curva patrón y a los problemas se les

añadió imí de reactivo de coloración (BioRad Potein Assay) previamentediluido

(1:5) y filtrado. Por último, tras 5 minutos de incubación en la oscuridad, se procedió

a la lectura de los tubos en el espectrofotómetro a 595nm.

La concentración proteica de los extractos de membrana se conoció por la

interpolación de los valores de sus absorbancias sobre la recta de la curva patrón.

2.18. CÁLCULOSESTADISTICOS.

Los resultados se expresan como media + desviación standard (D.S.).

- > (~1 3~)2 n.s

.

n-1

El número de datos de cada población (u) se detalla en cada experimento

concreto.

En todos los casos, de manera previa al análisis estadístico pertinente, se

aplicó el test de la X2 para rechazar aquellos datos que se hallaban sensiblemente

alejados de la media y que no se incluían dentro del intervalo

x2z(1 x)~

donde X2 se determinó en las tablas correspondientes en función del número de datos

que quedaban fuera del intervalo definido.

2.18.1.Análisis de la varianza.

El grado de significación estadística de la diferencia entre las medias de dos

poblaciones se determinó mediante el análisis de la varianza (ANOVA> de una vía

(muestras independientes) o de dos vías (muestras apareadas). Este análisis consiste

en comparar las varianzas S~2 (variabilidad de los datos dentro de cada muestra

debida sólo al azar) y ~E2 (variabilidad entre las muestras debida al azar y, si las

95

Materialy métodos

mediasson distintas, a que las muestrasprocedende poblacionesdistintas) por el

procedimiento de la F de Snedecor(Snedecor,1956). Cuando el ANOVA es

significativo o se busca qué media son igualesy cuálesdistintas, se comparala

cantidadexperimental

texp= ‘321 1

$1, (— + —)n. n

1 .1

con una ta(f;k) con f= número de datos totales - número de grupos y k= número

de comparaciones a analizar. Esta cantidad tcx se determina en las tablas

correspondientes según el test a aplicar, que depende a su vez del objetivo y la

planificacióndel experimento.Una diferenciaseconsiderósignificativa a partir de

p<O.05.

2.18.2.Regresiónlineal y correlacion.

El análisis de regresión lineal se llevó a cabo por el método de los mínimos

cuadrados. Para verificar si la correlación obtenida era significativa se comparó el

valor experimental (texp) con una kv de n-2 grados de libertad:

texp= (n-2>r21 -r2

donder es el coeficientede correlacióny n el númerode parejasde datos.

Se consideróquehabíasignificacióna partir de p <0.05.

96

RESULTADOS

Resultados

3. RESULTADOS.

3.1. ‘[IROIDECTOMIA (‘[)Y TRATAMIENTO CON METIMAZOL (MMI) EN

PERIODO NEONATAL.

3.1.1. Evolución del pesocorporal.

Seestudiael pesocorporalde los animalesneonataleshipotiroideosde 10, 15

y 20 díasde vida, tanto de los tiroidectomizadosquirúrgicamente(5, 10 y 15 días

después de la operación) como de los tratados con MMI.

La Tabla 4 muestra el esperado incremento del peso de los animales en

relación a su edad, tanto en la población control como en las hipotiroideas

(tiroidectomizaday tratadacon MMI), aunque siempreel peso corporal estuvo

disminuido respectoa las ratas control en ambaspoblacioneshipotiroideas. No

obstante,cabedestacarqueestadisminuciónen el pesode los animaleshipotiroideos

fue más acusada en el caso de la población tiroidectomizada (a los 10 días de vida fue

de un 9.28% y, a los 20 días de vida, de un 40.19%) que en la tratada con MMI (a

los 10 días de vida fue de un 0.47% y, a los 20 días de vida, de un 17.45%) respecto

a los controles,sin embargo,en amboscasos,a los 10 díasde vida, la diferencia

encontrada respecto a la población control estaba ya disminuida.

3.1.2. Niveles séricosde ‘[~ y ‘[4 y plasmáticose hipotisariosde GH.

De un modo análogo a lo que sucedíacon el pesocorporal, las hormonas

tiroideas circulantes disminuyeron en ambos grupos de animales neonatales

hipotiroideosrespectoal control(Figura7) y ya, a los 10 díasde vida (5 díasdespués

de la operación),se encontróuna diferenciaentre los niveles de ‘[3 y ‘[4 de las

poblacioneshipotiroideas(tiroidectomizaday tratadacon MMI) respectoa la control.

La disminuciónen las cifras de ‘[3 a estaedad(10 díasde vida) fue de un 55.29%

paralas ratastratadascon MMI y de un 70.64%paralas tiroidectomizadasrespecto

a los animalescontrol, mientrasque en el casode la 14, el descensoen los valores

circulantesfue de un 92.77% y un 91.19% para aquellas ratas a las que se le

administró MMI y operadas, respectivamente, siempre respecto a los valores control

a los 10 días de vida; por consiguiente,los animalestratadoscon MMI también

mostraron unos niveles de hormonas tiroideas muy disminuidos respecto a los de la

poblacióncontrol,aunquelos nivelesde descensode T3 no fuerontanbajos como en

las tiroidectomizadas.

En los animales tiroidectomizados, de forma inesperada, los niveles

98

Tabla 4.- Pesocorporal, nivelescirculantesde glucosa,GH y contenido hipofisario de GH de ratasneonatales tiroidectomizadas (T), controlesy tratadascon MMI (MMI) sacrificadasa los 10, 15 y 20 díasde vida (5, 10 y 15 díasdespuésde la tiroidectomía)(ddT). Media de 8-10 animales±DS.

OlAS DESPUES1 (ddT)Díasde vida

Pesocorporal(g)TControlesMMI

15.35 + 1.02’16.92±0.47

16.84 ±035’b

2311 ±1.23’30.29 + 0.29

28.09 + 0.27a.b

24.85 ±0.83~41.55±0.71

34.30 + 0.95’’

GH plasmática(ng/mi)1Controles

MMI

226.93 ±38.02’110.34 + 13.21

26.30±1,79’,b

81.78 + 16.0171.76 + 220

4.81 + 0.26&b

7.70 ±0.52’211 ±0.15

2.57 ±07¡b

GH hípofisaria(pg/mg)1Controles

MMI

3.69 + 0.01’2.57 + 0.09

1.39 + 0•01a.b

2.97 + 0.023.00 + 0.06

2.79 + 0.08’

11.55 ±0.15’11.13 ±0.35

¡0.32 ±008’,b

Glucemia(mg/[OCmI)1ControlesMMI

103.79±2,96’124,31 + 1.17122,61 + 1.2V’

11341 + 1.08’12491 + 3.09118.54+ 257b

105.92±4.85’131.62±1,69127.29 ±4.39

5 ddT (10) 10 ddl (15) 15 ddT (20)

< 0.05 respectoa las ratasCbp < 0.05 respectoa las ratas1

lOddT

15

l5ddT

20 Ox.mC

~ MMI

l5ddT

20 Dv.

Fig 7 Nivelesde T3 <A) y T4 (E) en suero de ratas neonatalestiroidectomizadas(T),controles(C) y tratadas con MMI (MMI) de 10, 15 y 20 díasde vida (5, 10 y ¡5días despuésde la tíroidectomía) determinadospor MA. Media + DS cte 8-JOanimales.* Significaciónestadísticarespectoa los valoresdela poblacióncontrol.

A T3

ng/di100

80

60

40

20

o

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5ddT

10

B 14

ug/dt8]

7—

6

5

4

3

2

o

*

*

*

5ddT lOddT10 15

Resultados

circulantesehipofisariosde GH aumentarona los 5 y 15 díasdespuésde laoperación

(10 y 20 díasde vida) respectoa los valorescontrol (Tabla4); sin embargo,a los 15

días de vida (10 días despuésde la tiroidectomía)no se encontrarondiferencias

significativas entre ambos grupos de animales, aunque se mantuvieronaltos,

probablementepor falta de población.Por el contrario, las ratastratadascon MMI

presentaronunosnivelesde Gil plasmáticainferioresa los de los animalescontrol

(‘[abla 4) en un 76.16%y un 93 .30% a los 10 y 15 díasde vida respectivamente,

aunquea los 20 días de vida, ambaspoblacionespresentaronuna concentraciónde

estahormonacirculantesimilar. Del mismomodo,a nivel hipofisario,estosneonatos

tratadoscon MMI presentaroncontenidosen Gil inferiores a los de la población

control.

En las tres etapasestudiadas,la poblacióncontrol mostró un incremento

progresivo asociado a laedaden los nivelesde T3 y el contenidode GR enpituitaria,

mientras que las cifras de Gil plasmática disminuyeron. Por otra parte, en los

animales hipotiroideos (tiroidectomizadosy tratados con MMI) se observóuna

alteraciónde la pautaseguidaduranteel desarrolloporestashormonas.

3.1.3. Glucemiae insulinemia.

Los valoresde glucemiade los animalestratadoscon MMI fueron similares

a los control,pero lascifras de glucosaen sangrede las ratasoperadasdisminuyeron

respecto a las de la población control, por lo que la glucemia de las ratas

tiroidectomizadastambiénfue inferior a la de aquellos animalesa los que se les

administró el fármacobociógeno(Tabla 4).

La insulina plasmática de la población hipotiroidea tratada con MMI

disminuyó respecto a los animales control en una proporciónque osciló desdeun

28.92% a los 10 díasde vida hastaun 37.55% a los 20 días de vida (Figura8). Sin

embargo,la insulinemiaaumentóen los animalesoperadosrespectoa los controles

(27.48% a los 10 días de vida, y 42.59% a los 20 días de vida), lo que podría

explicar el hecho de que los animales operadospresentaranniveles de glucosa

sanguíneainferioresa los de los animalescontrol.

3.1.4. Factores de crecimiento similares a la insulina (IGFs): niveles

séricosy expresión del ARNn’ hepático.

3.1.4.1.Niveles séricos.

Los nivelesde IGF-I en suerode rata control experimentaronun incremento

progresivoentre los 10 y 20 díasde vida, pasandode 178.05 a 255.SOng/ml(Figura

101

A IGF-I B ¡OF-II

ng/ml ng/ml350 400

300

250

200

200

150

1 00100

50

oISddT

20 0>

C INSULINA

,jU/mI70

60

50

Fig 8 Niveles circulantes de ¡CF-! (A), ¡CF-JI

40 (BJ e insulina (C) de ratas neonatalestiroidectomizadas (7), controles ((9 y

so tratadas con MMI (MMI) de 10, 15>’ 20días (5, 10 y 15 días despuésde latiroidectonila). Media + VS de 8-10

20animales. * Sign~caciónestadísticarespecto a los animales control.

lO ~ Significaciónestadistica respectoa la

población tiro idectonilzada.O

5ddT loddT lSddT

lO 15 20 DV.

-c MMI

300

o5ddT lOddT lSddT SddT 1OddT

lO 15 20 Dv. lo 15

Resultados

8). De manera análoga a lo ya descrito para la insulina, los animales

tiroidectomizadospresentaronnivelesdeIGF-I ensuerosignificativamentesuperiores

a los de sus controlesen todaslas edadesanalizadas.En las ratastiroidectomizadas,

los nivelesdel péptido fueronun 71.60%(10 díasde vida), un 128.49%(15 díasde

edad) y un 64.40%(20 díasde vida) superioresa los de sus controles.

Los niveles séricos de IGF-I de los animalestratadoscon MMI, por el

contrario, disminuyeronrespectoa los de los controles,de manerasimilar a lo que

ocurriócon la insulinemia.Estedescensodel IGF-I circulantesecifró enun 54.75%

a los 10 días de vida y alcanzóhastaun 65.12%a los 20 díasde vida.

En cualquiercaso, el hipotiroidismo causó, al igual que en el caso de la

insulina, un transtornoenel patrónde cambiosde los nivelesde IGF-I asociadoa la

edad.

En la Figura 8 serepresentan las concentracionesde IGF-II existentesen el

suero de las poblacionesde ratas neonataleshipotiroideas (tiroidectomizadasy

tratadascon MMI) y controles. En los animalescontrol, se apreciaun descenso

progresivo en los niveles de este péptido conforme aumenta la edad (359.92ng/ml a

45. 9Ong/ml).

En las ratas tiroidectomizadas, a los 10 y 15 días de vida (5 y 10 días después

de la operación), se encontró un descensoen los valorescirculantesrespectoa la

población control (88.34 y 44.93%, respectivamente), mientras que a los 20 días de

edad (15 días después de la tiroidectomía), la concentración sérica del péptido se

incrementó enormemente (278.04%) respecto a las ratascontrol. Por otro lado, los

animales neonatales que fueron tratados con MMIpresentaronunosnivelesde IGF-II

superiores a los controles desde los 20 días de edad.

3.1.4.2. Expresión del ARNmhepático.

La expresión hepática de IGF-I mostró un perfil similar al ya visto en suero.

Así, se observóun aumentoen el ARNmhepático de los neonatos tiroidectomizados

y un descenso en el de los tratados con MMI; dicha disminución en la expresión se

inició a los 15 días de vida, mientras que el aumento se aprecióya a los 10 díasde

vida (5 díasdespuésde la tiroidectomía)(Figura 9).

Al igual que se había mostrado a nivel circulante, la expresión del IGE-Il en

hígadodisminuyóal aumentarlaedaddel animal control (Figura9), sin embargo, las

ratas hipotiroideas (tiroidectomizadasy tratadascon MMI) mostraron un perfil

diferenteque semodificó dependiendodel tipo de hipotiroidismoconseguido.Así,

103

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Resultados

en las poblacionesde animalestratadoscon MMI, los nivelesde ARNm del péptido

se vieron paulatinamenteaumentadosdesde los 15 días de vida respectoa la

población control y, por el contrario, en el caso de las ratas operadas

quirúrgicamente, el hipotiroidismo cursó con niveles de expresión de IGF-II

disminuidos(10 y 15 díasde vida) aunque,finalmente,aumentaron(20díasde vida).

De nuevo, seencontróun paralelismoentrelos nivelescirculantesy los de

ARNm de los péptidos, lo que sugiere la existencia de una regulacióna nivel

transcripcional en la secreción de los IGFs debido a la falta de hormonas tiroideas.

3.1.5. Estudiode regresiónlineal y correlación.

Se efectuóel análisisde regresióny correlaciónde diversosparámetrosde las

ratasen periodoneonatal(Figura 10). Paralos cálculosse reunieronen cadaanálisis

los datos de las tresedadesestudiadas.

Se encontróunafuertecorrelaciónpositiva entreJos niveles séricosde IGF-1

y los plasmáticosde insulinatanto en los animaleshipotiroideos (r= 0.83, p < 0.05

para las ratas tiroidectomizadasy r~ 0.89, p < 0.05 para las tratadascon MMI)

como en los controles(r= 0.96, p < 0.05). Sin embargo,cuandose representaron

los niveles circulantesde IGF-I frente a los de Gil, estaspoblacionesmostraronuna

correlación negativa (r= -0.58) o baja (r= 0.46 y 0.75) para los animales

tiroidectomizados,tratadosconel bociógenoy control, respectivamente.

3.1.6. Proteínasligadorasde IGFs (IGFBPs): niveles séricos y expresión

del ARNm hepático.

3.1.6.1. Niveles séricos.

3.1.6.1.1.Westernligand blot.

En todos los estadiosanalizadosse observóun patrónclaro constituidopor

tres gruposde bandasde un pesomolecularestimadoen45kDa, 3OkDay 24kDa,y

que se designancomo IGFBP-3, IGFBP-1 y 2 e IGFBP-4, respectivamente(Figura

11).

En las ratascontrol, la bandade 30kDadisminuyóconformelo hacia la edad

del animal, mientrasque la bandade 45kDaexperimentóun aumentode intensidad

paraleloal de la edad,lo cual no se apreciaconclaridaden la Figura 11 debido al

cambiode escalas.

Los valoresséricosde las proteínasde bajo pesomolecular(IGFBP-1 y 2)

aumentaronpor la falta de hormonas tiroideas desde los 10 días de vida, sin

embargo,dichoincrementofue másmarcadoen los animalestratadosconel fármaco

105

CONTROLES <C)y= -812.45 + 29.76x y 299.42r= 0.96 (p’zO.O5) . r~ 0.75

+ 39.87x

CH <ng/mi)

la’

y= 44.39 + 45.58xr= 0.46

loo-

SO

60

20

20

e

e e e cee

800 —0 200 400 600

CH (ng/mi)

Fig 10 Análisisde regresiónlineal y coeficientede correlación de los niveles séricosde¡GE-! y las concentracionesplasmáticasde insulina y Clii en ratas neonatalestiroidectomizadas(T), controles (C) y tratadascon metimazol(MMI). Esteanálisisse efectuóreuniendolos datos de los tres estadiosneonatales<10, 15y 20 díasdevida). Se muestranlas diferenciasestadísticas.

NEONATOS

TIROIDECTOMIZADOS (T)

y~ 120.87 + 2.45x•~~f r=~ 0.83 (p’C0.05)

e OOt

*

300

200’

y= 632.58 - 13.65xr= -0.58

e

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Insulina (pU/mi) CH (ng/mi)

00

e

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300

200.

o31 30 36 ‘0 65 50 40

Insulina (pU/mi)

HIPOTIROIDEOS-MMI <MMI)

y= 8.73 + 5.09x“a’ r= 0.89 (p<O.05)loo

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Insulina (pU/mi)

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Resultados

bociógeno,lo quepusode manifiestounadiferenciaentreestaspoblacionesde ratas

en cuantoa las cifras séricasdel complejode 3OkDa.

Los nivelesde IGFBP-3de las ratashípotiroideasexperimentaronun descenso

también desde los 10 días de edad,pero fue másacusadoenel casode los animales

neonatalestiroidectomizadosque en el de los tratadoscon metimazol, siempre

respectoa las ratascontrol; de nuevo, encontramosuna alteraciónen el patrónde

cambiode los nivelesde las IGFBPsen los animaleshipotiroideos.

3.1.6.1.2.Westerninmunoblot.

El análisismediante“Westernligandblot” mostróun aumentoen las proteínas

de bajo pesomolecular del suero (IGFBP-1 y 2), y para averiguar si dicho

incrementose debíaa ambasproteínaspor igual o al predominio de una de ellas

sobre la otra, se recurrió a otro tipo de análisis que nos permitiera conocerla

intensidadde la bandadebida a cada proteínapor separado;se trataron así las

membranascon anticuerposanti-IGFBP-1y anti-IGFBP-2específicospara rata.

El tratamientode las membranascon anti-IGFBP-1 nos reveló un aumento

significativo en los nivelesséricosde estaproteínade bajopesomolecularenaquellos

animalesque fuerontiroidectomizadosa 10, 15 y 20 díasde vida respectoa las ratas

control (Figura 12). Porel contrario, las poblacionesde ratashipotiroideasa las que

se les administró el fármaco bociógenomostraron un descensoen los valores

circulantesde estepéptido respectoa la población control en todos los estadios

analizados(10, 15 y 20 díasde edad).

Los nivelescirculantesde IGFBP-2se encontraronaumentadospor la falta de

hormonastiroideas(animalestratadosconMMI y tiroidectomizados)a partir de los

10 y 15 días de edad, respectivamente(Figura 12); no obstante,el incremento

observado fue mucho más acusado en el caso de las ratas tratadas con el fármaco

antitiroideorespectoal mostradoporaquellosanimalesque fueronoperadosen todas

las edadesestudiadas(10, 15 y 20 días de vida).

3.1.6.2.Expresióndel ARNm hepático.

Los nivelesde ARNm hepáticode la proteínade bajopesomolecularIGFBP-

1 seencontraronaumentadosen las ratastiroidectomizadasrespectoa las controles

en los tres estadiosanalizados(Figura 13), mientrasque dismuníanen los animales

hipotiroideos tratadoscon MMI tambiéndesdelos 10 días de vida, mostrandoun

paralelismocon los valorescirculantesde IGFBP-l por inmunoblot (Figura 12).

La expresiónde IGFBP-2 aumentótantoen los animalesneonatalestratados

los

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EXPRESION DEL ARNm HEPATICO (IGFBPs)

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IGFBP-3

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lOdT (wsDv)

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2400

160dMIM *800’LÍAI

T o MMI

l5dT (200v)

F¡g 13 Expresiónhepáticadel ARNmy cuantWcacióndensitométricade IGFBP-J, 2 y 3 en ratasneonatalestiroidectomizadas(2), controles(C) y tratadascon inetimazol(MMI) de JO, 15y 20 días (5, 10 y 15 díasdespuésde la operación).El análisisse llevó a cabo medianteel ensayode protecciónde la RNasa. Media + JiSde 5-6 análisisdiferentes.* Significaciónestadísticarespectoa los animalescontrol. > Significaciónestadísticarespectoa la poblacióntiro idectomizada.

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1400

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95dT (ioDv)

Sonda

Resultados

con MMI comoen los tiroidectomizadosrespectoa los controles(Figura 13); en la

poblaciónde ratasoperadasquirúrgicamente,el aumentoen los nivelesde ARNm de

IGFBP-2 se produjo a los 10 díasde vida (5 días despuésde la tiroidectomía),y

aunque,también se observóa los 10 días de edad, fue más pronunciadoen los

tratadoscon MMI, lo que está igualmentede acuerdocon los valores circulantes

encontradospor inmunoblot (Figura 12).

La IGFBP-3disminuyósuexpresiónhepáticaenambaspoblacionesneonatales

hipotiroideas(tiroidectomizadasy tratadascon MMI) respectoa la control desdelos

10 díasde vida, aunqueestadisminuciónparecióser másacusadaen el casode los

animalestiroidectomizadosy seobservóconmayorclaridada los 15 díasdespuésde

la operación(Figura 13).

A lavistade todosestosresultados,seobservala existenciade unparalelismo

entrelos nivelescirculantesde las IGFBPsy suexpresiónenhígado,lo que vuelve

a sugerir una posibleregulaciónde estasproteínasa nivel transcripcionalporparte

de las hormonastiroideas.

3.2. TRATAMIENTO CON ESTREPTOZOTOCINA (STZ) DE RATAS

NEONATALES TIROIDECTOMIZADAS.

Paraprofundizarenel papelde la insulinasobrela secreciónde los IGFs en

situacionesdehipotiroidismoneonatal,se realizóel siguienteexperimento.Las ratas

neonatalestiroidectomizadas,que presentabanaltos niveles de insulina, fueron

tratadascon STZ a los 15 díasde edad(10 díasde vida) parabloquearla liberación

de estahormonadespuésde la tiroidectomía.


Las ratasneonatalesoperadastratadasconSTZ mantuvieronel pesode cuerpo

por debajo de los valores de los animalescontrol, si bien presentaronun ligero

aumentorespectoa los tiroidectomizados(Tabla5).

3.2.2. Nivelesséricosde T3 y T4 y plasmáticose hipofisariosde GH.

Los neonatos tiroidectomizados tratados con STZ el día 15 de edad

presentaronunos nivelescirculantesde hormonastiroideas inferiores a los de sus

controlesen un 86.00%para la ‘[3 y en un 94.95%para la ‘[4 (Tabla 5); de esta

manera,la concentraciónséricade las hormonastiroideasde estosanimalesresultó

ser también inferior a la de los controles como en las ratas neonatales

tiroidectomizadasno sometidasal tratamiento.

111

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VV

Resultados

El bloqueode la secreciónde insulina provocóun descensoen los valores

plasmáticos de Gil superior al 65% respecto a la población de animales

tiroidectomizados,lo que igualó la concentraciónde Gil circulante de estas ratas

sometidasal tratamientoa los nivelesde los animalescontrol. Porotraparte,en estos

animalesinyectadoscon STZ, tambiéndisminuyó,incluso pordebajode los valores

control (19.57%), el contenido hipofisario de esta hormona, con lo que este

parámetrofue muy inferior en estas ratas respectoa los animales neonatales

tiroidectomizadosno sometidos al tratamiento (Tablas 4 y 5), mostrando un

paralelismoentreel descensode la insulinemiay dichosparámetroscomosucedíaen

los animalesdiabéticos.


La administraciónde STZ causó,comoera de esperar,un gran aumentoen

los nivelescirculantesde glucosade los animalessometidosal tratamiento(Tabla5),y, de maneraparalela,un descensoen su insulinemiadel 70.44% respectoa los

valores control (Figura 14) debido al bloqueo de la secreciónde insulina por la

droga.

3.2.4. IGFs: niveles séricos y expresióndel ARNm hepático.


Los nivelesde IGF-I, comosucediócon las ratasneonatalestiroidectomizadas

sin STZ, mostraronun perfil similar al ofrecidopor la insulina, estoes, los valores

circulantes del péptido de las ratas tratadas con STZ disminuyeron en un 76.32%respecto a la población tiroidectomizada y mostraron unos niveles similares a los de

los animalescontrol (Figura 14).

Laconcentraciónde IGE-Il ensueroaumentódespuésde la administraciónde

STZ respectoa la población control (Figura 14), e incluso, estos valores superaron

a los alcanzadospor los animales tiroidectomizados,cuyos nivelesaparecíanya muy

incrementadosrespectoa las ratascontrol.


La expresióndel ARNm hepático de los tránseritos de IGF-I (Figura 14),que

estabaaumentadaen los neonatostiroidectomizados,disminuyó, de forma paralela

a lo que ocurríaen el suero,respectoa estapoblacióny a la control tras sometera

los animalesal tratamientocon STZ. Sin embargo,en estasratasneonatales,después

de la administraciónde STZ, los nivelesde ARNm de IGF-II aumentaronaún más

que en las tiroidectomizadasrespectoa la poblacióncontrol (Figura 14), igual que

113

Fig 14 A) NivelescirculantesdeJGF-J, insulina e IGF-¡I deratas neonatalesuiroidecromizadasrn. controles(C) y tiroidecromizadastratadas con 522 (1 + 572) de 20 días (15 días después de la operación).Media ±DS de 8-10 animales.B) Expresión hepática del ARNm y cuan¡~ficación densizométricadel IGF-I y II en ratastiroidectomizadas(7’), controles (C) y ¡iroidecromizadastratadascon STZ (T + 572)de 20días. Elanálisisseefectuómedianteel ensayode protección de ribonucleasas.Media + DSde 4 análisisdistintos.* Significación estadísticarespectoa los animales control. ~ Significaciónestadísticarespectoala poblaciónoperada.

INSULINA

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l5dT (2aDv) l5dT (200v)

Resultados

sucedíaa nivel circulante.

3.2.5. Estudio de regresión lineal y correlación.

La Figura 15 resume los resultados del análisis de regresión de algunos de los

parámetrosestudiadosenesteexperimentocon STZ que se acabade describir.Para

el análisis serecogieronlos datosobtenidosparalas tres poblaciones.

La correlaciónentre IGF-I e insulinemia fue alta y positiva (r= 0.97, p <

0.05),mientrasque el IGF-I secorrelacionóde formanegativacon los nivelesde Gil

en plasma(r= -0.83).

3.2.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresión del ARNni hepático.


3.2.6.1.1.Western ligand blot.

El hipotiroidismoprovocó, como ya seha mencionadoconanterioridad,un

aumentode las proteínastransportadorascirculantesde bajopesomolecular(IGFBP-I

y 2) respecto a la población control, y dicho incremento no fue corregido tras el

tratamientode las ratastiroidectomizadascon STZ (Figura 16).

Los niveles séricos de IGFBP-3, que disminuyeron en aquellos animales que

fueron operados,aumentaronsignificativamentedespuésde la administraciónde STZ

e incluso,alcanzaronunosvaloressimilaresa los de lapoblacióncontrol,comohabía

ocurrido con los niveles de GH (Figura 16).

3.2.6.1.2.Western inniunoblot.

El análisisefectuadocon el anticuerpoespecíficode rata anti-IGFBP-1 nos

mostróque los nivelesde estaproteínatransportadorase incrementaban,respectoa

los de las ratas control, tanto en animales que fueron tiroidectomizados como en los

que fueron sometidosal tratamiento(Figura 16).

La IGFBP-2presentóun perfil análogoal ofrecidopor IGFBP-1,estoes, sus

niveles séricos aumentaron en las ratas operadas y en las que se les administró STZ

cuandosecompararoncon los mostradospor los animalescontrol, y la SIZ no los

varió (Figura 16).

3.2.6.2.Expresión del ARNrn hepático.

La Figura 17 muestrala expresiónhepáticade IGFHP-1,2 y 3 en los animales

neonatalesantesy despuésde ser tratados con STZ. En estascondiciones,seobservó

un mantenimentoen los nivelesdel ARNm de IGFBP-1 en los animalesa los que se

les administró STZ respecto a los tiroidectomizados, lo que parece motivado por el

bloqueode la secreciónde insulina en estasratas, dado que esta proteínaligadora

115

NEONATOSTIROIDECTOMIZADOS <1 + SIZ)

y= -90.95 + 12.85xr=0.97 (p<0.05)

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Insulina <pU/mi)

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GH <ng/mí>

Fig 15 Análisis de correlación lineal y coeficientede correlaciónde los nivelescirculantesde IGF-l e insulina y Gil en ratas neonata les de 20 días de edad tiro idectonzizadas(1,>, controles (C) y operadas tratadas con STZ (7’ + Si?). Se muestran lasc4ferenciasestadísticas.

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B3!)dQPEP!SU~G

Resultados

muestrauna dependencia,ya descrita,de estahormona:un descensoen la insulina

provocauna subidade los nivelesde IGFBP-1.

Porotro lado, la expresiónde IGFBP-2,que estabaaumentadaen los neonatos

tiroidectomizados,se vió disminuidaen estasratas neonatalesporel tratamientocon

STZ incluso hastaunos valoresinferioresa los control (Figura 17).

La expresióndel ARNm de IGFBP-3 sufrió un aumentosignificativo tras el

tratamientode las ratasoperadascon STZ respectoa la poblacióntiroidectomizada,

aunqueesteno fue tangrandecomo para equipararlosa los de los animalescontrol

(Figura 17).

El perfil de los tránscritosde las IGFBPs es similar al observadoa nivel

circulante: IGFBP-1 disminuyóe IGFBP-3 aumentó;sin embargo,IGFBP-2 ofreció

un comportamientodiferente en el caso de los animales tiroidectomizadosy

posteriormentetratadoscon STZ, y así, se encontró un aumento en los niveles

séricos, mientras que su expresión hepática disminuía.

3.2.7. Resumen de los resultados del estudio de la tiroidectomía y la

administración de MMI en ratas neonatales y de las ratas neonatales

tiroidectomizadas tratadas con STZ.

Los neonatostiroidectomizadospresentaronunosaltos nivelescirculantesde

insulina y Gil plasmática e hipofisaria, así como unos valores séricos y de expresión

hepática de IGF-I aumentados respecto a las ratas control. Por otro lado, las cifras

circulantes de IGF-II y los niveles de su ARNmen hígado aparecieron disminuidos

en estos animales tiroidectomizados, excepto a 20 días en que estos valores

aumentaron respecto a los animales control. Por el contrario, los neonatos tratados

con MMI presentaron una baja insulinemia junto con unos valores plasmáticos e

hipofisarios de GH, y unos niveles séricos y de ARNmhepático de IGF-I

disminuidos,mientras que los valores de IGF-II aumentaronrespectoa las ratas

control. En ambaspoblacioneshipotiroideas(tiroidectomizaday tratadacon MMI),

se encontró una correlación positiva por análisis de correlación lineal entre los niveles

circulantes de IGF-I e insulina.

Los valores séricos de IGFBP-3 disminuyeron en las dos poblaciones

hipotiroideas,al igual que la expresiónde su ARNm hepático;por el contrario,en

los neonatos tiroidectomizados, las IGFBPs de bajo peso molecular aumentaron sus

niveles en suero y de expresión en hígado, mientras que aquellas ratas que sólo

fueron tratadascon MMI mostraronun aumentoen los valores circulantesy de

119

Resultados

expresiónde los tránscritoshepáticosde la IGFBP-2, aunquela IGFBP-1 disminuía

a ambos niveles. Pareceque el aumentoen los animalestiroidectomizadosen el

complejo de 3OkDa fue debido a IGFBP-1 y 2, mientras que en el caso de los

animaleshipotiroideospor tratamientoconMMI, pareciódeberseal aumentosólo de

IGFBP-2.

Los animalestiroidectomizadosy tratadoscon STZ presentaronvaloresbajos

de insulinemia, Gil plasmáticae hipofisaria e IGF-I circulante, así como de su

ARNm hepático(Cuadro1). El IGF-II circulantey su ARNm aumentanal igual que

la glucemia;aumentanIGFBP-1 y 2, tanto circulante como ARNm hepáticoy la

IGFBP-3 circulanteno varia y disminuyesu ARNm hepático(Cuadro 1). Todos los

valoressecompararoncon los animalescontroleseutiroideos.

El resumende estosresultadosestárefejadoen el Cuadro 1.

Seestablecióunacorrelaciónpositivaentrelos nivelescirculantesde insulina

e IGF-I.

Cuadro1.- Resumende los resultadosde los estudiosde tiroidectomía(T),

administraciónde MMI (MMI) y tratamientoconSTZ (T + SIZ) en ratasneonatales

respectoa la poblaciónde animalescontrol.

T MMI T+STZGLUCEMIAINSULINEMIA t 4 ¿

GB CIRCULANTE 1 4OH HIPOFISARIA 1 ¿ ¿

IGF-I CIRCULANTE 1ARNm [GP-! t 4 4

IGF-Ií CIRCULANTE 1 1 1

ARNm IGF-I[ 1 1 1

IGFBP-1 CIRCULANTE 1 4

ARNm IGFBP-1 1 4 1


ARNm IGFBP-2 1 1 4IGPBP-3CIRCULANTE 4 ¿

ARNm IGFBP-3 4 4 4

120

Resultados

3.3. TIROIDECTOMIA EN PERIODODE DESTETEY ADULTO.

En las ratasenperiodode destetey adulto, sellevó a caboun estudioanálogo

al efectuadoen la etapaneonatal.Se sacrificarona los 5, 10 y 15 díasdespuésde la

operación(27, 32 y 37 díasde vida para los animalesdestetadosy 77, 82 y 87 días

de vida, paralos adultos).


En las Tablas6 y 7 se recogenlos resultadosdel pesocorporalde las ratas

destetadasy adultas.Seobservóen las dospoblacionesde animalestiroidectomizados

un descensoen los valoresde esteparámetro,que llegó a serde un 34.37%paralas

ratasdestetadasa tos 32 díasy de un 14.20%paralas adultasa los 87 días,respecto

a los animalescontrol.

Los tresestadiosdeedadesconsideradosparaestosanimalestiroidectomizados

y en ambaspoblaciones(destetaday adulta)presentabanel pesodisminuido respecto

a los controles.

3.3.2. Nivelesséricosde T3 y T4 y plasmáticose hipofisariosde GH.

Las ratas tiroidectomizadas,tanto destetadascomo adultas,mostraronunos

nivelescirculantesde T3 y ‘[4 disminuidosdespuésde la operación(Figura 18). Esta

disminuciónfue más acusadaa los 15 días despuésde la tiroideetomíaquea los 5

dias, y así, en el caso de los animalesdestetados,seprodujo una caída desdeun

86.70% (27 días de vida, 5 díasdespuésde la operación)a un 94.89%(37 díasde

edad,15 díasdespuésde la tiroidectomía)para ‘[3 y desdeun 90.81%a un 93.09%

para‘[4; paralas ratasadultas,dichodescensooscilóentreun91.49%(5 díasdespués

de la tiroidectomía,77 díasde edad)y un 92.24%(15 díasdespuésde la operación,

87 días de vida) para ‘[3, y desdeun 85.63% (77 días) a un 92.02%(87 días)para

‘[4.

Los nivelesplasmáticosde OH, de maneraparalelaa lo que sucedíacon el

pesocorporaly los valorescirculantesde T3 y T4, experimentaronun descensoen los

animalestiroidectomizadosdestetadosy adultos (Figura 18 y Tablas 6 y 7). Sin

embargo,estadisminuciónde OH en sangreseprodujoen las ratasdestetadasa los

15 díasdespuésde la tiroidectomía(37días), mientrasqueen las adultassemanifestó

ya a los 5 díasdespuésde la operación(77díasde vida).

El descensode OH en pituitaria a los 5 díasdespuésde la tiroidectomíafue

de un 35.00% en las ratasdestetadasy de un 53.00% en las adultas,aunqueesta

diferenciasuperóel65.00%en ambosgrupos15 díasdespuésde laoperación(Tablas

121

Tabla6.- Pesocorporal,nivelescirculantesde glucosa,insulina, OH y contenidohipofisariode OHde ratasdestetadastiroidectomizadas(T) y controlessacrificadasa los 27, 32 y 37 días de vida (5,10 y 15 díasdespuésde la tiroidectomía)(ddT). Media de 8-10 animales+ DS.

DíAS DESPUES1’ (ddT)Días de vida

Pesocorporal (g)TControles

4707 ±1.48’66.53 + 2.14

63.24 + 4.06’73.16±2.87

77.55 + 2.40’118.17 + 2.21

OH plasmática(ng/mí)TControles

19.49±4.212.29 + 0.77

282 + 0.164.16 + 0.59

376 + 0.60’6.65 + 0.91

OH hipofisaria(pg/mg)TControles

8.09 + 0.04’12.40 ±0.12

18.21 + 0.0920.60 ±0.03

6.06 + 0.04’30.57 + 0.03

Glucemia(mg/lOOml)TControles

102.30± 1.98’123.17 ±1.00

120.09 + 1.98124.96 + 5.09

117.30+ 4.90121.72 + 1.17

Insulinemia(1xU/ml>‘¡7Controles

12.79 ±0.33’45.68± 1.10

43.47 + 0.3748.29 ±0.36

41.23 + 0.4650.48 + 0.56

1 5 ddt (27) lO ddT <32) 15 ddT (37)

‘p < 0.05 respectoa las raíasC

Tabla 7.- Pesocorporal,niveles circulantesde glucosa,insulina, OH y contenidohipofisario de OHde ratasadultastirodectomizadas(17)y controlesa los77, 82y 87 díasdevida (5, 10 y 15 díasdespuésde la tiroidectomía)(ddT) . Media de 8-10 animales+ OS.

DíAS DESPUESY (ddT)Días de vida

Pesocorporal (g)TControles

159.70 ±3.42’162.83 ±3.23

163.25 + 4.57’187.48±3.73

166.20 ±3.59’193.72±4.92

OH plasmática(ng/mí)1Controles

28.80 + 4.71’51.03 ±10.03

25.42 + 3.52’71.13 + 16.41

15.56 ±1.52~98.21 ±7.63

OH hipofisaria(pglmg)T

Controles

32.96 ±0.19’

69.91 + 0.74

49.81 + 0.14’

52.24 + 004

10.56±0.10’

32.47 + 0.16

Glucemia(ng!IGOmí)TControles

110.65 + 1.58118.64 ±2.86

108.96 + 2.28’123.86±4.57

120.63 + 1.71123.05+ 1.90

Insulinemia(pAl/mi) 17Controles

47.35±3.34’64.31 ±5.50

36.95 + 4.43’63.39 + 4.03

32.42 ±2.6T66.95 ±2.41

5 ddT (77) 10 ddT (82) 15 ddT (87)

‘p< 0.05 respectoa las ratasC

A

160

140

120

loo

80

60

40

20

o

13

ng/dl

B

8

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4

2

o

T4 LIZo

Dv.

Fig 18 Nivelescirculantesde T3 (A) y 7% (13) en ratasdestetadasy adultastiro idectomizadasrn y controles(Q derenn¡nadospor RÍA. Los animalessesacrificaron a los 5, 10y 15 díasdespuésde la tiroidectomía,que correspondena 27, 32y 37díasde vidaenel casode la poblacióndestetada,y a 77, 82 y 87díasen el de la adulta. Media+ DSde 8-10animales. * Sign¿ficaciónestadísticarespectoa las ratas control.

5dT lOdT lSdT 5dT lOdT I5dT

27 32 37 77 82 87 Dv.

ug/dI

bdT lOdT l5dT 5dT lOdT l5dT

27 32 37 77 82 87

Resultados

6 y 7).

3.3.3. Glucemiae insulineinia.

Los nivelesde insulinadisminuyeronen los animalesdestetadosa los 5 días

despuésde la tiroidectomía, pero no a los 10 ni a los 15 días despuésde la

operación; las ratas adultas hipotiroideas, sin embargo, presentaronvalores

plasmáticosde estahormonainferioresa los de sus respectivoscontrolesdesdelos

5 díasdespuésde la operación(Tablas6 y 7).

La glucemiadescendiórespectoa las ratascontrol,en los animalesdestetados

a los 5 díasdespuésde la operacióny en los adultosa los 10 días, mientrasque en

los otros estadiosanalizados,los nivelescirculantesde glucosamostraronunascifras

similares a los de la poblacióncontrol (Tablas6 y 7).

3.3.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

3.3.4.1.Nivelesséricos.

Los niveles de IGF-I en suero fueron más bajos en los animalesoperados

repectoa los controlestanto a los 10 díasdespuésde la tiroidectomía(40.46%a 32

días de vida y 82.55%a 72 días) comoa los 15 días (45.52%a 37 díasy 32.09%

a 87 días) (Figura 19). Sin embargo,sólo los animalesdestetadosmostraronuna

diferenciasignificativa en cuantoa los valores circulantesde IGF-J respectoa sus

controlesa los 5 días despuésde la operación,quizás por falta de población en

adultas.

El IGF-II sólo fue dosificadoen los animalesneonatales,ya que sus niveles

en las ratas destetadasy adultas son despreciables,se sitúan por debajo de la

sensibilidaddel método.


La expresióndel IGF-I en hígadofue inferior para las dos poblacionesde

ratasdetetadasy adultastiroidectomizadasen los tres estadiosanalizadossiempre

respectoa los animalescontrol (Figura 19); este hecho, correlacionadocon los

nivelesséricosanteriormentemostrados,nos hacesugeriruna posibleregulacióna

nivel transcripcionalen la secreciónde los IGFs por la falta de hormonastiroideas.


La Figura 20 resumelos resultadosdel análisisde la regresiónde algunode

los parámetrosestudiadosen estosexperimentos.Paralos cálculos se reunieron¡os

datosobtenidosde los tres estadiosde las poblacionesdestetaday adulta.

Las ratasdestetadasy adultaspresentaronunaalta correlaciónentrelos niveles

125

Fig 19 Niveles séricos (A) y expresiónhepática del ARNm (fi) de ¡GF-J en ratas destetadasy adultastiroidectomizadas<W) y controles(C) a los 5, lOy 15 díasdespuésde la operación (27, 32 y 37 ó77, 82 y 87 días, respectivamente).

A) Media ±DSde 8 animales.B) Ensayodeprotecciónde la RNasay cuantf/¡cacióndensitométrica(5 análisisdiferentes).

* Sign¿/¡caciónestadísticarepectoa la población de animalescontrol.

‘OF-’ng/ml

27 32 37 77 82 87 Dv.

EXPRESION DEL ARNm HEPATICO (IGF-I)

Destetadase ——e

u”

300

200

100

T O

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1500

1000

500

o

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5dT (27Dv) lOdT(32Dv) l5dT(37DV)

Adultas

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5000 __

1* U300011 u1000 .1

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400

300

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B5dT lOdT l5dT 5d7 lOdT l5dT

Senda

T O

500

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T o

5dT (770v] 1OdTC82DV 9 15 dTCBZDV)

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l

Resultados

deOH enplasmay los de IGF-1 en suerotantoen los animalestiroidectomizados(r~

0.94, p< 0.01 y r= 0.91, pcZO.05, respectivamente)como en los controles(r=

0.96, Pc 0.05 y r= 0.99, p< 0.05) (Figura 20). Porel contrario, la correlación

encontradaentre la insulinemia y los valores circulantes de IGF-I en las ratas

destetadastiroidectomizadasy controlesfue muy bajae incluso, negativa(r= -0.51

y r~ 0.011, respectivamente),e igual ocurrióenel casode los animalesadultos(r~

0.47 y r= -0.36, respectivamente)(Figura 20).

3.3.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

3.3.6.1. Nivelesséricos.

Las IGFBPs del suero se analizaron por ‘Western ligand blot”, y

posteriormentese hizo un estudiocomparativoempleando‘Westernligand blot” y

Westerninmunoblol’ paraidentificar IGFBP-2,dadoqueelantisueroanti-bIGFBP-2

fue el único de los ensayadosque dió reaccióncruzadacon las IGFBPs circulantes.

3.3.6.1.1.Westernligand blol.

Los niveles en suero de las proteínasligadorasde bajo peso molecular

(IGFBP-1 y 2) fueron inferiores en los animalestiroidectomizadosrespectoa sus

controlesen las dos poblacionesde ratas(destetadasy adultas)paratodaslas edades

analizadasa los 10 y 15 díasdespuésde la operación,y sólo a los 5 días despuésde

la tiroidectomíaparalos animalesadultos(Figuras21 y 22). Tambiénse encontróuna

disminuciónen la intensidadde las bandasde IGFBP-3 pata todos los animales

destetadosy adultos tiroidectomizadosrespectoa los controles (5, 10 y 15 días

despuésde la operación)(Figuras21 y 22).

3.3.6.1.2.Westernimnunoblot.

El análisis mediante Westerninmunoblot mostróque, tanto los animales

destetadoscomo los adultostiroidectomizados,y en todaslas etapasconsideradas,

presentabanun ligero aumentoen la intensidadde la bandacorrespondientea IGFBP-

2 respectoa la poblacióncontrol (Figuras21 y 22). Así pues,por lacomparaciónde

estos resultadoscon los obtenidosmediante“Western ligand blot, se podríadecir

que en estasratas(destetadasy adultas)seprodujoun incrementoen los nivelesde

IGFBP-2 circulante, y que este aumento fue menos marcado que el descenso

provocadoporel hipotiroidismosobrelos valoresséricosde IGFBP-1, puestoqueel

ligand blot, que muestra los niveles circulantes conjuntos correspondientesal

complejo constituido por las proteínasde bajo pesomolecular(IGFBP-1 y 2), nos

revelóunadisminuciónen la intensidadde estasbandasde 3OkDa(Figuras21 y 22).

128

WESTERN LIGAND BLOT (Destetadas)

4u._T O

4500

2700

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T

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WESTERN INMUNOB LOT

1 o T

5dT(27 Dv) lOdT (32 Dv) l5dT(37Dv)

Fig 21 A) Análisismediante“Western íígand bíot” de los nivelesde las JGFBPs en ratasdestetadastiroidectomizadas(T) y controles(C) de27, 32 y 37días(5, JOy ISdíasdespuésde la tiroidectomía~. Se analizaron 2.5i2 de suero. Se muestra lacuantWcacióndensitométricade las concentracionesde las IGFBPs de las mismaspoblaciones.Media + DS de 4 análisis diferentes. * Sign4ficaciónestadísticarespectoa la poblacióncontrol.B) Contenidode IGFBP-2 del suero de ratas destetadastiroidectomizadas(T3 ycontroles(C) de 27, 32 y 37 díasde edad(5, lOy 15 díasdespuésde la operación).El análisis se efectuómediante“Western inmunoblot”.

A

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WESTERN LIGAND BLOT (Adultas)

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WESTERN INMUNOBLOT

1 o

5dT (7lDv) lOdT CS2Dv :i 15 dTC87Ov)

Fig 22 A) Contenido de IGFBPs en el suero de raras adultas tiroidectomizadasaY ycontroles(Ql de 77, 82 y 87 días (5, 10 y 15 días despuésde la tiroidectonifa» Seanalizaron 2.5¡A de suero mediante “Western ligand blm”. Se muestra lacuat4ficacióndensirométricade los niveles de las ÍGFBPs de dichos animales.Media + DS de 4 análisis d¿ferenres. * Sign¿Iicacíónestadísticarespecto a lapoblacióncontrol.B,) Análisismediante Wesrerninmunobior” de los nivelesde IGFBP-2 en sueroderatasadultastiroidectomizadas(1) y controles(69 de 77, 82 y 87díasde edad (5,10 y 15 díasdespuésde la operación).

A

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1200600

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B5dT(77DvJ lOdTE82DvJ

T o15 dTC87DV)

T o T o

Resultados


Los niveles de ARNm hepático de IGFBP-1 disminuyeronen las ratas

destetadashipotiroideasa los 5, lay 15 díasdespuésde la tiroidectomía(Figura23).

Sinembargo,la poblaciónadultatiroidectomizadamostróun descensoen la expresión

de estaproteínade bajo pesomoleculara los 5 y 10 días despuésde la operación,

pero a los 15 díasdespuésde la tiroidectomíaaumentó,siemprerespectoa las ratas

control (Figura24). Así mismo,se observótambiéncomo a medidaque aumentaba

la edaddel animal control disminuíanlos nivelesde ARNm de estaproteína,dado

que estaIGFBP es constitutivade etapasinmaduras.

Al igual que sucedíacon los nivelesde ARNm de IGFBP-l en el hígadode

las ratascontrol, la expresiónhepáticade IGFBP-2 disminuíaconformeaumentaba

laedaddel animal,y estedescensose observómuy claramenteen la poblaciónadulta

(Figura24). Además,laexpresiónde IGFBP-2 se vió incrementadaa 5,10 y 15 días

despuésde la tiroidectomiaen las ratasdestetadasy a los 10 y 15 díasdespuésde la

operaciónen las adultas(Figuras23 y 24).

Finalmente,la expresiónhepáticade la proteínatransportadorade alto peso

molecular (IGFBP-3), característicade la edadadulta, disminuyóen los animales

destetadostiroidectomizadosa los 10 y 15 díasdespuésde la operación(Figura 23),

mientrasque en las ratasadultas,estedescensose observóya a los 5 díasdespués

de la intervenciónquirúrgica (Figura 24).

De nuevo,y al igual que ocurrió con los IGFs, encontramosla existenciade

un paralelismoentrelas fluctuacionesde los nivelesséricosde las IGFBPsy las del

ARNm hepáticode las proteínastransportadoras.

3.4. TRATAMIENTO CON INSULINA DE RATAS TIROIDECTOMIZADAS

DESTETADAS Y ADULTAS.

Paraprofundizarenel papelque desempeñala insulinaen la secreciónde los

IGFs, e intentar restaurarlos bajos valores circulantes de dicha hormona que

presentabanlos animalesdestetadosy adultosdespuésde tiroidectomizarlos,se les

inyectó insulina a los 10 días despuésde la operación (32 y 82 días de vida,

repectivamente).


El pesocorporal,quedisminuyó en las ratastiroidectomizadas,aumentótras

el tratamientode estos animalescon insulinaenun 22.95%paralos destetadosy en

131


IGFBP-1

*2100

1400 * 1700

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600

3003

T ol5dT(370V)

delARNmy cuantwcacióndensitométricade IGFBP-1, 2 y 3 deratas destetadastiroidecromizadas(1) y controles (6’,) de 27, 32 y 37 días de vida(5, 10y15 díasdespuésla tiroidecromía,).El análisisseefectuómediantela técnicadel ensayode prwección de la RNasa. Media + DS de 5 análisis diferentes.* Sign~caciónestadísticarespectoa los animalescontrol. -

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‘0 .01~

Sonda

IGFBP- 2

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2700

1800

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.~ .~4- L~

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500

o

Fig 23 Expresiónhepática

Sorida


IGFBP-1

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1800

1200.3

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T o

5dT (770v]

e e

800

12001 Li600

T O

1200

800

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*

T o

15dTCB7Ov)

IGFBP-2e

500

250~IAT O

5dT (770v)

1200’

0— T

600

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*

15dTCS7DVJ

IGFBP-3

e

200

II-100o T O

5dT (770v]

e600

400

200 L1______O 1

1OdTC82DVJ

e1800

1200 ¡600

0 0

15 dTC87Ov)

O

Fig 24 Análisismedianteensayodeprotecciónde la RNasade los trónscriboshepáticosdeIGFBP-1, 2 y 3 de ratasadultas tiroidectomizadas(2’) y control (69 de 77, 82 y 87días <5, 10 y 15 días despuésde la tiroidecromía). Media + DS de 5 análisis

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1 0

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4- 3-Os.-.‘oE Senda

diferentes. * Sign¿ficaciónestadísticarespectoa la poblacióncontrol.

Resultados

un porcentajemenorparalos adultos(8.71%). No obstante,tanto a los 37 como a

los 87 días de vida (ratas destetadasy adultas, respectivamente)el pesode estas

poblacionestratadasfue inferior al de sus respectivoscontroles(Tabla 8).

3.4.2. Nivelesséricosde 123 y 124 y plasmáticose hipofisariosde GH.

Les valorescirculantesde las hormonastiroideasde las ratastratadascon

insulina permanecieronpor debajode los nivelesde la poblacióncontrol (Tabla 8).

La concentraciónséricade T> aumentórespectoa los animalestiroidectomizados,

tantoenel casode las ratasdestetadas(57.41%)comoenel de las adultas(27.55%),

sin embargo, los niveles de 124 no se modificaron respectoa los de la población

operadaen destetadasy bajaronen la adulta.

El tratamientocon insulinade las ratastiroidectomizadasprovocóun aumento

distinto enporcentajede los nivelesde OH circulantey que difirió segúnla edadde]

animal (Tabla 8): 25.43%paralas destetadasy 63.56%para las adultas,respectoa

las ratasoperadas.De un modo similar, el contenido de Gil en hipófisis se vió

incrementadoen un porcentaje superior al 35.00% para ambas poblaciones

hipotiroideasinyectadascon insulina respectoa las ratastiroidectomizadas,aunque,

como sucedió en el plasma, los niveles alcanzados continuaron siendo

significativamenteinferiores a los de los animalescontrol.


La insulinemiade las ratastiroidectomizadassometidasal tratamientocon la

hormona,comoseesperaba,fue significativamentesuperior(61.26%en el casode

las destetadasy 48.73%enel de las adultas)a la de la poblacióncontrol(Figura25).

Sin embargo, en el momento del sacrificio, no se encontraron diferencias

significativasentre las glucemiasde estasratashipotiroideastratadascon insulina y

las de las ratascontrol, quizáporhaberserestauradoya la hipoglucemiaproducida

por la administraciónde la hormona(Tabla 8).

3.4.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNni hepático.


Los nivelesde IGF-I ensuerofueronmásbajosen los animalestratadoscon

insulina que en los controles,y semantuvieronigualesa los tiroidectomizados,a 37

y 87 díasde Vida (Figura25). Así, y a pesarde que la administraciónde la insulina

aumentósus propios niveles circulantes,no modificó los bajos valores de IGF-I

disminuidospor la tiroidectomía.

134

4.)uto~

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EXPRESION DEL ARNm HEPÁTICO (JGF-I)

Destetadas

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T

Adultas

e

*

0 1+1

5

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0~—

*

Tl5dT (370v)

u

Sonda

*

1+I

15 dTC87DvTiFag 25 A) Niveles séricosde JGF-J y plasmáticosde insulina en animalesdestetadosy adultos

tiroidectomizados(‘¡9, controles (6’) y tiroidectomizadostratadQscon insulina <1 + 1) de37y 87díasde edad> respectivamente.Media + DSde 8-JOrasas~.B) Análisismedianteensayode protecciónde la RNasadel ARNmde IGF-¡ de las ratas

• anteriores.Media + DSde 4 análisisdiferentes.* Significación estadísticarespectoa los animales control. > Significaciónestadísticarespectoa la población tiroidectomizada.

A

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500

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500

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*

*

B

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37 87 Dv.

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-~ r¡~.-4)~4D-o

6

4

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o

~1~

o

Resultados


La Figura 25 muestraque, tanto en las ratastiroidectomizadasdestetadas

comoen las adultas,laadministraciónde insulinaprovocóunaumentoen los niveles

del ARNm hepáticode IGF-I respectoa la poblaciónoperada,aunquedichosvalores

no llegarona alcanzarlos de las ratascontrol (sesituaronpor debajode ellos). De

nuevo, comoocurríaa nivel circulante,seobservócomo el tratamientocon insulina

no era capazde normalizarla bajaexpresiónde los tránscritoshepáticosde IGF-I

causadapor la tiroidectomía.


Parael análisisde correlaciónse recogierontodos los datoscorrespondientes

a las dospoblacionesde los dos estadiosy se muestranen la Figura 26

Al igual que enel caso de las ratasdestetadasy adultastiroidectomizadasy

controles, se volvió a encontraruna alta correlaciónentre los niveles de OH en

plasmay los de IGF-I en suero(r= 0.91 y r~ 0.98, p’Z 0.05 para las poblaciones

hipotiroideasdestetaday adulta inyectadascon insulina, repectivamente).Por el

contrario,la correlaciónhalladaparala insulinemiay los nivelesséricosde IGF-I fue

de nuevo,muy bajae incluso, negativaen los animalesdestetadosy adultostratados

con insulina (r= -0.038y r= 0.62, respectivamente)(Figura 26>.




La tiroidectomíacausóun descensoen los niveles séricos de las proteínas

transportadorasde 30 (IGFBP-1 y 2> y 45kDa frente a la poblacióncontrol. No

obstante, la administraciónde insulina a estos animales operadosprodujo un

incrementoen los valorescirculantesdel complejoproteicode bajopesomolecular,

tanto en las ratasdestetadascomoen las adultas,aunqueen ningunade estasdos

poblacionesse llegarona alcanzarlos valorescontrol (Figura27).

Encuantoa la IGFBP-3,en los animalesmásjóvenes(destetados),la insulina

sí aumentósus niveleshastaalcanzarlos valorescontrol, aunqueen el caso de las

ratasadultas,el tratamientohormonalno alteró lascifras circulantesde estaproteína

transportadora(Figura 27), quizás porque la insulina tiene un mayor papel en la

regulacióndel sistemaIGFs/IGFBPsen etapasmás inmadurasdel desarrollodel

animal que en el estadioadulto, dondepareceserque la CH pasaa tenerunamayor

relevancia,o tambiénporquelos niveles de Gil despuésde la administraciónde la

137

DESTETADAS

TIROIDECTOMIZADAS (T

y= 69.63 - 0.019x- 0.038

e e

20

y= -67.91 + 63.68xr= 0.91

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Insulina (pU/mi)

e

e0 500 1000 1500 2000 2500 2000

GH <ng/mi)

ADULTASTIROIDECTOMIZADAS (T +

y= 130.03 + 0.38xr= 0.62

e

250 -

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200

50

eloo -

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o •--

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Insulina (pU/mi)

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0 2 4 6 8 10

GH <ng/mi)

Fig 26 Análisisdecorrelaciónlineal y co«ficientede correlaciónde los nivelescirculantesde IGF—I e insulina y Gil en ratas destetadas~37días) y adultas (87 días)riroidectomizadastratadas con insulina (T + 1). Se muestran las diferencias

120 -

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+ 1)

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estadísticas.

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iiiT O Pi

l5dTC8lDvJ

Fig 27 Nivelesséricosde las ZGFBPs en. ratas destetadas(37díasde vida) y adultas <‘87

días) tiroidectomizadas(T), controles (6’,) y timídectonilzadastratadascon insulina(T + 1). El análisis seeJéctuópor mediode “Western íigandbloC y con 2. S~~l desuero. Se muestra la cuant¿ficacióndensirométricade las concentracionesde lasIGFBPs de las núsinaspoblaciones.Media + DS de 4 análisis diferentes.* Signfficacíón estadística respecto a los animales control. ~ Sign¿ficaciónestadísticarespectoa la población.tírioídecro¿nizada.

45KDa

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300

150

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2000

o1 0 Pi

Resultados

insulina fueron superioresen la poblacióndestetada.


La IGFBP-1, como ya se ha mencionado,se encuentra reguladapor la

insulina, por ello, no fue extrañoel hechode que las ratassometidasal tratamiento

experimentaranunadisminuciónen la expresiónhepáticade estaIGFBP-1 respecto

a la poblacióncontrol, y que tal descensofuera incluso significativamentesuperior

al padecidopor los animalestiroidectomizados;estadisminuciónen los niveles de

ARNm de IGFBP-1 pareciósermásacusadaenel estadioadultoque enel destetado

(Figura 28).

Les nivelesde ARNm de IGFBP-3 aumentarony sehicieron comparablesa

los controles tras el tratamiento con insulina, tanto en el caso de las ratas

tiroidectomizadasdestetadascomo en las adultas, aunque en estas últimas, el

incrementofue mayory superóincluso los valorescontrol quizásporel aumentode

la GH (Figura 28).

En cuanto a la expresión hepática de IGFBP-2, en la población

tiroidectomizadadestetadaa la que se le administróla hormona,disminuyórespecto

a estosanimalesoperados,de manerasimilar a lo que sucedíaen el caso de los

neonatos tiroidectomizados tratados con STZ, mientras que en los animales

tiroidectomizadosadultostratadoscon insulina, los nivelesde ARNm de estaproteína

aumentaron(Figura28).

3.4.7. Resumende los resultadosdel estudiode tiroidectomíaen ratas

destetadasy adultasy de animalesdestetadosy adultosoperadostratadoscon

insulina.

La tiroidectomíacausóun descensoen la insulinemiay los nivelescirculantes

ehipofisariosdeGil de las ratasdestetadasy adultasrespectoa las control.El déficit

dehormonastambiénprodujo un descensoen los valoresséricosy de expresióndel

ARNm hepáticode IGF-I, IGFBP-1 y 3, mientrasque las cifras circulantesy las de

los tránscritosde IGFBP-2 aumentabanen estos animales destetadosy adultos

operadosrespectoa sus controles(Cuadro2).

La administraciónde insulinaa las ratasdestetadasy adultastiroidectomizadas

se acompañóde un incrementode su insulinemia,de los niveles circulantesde Gil

y de su contenidoen hipófisis respectoa los animalestiroidectomizados(Cuadro2).

No obstante,este tratamiento no modificó la expresión hepática ni los niveles

circulantesdel IGF-I respectoa las ratasoperadas.

140

flg 28 ExpresiónhepáticadelARNmdeIGFR¡‘-1, 2y 3 de ratasdestetadas(37días)y adultas(87días) ziroidectomizadas(79, controles CC) y tiroidectomizadastratadas con insulina (T +

1). El análisisseefectuómedianteel ensayodeprotecciónde la RNasa.Media + DSde4 análisis diferentes. * Sign~caciónestadística respecto a la población control.> Sign¿flcaciónestadísticarespectoa los animalestiroidectomizados.


IGFBP-1

Destetadas

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Sonda

l5dT(370v) 15dTC870v)

Resultados

En cuanto a las IGFBPs, la insulina aumentó los valores séricos de las

proteínasde bajo pesomoleculary tambiénIGFBP-3 respectoa las ratasoperadas,

aunquetan solo estaúltima alcanzólos valorescontrol en las ratasdestetadas.

Los tránscritosmuestranque la IGFBP-1 guardóun paralelismocon respecto

a valorescirculantes,mientrasque la IGFBP-2 disminuyeen destetadasy aumenta

en adultas.

La expresiónhepáticadel ARNm de IGFBP-3 pareceguardarun mayor

paralelismocon los valorescirculantes,aunqueseencuentraaumentadaen adultos

(Cuadro2).

Se establecióuna correlaciónpositiva entre los niveles circulantesde GH e

IGF-I.

Cuadro2.- Resumende los resultadosde los estudiosde tiroidectomía(T) y

tratamientocon insulina (T + 1) en ratasdestetadasy adultasrespectoa la población

control.

1 1+1

DESTETADAS ADULTAS

GLUCEMIA

INSULINEMIA 4 t 1

GH CIRCULANTE 4 4

CI-? HIPOFISARIA 4 4 4

IGF-I CIRCULANTE 4 4 4

ARNm IGF-I 4 4

IGFBP-1 y 2 CIRCULANTES 4 4 4

ARNm IGFEP-l 4 4 4

ARNm IGFBP-2 1 1 1

IGFBP—3 CIRCULANTE 4 4

ARNm IGFBP-3 4 1

3.5. TRATAMIENTO CON T4 DE RATAS TIROIDECTOMIZADAS

NEONATALES, DESTETADAS Y ADULTAS.

Con el objeto de continuar nuestro estudio sobre la influencia del

hipotiroidismoen el axis IGFs¡IGFBPs,se sometióa los animalestíroidectomizados

a una pautade rehabilitacióncon 14. Estaadministraciónse llevó a cabomediante

142

Resultados

la inyección de la hormonao por el implante de pellets para, de esta manera,

estableceruna comparaciónentre ambas vías de absorción,dado que con los

dispositivosde liberacióncontrolada(pellet)seconsigueunaformade administración

más fisiológica y continuada.El tratamientose inició a los 10 días despuésde la

tiroidectomía(15, 32 y 82 días de vida, para las ratas neonatales,destetadasy

adultas,respectivamente)y seprolongódurante5 días. Sin embargo,enel caso de

los animalesdestetadosy adultos, se estudiótambiénotra poblaciónen la que la

duraciónde la rehabilitaciónfue de 10 díasuna vez obtenidoslos resultadosde 5

días.

3.5.1. Tratamiento con T4 de las ratas neonatalestiroidectomizadas.

Comparaciónentredosisinyectadasy pellets.

3.5.1.1.Evolución del pesocorporal.

El tratamientode las ratastiroidectomizadascon T4 produjo un aumentode

supesocorporal respectoa la poblaciónoperada(Tabla 9), aunqueeste incremento

fue superiorcuandoseadministróal animal la hormonaen formadepellet (56.64%)

y no como inyección(31.28%);además,esto supusoque la ratatratadacon pellet

igualara su pesoal de la rata control frente a la rehabilitadacon la inyección

(21.52%).Se encontróuna diferenciaestadísticaentre los dos tipos de tratamiento.

3.5.1.2.Nivelesséricosde T3 y T4 y plasmáticose hipofisariosde GH.

Las hormonastiroideas séricas,como cabía esperar,disminuyeron en los

animalestiroidectomizados,aunqueel tratamientosustitutivo con tiroxina aumentó

los nivelescirculantesde T3 y T4 en estosanimalesoperados(Tabla 9). Así pues,

todos los gruposde ratastratadascon 114 mostraronun incrementoen los nivelesde

hormonastiroideas, que fue mayorcon la administraciónde pellets, pero que en

ningún casoresultó ser suficientepara alcanzarlos valorescontrol, y así, para las

ratastratadasconuna inyeccióndiaria de tiroxina, ladiferenciarespectoa lascontrol

se situó en un 84.78% para 113 y en un 73.74% para T4, mientrasque para las

recuperadasconpellet fue de un 66.30%parala 113 y de un 57.54%parala 114. Este

comportamientose debe a que las ratas neonatalespresentanuna elevaciónde

hormonastiroideasdurantela etapainmadura,y porello, enesteestadio,los niveles

de estas hormonasson superioresa los de los animalesadultos; así pues, en

experimentosfuturos intentaremosrestaurarlos nivelesde hormonastiroideasa los

valorescontrol mediante[a administraciónde dosis superioresde 114.

El tratamientode los animales tiroidectomizadoscon pequeñasdosis de

143

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Resultados

tiroxina (1.5~gIlOOg de peso) incrementólos niveles plasmáticosde GH, que

aparecíanya aumentadosen las ratas operadasrespectoa la poblacióncontrol, en

mayormedida.La pautade recuperaciónconpellet superóenun 72.28%el aumento

registradopor la administraciónde la inyección(Tabla 9).

La administraciónde 114 aumentótambiénel contenidodeGH enhipófisis de

las ratastiroidectomizadas,incluso porencimade los valorescontrol enun30.08%

para la inyección y en un 73.47% para el pellet, con lo que se encontróuna

diferenciasignificativaentreambaspautasde recuperación(Tabla 9).

3.5.1.3.Glucemiae insulinemia.

Les nivelesde glucosacirculante aumentaronrespectoa los valoresde los

animalestiroidectomizadospor la administraciónde tiroxina cuandosellevó a cabo

el tratamientocon los pellets (Tabla 9), y mostraronuna glucemiacercanaa los

niveles control (133.17mg/dl), no así con la misma dosis de 114 inyectada

(1 14.93mg/dl).Estediferenteaumentoen la glucemiade los animalestratadoscon

una u otrapautaresultó serestadísticamentesignificativo, lo que de nuevo llama la

atenciónsobrela mayor eficaciadel pellet en la rehabilitaciónde estosanimales.

Las dosis de tiroxina (1.5¡xg/ 1 OOg de peso) administradas por vía

intraperitoneal(inyección) o subcutánea(pellet) no modificaron los altos niveles

circulantesde insulinaencontradosparala poblacióntiroidectomizada,con lo que las

diferenciasrespectoa los animalescontrol (Figura 29) se cifraron en un 114.20%

paralos animalesa los que se les inyectó la T4 y en un 170.96%paraaquellosa los

que seles administróen fonna de pellet.

3.5.1.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

3.5.1.4.1.Niveles séricos.

El IGF-I, que aparecíaaumentadoen las ratasneonatalestiroidectomizadas,

disminuyócon la administraciónde 114, y así, ambaspautasofrecieronunosniveles

séricosdel péptido igualesa los valoresde los animalescontrol (Figura 29). Por

tanto, y contrariamentea lo que sucedíacon las cifras de insulinacirculante,ambos

tipos de tratamientoresultaronapropiadosparala rehabilitaciónde esteparámetro.

La recuperacióncon 14 de los aminaleshipotiroideoscausóun descensoen

sus aumentadosniveles de IGF-II, y los situó incluso por debajode los valores

control en un 65.08% y un 71.94% para la administraciónde 114 con inyección y

pellet, respectivamente(Figura 29).

145

Eig 29 4) Niveles circulantes de IGF-I, insulina e IGF-II en raías neonatatesde 20 días de vidauiroidectomizadas(7’), controles (C), tratadascon una dosisde 1.5¡ig/¡OOgdepesoadministradaenfonnade inyección (1?) y tratadascon la mismadosisde 7’4~ pero enforma depella (Rl>). Media ±DSde 8-10animales.II) Expresiónhepáticadel,4RNmy cuaní(JicacióndensizométricadelosIGF-¡ y ¡len ratasneonatalestiroidectomizadas(7).controles((2), tiroidectomizadasrecuperadasconuna inyecciónde 1.5~g/1OOgde peso de T4 (R) y con el pelleí de T4 (Rl>). El análisis se llevó a cabo medianteel ensayode

protecciónde la RNasaen animalesde 20 díasde vida (15 díasdespuésde la operación).Media ±DSde 4 análisis diferentes.* Signfficaciónestadísticarespectoa los animalescontrol. > Signficaciónestadísticarespectoalas ratas tiroidectomizadas.•Sign(ficaciónestadísticarespectoa la poblaciónde neonatostratadoscon la inyecciónde 1.Spg/lOOgdepesode L,.

INSULINA ¡OF -II

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EXPRESION DEL ARNm HEPATICO (IGFs)

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IGF-I

* * *-r

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l5dT (200v) 15d1 (200v)

Resultados

3.5.1.4.2. Expresióndel ARNin hepático.

Les nivelesde ARNm hepáticode IGF-I fueron, al igual queen los animales

tiroidectomizados,significativamentesuperiorestantoen los neonatosa los queseles

administróla T4 conuna inyecccióncomo los del pellet, respectoa los de animales

control (Figura29). Sin embargo,la expresiónhepáticade IGF-II disminuyótras el

tratamientohormonalconpellet (Figura 29), y no lo hizo con la inyección,siempre

respectoa la poblaciónde ratascontrol; seobservóasíunaclara diferenciaentreuna

y otrapautade reemplazamientoque, de nuevo,evidencióla mayoreficaciadel pellet

parala rehabilitaciónde los animalestiroidectomizados.

3.5.1.5.Estudiode regresiónlineal y correlación.

Seefectuóel análisisde regresióny correlaciónde los nivelescirculantesde

IGF-I frente a los de insulina y GH (Figura30).

Seencontróuna fuertecorrelaciónpositiva entrelos nivelesséricosde IGF-I

y los plasmáticosde insulinaen estosanimalestiroidectomizadostratadoscon 114, no

obstante,estacorrelaciónfue mayorcuandoel tratamientose llevó a cabomediante

la implantaciónde pellets (r=O.83) frente a la inyección (r=0.52). Sin embargo,

cuandose representaronlos valorescirculantesde RF-I frentea los de OH, estas

poblacionesmostraronunacorrelaciónbaja(r=O.50 y rzO.64paralas ratastratadas

con 114 vía intraperitonealy subcutánea,respectivamente).

3.5.1.6. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNrn hepático.


3.5.1.6.1.1.Westernligand blot.

Les animalesneonatalestiroidectomizadosexperimentaronun aumentoen los

niveles circulantes de las IGFBPs del complejo de 3OkDa, aunque los dos

tratamientosde recuperaciónprovocaronun descenso,muy similar, en sus valores

séricos(Figura 31) respectoa la poblaciónoperada,estohizo que ambosgruposde

animalestratadosalcanzaranunosnivelessimilaresa los de las ratascontrol.

La IGFBP-3 experimentóun aumento de sus niveles en suero tras la

rehabilitaciónde los neonatostiroidectomizadoscon T4 (Figura 31). Sin embargo,la

implantacióndel pellet, al igual que en otras ocasiones,consiguió restaurarlos

nivelesdel péptidode 45kDaa los valorescontrol, mientrasquela administraciónde

la inyecciónno consiguióun aumentoen los nivelesde estaproteínaligadorarespecto

a los animalestiroidectomizados.De nuevo, se observóuna mayor eficaciaen una

pautade tratamientosustitutivo respectoa la otra.

147

y= -89.79+ 9.71xr= 0.52

NEONATOSTIROIDECTOMIZADOS (R)

y= L33.42+ 12.42xrz 0.50

TIROIDECTOMIZADOS (RP)yr 18.75 + 1.39xr= 0.83 e

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5 15 25 25 45 65 65 75 85 95

Insulina (pU/mí>

Fig 30 Análisis de regresión lineal y coeficientede correlación de los niveles circulantesde IGF-I e insulinay CH de las ratas operadasde 20 días (15 días despuésde lariroidecíomla,.) tratadascon dWerentesdosisy vías de administraciónde 7%:

A) Inyecciónde ].5pg/lOOg de pesode T4 durante5 días.fi) Pcíletde l.Spg/lOOgde pesode 7% duranre 5 días.

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Resultados

3.5.1.6.1.2. Western inmunoblot.

Los nivelesséricosde IGFBP-1, queaumentarondespuésde la tiroidectomía,

disminuyeronal tratar a estosanimalesoperadoscon una dosis de 1 .Sgg/lOOgde

pesode 114 (Figura 31). La administraciónintraperitonealde la hormonaigualó los

niveles de estaproteínade bajo pesomoleculara los valorescontrol, mientrasque

el tratamientocon pellet situó las cifras circulantesde IGFBP-1 en unos valores

intermedios y distintos a los mostrados por las poblacionestiroidectomizaday

control. Se encontróuna diferenciaentre los dos tipos de tratamiento,aunqueen

cualquiercaso, con ambaspautasde administraciónse encontróuna disminución

respectoa los nivelesalcanzadosdespuésde la tiroidectomia.

El tratamiento con T4 mediante la inyección intraperitonealprodujo un

aumentoaún mayorde los nivelesséricosde IGFBP-2 (Figura31). La implantación

de pellets,por el contrario, disminuyólos altosvalorescirculantesde estaproteína,

con lo que se alcanzaronunascifras similares a las mostradaspor los animales

control; de nuevo, se puso de manifiesto una diferenciaentre los dos tipos de

tratamiento.

3.5.1.6.2.Expresióndel ARNm hepático.

Les niveles de ARNm hepáticode IGFBP-1 disminuyeron al tratar a los

animales neonatalestiroidectomizadoscon T4 (Figura 32). La inyección de la

hormonaprovocó un gran descensoen la expresiónde estaproteínade bajo peso

molecular,y resultósermásacusadoque el producidopor la implantaciónde pellet,

que mostró unos niveles de ARNm similares a los de la población control; se

encontró así una diferencia estadísticamentesignificativa entre los niveles de

expresiónde IGFBP-1 de las ratastratadascon inyeccióny las control, y entrelas

dospautasde reemplazamiento.

La IGFBP-2 mostró una menorexpresiónhepáticadespuésde tratar a los

animalestiroidectomizadoscon el pellet (Figura 32). Por el contrario, la inyección

de 114 no sólo no provocóun descensoen los nivelesde ARNm de estaproteína,sino

que los aumentó,y los valores alcanzadosfueron muy superioresa los de los

neonatoscontrol e, incluso, a los de los tiroidectomizadosque los presentabanya

aumentados.El análisisestadísticomostró así una diferenciasignificativa entrelos

dos tipos de tratamiento.Este anómaloincrementoen la expresiónen hígadode la

IGFBP-2 asociado a la administración intraperitoneal de la T4 será estudiado

oportunamente.

150

ng 32 Análisis medianteensayodeprotecciónde la RNasade los tránscritoshepáticosde lGFBP-!, 2 y3 de razasenperiodo:

Neonatal(20días): ziroidectomizadas(2), controles ((2), tiroidectomizadastratadas con unainyecciónde 1..S~g/1OOgde peso(R,)ycon peZ/e:de igual dosis (Rl’,).Destetado(37 días)y adulzo(87días):tiroidectoniizadasrn. controles(C%tiroidectomizadascon una inyección de 1. 7Sgg/IOOgde peso de 7’., durante 5 días (R,), tiroidectomizadasrehabilitadasconpella de igualdosisduranteSdías(Rl>5), tiroidectomizadasrecuperadascon

pellet de la mismadosificacióndurante 10 días (RP¡a).*Signjficación esuidínicarespedoa la población control. > Sigt«ficaciónestadísticarespectoa los

animalestiroidectomizados.O Sign<ficación estadísúcarespectoa las ratas rehabilitadas con lainyecciónde 7’,.Semuestrael análisis densitomnñrieo.Media + DSde 4 análisis dferen¡es.


IGFBP-1

Neonatos Destetadas Adultas

k»

200

100

o

lbdT (2oDv)

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l5dT (2oDv) l5dT(37Dv) 15dTC87DV)

Resultados

La expresiónen hígadode la IGFBP-3 aumentódespuésde recuperara las

ratastiroidectomizadascon tiroxina, incluso superóa los valorescontrol cuandose

administró la hormonacomo inyección(Figura 32). A pesarde que no se encontró

ningunadiferenciaestadísticaentrelas dospautasde reemplazamiento,los nivelesde

ARNm de esta proteínade alto pesomolecularse aproximaronmás a los valores

controlcuandose llevó a caboel tratamientomediantela implantaciónde pellets.

A la vista de estosresultados,sepodríadecir que la administraciónde 114 a

ratasneonatalesrestauralas alteracionesproducidaspor la tiroidectomía.

3.5.1.7.Resumende los resultadosdel estudiodel tratamientocon T4 en

ratasneonatalestiroidectomizadas.

Los valores circulantes de IGF-I y II despuésde la administración de

1 .Sgg/lOOgde peso,tantoporvía intraperitonealcomo conpellet, desciendenal nivel

de los controlese igualmentela expresiónde suARN paraIGE-Il no paraIGF-I. Los

valores circulantesde insulina tambiéndisminuyen, quedandoaún por encimade

controles.Tambiéndesciendea nivel de controlesel complejode 3OkDa circulante;

por inmunoblotse muestraen los animalestratadosconpellet, que estadisminución

es mayoren la IGFI3P-2cosa que no semanifiestacon la inyecciónde 1 .5pg/íOOg

de peso.

La IGFBP-3 circulante no se altera con la inyección y remontaa valores

controlcon el pelletde 14. La expresiónde ARNm de las IGFI3Psde 3OkDamuestra,

igual que lo hizo el inmunoblot, que es mayorel descensoen IGFBP-2 despuésde

la implantacióndel pellet. Tambiénaumenta,alcanzandolos valorescontrol, el

ARNm de IGFBP-3; por tanto despuésde la implantacióndel pellet se muestrauna

recuperaciónparalelade los valorescirculantesy la expresiónhepáticadel ARNm

en las tres JGFBPsestudiadas,cosa que no sucedecon las mismasdosisde T4 por

inyección. Todo ello manifiestala no convenienciade estavía para rehabilitación

como ya se ve tambiénen los cambiosde los parámetrosde la Tabla 9 despuésde

la inyecciónde 114.

En los animalestratadosconpellet, la Gil plasmáticaehipofisariaaumentaron

respectoa las ratascontrolesy tiroidectomizadas,y la glucemiaalcanzalos valores

control, los mismos cambios se producenen los animalesinyectadoscon 14 pero

menosacusados.

Se establecióunacorrelaciónpositivaentre los nivelescirculantesde insulina

e IGF-I que esmayorcon pellet.

152

Resultados

Cuadro3.- Resumende los resultadosde los estudiosde la administraciónde

T4 endosisde 1.5 ¡íg/lOOg de pesopor vía ip (11 +T4)~~ o vía sc (pellet) (T + T4)SC

en ratasneonatalesrespectoa la poblaciónde los animalescontrol (20 díasde vida).

(T + T4)1~ (T + T4),~

GLUCEMIA 4

INSULINEMIA t 1

GR CIRCULANTE 1 1

OH HIPOFISARIA 1 1

IGFt~I CIRCULANTE

ARNm IGF-I 1 1

LOE-II CIRCULANTE

ARNm LOE-II

IGFBP-1 CIRCULANTE

ARNm LGFBP-L

IGFBP-2CIRCULANTE

ARNm IGFI3P-2 1 4

IOPBP-3 CIRCULANTE

ARNm IGFBP-3 1

3.5.2. Tratamiento con 114 de las ratas destetadas y adultas

tiroidectomizadas.Comparaciónde dosisinyectadasy pellets.

Al igual que en los estudiosrealizadossobrela poblaciónneonatal,en las

ratas destetadasy adultastambiénsellevó a cabola rehabilitaciónde estosanimales

tiroidectomizadosmediante la administración ip (inyección) y sc (pellet) de la

tiroxina, para de nuevo estableceruna comparaciónentre las dos vías empleadas,

pero ahoraen estadiosmás madurosdel desarrollo.La recuperacióncon pellet se

realizódurante5 ó 10 días.

3.5.2.1. Evolución del pesocorporal.

Las ratastiroidectomizadaspresentaron,comoya seha visto, unpesocorporal

inferior al de las ratascontrol, sin embargo,la rehabilitaciónconT4 aumentóel peso

del animal operado. Este incremento fue significativo respecto a la población

tiroidectomizadacuandoel tratamientohormonalse realizó con el pellet, puestoque

la administracióndiaria de la inyecciónno modificó el pesode los animalestratados

con 114 respectoal de los operados,tanto en la etapadestetadacomo en la adulta

<Tabla 10). Cuandola recuperaciónse prolongódurante5 díasmás,el valor del peso

se igualó al de las ratas control, por tanto se ve un aumentoprogresivodel peso

153

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E--o

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Resultados

cuandoserehabilitanconpellet.

3.5.2.2.Nivelesséricosde 13 y 14 y plasmáticose hipofisariosde GR.

Los niveles de hormonastiroideasdisminuyeron despuésde la operación,

aunqueel tratamientosustitutivo con T4 produjo un incrementosignificativo en las

cifras circulantesde estashormonasen todos los casosestudiadosrespectoa los

animalesoperados(Figura 33). Este aumento,al igual que sucedíacon el peso

corporal,fue menorparaaquellasratasa las que se les inyectéla hormonarespecto

a las que se les implantéel pellet, tanto a los 5 comoa los 10 días de tratamiento.

El incrementoencontrado,que superóinclusolos valoresde los animalescontrol,en

las ratasdestetadastratadasconpelletdurante5 días, fue de un 13 1.05% para la T3

y de un 70.00% para la 14, mientras que para las adultasesteresultó ser más

modesto(5.20%parala T3 y 28.71%parala T4) e igualélos nivelesde las hormonas

tiroideas a los de la población control. Estos datos contrastaroncon los obtenidos

paraaquellosanimalesdestetadosy adultosinyectadoscon T4 diariamente,dadoque

el incrementofue menor, y en ningúncaso superaronlos valorescontrol (59.69%

para13 y 76.02%para114 en las ratasdestetadasy 72.42%paraT3 y 62.74%para

14 en las adultas);asípues,pareceque encuantoa la recuperaciónde las hormonas

tiroideasen ratasdestetadas,el tratamientoidóneoesel pellet durante10 días.

En los animalesadultos,el tratamientocon pelletsde T4 mantuvolos niveles

de hormonastiroideas igual a los controlestanto a los 5 como a los 10 díasdespués

del inicio de la administraciónhormonalporpellet (Figura 33). Sin embargo,y dado

que la dosis fue la misma para los animalesadultos y destetados,estos últimos

mostraronunosnivelesde hormonastiroideassuperioresa los de lapoblacióncontrol

a 5 días, probablementedebidoal menorpesode las ratasmás jóvenes.Por tanto,

cabedestacarque paralos animalesadultos,encuantoa las hormonastiroideaslas

dosis de 1 .75j¿g/lOOg de pesode 14 es la idóneatanto con 5 como con 10 días de

tratamiento.

La Gil circulanteaumentéal tratar con T4 a los animalestiroidectomizados

respectoa los operadosen ambaspoblaciones,superandolos valores control en

destetadasy no llegandoa ellos en adultos; igualmenteaumentóla Gil hipofisaria,

no llegandoa valorescontrol más que en las adultasde 10 díasde tratamientocon

pellet (Tabla10). Al igual quesucedíaparaelpesocorporaly las hormonastiroideas,

la rehabilitacióncon pellet durante10 días ofreció los niveles más cercanosa los

control.

155

e

T3

ng/dr

T

ticrARW RP6

LII np-io

flg 33 Nivelesde T~ (A) y T4 (8) en suerode Tatasdestetadas(37días)y adultas (87díasde vida)¿‘iroidectomizadas(2), controles ((2), ¡‘iroidectomizados rehabilitadas con inyección de1. 7Spg/¡OOgdepesode T4 durante5 días <1?), conpellet de la mismadosisde 7’4 durante5 días (Rl>) y 10 días (Rl>,0). Media ±DS de 8 animales. * Signficación estadísticarespectoa la población control.~ Significaciónestadísticarespectoa las ratasoperadas.• Significación estadística respectoa los animales recuperadoscon la inyección de1. 7Sgg/lOOgdepesode 7% durante5 días,OSignificaciónestadísticarespectoa las ratasrehabífijadascon pelter de 7% y una dosisde l.75>g/lOOg de pesodurante 5 días.

T4

87 Dv.

lSddT lSddT

37 87 Dv.

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* *

Resultados

La rehabilitaciónconpelleta lo largode 5 díaspareciósermásefectivaque

la inyección, que no modificó el contenidoen GH de estetejido respectoa las

poblacionestiroidectomizadasdestetaday adulta.A la vistade los resultadosse debe

destacarque la respuestaal tratamientodifirió segúnla edaddel animal; las ratas

destetadasrehabilitadascon pellet presentaronunos niveles de GH en plasma

superioresa los de los animalescontrol,perosucontenidohipofisariofue inferior al

de dichoscontroles,sin embargo,las ratasadultasa las que se les implantóel pellet

o se les inyectó la hormona,mostraronunos valoresde GH en plasmae hipófisis

inferiores o igualesrespectoa las ratascontrol; estasdiferenciaspuedenserdebidas

a la distinta madurezdel axis de la Gil, dadoque en las ratasdestetadaspuedenno

haberseestablecidolas conexionesneuroendocrinascompletamente.

3.5.2.3.Glucemiae insulinemia.

Los nivelesplasmáticosde insulina aumentaronal administrar114 a las ratas

tiroidectomizadas(Tabla 10) porambasvíasen destetadasy adultas,peroalcanzaron

valorescontrol sólo con el implantede pelletsa 5 o a 10 díasenambaspoblaciones

destetadasy adultas.A pesarde todo, y al igual queencasosanteriores,los valores

que fueron similares y más cercanosa los niveles control resultaronser los de

aquellasratastratadascon pellet y cuyo tratamientose prolongó durante10 días

(22.82y 3.76% paralas ratasdestetadasy adultas,respectivamente).

El tratamientocon tiroxina aumentólos nivelessanguíneosde glucosade los

animales tiroidectomizados (Tabla 10), y se observó de nuevo, un mayor

acercamientoa los valorescontrol en aquellasratastratadascon114 durante10 días.

3.5.2.4.IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

La recuperaciónde los animalestiroidectomizadoscon114 produjoun aumento

en los nivelescirculantesde IGF-I (Figura 34). Este incrementoen los valoresdel

péptidofue mayoral tratarcon pelletsdurante10 díasa ambaspoblacionesdestetadas

y adultas. El tratamientocon pellets durante5 días se mostró más efectivo en la

restauraciónde los nivelesde IGF-I que la inyecciónde 114 (Figura 34).

En los animalesdestetadostan solo el tratamientocon pelletdurante10 días

rehabilitó los nivelesde IGF-I a los controles,cosaque selogró a los 5 días en los

adultos.Sin embargo,el tratamientocon pellet ya a los 5 días rehabilitéa niveles

controlel ARNm hepáticode IGF-I en laspoblacionesdestetaday adulta, aunquelas

inyeccionesde igual dosis no tuvieronefecto (Figura 34).

Se observépuesun gran paralelismoentre los nivelesséricosde IGF-I y los

157

A IGF-l

600

500

400

300

200

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LII RP1O

EXPRESION DEL ARNm HEPÁTICO (IGF-I)

37

Destetadas Adultas

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O RRPRI%

1 5dT (37Dv) 15 dTCS7Dv)Nivelesséricos <A) y expresiónhepáticadel ARNm (B) de [GE-! en ratas destetadas<37 días) yadultas(87días) tiroidecwmizadas(T), controles <ci» tiroidectomizadastratadasconuna inyecciónde 1. 7Spg/lOOgdepesode 7% durante5 días (R), operadasrecuperadascon pellety una dosisde1. 7SpgIJOOg de peso durantes días (Rl’5) y tiroidectomizadas tratadas conun pelter y fa mismadosisde T, durante10 días (Rl>,0).A) Media ±Di de 8 animales.B) Ensayodeprotecciónde ribonucleasasy cuantificacióndensitométrica.* Significaciónestadísticarespectoa la poblacióncontrol. ~ Significaciónestadísticarespectoalos animalesdroidectomizados.@ Significaciónestadísticarespectoa las ratas tiroidectomnizadastratadas con una inyeccióndiaria de 1. 75jsgIlOOg depesode 2% durante5 días.

e

*

Bl5ddT I5ddT

87 Dv.

*T

*~1~

Sonda

Fig 34

Resultados

de suexpresiónenhígado,lo que nos lleva unavezmása sugerirque las hormonas

tiroideas parecenactuar sobre el IGF-I a nivel transcripcional. Así mismo, se

encontróuna recuperaciónmás inmediatade la expresióndel ARNm hepáticode

IGF-I respectoa sus nivelesséricos,ya que tanto a los 5 como a los 10 díasdespués

del inicio del tratamientoconel pellet, las poblacionesdestetaday adulta igualaron

sus nivelesde ARNm a los valorescontrol.

3.5.2.5.Estudiode regresiónlineal y correlación.

Las Figuras35 y 36 resumenlos resultadosdel análisis de regresiónde los

nivelesséricosde IGF-I frentea los plasmáticosde insulina o GR.

Las ratas destetadasy adultaspresentaronuna alta correlación entre los

valores circulantesde Gil e IGF-I, tanto en las tratadascon inyecciónde 114 (r=

0.78, para las detetadasy r= 0.97, p’Z 0.05, para las adultas)como en aquellos

animalesa los que se les trató conel pellet durante5 días(r= 0.99, p<O.0S,para

los destetadosy r~ 0.97, p<O.OS,paralos adultos)como 10 días (r= 0.83 paralos

másjóvenes,y r= 0.99, p’c0.Ol, paralos adultos).Porel contrarío, la correlación

encontradaentrela insulinemiay los nivelesséricosde IGF-I en las ratasdestetadas

tiroidectomizadasy tratadascon114 fue muy baja,e inclusonegativa(r= 0.048, r= -

0.60 y r~ -0.85, para la administraciónde la hormonacomo inyección, pellet

durante5 díasy pellet durante10 días, respectivamente),e igual ocurrió en el caso

de los animalesadultos (r=r -0.62, r= -0.21 y r~ -0.28, para el tratamiento

intraperitonealde 114 y subcutáneode 5 y 10 días de duración, respectivamente)

(Figuras35 y 36).

3.5.2.6.IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.


3.5.2.6.1.1.Westernligand blot.

El hipotiroidismo,comoseha visto en la primeraparte,provocóun decenso

en los nivelescirculantesde las proteínasligadorasde alto y bajopesomolecular,sin

embargo, la recuperación de los animales tiroidectomizados mediante la

administraciónde T4 aumentélos valoresséricos de las IGFBPs de 30 y 45kDa

(Figura37>. Este incrementofue superiory supusouna rehabilitacióncompletade

los animalesdestetadosy adultos tratadoscon el pelletdurante10 días, encuantoa

los niveles de las IGFBPs de alto y bajo peso molecular. La administraciónde

tiroxina mediantela inyecciónde la hormonao por el implantedel pellet durante5

días no restauró los nivelesde la proteínade 45kDa (IGFBP-3) en la población

159

DESTETADASTIROIDECTOMIZADAS (R)

y= 139.68 + 0.025xr= 0.048

ee

e150

ee

eloo

e50

e

40 50

Insulina <pU/mi)

1.29r= 0.78

+ 47.50x

e

e e

e e e

9——e-

0~

60 1 2 0 4 5 6

OH (ng/mi)

TIROIDECTOMIZADAS (RP)

+ 261.96x

OH (ng/mi)


e e

e

ey= 256.05 - 2.06xr= -0.85

S50.

>00

260

200

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50o

O t 20 30 40 50 CC • 70

Insulina <pU/mi>

y= 108.55+ 9.35xr= 0.83

e e

-e

0 6 10

OH (ng/mi)

Fig 35 Análisis de regresión lineal y coeficientede co’-,-elaciónde los nivelesde IGF-I ensueroy las concentracionesplasmáticasde insulina y CH en ratas destetadast3~días) tiroidecronzizadastratadas con 1. 7Spg/]OOg de pesode T4 en forma deinyeccióndurante5 días (Rl, conpePe?de la misnza dosisa lo largo de5 días (Rl>)y conpellet durante JO días (RP1). Se muesa-anlas dlfe¡-enciasestadísticas.

250

E

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168.17 - 0.82xr= -0.60

e e—e

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E

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‘0 20 50 40 $0 6 0

Insulina (pU/mi)

260

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200

160

lOO:

60

16 20

ADULTAS

TIROIDECTOMIZADAS <R)y= 694.88 - 7.82x

er= -062e

ee e

e.

e

60 60

insulina (pU/mi)

y= -588.31±53.59x

70 0

y= 663.35 - l.89xr= -0.21

TIROIDECTOMIZADAS (nP)600 y~ 60.87 + 0.86x

r~ 0.97 (p<O.O5)~e e ~ e

400~t ~ ee ee e ee

e—--e

300 -

200 -

loo

20 30 40 60 60

Insulina (pu/mi>70 60

0 ———- -~

0 5 lO 16 20

OH (ng/mi)

600 r y~z 640.83 + 3.69x

600 r= -0.28e e400 ee e——~~

e300

200 -

100

600

400 -

300 -

200 -

40 50 60 70 60

Insulina (pU/mi)

ee

e

e•

loo-

o$4 It 6 20

OH (ng/mi)

Fig 36 Análisisde regresiónlineal y c-ojicieníede cori-elación de los nivelescirculantesde ¡CF-! e insulina y CH en rotas ¿¡dulías (87días) tiro idee/onzizadasrecuperadascon dosisde 1. 7Syg/lOOgde pesoen fin-ma de inyeccióndurante5 días (R) y conpelleis de la mismadosis durante5 días (RP) y JO días (RP~. Se muestranlasd¿ferenciasestadísticas.

600

400

300

200

E5—

ItO

400

300

400

o30 40

4000

OH (ng/mi)

600

600

E‘5-o)

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CD

400

200 -

o


600- y= 13.47+62.12xr= 0.99 (p-cO.Ol)

E—5.o)

LI.CD

A WESTERN LIGANJ~ BLOT

Destetadas Adultas

45KDa e1200

600

0

—PI’— n. giu

e2700

1800 *

900 3RPR%

*

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B WESTERN TNMUNOBLOT

T C RRPRF?O

l5dT(37Dy)

T O RRPRI~Q

15dTC87DvJ

Hg 37 A) Análisismediante“Wesíern ligand blw’ de los nivelesde las ¡CPBPs en ratasdestetadas<‘37 días) y adultas (87 días) íiroideuomizadas (7), conu-oíes ((2)tiroidectomizadastratadascon 1. 75yg/IOOgde pesode 7’4 ip (R9 y sedu¡ante5 día:(RP9y JO días (RPJJ. Se analizaron

2.Syíde suero. Se muestrala cuanrWcaciórdensitométricade las concentracionesde las WFBPsde las mismaspoblaciones.Media + DSde4 análisisdWerentes.* Sign~ficaciónestadísticarespectoa las rataácontrol. ~ Sign~caciónestadísticorespectoa los animalesoperados.• Sign¿tlcaciónestadísticarespectoa la población recuperadacon un.a inyecció¿diaria de 1, 7Sgg/lOOgde pesode 7’4 durante 5 días.B) Contenidode ICFBP-2 del suerode ratas destetadasy adultas (37y 87 días,respectivo,nente~pertenecientea las poblacionesde animalesanteriores (7’, (2, R,RP

5 y RP,9. El análisisse efectuómediante “Western inmunobíot”.

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Resultados

destetadani en la adulta. En estascondiciones,tampocoserecuperaronlos valores

del complejo de 3OkDa (IGFBP-1 y 2) en las ratas adultas, aunqueeste sí se

rehabilitócon los tres tratamientoshormonalesen la poblacióndestetada.

3.5.2.6.L2.Westerninmunoblot.

La administraciónde 114 a los animalesdestetadosy adultostiroidectomizados

provocóun decensoen los nivelesséricosde IGFBP-2(Figura37). Estadisminución

en la intensidadde las bandaspareció ser mayor en el tratamientode 5 días de

duraciónfrenteal de 10, que seaproximómás a los valorescontrol. Así pues,y por

comparaciónde estosresultadosconlos obtenidosmedianteel ‘Westernligand blot”,

sepodríasugerirque el descensoen la intensidadde las bandasde 3OkDaregistrado

mediante el “Western inmunoblot” se debió a la disminución de la IGFBP-2

circulante,puestoque el “Westernligand blot” mostróun aumentoen la cantidadde

complejode proteínasde bajo pesomolecular(IGFBP-1 y 2).

3.5.2.6.2.Expresióndel ARNm hepático.

La expresiónhepáticade IGFBP-1 disminuyóen las ratasdestetadasy adultas

tiroidectomízadasrespectoa suscontroles,sin embargo,laadministraciónde T4 a los

animalesoperadosprovocóuna restauraciónen los nivelesde su ARNm (Figura 38);

estarehabilitaciónse produjo ya con la inyecciónen las ratas adultasy no en las

destetadas.La rehabilitaciónfue igual a los controlescon 10 díasde tratamientoen

ambaspoblaciones.

Los niveles de IGFBP-2, que aparecieronaumentadosen los animales

tiroidectomizados,disminuyerontrasel tratamientocon 974 (Figura38). En las ratas

destetadas,el descensode la expresiónfue másacusadoal administrara los animales

los pellets, e incluso, los nivelesde los tránscritosde estaproteínafueron inferiores

a los mostradospor la poblacióncontrol. En los animalesadultos,sin embargo,y

quizás debido a los bajos niveles de IGFBP-2 que existen en ellos, los tres

tratamientosensayadosse mostraronefectivosparadisminuir la expresiónhepática

de la proteína, e incluso, como sucedíaen las ratas destetadas,estos valores

resultaronser inferiores a los mostradospor los controles.En ningunode los dos

gruposde animales(destetadosy adultos) se encontrarondiferenciassignificativas

entre las dospautasde rehabilitaciónllevadasa cabocon pelletsy sí respectoa los

de la inyección (destetadas).

En cuantoa la IGFBP-3, el tratamientocon pelletdurante10 días fue capaz

de restaurarlos niveles de ARNm de esta proteína en ratas tiroidectomizadasa

163

Fig 38 Análisis medianteensayodeprotecciónde la RNasade los tránscritoshepáticosde ICFBP-1, 2 y3 de ratas en periododesteuzdo(37días)y adulto (87días): ratas tiroidectornizadas (7), ccittroles

(Q.uiroideaomizadasy tratadascon una inyeccióndel. 7Sgg/lXgdepesode T4duranteSdías(RLtiroidectornizadasrehabilitadascon pellet de igual dosisdurante 5 días (Rl>), tiroidectomizadasrecuperadasconpetletde la mismadosfficacióndurante¡O días (RPJ4).* Significaciónestadísticarespectoa lapoblacióncontrol.NISignlficació,¿estadísticarespectoa losanimalestiroidecromizados.• Signqlcaciónestadísticarespectoa las ratas rehabilitadascon la inyecciónde T4 (1. 75p.g/lOOgdepeso).Semuestra el análisis densitométrico.Media + DS de 4 análisis dWerentes.

EXPRESION DEL ARNm IBIEPATICO (IGFBPs)

IGFBP-1

Destetadas

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*

1 0 R RPRI90

*

l5dT(37Dv) 15dTC87Dv)

Resultados

valores control (destetadas>o incluso superiores(adultas) (Figura 38>. En los

animalesadultos, los tres tratamientosensayadosaumentaronla expresiónhepática

de la IGFBP-3, y aunquelos pellets lo hicieron incluso por encimade los valores

control, la inyección mostróunos nivelessimilares a la poblacióncontrol. En las

ratasdestetadas,sin embargo,sólo la pautallevada a cabo mediantela implantación

del pellet durante 10 días, fue capaz de aumentarla expresiónhepáticade esta

proteínade alto peso molecularhastavalores control, y a pesar de ello, no se

encontrarondiferenciasestadísticasentreningunode los tres distintostratamientos.

3.5.2.7.Resumende los resultadosdel estudiodel tratamientocon 114 en

ratasdestetadasy adultastiroidectomizadas.

El IGF-I circulanteen animalesdestetadosserestauraigual a controlescon

pelletdurante10 díasy en adultaspor igual vía de administracióntantoa 5 como 10

días. La expresióndel ARNm hepáticoes rehabilitadaigual a controlescon peflet

tantoa 5 como 10 díasen ambaspoblaciones.El pesocorporal y la Gil plasmática

e hipofisariamuestranuna mejor restauración,a pesarde que no alcanzanvalores

controlmás que enel contenidoen pituitaria de adultasa los 10 díasde tratamiento

conpellet, mientrasla insulinaesrestauradaigual a controlesconpelleta 5 ó 10 días

enambaspoblaciones.

La glucemiaalcanzanivelescontrolescon cualquier tratamientode 114. En

estas condiciones, las bandas proteicas de bajo peso molecular circulantes se

restaurarontan solo conpellet 10 días en destetadasy adultasy la IGFBP-3 mejor

con 10 días de pellet en adultas. La expresiónde su ARN muestra que dicha

restauraciónpodríaserdebidaa IGFBP-1, ya que la expresiónde IGFBP-2disminuía

con 114 por cualquier tratamientotanto en destetadascomo adultas. El ARN de

IGFBP-3serehabilitóconpelletdurante10 díassubiendoporencimade los controles

en adultas.

165

Resultados


114 en dosisde l.75¡íg/lOOgdepesoporvía ip (T ±974)duranteSdíaso vía sc a lo

largo de 5 ((T + 114)5) o 10 días ((97 + Tj~) en ratasdestetadas(37 días)y adultas

(87 días) respectoa la poblacióncontrol.

1 + 14

DESTETADAS

4INSULINEMIA

GLUCEMIA

GH CIRCULANTE -

GIL HIPOFISARIA ¿

IGF-I CIRCULANTE

ARNmIGF-I

IGFBP-1 y 2 C[RCULANTES=

ARNm IGFHP-1 4

ARNm IGFBP-2 1

IGFBP-3 CIRCULANTE ¿

ARNm IGFEP-3 ¿

ADULTAS

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4

4

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4

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DESTETADAS ADULTAS

1 4

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(T + T~

DESTETADAS ADULTAS

t

4

4

4

1 1

NEONATAL Y ADULTO YREHABILITACION3.6-DIABETESENPERIODO

CON t.El modelo de diabetespor STZ se provocó por inyección

estasustanciaa los 10 díasde vida (neonatos)o a los 72 díasde

animalesfueron divididos en dosgruposy sacrificadosa los 20 y

el primer grupo fue sometidodurante5 díasa un tratamientocon

de LS y l.75jig/lOOg de pesoparalas ratasneonatalesy adultas,

y el segundoactué de control.


Las ratasdiabéticaspresentaronun pesoinferior al de sus controlestantoen

la etapaneonatal(25.45%)como en la adulta (31.56%)(Tabla II).

En la etapaneenatal,el tratamientocon 114 aumentóel pesocorporalde estos

animalesdiabéticosa los que se les implantó el pellet (12.13%)frente a los no

tratados,aunque persistió la diferencia respectoa la población control. Por el

contrario, las ratas adultasno modificaron su peso tras la administraciónde T4

respectoa los animalescontrol.

intraperitonealde

vida (adultos). Los

87 días de edad:

unasdosisde T4

respectivamente,

166

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VV

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Resultados

3.6.2. Nivelesséricosde 113 y 114 y plasmáticose hipot’isar¡osde GH.

La diabetesprovocóun descensoen los niveles circulantesde las hormonas

tiroideas (Tabla 11). Esta disminuciónfue más acusadapara los animalesadultos

(85.57% para T3 y 82.16% para 114) que para los neonatos(34.52% para 113 y

28.89%para114) respectoa los controles.

La administración de T4 provocó el esperadoaumento en los niveles

circulantesde las hormonas tiroideas (Tabla 11). En el caso de los animales

diabéticosneonatalestratadoscon l.5p¿g/lOOgpesode tiroxina, el incrementofue de

un 65.54%para T~ y un 58.65%para14 respectoa las ratasdiabéticasno tratadas,

lo quesituó las concentracionesséricasde las hormonasenunosvaloresigualesa los

de las ratascontrol. Al igual quesucedíaconlas ratasneonatalesque recibíanT4, los

animalesadultosdiabéticossometidosal tratamientohormonalexperimentaronun

aumentoen los valorescirculantesde las hormonastiroideas (262.84%y 27132%

paraT3 y 14, respectivamente)frentea las ratasdiabéticas,perono sealcanzaronlos

valoresde la poblacióncontrol.

Los nivelesplasmáticosde OH disminuyeroncon el estadode diabetesen los

animalesadultos (75.13%)respectoa los control (Tabla 11). Sin embargo,las ratas

neonatalesdiabéticasexperimentaronun ligero descenso(no significativo) en los

valorescirculantesde estahormonarespectoa los de la poblacióncontrol.

El contenidohipofisariode OH, al igual quelos nivelescirculantes,disminuyó

en mayor medidaen los animalesadultosdiabéticos(62.67%)que en los neonatos

(28.95%)respectoa las ratascontrol (Tabla 11).

El tratamientode los animalesdiabéticoscon T4 provocó un aumentoen la

concentracióncirculantede OH y en su contenidohipofisario(Tabla 11). Los niveles

plasmáticosde OH en las ratas neonatalestratadascon la hormonasufrieron un

aumentoespectacular,e incluso sobrepasaronlos valoresde la poblacióncontrol,

mientrasqueen los animalesadultosdiabéticos,a los que tambiénse les adminstró

la tiroxina, esteincrementofue másdiscretoy situó los nivelesde estasratasen unas

cifras intermediasa las de las poblacionescontrol y diabética.A nivel hipofisario,

el aumentoprovocadoen el contenidode OH por la administraciónde 114 en las dos

poblacionesde animalesno redujo la diferenciaexistenterespectoa los animales

control, aunqueeste incrementoresultó ser ligeramentesuperioren el caso de las

ratasadultas(28.25%)respectoa las neonatales(28.07%).

168

Resultados


La glucemiade las ratasdiabéticasfue de 2 a 4 veces superiora la de los

animales control (Tabla 11). No obstante, el tratamiento con 114 disminuyó

significativamentelos nivelessanguíneosde glucosade los neonatosdiabéticosque

recibieronunadosisde tiroxina de 1 .Sgg/lOOgde peso,aunqueno se alcanzaronlos

vaioresde la poblacióncontrol.

Los niveles de insulina en plasmade los animalesdiabéticosneonatalesy

adultos,comoera de esperar,fueronmuy inferioresa los de sus controles(55.63 y

84.81%, respectivamente)(Figura 39>. Estasdiferenciasrespectoa las poblaciones

control se mantuvierona pesardel tratamientohormonalcon T4 de estosanimales

diabéticosneonatalesy adultos(Figura 39).

3.6.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

3.6.4.1. Nivelesséricos.

La concentracióncirculante de IGF-I disminuyóen los animalesdiabéticos

neonatalesy adultos respectoa los control en una proporcióncercanaal 50% en

ambaspoblaciones(Figura 39).

Las ratas neonatalesdiabéticas que recibieron la tiroxina aumentaron

significativamentelos nivelesséricosde IGF-I respectoa los animalesdiabéticos,de

modo que la concentracióndel péptido fue igual a la de la poblacióncontrol. En

cuantoa los animalesadultos,la implantacióndel pellet a los animalesdiabéticosno

pareciótenerningúnefectosobrelos nivelesséricosde IGF-I.

Los valores de IGF-ll en el suero de las ratas diabéticas neonatales

disminuyeron frente a los de la poblacióncontrol (43.57%) (Figura 39), y el

tratamientocon 1 .5¡tg/lOOgde pesode T4, quetaneficazsemostróen la restauración

de los nivelesde IGF-I, no tuvo ningúnefectoen la recuperaciónde la concentración

circulantede IGF-Il.


Los valoresde ARNm de IGF-I en hígadode las ratasneonata]esdiabéticas

disminuyeronrespectoa la poblacióncontrol,al igual que sucedíaa nivel circulante

(Figura39).La administraciónde 114 a estosanimalesdiabéticosaumentólaexpresión

del péptido (Figura 39), pero no sealcanzaronlos nivelescontrol.

En la etapaadulta, como sucedíaen la neonatal,los nivelesde ARNm de

IGF-I disminuyeronen las ratasdiabéticas,pero en estecaso,el tratamientollevado

a cabocon T4 no tuvo ningúnefecto sobrelaexpresiónhepáticadel péptido (Figura

169

AIGF-I

ng/ml

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Fig 39 A) Niveles circulantes de lOE-!, insulina e ¡OF-II en ratosneonatales(20 días)y adultas(87 días) diabéticas<71), diabéticastratadascon pelleis de 7’~ de 1 .5~g/lOOgde pesoen el caso delos animalesneonatalesy 1. 7sjsg/lOOgdepesopara lasadultas(D + T4). controles(C). Media +

VS de 8-10 animales.E) Expresiónhepáticadel ARNniy cuantificacióndensitométricadelos¡GE-!y ¡len ratas

neonatales(20 díasde vida)y Multas (87días) diabéticas(D). diabéticastratadasconpelleis ae 14del.5~¿g/1OOgdepesoene!casode losanimalesneonatalesy 1.7Spg/1003 depesode T4para lasadultas <~ + T4, controles (C). El análisis se realizó medianteel ensayode protección deribonucleasas.Media ±DS de 4 análisis diferentes.* Significaciónestadística respectoa lasratas control. ~ Significaciónestadísticarespectoa la poblacióndiabética.

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Resultados

39).Los nivelesde ARNm hepáticode IGF-II de las ratasneonatalesaumentaron

enunasituaciónde diabetesrespectoa la poblacióncontrol(Figura39). No obstante,

la administraciónde 114 produjo un descensoen la expresiónde dicho péptido, e

incluso, fueron inferiores a los mostradospor la poblacióncontrol.




Enla etapaneonatal,la diabetesprodujoun descensoen los nivelescirculantes

de las proteínasligadorasde IGFs, tanto en el complejo de 3OkDa (IGFBP-1 y 2>

como en el de 45kDa (IGFBP-3), de los animales(Figura 40>. Sin embargo,el

tratamientohormonalllevadoa cabocon14 no modificó los nivelesséricosde dichas

proteínas,con lo quelos valorescirculantesde estospéptidossemantuvieroniguales

a los de la poblaciónneonataldiabética(Figura40).

Los animalesdiabéticosadultos,por su parte, tambiénmostraronun descenso

en los nivelescirculantesde los doscomplejos(30 y 45kDa),y tampocoen estecaso

el tratamientoefectuadocon 114 aumentólos niveles circulantesde estasproteínas

respectoa la poblacióndiabética(Figura40).

36.5.1.2.Westerninmunoblot.

La poblaciónde ratasneonatalesdiabéticasmostróun aumentoen los niveles

circulantesde IGFBP-1 respectoa los animalescontrol (Figura40), mientrasquelos

valoresde IGFBP-2 no sevieron afectados.

La administraciónde T4 a las ratasneonatalesdiabéticasprovocóun descenso

en los niveles séricosde IGFBP-l respectoa la población de animalesdiabéticos

(Figura 40)- Estadisminuciónigualó los valoresde las poblacionestratadascon la

hormonaa los de la control. Los nivelescirculantesde IGFBP-2 no se modificaron

por la administraciónde T4 a los animalesdiabéticos(Figura 40).


De maneraanálogaa lo que sucedíaa nivel circulante, la diabetesprovocóun

granaumentoen la expresiónhepáticade la IGFBP-1 en lasratasneonatalesy adultas

respectoa sus poblacionesde animalescontrol (Figura41).

El tratamientocon T4 de los animalesneonatalesdiabéticosdisminuyó los

niveles de ARNm hepático de IOFBP-1 (Figura 41) y, aunque los valores

descendieronrespectoa los de las ratasdiabéticas,no sellegarona alcanzarlas cifras

171

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o.I~1.

Fig 41 ExpresiónhepáticadelARNmy cuantfficacióndensitométricade IGFBP-1, 2y 3 enratasneonatales(20días)y adultas(87días) diabéticas<D), diabéticastratadascon1.Sgg/lOOgdepesoen el casode los animalesneonatalesy 1. 7Sgg/lOOgdepesopara los adultos <V + T4), controles (C). Media + DS de 4 análisis distintos.* Sigtgficaciónestadísticarespectoa las ratas control. > Sign~caciónestadísticarespectoa la población diabética.

EXPRESION DEL ARNm HEPÁTICO (IGFBPs)

IGFBP-1

Neonatos

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lbdT (200v) 15 dTE87DV)

Resultados

de la poblacióncontrol.

En la etapa adulta, el tratamientocon 114 aumentóaún más los niveles de

ARNm de IGFBP-1 respecto a los de las ratas diabéticas (Figura 41), y la

administraciónde tiroxina por tanto no restaurósus niveles a los de los controles.

La expresiónhepáticade IGFBP-2aumentóen las ratasdiabéticasneonatales

y adultasrespectoa las control (Figura 41). Sin embargo,en la etapaneonatal,el

tratamientohormonalde estosanimalesdiabéticosdisminuyó los nivelesde ARNm

de IGFBP-2 hastaalcanzarunos valores similares a los de la poblacióncontrol

(Figura 41), y por el contrario, los animalesdiabéticosadultos tratadoscon la

hormonamostraronun aumentosignificativo de la expresiónde IGFBP-2 respectoa

la poblacióndiabética(Figura 41).

En cuanto a los niveles de ARNm hepático de IGFBP-3, disminuyeron

significativamenteenuna situaciónde diabetestanto en la etapaneonatalcomo en la

adulta (Figura 41). No obstante, la administraciónde 14 a las ratas neonatales

diabéticasaumentóla expresiónhepáticade la IOFBP-3,aproximandolos nivelesde

ARNm a los control (Figura41). Porúltimo, en la etapaadulta, laadministraciónde

114 a los animalesdiabéticosaumentóla expresiónhepáticade IGFBP-3 y situó sus

nivelesenvaloresintermediosy distintosa los mostradospor las poblacionescontrol

y diabética(Figura 41).

36.6. Resumende los resultadosdel estudio de la diabetesen ratas

neonatalesy adultasdiabéticasy tratadascon T4.

La administraciónde STZ a las ratas provocó un bloqueoen la secreciónde

insulina, por lo que los niveles plasmáticosde estahormonafueron muy bajos, y el

tratamientocon 14 no mejoró la situación.En los animalesdiabéticos,las dosis de

T4 rehabilitaronlos nivelesde IGF-I circulantey tambiénsu expresiónde ARNm

hepáticosin incrementarla insulina,cosa queno hicieronen adulto. El IGF-II no se

restauróa nivel circulante pero el ARNm, que lo tienen aumentadolos animales

neonatalesdiabéticos,disminuyódespuésdel tratamiento.Las IGFBPscirculantes,

que estándisminuidas en ambos animalesdiabéticosneonatalesy adultos, no se

rehabilitaroncon T4. En neonatossí que descendióla IGFBP-1 que tenía niveles

mayorescon respectoa controles.

Las dosis de 114 en neonatosdisminuyeron la expresión de IGFBP-1 y 2

aumentadasen los animalesneonatalesy adultosdiabéticos,pero no lo hicieron en

la población adulta. La expresióndel ARNm en neonatosy adultos se rehabilta

174

Resultados

despuésde las dosisen neonatosigual a controlesy no en adultas.Seconcluyela no

regulacióna nivel transcripcionaldel complejo de 3OkDa (IGFBP-1 y 2> en los

animalesdiabéticosneonatalesy adultos.


en dosisde 1.5 y 1 .75$g/lOOgde pesopor vía sc (D + 114) en ratasneonatales

y adultasdiabéticas(20 y 87 díasde vida) respectoa la poblacióncontrol.

NEONATOS ADULTAS

D D±~ O D+T,

GLUCEMIA 1 1 t 1

INSULINEMIA 4 ¿ ¿

OH CIRCULANTE ¶ 4 4

OH HIPOFISARIA — t 4 4

IOF-l CIRCULANTE —

ARNm lORd 4 4 4 4

¡OF-II CIRCULANTE 4 4

ARNm IGF-II ¶ 4

IGPBP-1 Y 2 CIRCULANTES 4 4 4

IGFEP-I CIRCULANTE 1

ARNm IGFEP-1 1 1 1 1

IOFBP—2 CIRCULANTE —

ARNm IOFBP-2 1 — 1 1

IGFBP-3CIRCULANTE 4 4 4

ARNm IGfl3P-3 4 4 4 4

3.7. HIPOTIROIDISMO, IGFs, IGFBPs Y TRANSPORTADORES DE

GLUCOSA (GLUTs) EN PERIODONEONATAL.

En el hipotiroidismocomo se ha mostradosealterael axis IGFs/IGFBPsy en

dichasalteracionesparecetenerun papel importantela insulina. Por otra parte,está

descritoque el pasode GLUT-1, transportadorde glucosaabundanteen periodos

inmaduros,a GLUT-4, transportadorde glucosaen etapaadulta,pareceestarregido

por las hormonastiroideas (Castelló, 1994). Con el fin de ver si ambos procesos,

regulación del axis IOFs/IGFBPs y de GLUTs por dichas hormonas, están

relacionados,se compararonestosestudios.Se diseñóun protocolode trabajo enel

que se analizaronlas posiblesalteracionesen los niveles de los IGFs, IGFBPs y

GLUTs de los animaleshipotiroideos(tratadoscon MMI y tiroidectomizados)a lo

175

Resultados

largo del periodoperinatal(2, 4, 8 y 20 días de vida).


El peso corporal de los animalestiroidectomizadosfue inferior al de los

controlesa los 4, 8 y 20 días de vida, y a esasedadesla variaciónde dicho peso

encontradaosciló frente a las ratascontrol entreun 13.28%, 21.75% y un 40.19%,

repectivamente(Tabla 12).

Finalmente,en ambaspoblaciones(hipotiroideay control), se observóun

aumentoprogresivodel pesocorporal con la edada lo largo de la etapaestudiada.

3.7.2. Niveles séricosde 113 y 114 y plasmáticose hipofisariosde GH.

Los niveles circulantesde 973 y 14 disminuyeron en todos los animales

hipotiroideos(tratadoscon MMI y tiroidectomizados)(Tabla 12). No obstante,las

ratasneonatalesde 2 y 4 días de vida, que fueron tratadascon MMI (0.02%,p/v)

desdeel día 14 de gestación,presentaronunos valores circulantes de hormonas

tiroideasligeramenteinferioresa los de las ratascontrol a 4 días(38.47%).Porotro

lado, los animalesque fueron operadospresentaronunosvalores séricosmuy bajos

de 113 (81.95% y 93.58% a los 8 y 20 díasde vida, respectivamente)y 114(84.21%

y 78.96%a los 8 y 20 díasde edad)frentea los mostradospor la poblacióncontrol.

Los nivelescirculantesde Gil disminuyeronen los animaleshipotiroideosde

2 (58.27%) y 4 días de vida (51.89%) respectoa la población control, pero

aumentaronde un modo significativo en las ratastiroidectomizadas,tantoa los 8 días

de edad(3 díasdespuésde la tiroidectomía,84.17%)comoa los 20 díasde vida (15

días despuésde la operación,248.42%),siemprerespectoa los neonatoscontrol

(Tabla 12) comosehabíaencontradoen la primerapartede estetrabajo.

El contenidode Gil en pituitaria de las ratashipotiroideasse alteró en el

mismo sentido, respectoa la poblacióncontrol, a como lo hicieron los niveles

plasmáticosde estahormona(Tabla 12): disminuyóa los 2 y 4 días de vida en un

60.53 y un 85.11%,respectivamente,y se incrementóa los 8(10.84%)y 20 díasde

edad(3.78%).


Los animalestiroidectomizadospresentaronun descensosignificativo en los

nivelessanguíneosde glucosa(8 y 20 díasde vida) (Tabla 12).

Los valores plasmáticosde insulina no se modificaron en los animales

neonatalestratadoscon MMI de 2 días de vida, aunquea los 4 días de edad se

observóunadisminuciónen las concentracionesde estahormona(Figura42). Porel

176

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Resultados

contrario, las ratasque fueron operadasmostraronunosniveles superioresa los de

suscontrolesen un 64.86%y un 42.59%a los 8 y 20 díasde vida, respectivamente

(Figura42) igual a lo halladoen la primerapartede estetrabajo.

En ambas poblaciones(hipotiroideasy control), se observó un aumento

progresivoen los nivelesde insulina circulante,conunpico habitualy claro a los 4

días de vida en las ratas control que no aparece tan claro en las ratas

tiroidectomizadas.

3.7.4. IGFs: nivelesséricosy expresióndel ARNni hepático.


Los niveles de IGF-I en suerode las ratascontrol (Figura 42) mostraronun

incrementoprogresivo (de 54.84ng/ml a 148.O9ng/ml) de maneraanáloga a lo ya

descritopara la insulina.

Los animalestratadosconMMI presentaronunosvaloresde IGF-I inferiores

a los de sus controles a los 4 días de edad (47.28%). Por el contrario, las ratas

tiroidectomizadasmostraronun aumentoen los nivelescirculantesdel péptido que

llegó a ser de un 98.77% a los 20 días de vida y que resultó ser paralelo al

incrementomostrado por la insulinemia en todos los casos,exactamentecomo

sucedióen la primerapartedel trabajo.

La concentraciónde IGF-II en el suerode las ratascontrol experimentéun

descensoconformeaumentabala edaddel animal (Figura 42). Las ratasneonatales

de 2 y 4 díasdevida, que fuerontratadascon MMI, asícomolas de 20 díasdeedad,

quefuerontiroidectomizadas,mostraronun aumentoenlos nivelescirculantesdeeste

péptido frentea la poblacióncontrol(69.97,57.33y 241.00%,respectivamente).Sin

embargo,a los 8 díasde vida se igualaronlos valoresséricosde IGF-II de las ratas

operadasy controles.


Los animaleshipotiroideosmostrarona 2 y 4 díasde vida (tratadosconMMI)

un descensoen los nivelesdel ARNm hepáticode IGF—I (Figura42). Sin embargo,

a los 8 y 20 díasde edad,en los neonatostiroidectomizados,se observóun aumento

en la expresióndel péptido enhígado,siemprerespectoa la poblacióncontrol.

Los nivelesde ARNm hepáticode IGF-II (Figura42)aumentaronenlas ratas

a las que se les administró el fármaco bociógeno(2 y 4 díasde vida), así como en

aquellasde 20 días de edadque fueron tiroidectomizadas,mientrasque a los 8 días

de vida (3 díasdespuésde la operación) la expresióndel MF-II fue menor en la

178

IGF-IAINSULINA

40

30

le

1400

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600

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circulantes de IGF-I, ¡¡isulina e ¡UF-II en anima/es neonatales(ti-citados &>¡¡ MMI o t¡/uidecloiniziaclos) y controles (C). Media + DS

Fig 42 A) Niveleshipoti’-oideosde 8-JO animales.fi) Análisis mediante ensayo de p¡uíec-c-¡án a ribonucíeosc¡s de los H-ánscritoshepáticos de ¡GP—! y 1/ dc irnos necn,auíles h¡poÑvideas ~MMl y 7) ycontroles (Q. Media + DS de 4 análisis ¿/ifr rentes.* Sign¿ficoc-ión <‘stúdíst¡&i /Y’5/WCIC) CI 1(1 ¡>oblctc¡óii c-ontrol.

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MMI T

Resultados

poblaciónde animalestiroidectomízadosrespectoa la control.

Se destacaasí la existencia de un gran paralelismo entre las variaciones

encontradasparaestospéptidos(IGF-I y II) a nivel séricoy de expresión,lo que nos

hacesuponerla existenciade unaregulaciónpor partede las hormonastiroideasa

nivel transeripelonal.Además,se observóuna gran similitud de resultadosen estas

poblacionescon respectoa las igual tratadasen la primeraparte(apartado3. 1.), con

lo cual ratificamostotalmentenuestrosprimerosresultados.


El análisis de regresióny correlaciónentreIGF-I e insulina y Gil se efectuó

reuniendoen cadaanálisis los datosde las diferentesedadesestudiadas.

La correlaciónfue muy buenay positiva entreIGF-I e insulina, tanto para

poblaciónhipotiroidea(r~ 0.89, pC 0.001) como para la control (r= 0.84, p<

0.01) (Figura43). Sin embargo,estaspoblacionesmostraronunacorrelaciónnegativa

(rr= -0.12, p< 0.05 y r~ -0.93, p<O.Ol paralas ratas hipotiroideasy controles,

respectivamente)cuandose representaronlos nivelesde IGF-I frente a los de GH

(Figura 43), igual que lo obtenidoen la primeraparte.




Los animalesque fueron sometidosal tratamientoconel fármacobociógeno

presentaronunapautadiferente,respectoa las fluctuacionesobservadasen los niveles

circulantesde las IGFBPs, frentea aquellasratasque setiroidectomizaron.

Los nivelesséricosde las proteínasde 3OkDa de los neonatoshipotiroideos

disminuyerona los 2 y 4 días de edad(poblacionestratadasconMMI desdeel día

14 de gestación), mientras que aumentarona 8 y 20 días de vida (animales

tiroidectomizados)frentea las ratascontrol (Figura44).

La IGFBP-3 disminuyóen los animaleshipotiroideos(tratadoscon MMI y

tiroidectomizados)en todaslas edadesconsideradasenel estudio(Figura 44).

La poblacióncontrol, comoya se ha señaladoen otrasocasiones,mostrólos

cambiosde las proteínastransportadorasasociadasal desarrollo;estoes, los niveles

de IGFBP-1 y 2 disminuyeron al aumentarla edaddel animal, mientras que la

proteínade alto pesomolecularsiguióelpatróncontrario(aumentóconformelo hacía

la edadde la rata).

180

NEONATOSHIPOTIROIDEOS (MMI/T)

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insulina (pU/mi) OH (ng/mi)

Fig 43 Análisis de regí-esión lineal y co«/¡cieme de corí-elacion de los niveles ch-tu/untesde fUE! e insulina y CH de las ‘-atas hiporíroideas (MMI y 7) y cono-o/es (C) de

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2, 4, 8 y 20 días de vida. Se muestran. las diférencia.s sígn ¿¡¡cari vas.

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Resultados

3.7.6A1. Westerninmunoblot.

Los nivelescirculantesde IGFBP-1 se comportaronde modo muy distinto

segúnel protocoloa que fue sometidoel animal. Las poblacionesa las que se les

administróMMI (2 y 4 díasde vida) presentaronunascifrasséricasde estaproteína

disminuidas,mientrasque la tiroidectomía(8 y 20 díasde edad)produjoun aumento

en sus niveles,siemprerespectoa los neonatoscontrol (Figura44), siguiendoigual

pautaque la insulina.

El tratamientode las membranascon anti-IGFBP-2 nos revelóun aumento

significativo en los nivelesséricosde estaproteínade bajo pesomolecularen todos

los animaleshipotiroideos(tratadosconMMI y tiroidectomizados)respectoa las ratas

control (Figura44).

3.7.6.2. Expresiónhepática.

Los nivelesde ARNm hepáticode IGFBP-1 se encontrarondisminuidosenlos

neonatoshipotiroideosque fueron tratadoscon MMI respectoa los controlesy, por

el contrario, los animalestiroidectomizadosmostraronun aumentode la expresión

de IGFBP-1, tanto a los 8 como a los 20 días de vida (Figura 45), al igual que

ocurría con los nivelescirculantes.

Los animaleshipotiroideosmostraronunosnivelesde ARNm de IGFBP-2en

hígado (Figura 45) superioresa los de sus controlesen todaslas edadesestudiadas,

exceptoa los 2 díasde vida, en que no se modificaroncon respectoa controles.

La expresiónde la proteínade 45kDa (IGFBP-3)enhígadodisminuyóen las

ratashipotiroideasrespectoa las controlesen todaslas edadesconsideradas,excepto

a los 4 díasde vida (Figura45).

Estosresultadosnos muestran,por tanto, la existenciade un paralelismoentre

los valoresséricosy laexpresióndel ARNm hepáticode las proteínastransportadoras

encontradasparaestosanimales.Además,seencuentratambiénunperfil análogoen

cuantoa las alteracionesen los nivelesde las IGFBPsentrelos animalesde 10, 15

y 20 díasde vida tratadosconMMI (ver apartado3.1.)y los de 2 y 4 díasdeedad.

Sedebedestacartansolo que las ratasde 2 y 4 díasde vida presentaronunosniveles

en el complejoproteicode 3OkDa (Westernligand blot) disminuidosfrentea sus

controles,mientrasque los animalesde 10, 15 y 20 díasde vida, que fuerontratados

también con MMI, mostraron unos valores de IGFBP-1 y 2 aumentados;esta

diferenciaquizásse debaa un descensomás acusadoen los valores individualesde

IGFBP-1, a 2 y 4 días de edad, respectoa 10, 15 y 20 días de vida o a que 2 y 4

183

Fig 45 ExpresiónhepáticadelARNmy cuan4ficacióndensitométricade IGFBP-1, 2 y 3 enneonatoshipotiroideos(MMI y T) y controles(C) de 2, 4, Sy 20 días. El análisisseefectuómedianteel ensayo de protección de ribonucleasas.Media + DS de 4análisis deferentes.* Sign~ficacián estadística respecto a la poblacióncontrol.

EXPRESION DEL ARNm HEPÁTICO (IGFBPs)IGFBP-1 wg7fl

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MMI T

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Sonda

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MMI 1

Resultados

díasson edadesmuy inmaduras.

3.7.7. Nivelesde GLUTs en membranacruda.

3.7.7.1. Corazón.

El corazónes un tipo especial de músculo esqueléticoque, como se ha

mencionado,cuentacon dos tipos de transportadoresde glucosa,el GLUT-1 y el

GLUT-4.El GLUT-1, que disminuyeal aumentarla edaddel animal en la ratacontrol

(Figura46), incrementósus nivelessignificativamenteen las membranasplasmáticas

de estetejido por la falta de hormonastiroideasa los 4 y 8 díasde edadrespectoa

los animalescontrol.A los 2 y 20 díasde vidano seencontródiferenciaentrelas dos

poblacionesconsideradas(hipotiroideasy controles)-

En los animalescontroly, tambiénen los hipotiroideos,el GLUT-4 aumentó

con la edad de la rata (Figura 46). Los niveles de este transportadorde glucosa

disminuyerontantoen los animalestratadoscon MMI como en los tiroidectomizados

respectoa los controles,exceptoa los 2 días de vida en que sus valores fueron

igualesa los de la población control.

A la vista de los resultados,se podría sugerir que la falta de hormonas

tiroideasprovocaun retrasoo una alteraciónenel patrónde cambiode los GLUTs,

se produceunadisrupciónen el incrementode los niveles de GLUT-4 (propio del

animal adulto).

3.7.7.2.Hígado.El GLUT-1, en el hígado,aumentóen los animaleshipotiroideosrespectoa

los controlesa los 4, 8 y 20 díasde vida, al igual queen el corazón.No se encontró

diferenciaestadisticamentesignificativa en los nivelesde estetranportadorentrelas

dos poblaciones(hipotiroideay control) a los 2 díasde edad(Figura46).

El GLUT-2, que es el transportadorde glucosamayoritarioen el hígado,

aumentóal hacerlo la edaddel animalen las ratascontrol (Figura 46). En las ratas

hipotiroideas,los nivelesde GLUT-2 aumentarona los 2 y 8 díasde vida, pero a los

20 díasde edad,momentoen que los animalesllevan un largo tiempo sufriendolas

alteracionesmetabólicasdebidasa los bajosnivelesde hormonastiroideas,mostraron

un descensosignificativo que, quizá, no seobservóantespor la necesidadde una

situación de hipotiroidismo prolongado para que se produzca una adaptación

(reducciónde los niveles de GLUT-2) en este órgano clave para el metabolismo

glucídico. De nuevo, pareceque las situacionesde hipotiroidismo provocanuna

185

CORAZONA

GLUT—1 eS eS a — GLUT-4 — - a —

*

vaCd0-cd1-

1-Cd(a4>

Cd

a)

COCa

o-‘o

Cd

UN

4>

1400 -

1200

1000-

800-

600 -

400 -

200

0-3d, 2Odv

T

U

~J2t2dv 4dv 8dy

MMI 1

HIGADO

GLUT-1 58 1

UNCd0-

CO1-

-O‘aCdEn4>

-a)CO

•0a)

CdCa

o-‘o-o

Cd

joo4>

1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

o2dv 4dv

MMI

-a tl GLUT-2

UNCd‘a

e--

‘aCdva4>

Cd-v

CdCa

o-‘o

Cd

UNa)4>

2000

1600

1000

500

O

1

— —

MMI

— ea —

TH(MMI/T) Lic

F¡g 46 Contenidode GLUT 1 y GLUT-4 en el corazón (A) y de GLUT-1 y GLUT-2 enhígado (B) de ratas hipotiroideas (MMI y T) y controles(C) de 2, 4, 8 y 20 días.Seanalñaronpor “Western inmunoblot” SOy2Optg deproteínasen el corazónparaunoy otro transportador,y liS y 2Sggdeproteínasen el hígadopara uno y otrotransportador, respectivamente.Se muestrala cuantfficacióndensitométricay elvalor medio + DSde 4 análisis distintos.* Sign~caciónestadísticarespectoa lapoblacióncontrol.

Cd‘aCd1-

‘aCdCo4>Cd-co

o-‘O

-vCO

UNo4>

4000 -

3000

2000 -

1000-

0

*

2dv 4dv

MMI

B

Bdv 2Odv 2dv 4dv 8dÚ 2Odv

Resultados

disrupciónen el patrónde incrementode estetransportador,al igual quesucedíacon

el GLUT-4 en el corazón.

3.7.7.3. Músculosesqueléticos:cuadricepsy gastrocnemius.

En las ratastratadascon MMI, a los 2 díasde vida, seencontróun aumento

en los niveles de GLUT-1 respectoa la poblacióncontrol; este incremento fue

estadisticamentesignificativo enel cuadriceps,pero no en el gastrocnemius(Figura

47).Sin embargo,a los 4 díasde edad,el descensoen los valoresdeGLUT-1 de los

animales hipotiroideos fue mayor en el gastrocnemiusque en el cuadriceps.

Finalmente,el contenidoenGLUT-1, tanto en las membranasde cuadricepscomo

en las de gastrocnemius,aumentóa los 3 y 15 díasdespuésde la tiroidectomía(8 y

20 díasde vida).

El GLUT-4disminuyóen ambosmúsculosa los 4 díasde vida en los animales

hipotiroideosque fueron tratadosconMMI (Figura 47). Porel contrario, a los 3 y

15 díasdespuésde la operación(8 y 20 díasde edad) se encontróun aumentoen el

contenidodeestetransportadoren la fracciónmembranosade ambostejidos para la

población de ratasoperadas.

No se encontródiferenciaentre los niveles de GLUT-4 de los dos músculos

esqueléticosentrelas ratashipotiroideasy control a los 2 díasde vida.

3.7.8. Resumende los resultadosdel estudiodel hipotiroidismoenratas

neonatales.

Los resultadosmostradospor estos animalesneonatalesfueron igualesa los

ofrecidospor las ratasde 10, 15 y 20 días tratadascon MMI (2 y 4 días en este

estudio)y tiroidectomizadas(8 y 20 días) (apartado3.2.7.).

187

CUADRICEPS

----e GLUT—4--- — -

1600 1jo~- 1400Cd‘a

-ff 1200Cdjo -4>

~1000 -

Cd

~ 800

Cd•~ 600-0.‘o~ 400

CO“o~ 2004> ¡

0-2dv 4dv

MMI

GASTROGNEMIUS

GLUT-1 “ GLUT-4

H (MMI/T)

e,1-Cl‘a

.0‘aCdCo4>CO-oO

ce4

>

0.‘o

“oCd

‘oe4>

2000 -

1500

1000 -

500 -

0- 14LMMI

LicFig 47 Análisis de los nivelesde GLUT-l y GLUT-4en el cuadriceps (A) y gaserocnemius

(B) de ratas hipotiriodeas (MMI y T) y controles (C) de 2, 4, 8 y 20 días. Seanalizaronmediante “Western inmunoblot»15 y Spg deproteínasde uno y otrotransportador, respectivamente.Semuestrala cuantificacióndensitométrica.Media+ DS de 4 análisis distintos. * Sign¿ñcaciónestadísticarespectoa la poblacióncontrol.

A

*

700<tICd1..c~ 600‘a

‘aCd 500UN4>

Cd 400

COcd

300CO‘a>

0.‘o 200

CO

jo4>

4

*

*

*

100

o

MMI2dv 4dv Bdv 2Odv

T

B

8i1V 20dv

T

UNCl‘ael‘a-

a-clUN4>Cl

COcd

ClCa4.40.‘o

Cl-ojoCO4>

2000

1500

1000

500

o

4

*

2dv 4dv Sdv 2Odv

MMI Tatt ZOd<

T

Resultados

Cuadro6.- Resumende los resultadosde los estudiosdel hipotiroidismoen

ratas neonatalestratadascon MMI (MMI) y tiroidectomizadas(T) respectoa la

poblacióncontrol-

MMI T

GLUCEMIA ¿

INSULINEMIA 4 t

Gil CIRCULANTE 4 1

Gil HIPOFISARIA 4 1

IGF-I CIRCULANTE

ARNm 1GW! 4 1

IGF-fl CIRCULANTE t 1

ARNm IGE-Il 1 1

IGFBP-l CIRCULANTE 1

ARNm IGFBP-1 4 1

IGPBP-2CIRCULANTE 1 1

ARNm IGFBP-2 1 1


ARNm IGFBP-3 4 ¿

3.7.9. Resumende los resultadosde lasvariacionesdelos transportadores

de glucosa(GLUTs) en ratashipotiroideasneonatales.

El hipotiroidismoaumentaen todas las etapasel GLUT- 1 por encimade los

controles y baja el GLUT-4 de una forma clara en corazón. En los músculos

esqueléticosparecehaber un aumentode GLUT-4 cuando la insulina está alta y

disminucióncuandoestábaja, y el GLUT-I tiendeaaumentarconel hipotiroidismo.

En el hígado,el GLUT-1 tiendea aumentaren el hipotiroidismo.El GLUT-4 parece

aumentary disminuir con la insulina e IGF-I.

189

DISCUSION

Discusión

4. DISCUSION.4.1. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES DEL AXIS IGFs/IGFRPs EN

SITUACIONESDEHIPOTIROIDISMODESDELA ETAPA NEONATAL A LA

ADULTA.

En la actualidad,hay un númerocrecientede datos que sugierenque las

hormonastiroideasestáníntimamenteinvolucradasenla regulacióndel axisGH/IGF

a varios niveles. A pesarde que las hormonastiroideasejercenaccionessobre la

pituitaria, bien alterandoel númerode células somatotropas(Kitauchi, 1998), bien

influyendosobrela expresióndel gende GH (Evans, 1982),todos los efectosde las

hormonastiroideassobreel sistemaIGFs/IGFBPsno parecenestarmediadospor la

GH (Gaspard,1978; Ikeda,1989; Nanto-Salonen,1993).Enrealidad,la hormonade

crecimiento,y no la insulina, ha sido el objetivo de la mayoríade los estudios,dado

queseconsiderabacomoel posiblemediadorde los efectosde las hormonastiroideas

sobreel sistemaIGF/IGFBP(Burstein, 1979; Nanto-Salonen,1993; Mielí, 1994), a

pesarde que la T3 y la T4 afectana la mayoría de los aspectosdel metabolismo

modificandomuchashormonascomo la insulinay las catecolaminas(Azam, 1990),

y aunquetambiénla secreciónde los IGFs estáreguladapor el estadonutricional y

metabólico (Straus, 1994; Thissen, 1994). En este estudio, las ratas se

tiroidectomizaronparaconseguiruna reducciónmáximade los nivelesde hormonas

tiroideasy, además,paraprevenirlos distintosefectossobrela insulinemiamotivados

por las drogas bociógenas (John, 1970; John, 1974). Los resultados que se

desprendende este estudio, obtenidos pocos días despuésde la tiroidectomía,

muestran los efectos a corto plazo de unos niveles de hormonas tiroideas

extremadamentereducidossobre diferentesparámetros,analizadosdesde la etapa

neonatala la adulta,y señalanel hechode quelos efectosde la funcióntiroideasobre

el sistema IGFs/IGFBPs dependende la etapa de desarrollo del animal, como

previamentehabíanmostradootros modelosexperimentales(Gallo, 1991; Nanto-

Salonen,1992).

4.1.1. Nivelesde IGFs en sueroy expresiónde su ARNm en hígadoen

animalesneonataleshipotiroideos.

El pesocorporal disminuyó en las tres poblacioneshipotiroideas(neonatal,

destetaday adulta)y los valoresde hormonastiroideasfueronmuy bajosa los 5 días

despuésde la tiroidectomía,de acuerdocon estudiosprevios realizadosporCoiro y

191

Discusión

col. (1979)y Walker y Dussault (1980).Las ratasdestetadas,y másclaramentelas

adultas,mostraronun descensodelpesocorporal acompañadode unadisminuciónde

las hormonastiroideas y Gil circulantes,así como del contenidohipofisario de

hormonade crecimiento,y porel contrario,enlas ratasneonatalestiroidectomizadas,

el descensodel peso corporal no se acompañóde una reducción en los niveles

plasmáticosde GH o séricosde IGF-I; por tanto, estosresultadosapoyaronel papel

crucialde las hormonastiroideasen la regulacióndelcrecimientodurantelosestadios

inmadurosdel desarrollo,como previamentese habíadescritoen ratasneonatales

hipofisectomizadas(Glasscock,1992), y en contrastecon la eficacia limitada de la

T4 para favorecerel crecimientoen ratasadultas hipofisectomizadas(Glasscock,

1981). En las ratas destetadas,se encontró un descensoen los niveles de OH

circulanteehipofisariaa los 15 díasdespuésde la tiroidectomíade acuerdoconotros

autoresque previamentehabíanmostradoun descensoa los 10 díasdespuésde la

operación(Coiro, 1979); sin embargo,en las ratasadultas,se encontróunareducción

en los valores hipofisariosy plasmáticosde Gil ya a los 5 días despuésde la

tiroidectomía. Una posible explicación para esta diferenciaes el hecho de que el

mecanismoregulatoriohipotalámicoparala liberaciónde Gil de la pituitaria se está

desarrollando durante el periodo neonatal en la rata (Kitauchi, 1998) y

probablemente,la falta de sensibilidada las hormonastiroideasen la hipófisis para

la síntesisde GH maduraduranteel periodoneonataly estáya plenamenteestablecida

en la etapaadulta. Glydon y col. (1957)demostraronque el plexo primario de la

eminenciamediano se forma en la rata hastael quinto día de vida postnatal,y que

la concentraciónde somatostatinaaumentaduranteel periodoneonatalhastaalcanzar

un pico a los 28 díasde edad.Esta inmadurezdel sistemaendocrinopodríaexplicar

el hecho de que los neonatosde 10 días (5 días despuésde la tiroidectomía)

mostraranun aumentoinesperado,quese mantienehastalos 20 días (15 díasdespués

de la operación),en los niveles de Gil plasmáticae hipofisariay de insulina, en

contrade lo que seobservóen los adultos.Paraconfirmarlasdiferenciasencontradas

entreneonatosy adultos,fue necesariollevar a caboun estudiode ratasneonatales

tratadascon MMI, que se discutirá másadelante.

Se encontróun paralelismoentre los niveles plasmáticosde GH e insulinaen

todas las poblaciones, ambos parámetrosaumentaronen las ratas neonatales

tiroidectomizadas,mientrasquedisminuyeronen los animalesdestetadosa los 15 días

192

Discusión

despuésde la tiroidectomía,y en los adultos,entodoslos estadios.Asípues,insulina

y GH modificaron los valores en la misma dirección en todos los grupos

hipotiroideos,lo que estáde acuerdoconel hechode que bajosnivelesde hormonas

tiroideasen animalesadultosdisminuyenlos valoresplasmáticosde GH e insulina

(Montes, 1977; Bedo, 1991), y además,la diabetes,enadultos,secaracterizaporun

efecto inhibitorio sobrela secreciónde Gil, mientrasqueel tratamientocon insulina

normalizalos nivelesplasmáticosehipofisariosde GR (González,1985; Robinson,

1987). Además,el paralelismoen el cambiode los nivelescirculantesde insulina y

GH, así como las concentracionesde GR hipofisaria observadasen este estudio,

apoyaronla validezde las variacionesplasmáticasde Gil obtenidasenunasolatoma

de muestra,dadoquees bien sabidoque la secreciónde Gil es episódicay sigue un

ritmo circadiano (Tannebaum,1976). No obstante,el mecanismopor el que las

hormonastiroideascontribuyena la regulaciónde la homeostasisde la glucosay la

insulinaescomplejo(Lenzen,1984).El hipotiroidismoexperimentalseacompañade

niveles de insulinabasal normales,aumentadoso disminuidos(Lenzen, 1984),y las

variacionesse puedenexplicarpordiferentesmecanismosde adaptaciónmetabólica

a la falta de hormonastiroideas,depediendodel estadiode desarrollo,dado que la

somatostatinaaumentaduranteel periodo neonatal (Walker, 1977) e inhibe la

secreciónde insulina (Alberti, 1973). Lenzeny col. (1976)encontraronun aumento

en la secreciónde insulina de los islotes pancreáticosen las ratas despuésde la

tíroidectomía,comomostraronnuestrosresultadosparalos animalesneonatales,pero

otros autoreshandescritoun descensode la sensibilidada la insulinaen situaciones

dehipotiroidismo(Morovat, 1998).Con el fin de evaluarsi el incrementode la GH

y la insulina en las ratas neonatalespodría ser explicado simplementepor la

inmadurezdel animal, o sí estáinvolucradala ausenciade glándula tiroideaenesta

adaptación, se estudió una población de ratas neonatales tratadas con MMI

(hipotiroideas-MMI)en las mismasetapasque los animalestiroidectomizados.

Las ratashipotiroideastratadascon MMI mostraronunosbajos niveles de

hormonas tiroideas, junto con unos niveles plasmáticose hipofisarios de OH

disminuidos, y una insulinemia también inferior a la de las ratas control. Estos

resultadossugierenque,enetapasinmadurasde desarrollodel sistemahipotalámico,

el desequilibrioprovocadopor la falta de glándula tiroidea aumentalos niveles

plasmáticosde OH e insulina, y que los valoresaumentadosde insulina y OH, que

193

Discusión

habíamosencontradoen los animalesneonatalestiroidectomizados,no sedebena la

inmadurezdel animal,puestoque en los animalesneonatalestratadoscon MMI la

insulina desciende. La estimulación /3-adrenérgica aumenta la concentración

plasmática de insulina en los organismos eutiroideos (Okajima, 1978), y el

tratamientode las ratasconglucocorticoidesaumentala insulinemiabasal(Aránguez,

1986); no obstante,el estudio de las consecuenciasde las adaptacionesal stress

quirúrgico bajo una situación de ausenciade hormonastiroideas será objeto de

investigacionesfuturas. Además,el posibleefectode los bociógenosperse sobrela

insulina plasmática(John, 1970;John, 1974) podríajugarun papelen la reducción

de los nivelescirculantesde estahormonaencontradaen las ratastratadascon MMI.

En cualquiercaso,el estudiocomparativode dos poblacionesneonatalesen

las que se provocó el hipotiroidismo por distintos medios, permitió encontrar

diferenciasclarasentre ambosgrupos: los neonatostiroidectomizadosmostraronun

aumentoen los niveles séricos y de expresióndel ARNm hepáticode IGF-I en

presenciade unos niveles plasmáticosde insulina altos y, por el contrario, se

encontróuna reducciónen los tres parámetrosanteriorespara el caso de las ratas

hipotiroideastratadascon MMI. Aunqueen los animaleshipotiroideostratadoscon

MMI ya se habíadescritouna reduccióndel IGF-I (Gallo, 1991; Nanto-Salonen,

1991; Nanto-Salonen,1993),nuncase habíandeterminadolos nivelesde insulina, ni

se había calculadola correlaciónexistenteentre esta hormonay el IGF-I en estas

condiciones-

La correlaciónalta y positiva encontradaentre los niveles circulantesde

insulina e IGF-I en la etapaneonatalse confirmó porel análisis de regresiónlineal,

dondeademás,semostróuna correlaciónpobreentre los valoresplasmáticosde GH

y los séricosde IGF-I (Figura 10). Se lialló unacorrelaciónpositiva igualmentealta

entre insulina e IGF-I en las ratas hipotiroideastratadascon MMI, lo que apoyó

resultadosprevios de nuestro grupo y otros autoresque parecíanindicar que el

balanceinsuhina/nutrientes,más que la Gil, regulabala secrecióndel IGF-I en

estadiosinmadurosde] desarrollo(Johnson,1989; Bóni-Schnetzler,1991; Rivero,

1995; Goya, 1996).

Por otro lado, tanto la tiroidectomíacomo el tratamientocon MMI alteró el

perfil normalde descensoprogresivodel IGF-II asociadoa la edadmostradopor las

ratascontrol(Donovan,1989).Lasdiferenciasencontradasen la regulaciónde IGF-II

194

Discusión

entrelos dosgruposde animalesneonataleshipotiroideosse puedenexplicarpor el

efecto reguladorde la glucemiasobreel IGF-II que habíasido sugeridoenperiodos

inmaduros(Rivero, 1995; Goya, en evaluaciónen J. Biol. Chem.),dadoque los

nivelesdeglucosaen sangreestabandisminuidosen las ratastiroidectomizadas,pero

no en las tratadascon MMI.

4.1.2. IGFs enanimalesdetetadosy adultostiroidectomizados.

En esteestudio, las ratashipotiroideasdestetadasy adultasmostraronunos

valoresséricosy deexpresióndel ARNm hepáticode IGF-I disminuidosen todoslos

estadios,juntocon un descensode los nivelesde GH e insulinade acuerdocon lo que

sehabíadescritopreviamente(Rodríguez-Arnao,1993b).

Los análisis de regresión lineal en estos estadios, destetadoy adulto,

mostraronuna correlaciónalta y positiva entrelos niveles plasmáticosde Gil y los

séricosde IGF-I, aunquedichacorrelaciónfue pobrepara la insulina. En cualquier

caso,el descensode los nivelesde la GIl hipofisariay plasmáticay de la insulinemia

tras la tiroidectomíafue más rápidoen la etapaadulta que en la destetada,lo que

sugiereque las ratasdestetadasconstituyenunaetapaintermediaenel desarrollodel

sistema reguladorentre la inmadurez,periodo neonatal,y el estadoadulto. Todos

estos resultadosllevan a la conclusiónde que los efectosde las hormonastiroideas

sobre la secreciónde los IGFs dependende la edad, como se había sugerido

previamentepara las IGFBPs (Nanto-Salonen,1992). Estadependenciade la edad

parece estar causadano sólo por la inmadurez del sistema endocrinopara la

adaptación,sino tambiénporun mecanismoregulatoriodistintoentreambosestadios.

Pareceque la mediadorade los efectosde las hormonastiroideassobrela secreción

de IGFs en etapasinmadurases la insulina, pasandoluego a ser la GEl en etapa

adulta. Sin embargo,para confirmar nuestrahipótesisy excluir el posible papel

reguladorde la Gil, que cambiabaen igual sentidoque la insulina, se bloqueóla

secreción de la insulina en las ratas neonatalestiroidectomizadasmediante la

administraciónde STZ, y las ratasdestetadasy adultasoperadasse trataron con

insulina.

4.1,3. IGFs en animales tiroidectomizadosneonatalestratados con

estreptozotocina(STZ) y en destetadosy adultostratadoscon insulina.

Los animales neonatales tiroidectomizadostratados con STZ, como se

esperaba,presentaronunos niveles bajos de insulina 5 días despuésde iniciar el

195

Discusión

tratamiento(20 días), pero las cifras de Gil en plasmase mantuvieronen unos

valoressimilaresa las ratascontrol, y su contenidohipofisariocomenzóa disminuir

como sucedíaen las situacionesde diabetesen la rata (Montes, 1977; Giustina,

1994). En estascondiciones(hormonastiroideasdisminuidas,nivelesplasmáticosde

Gil elevadosy reducidosde insulina),seencontróun descensoen los valoresde IGF-

1, queya había sido descrito en nuestrolaboratorioen trabajosrealizadoscon ratas

diabéticas(Rivero, 1995; Goya, 1996), y se mostró la existenciade unacorrelación

positivaentreinsulinaeIGF-I (r= 0.98, p < 0.05>. Encuaquiercaso,el tratamiento

conSIZ causóun aumentoen los nivelesséricosy en la expresióndel ARN de IGF-

II en los neonatostiroidectomizados,lo que sugiere, como previamentese ha

mencionadopara los neonatostratadosconMMI, el papel reguladorde la glucemia

sobreel IGF-II. Dehecho,Goyay col. (en evaluaciónen J. Biol. Chem.),denuestro

propio grupo, han demostradomedianteestudiosin vitro con hepatocitosfetalesde

rata que la glucosaejerceun doble efecto sobrela expresióndel gen de estefactor

de crecimiento, dado que induce su transcripcióne incrementala estabilidaddel

ARNm, y además,el hipotiroidismo pareceretrasarla aparicióndel cambiode la

expresiónde las formas fetalesde los JGFs a las adultas(Gallo, 1991).

Por otro lado, la administraciónde insulina aumentóel pesocorporalde las

ratasdestetadasy adultastiroidectomizadasrespectoa los animalesoperados,dado

que la hiperinsulinemiaseacompañade un aumentode las necesidadesenergéticas

(Melian, 1997). Sin embargo,no altera los niveles de Gil, lo que sugiere la

necesidadde un tratamientode mayor duración o de dosis superioresde dicha

hormonaparaaumentarlos nivelescirculantesde GIl (Ortiz-Caro, 1984).

4.1.4. Consideracionesfinalesdel estudiode las variacionesde los IGFs.

Los datospresentadossugierenque la insulina, y no la Gil, medialos efectos

de las hormonastiroideas sobre la secrecióndel IGF-I en la etapa neonatal del

desarrollo;encualquiercaso,dadoqueen el estadoadultoel sistemaneuroendocrino

ha maduradoy se han establecidolas conexiones,la Gil media los efectostiroideos

sobre la secrecióndel IGF-I. La regulación del sistema hormonatíroidea/IGF es

compleja,pero se clarificaráen la segundapartede estetrabajopor el estudiode las

IGFBPs en estas poblaciones y por los experimentos de rehabilitación de

hipotiroidismomediantela administraciónde T4.

Pensamosque el papel de la insulina, que ha sido olvidado, deberíaser

196

Discusión

consideradoen los estudiosde las relacionesentrela función tiroideae IGF-I en las

etapasinmadurasdel desarrollo. El papelpreciso de la insulina en el organismo

adulto, cuandola regulacióndel IGF-I por la GH estátotalmenteestablecida,será

objeto de investigacionesfuturas, ya que el equilibrio insulina/nutrientesparece

interarde forma sutil con laGil en adulto sobrela regulacióndel axis IGFs/IGFBPs

(Goya,enprensaenLife Sci.).

4.1.5. IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNmhepáticoenanimales

hipotiroideosneonatales.

En el suero, las IGFBPsjueganun importantepapel en la regulaciónde las

accionesde los IGFs en situacionesfisiológicasy patológicas(Rajaram, 1997), así

algunosestudiossobrela regulaciónde estasproteínastransportadorashanmostrado

que,endichassituaciones,algunashormonaspuedeninfluir sobrelos nivelesséricos

de una o varias IGFBPs (Jones, 1995; Rajaram, 1997). Además, se sabe que la

regulacióndel axis IGFs/IGFBPsdependedel estadonutricional (Clemmons, 1991;

Thissen, 1994), con lo que la influenciade las hormonastiroideas, que afectana

todos los aspectosdel metabolismo,sobredicho axis serácompleja.

Las hormonastiroideas, al igual que los IGEs (IGF-1 y II), jueganun papel

fundamental en el inicio y el mantenimientodel crecimiento somático en los

mamíferos,y las IGFBPsmodulanla actividadbiológicade los IGFs (Rechíer,1993;

Jones, 1995; Rajaram, 1997). Anteriormente,y en las tres poblacionesde ratas

(neonatal,destetaday adulta), se han estudiadolas variacionesde los JGFs y su

expresióndel ARN hepático, y se ha establecidoel papel de la insulina como

mediadorade los efectosde las hormonastiroideassobrela secreciónde los IGFs en

etapasinmaduras,pasandoa dependeren el adulto dichos efectosde la Gil. Las

variacionesséricasde las IGFBPs se han estudiadoen situacionesde alteración

nutritiva (Straus, 1994; Thissen, 1994), y también se han descrito variaciones

diurnas, sobre todo para IGFBP-l (Baxter, 1987), lo que estárelacionadocon la

ingesta,dado que el estadometabólico de un individuo se refleja en el nivel de

insulina, el cual,como se ha descrito,regulala secreciónde IGFBP-1 (Lewitt, 1994;

Baxter, 1995).

Las variacionesde la glucosa,insulina, GH, T3, T4 e IGF-I circulantes,así

como el contenidode Gil en hipófisis y el pesocorporal, respectoa los animales

neonatales,destetadosy adultoseutiroideos,puedenverse en las Tablas4, 5 y 6,

197

Discusión

respectivamente.Lasratasneonatalespresentarondossituacionesdiferentesencuanto

a los valoresde insulina, Gil e IGF-I circulante,puestoque estos nivelesfueron

superioresa los de los animalescontrol enla poblacióntiroidectomizada,e inferiores

en la tratadacon MMI, tanto a 10 y 15 comoa 20 días de vida (5, 10 y 15 días

despuésde la tiroidectomíaen la primerapoblación).Sin embargo,el pesocorporal

y las hormonastiroideasséricasdisminuyeronen ambosgruposde animalesrespecto

a los controles. Estas diferentesvariacionesencontradaspara las dos poblaciones

neonataleshipotiroideas,en cuanto a los nivelesplasmáticosde insulina y Gil,

sugierenque enetapasinmadurasdel sistemahipotalámico,el desequilibriocausado

por la extripacióndel tiroides aumentalas concentracionescirculantesde insulina y

GIl, quizás por una estimulación adrenérgica (Okajima, 1978) o por los

glucocorticoides(Aránguez, 1986); tambiénalerta sobre el posible efecto de los

bociógenosper se sobrela insulinemia(John, 1970; John, 1974),que podríanjugar

un papelenel descensode los nivelesde la insulinacirculanteen la poblacióntratada

con MMI. Sin embargo,ello permitió estudiar, como se hizo con los IGFs, las

variacionesen la secreciónde las IGFBPsen dos poblacionesde ratashipotiroideas

que presentaronun cuadrometabólicodiferente.

4.1.5.1. IGFBPsen los animalesneonataleshipotiroideosy tratadoscon

STZ.

En estas condiciones, las poblacioneshipotiroideas (tratada con MMI y

tiroidectomizada)presentaron,en el suero, unos niveles altos para el complejode

3OkDa (IGFBP-1 y 2) y bajos, para el de 45kDa (IGFBP-3>. Sin embargo,este

aumentofue mayor en los animalestratadoscon el fármacobociógenoque en los

tiroidectomizados(Figura 11), y tanto el análisis de los niveles circulantespor

“Western inmunoblot como el de los tránscritoshepáticos,parecieronmostrarque

dicho incrementoen los valoresdel complejode 3OkDa fue debidoa la IGFBP-2 en

las ratastratadascon MMI, de acuerdocon lo observadopor otros autores(Nanto-

Salonen,1991; Nanto-Salonen,1992;Nanto-Salonen,1993;Rodríguez-Arnao,1994).

Sin embargo, nuestros resultados encontrados para las ratas neonatales

tiroidectomizadasparecieronmostrarqueel aumentode IGFBP-2 no era debidoa la

deprivaciónde las hormonas tiroideas circulantesdirectamente,como se había

pensado,ya que en ambaspoblacionesneonataleslos nivelesde T3 y 3’4 estánmuy

bajoscon respectoa la control (Tabla4) y no aumentatantoIGFBP-2en la población

198

Discusión

tiroidectomizadacomoen la quefue tratadacon el bociógeno;quizás,en lapoblación

hipotiroideatratadacon MMI el aumentode IGFBP-2 esdebidoa una situaciónde

diabetes (baja insulina y glucosa igual que controles, Tabla 4), ya que se ha

establecidoque la IGFBP-2 aumentadurantelos estadosde diabetessuave (Ooi,

1990; Bereket, 1995; Strasser-Vogel,1995), y tambiénse ha visto que IGFI3P-2 se

regulademanerainversapor la insulina y queel tratamientocon insulina normaliza

sus niveles(Lewitt, 1994>.

Se ha establecidoque la insulina está involucrada en la regulación de los

nivelesséricosde JGFBP-1(Holly, 1988; Lewitt, 1994), y que los valoresde esta

proteínatransportadoravarianporla ingestade alimentos(Yeoh, 1988),descendiendo

despuésde la comidapor el efectodirecto de la insulina. Sin embargo,en las ratas

tiroidectomizadas,que presentaronaltos niveles de insulina circulante, IGFBP-1

aumentó,no descendió,tanto a nivel circulante como de su ARN enhígado,frente

a los animalescontrol, y en la poblaciónhipotiroideatratadacon MMI, que mostró

una baja insulinemia, IGFBP-1 disminuyó, no aumentó,tanto en el suerocomoen

suexpresiónhepática;ello se podríaexplicarporqueenlos niños, seha visto quelas

alteracionesen los valorescirculantesde IGFBP-1 no estánligadasa cambiosen la

secreciónde insulina (Counts, 1992; Smith, 1995), sino que estaríanreguladaspor

su estadometabólicoglobal (Cotterill, 1988).No obstante,la dependenciainversade

la insulina sobre la secreciónde IGFBP-1, ya descrita en pacientesdiabéticos

(Suikkari, 1988; Quin, 1994; Muñoz, 1996) y en estudiosrealizadoscon animales

(Lewitt, 1994), si se manifestóen la poblaciónneonataltiroidectomizadadespuésde

recibir STZ. Además, el hechode que los nivelescirculantesy la expresiónen

hígadode estaproteínavariarandel mismo modo resultóindicativo de que el efecto

de la insulinasobrelaproducciónde IGFBP-1 estuvoreguladoa nivel transcripcional

en el hígado(Pao, 1992).

Los altos valores circulantes de IGFBP-2 de estos animales neonatales

tiroidectomizadostratados con STZ (Rajaram, 1997) se acompañaronde una

expresiónhepáticadisminuida,del mismomodo enquehabíasido mostradoen ratas

neonatalesdiabéticas(Rivero, 1995).Estadiscrepanciaentrelos nivelesséricosy de

ARNm de estaproteínaligadoraevidencióun hecho que ya habíasido descritopor

otros autores,y esque la regulaciónde la expresióndel gen de IGFBP-2 serealiza

a nivel post-transcripcional(Ooi, 1992a).

199

Discusión

Los nivelescirculantesy la expresióndel ARNm hepáticode IGFBP-3,menos

abundante en etapas inmaduras, disminuyeron en los animales hipotiroideos

(tiroidectomizadosy MMI) respectoa los controles,al igual que sucedíaen las ratas

subnutridasy diabéticas(Philipps, 1989;Donovan,1991;Rivero, 1995;Goya, 1996).

Estasvariacionesde IGFBP-3 fueronanálogasen ambaspoblacioneshipotiroideas,

tiroidectomizaday tratadacon MMI, quepresentaronnivelesde insulina, Gil e IGF-I

aumentadosy disminuidos,respectivamente,frentea las ratascontrol; ello pareció

mostraruna independenciade la IGFBP-3 respectoa Gil e IGF-I en estasetapas

¡maduras,y de forma contrariaa lo establecidoen adultos (Rechíer,1993; Jones,

1995), lo que sugeriríauna posibleacción directade la deprivaciónde hormonas

tiroideas.

Por otro lado, los niveles de IGFBP-3 séricos disminuyeron en las ratas

neonatalestiroidectomizadastratadascon STZrespectoa los animalescontrol,aunque

su expresiónen hígado, que era inferior a la de la población control, aumentó

ligeramenterespectoa los valoresmostradospor las ratas tiroidectomizadas.Se ha

postuladoque el déficit de insulina aumentala actividad proteasade la IGFBP-3

(Rechíer, 1998), y ello explicaría la disminución encontradaen los animales

neonatalestratadoscon STZ.

4.1.5.2. Consideracionesfinales del estudio de las variacionesde las

IGFBPs.

Creemos pues que estos resultados, en dos poblaciones neonatales

hipotiroideas,ambasconnivelesmuy reducidosde hormonastiroideas y diferentes

cuadros metabólicos(niveles circulantesdistintos de Gil, insulina y glucosa),

muestranque las variacionesdel complejode 3OkDa (IGFBP-1 y 2), que esel más

abundanteenelperiodoneonatal(Donovan,1989; Rivero, 1995),parecenregidasno

poruna accióndirectade la falta de hormonastiroideas,sino por la repercusiónque

ello tiene en el estadometabólicodel animal; por tanto, el aumentodel complejode

3OkDa respectoa los valorescontrol parecedebidoa IGFBP-1 y 2 en los animales

tiroidectomizadosy sólo a IGFBP-2 en los tratadoscon MMI. Todo ello además,

ponede relieve la importanciade la insulina en la regulacióndel complejode 3OkDa

en los animalesneonatales,que ya fue puestade manifiestopara la regulaciónde

IGF-I. Por otra parte, en ambas poblaciones hipotiroideas neonatales

(tiroidectomizadasy tratadas con MMI) existe un paralelismoentre los niveles

200

Discusión

circulantesobtenidosparaIGFBP-1 y 2 y su expresióndel ARN hepático(Figuras

11, 12 y 13), sugiriendounaregulacióntranscripcional(Rodríguez-Arnao,1994). La

regulacióndel complejode 3OkDa, enestasratas,concuerdaademáscon resultados

realizadosen tejidos fetales y adultos, que muestranque IGFBP-2 aumentaen

situacionesde diabetesligera, mientras que IGFBP-1 sólo se incrementaanteuna

insulopeniasevera,enla diabetes(Ooi, 1990),y sugiereunpapelbiológicoespecífico

para IGFBP-1 y 2.

Se destacael hechode que la variaciónde las IGFBPsenanimalesneonatales

hipotiroideoscoincidecon las alteracionesencontradasen neonatossubnutridos,y las

de los animalestratadoscon STZ en este trabajo coinciden con las de las ratas

diabéticas(Philipps, 1989; Donovan, 1991; Rivero, 1995; Goya, 1996), lo cual

resaltala importanciadel estadometabólicodel animal en sus regulaciones.

4.1.6. IGFBPs en animales destetadosy adultos tiroidectomizadosy

tratadoscon insulina.

Las Tablas 5 y 6 muestranque las tatashipotiroideasdestetadasy adultas

presentaban,respectoa las controles,unosnivelescirculantesde insulina,Gil e IGF-

1 disminuidos, junto con variaciones mínimas en la glucemia y muy bajas

concentracionesde hormonastiroideas.Así pues, los animalesdestetadosy adultos

tiroidectomizadosmostraronuncuadrometabólicosimilaral quepresentaronlas ratas

neonataleshipotiroideas tratadas con MMI; en estas condiciones, los niveles

circulantes del complejo de 3OkDa y la IGFBP-3 estándisminuidos, pero el

tratamientocon insulinade estosanimaleshipotiroideosrestituyó los valoresséricos

de IGFBP-3 sólo a 37 días de vida, y aumentóligeramenteel complejode 3OkDa,

aunque no se llegaron a alcanzar los niveles control en ninguna de las dos

poblaciones,destetaday adulta. La expresióndel ARN hepáticode IGFBP-1 y 3

presentóunasvariacionesparalelasa las mostradasporlos nivelescirculantes,lo que

sugeríala existenciadeunaregulacióntranscripcional(Ooi, 1990; Villafuerte, 1996;

Villafuerte, 1997).Sin embargo,el ARN hepáticode IGFBP-2aumentótanto en los

animales destetadoscomo los adultos, y los ensayos hechos por “Western

inmunoblot” pusieronde manifiestotambiénun incrementodedichaproteína,como

sucediócon los neonatoshipotiroideostratadoscon MMI, quepresentabanun cuadro

metabólicomuy similar (Tabla 4); ello pareció mostrarde nuevo que, en dichas

condicionesde diabetesligera (Ooi, 1990), la IGFBP-2tambiénaumentaen adultos.

201

Discusión

4.1.6.1. Consideracionesfinales del estudio de las variacionesde las

IGFBPsen animaleshipotiroideos.

Estosresultadosmuestranqueexisteunaregulacióndiferentey específicapara

IGFBP-1, 2 y 3 en las ratashipotiroideaspara cualquieredadque se considere,y

apoyan la conclusión (Nanto-Salonen,1992) de que las consecuenciasde la

deprivaciónde hormonastiroideassobrela secreciónde las IGFBPsdependede la

edad.En las ratasneonatales,las variacionesdel complejode 3OkDa,sin embargo,

parecenseruna consecuenciade las alteracionesdel cuadrometabólicoprovocadas

por el déficit de hormonastiroideas,y no una acción específicadirecta de estas.

Tambiénestosresultadossugierenquela IGFBP-2, entodos los periodosestudiados,

parece tener un papel homeostáticoen cuadros que cursan con alteraciones

metabólicas,como se habíasugeridopara la rataadultaduranteestadoscatabólicos

(Orlowski, 1990).Así mismo,se ratificó, por los resultadosexpuestos,el importante

papel de las hormonas tiroideas como reguladorasdel crecimiento en etapas

inimaduras,no sólo por sus accionesespecíficasconocidassobreel sistemanervioso

central, sino por sus accionesmetabólicas,sobretodo a través de las variacionesde

los niveles de insulina que se produceny que parecenregir alteracionesen el

complejode 3OkDa que modulala biodisponibilidadde los IGEsen estasetapas.De

nuevo, comose describióen los animalessubnutridosy diabéticos(Rivero, 1995;

Goya, 1996), todo ello parece producirse en estas etapasinmadurasde forma

independientede Gil, como se ha sugerido tambiénen estudios con animales

hipofisectomizados(Glasscock,1991).Estosresultados,junto con los obtenidospara

los IGFs, alertan además sobre la importancia de la vía de producción del

hipotiroidismopara los estudiosde la influenciade las hormonastiroideassobre la

regulacióndel eje IGFs/IGFBPs.

4.2. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES DEL AXIS IGFs/IGFBPs EN

SITUACIONES DE IIIPOTIROIDISMO (TIROLDECTOMIA) DESDE LA

ETAPA NEONATAL A LA ADULTA DESPUESDE LA REHABILITACION

CON T4.

El retrasodel crecimientoes una de las primerasrespuestasfisiológicasdel

hipotiroidismo, por ello todos los animalestiroidectomizadosmostraronun menor

pesocorporal respectoa sus controles(Aláez, 1992a). No obstante,el tratamiento

202

Discusión

con T4 normalizócompletamenteel crecimientomedianteel implantede pellet, de

acuerdo con lo que se ha descrito ampliamenteen la bibliografía, que la

administraciónde GR o T4 restaurael crecimientode las ratastiroidectomizadas

(Nanto-Salonen,1992; Nanto-Salonen,1993).

La administraciónde una dosis de 1.5p¿g/IOOgde pesode T4 a estas ratas

tiroidectomizadasno igualó los nivelesde las hormonastiroideascirculantesen estos

animalesa los de la poblacióncontrol. Las ratasneonatalestienenunosnivelesen

suero más elevados de hormonas tiroideas de forma fisiológica, por ello,

probablemente,ladosisde T4 utilizada(1.Spg/íOOgde peso)resultóinsuficientepara

la rehabilitaciónde los nivelesde las hormonastiroideas.No obstante,estacantidad

de tiroxina sí resultó adecuadapara incrementar,incluso por encimade los valores

control, los niveles plasmáticose hipofisariosde Gil, lo que evidenció la gran

sensibilidad de la pituitaria de estos animalesneonatalesa la regulaciónpor las

hormonastiroideas(Kim, 1993).

La tiroidectomíacausó un incrementoen la insulinemia de los animales

neonatales,perola administraciónde T4 no disminuyólos nivelesplasmáticosdeesta

hormonaalos valorescontrol, quizásporqueladosisde tiroxinaadministradaresultó

insuficiente,ya que se habíadescritocon anterioridadque el tratamientocon T3 de

ratashipotiroideasdisminuyelos nivelesde insulina circulante(Azam, 1990).

Las hormonastiroideas, como se ha mencionadoen repetidas ocasiones,

poseenuna gran importanciaen el crecimiento, y además,los niveles de Gil son

dependientesdel estado tiroideo, de ahí que los animalesdestetadosy adultos

operadospresentaranunmenorpesocorporaly nivelesdeGIl circulantee hipofisaria

disminuidosrespectoa las ratascontrol.No obstante,la administraciónde T4 produjo

una normalizaciónde los valoresde hormonastiroideas,junto conuna recuperación

del peso (Aláez, 1992a) de los animalesdestetadosy adultos que pasó por un

aumentoen el contenidoy los nivelescirculantesde Gil (Nanto-Salonen,1991).

Glasscock y col. (1991) han descrito una dependenciahormonal similar del

crecimientoen ratashipofisectomizadas,conunacorreccióncompletadel crecimiento

por el tratamientocombinadode T4 y Gil, y una correcciónsólo parcial con la

administraciónde hormonade crecimiento.Además,se ha visto queel hipotiroidismo

disminuyela secreciónpituitaria de Gil y sus nivelesde ARNm, pero senormalizan

tras el tratamientocon T, (iones, 1990), y tambiénse ha demostradoque la T3

203

Discusión

aumentala transcripcióndel gen de Gil (Martial, 1977).

Por otro lado, Hervás y col. (1975) demostraronque los efectosde las

inyeccionesde T4 sobreel contenidohipofisariode Gil de las ratastiroidectomizadas

serelacionabacuantitativamentecon la dosisde tiroxina empleada,dichosefectosse

observabanmáspronto con dosisaltasde 14, y segúnel tiempo transcurridodesde

la administraciónde la hormona;demostrarontambiénque la concentraciónde GH

enpituitaria aumentabaantesquesusvalorescirculantes.Asípues,no resultaextraño

que el tratamientollevado a cabo durante10 días, en ratasdestetadasy adultas,

mostraranivelesmáscercanosa los presentadospor los animalescontrol, y lo mismo

sucediócon el contenidohipofisariode Gil en ratasadultasrehabilitadas.De nuevo,

sedebedestacarel hecho de que las ratasdestetadasmostraranun comportamiento

intermedioentre la etapaneonataly la adulta, puestoque al igual que las primeras,

presentaron,tras el tratamientocon T4~ unos nivelesde GH circulantessuperioresa

los de sus respectivoscontroles. Además, la normalizaciónde los niveles de las

hormonastiroideasen los animalesadultosse acompañóde un aumentogradualen

los valores plasmáticosde GR e insulina, mientras que en el caso de las ratas

destetadas,el tratamientocontiroxina, quecausóun fuerte incrementoen los niveles

séricosde ‘[3 y T4, produjo unaumentorápido y bruscoen las cifras circulantesde

Gil e insulina. Se encontróun paralelismoentre los niveles plasmáticosde GH e

insulina ya descrito con anterioridad(Montes, 1977; Bedo, 1991) en todas las

poblacionesestudiadas.

Se debedestacarel hecho de que el tratamientohormonal llevado a cabo

mediantepellets, que constituye una pauta de administraciónmás continuaday

fisiológica que la inyección, ofrezca una normalizaciónde los valorespara estos

parámetrosendocrinosbasales,dato que se deberátener en cuentapara futuros

estudios. Así pues, esta restitución de los parámetrosendocrinosdespuésde la

rehabilitacióncon T4 de los animalesdestetadosy adultostiroidectomizados(Tabla

9) estuvodeacuerdocon lo esperadosegúnlos resultadosanteriormenteestablecidos

en la literaturacientífica.

4.2.1. IGFs e IGFBPsen neonatos.

El tratamientocon 14 disminuyó los niveles séricos de IGF-I y II en los

neonatostiroidectomizados,aunque la expresiónhepáticadel ARNm permaneció

elevada para ambos factores respectoa las ratas control, como sucedíaen la

204

Discusión

poblacióntiroidectomizadaantesdel tratamiento.Sólo se igualó la cantidadde los

tránscritosde IGF-II a los animalescontrol cuandolas ratasfueron tratadascon el

pellet. Este hechopareció sugerir una vez más que, en la poblaciónneonatal,la

alteraciónen los nivelesde IGF-I asociadaal hipotiroidismo no era secundariaa la

secrecióndeGil, ya que las dosisde T4 dadasrestaurabanporencimade los valores

control los nivelesde Gil. Sin embargo,los nivelesde insulina, aunquedisminuyen

conrespectoa los animalesno tratados,siguenaltosrespectoa los control; en dichas

circunstancias,los valorescirculantesde IGF-I se rehabilitanigual a los controles,

pero no la expresiónde IGF-I. Dicha rehabilitaciónparcial de IGF-I apuntaa una

accióndirectade las hormonastiroideasa travésde la GH y al margende la insulina,

que sigue alta en los animalesneonatales.

El descensode IGF-II despuésde recibir tiroxina parecemostrarla capacidad

de la hormonade acelerarel procesode maduraciónde IGFs, ya queel IGF-II esel

IGF abundanteenperiodofetal, y ha sido descritopor otros autores,que el pasoa

valorescirculantesaltosde IGF-I (IGF del periodoadulto),parecereguladopor las

hormonastiroideas (Gallo, 1991; Nanto-Salonen,1993). Tambiénsemuestraen los

animalestiroidectomizadosneonatalesque la elevaciónde laglucemiajuegaun papel

en la restauracióndel IGF-II, como sehabíadescrito(Rivero, 1995).

En cualquiercaso, la disminuciónde los nivelesde insulinaen los neonatos

tiroidectomizadosrehabilitados,respectoa los animalesoperados,parecejugar un

papelen la restauraciónde los valoresséricosde IGF-I; consecuentemente,las ratas

neonatalessometidasal tratamientocon 14 mostraronunacorrelaciónalta y positiva

entrelos nivelescirculantesde insulina e IGF-I, aunquedicha correlaciónfue mayor

cuandola administraciónde la T4 se realizópormedio de pelletque por inyección.

Porotro lado, el coeficientede correlaciónfue pobreparala Gil, pero no tanbajo

como se encontrabaen los animalestiroidectomizadossin rehabilitar,mostrandoque

en este caso, los valores altos de Gil circulante parecenjugar un papel en la

rehabilitación.De nuevose repitió el hechode quela correlaciónfue mejor al tratar

a los animalescon el pellet frenteal otro tratamiento.Estoshechosapoyanuna vez

más que, a pesar de que el IGF-I parecereguladopor la insulina en periodos

inmadurosdel desarrollo(Bóni-Schnetzler,1991; Rivero, 1995; Goya, 1996),la GH

juegatambiénun papelendeterminadascircunstancias.

La rehabilitacióncon T4 causó un descensoen las proteínasligadorasde

205

Discusión

3OkDa (IGFBP-1 y 2) y un aumentoen IGFBP-3 en neonatos,mientrasaumentaron

endestetadasy adultasambasproteínas,esdecir, seproduce,en las trespoblaciones,

unarehabilitacióna nivel circulantede estasIGFBPsdespuésdel tratmientocon 14.

La implantacióndel pellet de 14 a animalesneonatalestiroidectomizadosse

acompañódeunadisminuciónen los valoresséricosy de expresióndel ARNm de las

dos proteínastransportadorasdel complejo de 3OkDa; las variacionesfueron más

pronunciadasen la transcripciónque a nivel circulante.

La IGFBP-1 se encuentraregulada por la insulina (Baxter, 1995), sin

embargo,y quizásdebido a que los valores plasmáticosde esta hormona no se

restaurarontotalmentea los nivelescontrol, la administraciónde T4 no fue capazde

normalizarcompletamentela secrecióny producciónde estaproteínatransportadora;

de hecho, se ha descritoin vitro que la adición de la T3 no afectaa la expresiónde

IGFBP-1 y 2, pero sí a la de IGFBP-4(Demori, 1997).La normalizaciónde IGFBP-

2 muestraclaramentela idoneidaddel tratamientoconpelletparasu recuperación.

La concentraciónséricay de ARNm en hígadode IGFBP-3 aumentócon el

tratamientocon T4, si bienesteincrementofue mayorenel casode la administración

porpelletquedandola inyección. Estaproteínade alto pesomolecularestáregulada

fundamentalmentepor la Gil, por ello otros autores, al administrarhormona de

crecimientoa las ratashipotiroideasigualaronsu nivel a los valorescontrol (Nanto-

Salonen,1993).

Porotraparte,cabedestacarel hechode que a pesarde que la rehabilitación

de los IGEs y sus IGFBPs no fue muy buena en los animales neonatales

tiroidectomizados,sobretodo paralos IGFs, ello fue, sin duda, debidoa la bajadosis

de 14 empleadaen el experimento.

En todos los casos,se encontróun paralelismoentre las alteracionesde los

nivelescirculantesy de los tránscritoshepáticosde estasIGFBPs,lo que sugeríala

existenciadeunaregulacióna nivel transcripcional(Nanto-Salonen,1992; Latimer,

1993).

4.2.2. IGFs e IGFBPs en destetadosy adultos.

La tiroidectomíase asociaconunosbajosniveles circulantesy de expresión

del ARN hepáticode IGF-I (Rodríguez-Arnao,1993b),pero la administraciónde T4

los aumenta(Chernausek,1983; Nanto-Salonen,1991),tal como sucedeen nuestros

resultadospara animalesdestetadosy adultos. Se ha demostradotambiénque el

206

Discusión

estadotiroideo puedealterar la expresióndel IGF-I en otros tejidos ademásdel

hígado: la 13 aumentalos efectosde IGF-I encultivos de osteoblastos(Schniid, 1992;

Varga, 1994)y decélulasde Sertoli (Palmero,1990).No obstante,el tratamientocon

14 mostró unos resultadosdispares:la administraciónde la hormonamediantela

inyecciónrehabilitósólo parcialmentelos nivelesde expresióny séricosdeestefactor

de crecimiento(van Buul-Offers, 1994), aunqueel pellet sí los normalizó, lo que

pareceindicar que la eficaciade la pautahormonaldependeno sólo de la dosiso la

duracióndel tratamiento,sino tambiénde la forma de administracióno de la vía

(Latimer, 1993). El paralelismoencontradoentre los niveles circulantesy los del

ARN hepáticodelIGF-I enanimalesdestetadosy adultostiroidectomizadosy tratados

con 14 sugiereel hechode que la regulaciónde lashormonastiroideassobreel IGF-I

parecehacersea nivel transcripcional(Wolf, 1989), siendo,en la etapaadulta, la

GIl, la hormonaque actuacomomediadoraprincipal de las hormonastiroideas,y

que escapazde alterarla síntesisy/o estabilidadde los tránscritosdel ARN de IGF-I

en el hígadode rata (Roberts, 1986). Consecuentemente,los análisis de regresión

lineal en estosestadios,destetadoy adulto,mostraronuna correlaciónalta y positiva

entre los nivelesplasmáticosde Gil y los séricosde IGF-I, y dichacorrelaciónfue

pobreparala insulina. En cualquiercaso,en las ratasadultas,el coeficientefue más

alto cuandola administraciónse realizócon pellet frentea la inyección, y aumentó

máscuantomayorfue la duracióndel tratamiento,lo que pareceindicar unavezmás

a la GIl en la etapaadultacomomediadorade la acciónde las hormonastiroideas

sobrela secreciónde los IGFs (Kitauchi, 1998).En cuantoa las ratasdestetadas,el

coeficiente de correlación mejoró con el tratamiento por pellet respecto a la

inyección.

La administraciónde T4 a las ratasdestetadasy adultasoperadascausóun

aumentoen los nivelesséricosde las dos proteínasdel complejode 3OkDa y de la

expresiónhepáticade IGFBP-1. La expresióndel gende estaproteínatransportadora

está regulada por la insulina (Ooi, 1990), y la insulina aumentó despuésdel

tratamiento;quizás, además,estoscambiosen los nivelescirculantesde IGFBP-l,

probablemente,estaríanrelacionadoscon accionesdirectasde la 14, al menos en

parte,puestoque se ha visto que la T3 escapazde aumentarel ARNm y la secreción

de estaproteína in vivo y en cultivos de células de hepatomahumano(Rodríguez-

Arnao, 1993b;Mielí, 1994).No obstante,estoscambios,en nuestroestudio,parecen

207

Discusión

mediadospor el aumentoprogresivode insulina (Rivero,1995; Goya, en prensaen

Life Sci.).

La altaexpresióndel ARNm de IGFBP-2senormalizóporel tratamientocon

14 tambiénenel suero,de acuerdoconNanto-Saloneny col. (1992).Porotro lado,

Nanto-Saloneny col. (1993) mostraron que la administraciónde Gil a ratas

hipotiroideasno afectabaa la expresióndel gende IGFBP-2, con lo queparecíaque

la regulaciónde estaproteínainvolucrabaotros mecanismos,y entreellos estarían

las hormonastiroideas(Nanto-Salonen,1993); unaevidenciade estamodulaciónde

la IGFBP-2 por las hormonastiroideasse ha mostradoen cultivos de osteoblastos,

dondeaumentabala produccióny secreciónde esta proteínatransportadorapor la

administraciónde 13 (Schmid, 1992).

Las concentracionesséricay de ARNm hepáticode IGFBP-3,quedisminuían

despuésde la tiroidectomía,aumentarondespuésdel tratamientocon T4, al igual que

habíanestablecidootrosautores(Nanto-Salonen,1993).De nuevo,parecióestarclaro

que esteefectoera debido a un aumentoprogresivode la secreciónde GIl. Se ha

descritoque la administraciónde CH a ratashipotiroideasnormalizabalos nivelesde

IGFBP-3 (Nanto-Salonen,1993), lo que estableceque la expresiónde estaproteína

ligadoraestáreguladapor los nivelesde CH.

El hecho de que los niveles circulantesy de ARNm en hígado de estas

IGFBPsvariende formaparalela,sugirió la existenciade una regulacióna nivel de

la transcripciónporpartede la 14, cosaque previamentehabíasido mostradaen los

animalesdestetadosy adultospor otros autores,y tambiénen humanos(Latimer,

1993; Nanto-Salonen,1992; ; Angervo, 1993b; Mielí, 1994).

Finalmente,cabedestacarel hechode queel efectode la 14 sobrelos niveles

de las IGFBPs parece ser específico del órgano (Latimer, 1993). En nuestros

resultados,la restauraciónen la expresiónde estasproteínasvarió dependiendode la

vía deadministraciónempleaday de la duracióndel tratamiento,ofreciendomejores

resultadosel tratamientomáslargoy cuandola liberaciónde la tiroxina administrada

fue continuada.

4.3. ESTUDIODE LA REHABILITACION CON 14 EN SITUACIONES

DE DIABETES EN PERIODONEONATAL Y ADULTO.

La diabetescausó un descensodel peso corporal (Maiter, 1989) que se

208

Discusión

acompañóde unadisminuciónen los nivelescirculantesde insulina, 13, T4~ Gil, y

de esta última hormona también a nivel hipofisario. Se ha descrito que esta

enfermedadalterael axis hipotálamo-hipófisis-tiroides;se produceunareducciónen

los nivelesdel TRH hipotalámicoy plasmático(González,1980; Aláez, 1992a)y de

la TSH hipofisaria y circulante (Aláez, 1992a; Rodríguez, 1992), disminuye la

velocidadde secreciónde ‘[Sil, la respuestade la TSH a la TRI-I (Pastor, 1983;

Aláez, 1992a) a pesar de que el metabolismoperiférico de la ‘[Sil es normal, y

tienenlugarnumerososcambiosestructuralesen la glándulatiroidea(Tontis, 1990).

Además,desciendela producciónde hormomastiroideas (Tontis, 1990; Rodríguez,

1992)y la desyodaciónde T4 a 13 enlos tejidosperiféricos(Ortiz-Caro,1984; Aláez,

enprensaenMetabolism;Calvo, 1997)y, comoconsecuenciade ello, seproduceuna

disminuciónen las concentraciónde ambasyodotironinasen la mayoríade los tejidos

(Aláez, 1992a; Ortiz-Caro, 1984). lodos estos cambiosen el estadotiroideo se

considerancomo una respuestaadaptativacausadapor la limitadadisponibilidadde

energíaa nivel celular.

En la rata, la diabetesinducidapor STZ se acompañade un descensoen los

nivelesplasmáticosy el contenidohipofisario de Gil (Rodríguez,1992; Giustina,

1994;Flyvbjerg, 1995).Estedefectopodríadeberseaun aumentode la somatostatina

hipotalámica,quemotivaríauna disminuciónen la velocidadde transcripcióndelgen

de GH, aunqueesto sólo no explicaría totalmenteel descensoen los niveles de

ARNm y de Gil en pituitaria observadoen la diabetes(Martial, 1977; Rodríguez,

1992). Se podría pensar, por tanto, que la administraciónde T4 a estas ratas

diabéticasnormalizaría los niveles de la hormona de crecimiento circulantese

hipofisarios,así como suexpresiónen esta glándula,pero estono esasí, dadoque

Bedo y col. (1991)describieronque para conseguiruna regulaciónnormal del gen

de la GIl por las hormonas tiroideas es necesariala insulina. Este hecho se

compruebaen los animalesdiabéticosadultosde nuestrotrabajo, en los cuales,las

dosis de T4 no aumentanla insulina y tampoco la GH a los valorescontrol; sin

embargo,no sucedelo mismo en los neonatosdiabéticosde nuestroexperimiento,en

los que el aumentode Gil despuésde la administraciónde T4 se produce sin un

incrementoen la insulina.

4.3.1. IGFs e IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNm hepático.

La diabetesse asociacon unos bajos niveles circulantesy de expresióndel

209

Discusión

ARN hepáticode IGF-I (Ishii, 1994; Rivero, 1995). Sin embargo,estaenfermedad

altera laexpresiónde estefactorde crecimientotambiénenotros tejidoscomoriñón,

músculoesqueléticoo glándulasadrenales(Luo, 1991; Bornfeldt, 1992; Ishii, 1994).

No seconocetotalmentela causaporla que disminuyela expresióndel IGF-I

en la diabetes,aunqueparecedependerde la interacciónde variashormonas,entre

las que seincluyen la insulina y la Gil (Miller, 1981). En estaenfermedad,sesabe

que se produceuna resistenciaa la GR enel hígadode los animales(Maiter, 1989),

pero tambiénlos efectosdirectoso indirectosde la insulina parecensernecesarios

para mantenerlos niveles normalesdel ARNm de IGF—I (Bornfeldt, 1992).

A pesarpues,de que el cuadrometabólicoestotalmentedistinto enunarata

diabética y en una hipotiroidea,nosotros quisimos estudiar hasta qué punto la

rehabilitacióncon hormonatiroideadelaxis IGFs/IGFBPsguardabao no paralelismo

conlo quehabíaocurridoenla rehabilitaciónde los animaleshipotiroideos.El hecho

de que se encuentreun paralelismoentre los nivelescirculantesy los del ARNm

hepáticode IGF-I sugiereque, en la ratadiabéticala expresióndel gen de IGF-I se

regulaa nivel transcripcional,lo que estuvode acuerdocon lo descritopor Adamo

y col. (1991)y Pao y col. (1992).

Las ratasneonatalesdiabéticasque recibieronel tratamientohormonalcon T4

aumentaronlos niveles séricos y de expresiónen hígado de IGF-I, aunque la

administraciónde T4 a los animalesadultosno pareciótenerningúnefectosobrelos

valoresséricos,de acuerdocon Ikeda y col. (1990),y de expresiónenhígadode este

factor de crecimiento.Sin embargo,la administraciónde insulina a niños diabéticos

elevalos valoresde IGF-I antesde incrementarlos nivelesde receptoresde GH y sin

aumentarlas cifras de hormonade crecimiento,lo que sugeriría,en la diabetes,un

efectoestimulatoriodirecto de la insulina sobrela producciónhepáticade IGF-I para

las edadestempranasdel desarrollo(Bereket,1995).Sin embargo,ennuestrotrabajo,

obtenemosunarestauraciónde IGF-I en los animalesneonatalestratadoscon tiroxina

sin un aumentode insulina, lo cualpruebaque, en estascircunstancias,el aumento

de IGF-I seha producidopor una accióndirecta de T4 a través,probablemente,de]

aumentoproducidoen la Gil. En los animalesadultos, cuya secreciónde IGF-I y

expresiónde su ARNm hepáticohemosdemostradoque dependede los nivelesde

Gil, es natural que las dosisdadasa nuestrosanimalesdiabéticos,que no aumentan

la Gil, no restaurentampocolos valoresde IGF-I.

210

Discusión

El modelo de diabetespor STZ mostró unos nivelescirculantesde IGF-II

disminuidosy una expresiónen hígadoaumentadarespectoa las ratascontrol. Sin

embargo,existenmuy pocasreferenciasbibliográficas, y con resultadosdispares,

acercade la regulacióndel IGF-II en situacionescomo la diabetes;así, los distintos

autoresmostraronunos niveles de IGF-II elevados(ilalí, 1989), no alterados o

disminuidos(Merimée,1984; Rivero, 1995).La administraciónde 14 a los animales

diabéticosno alteró los bajosnivelesde IGF-II mostradospor las ratasno tratadas,

y bajó su ARNm, de acuerdocon lo observadopor Nanto-Saloneny col. (1993).

La diabetesdisminuye las proteínastransportadorasde 30 y 45kDa, o sea

IGFBP-I y 2 e IGFBP-3.El estudiorealizadomediante“Westerninmunoblot’mostró

que,enel periodoneonatal,la diabetesaumentalos nivelescirculantesde IGFBP-1,

y de IGFBP-2 de acuerdocon Ooi y col. (1990)y Untermany col. (1990), e igual

ocurre en el hombre(Quin, 1994; Bereket, 1995). Esteaumentoen la expresiónde

IGFBP-1 se debe a la regulacióninversadescritaentre la insulina sobre IGFBP-1

(Baxter, 1995).

Las alteracionesenlos valoresséricosdel complejode 3OkDaseacompañaron

de unasmodificacionesa nivel de la expresiónen hígadoen sentidoinverso, esdecir,

seprodujo un aumentoen los valoresde ARNm de IGFBP-1 y 2 tanto en las ratas

neonatalescomoen las adultas(Ooi, 1990; Rivero, 1995), lo que sugiereque no se

están regulandoa nivel transcripcional.Sin embargo,convendría,en un futuro,

revisar dicha aseveraciónrepitiendo el Western ligand blot’ con una población

diabéticamás amplia.Ooi y col. (1991)demostraronque el aumentoen los niveles

del ARNm de IGFBP-1 se debíaa un incrementoenla velocidadde transcripcióndel

gen de estaproteína,y así mismo,en estadosdiabéticos,se ha descritola magnitud

y velocidaddel descensoen la transcripciónde IGFBP-1 despuésdel tratamientocon

insulina (Ooi, 1992b; Pao, 1992).

A pesarde que los nivelesde ARNm de IGFBP-2 tambiénaumentabanen el

hígadode los animalesdiabéticos,no sehaencontradoun aumentoen la transcripción

del gende estaproteína,porlo quese ha sugeridounaregulaciónpost-transcripcional

(Tseng,1992).No obstante,cabedestacarque la expresiónde IGFBP-2estáregulada

de manera específica y diferente en cada órgano en condiciones metabólicas

anormalescomo la diabetes(Chen, 1994).

Los niveles de IGFBP-3 fueron inferiores a los controles en las ratas

211

Discusión

diabéticasneonatales,adultas (Rivero, 1995; Rodgers, 1995) y en el hombre

(Brismar, 1994; Bereket, 1995; Hanaire-Broutin, 1996). Estos bajos valores

circulantesse asociarona una disminuciónen la abundanciadel ARNm de esta

proteína(Rivero, 1995), todo lo cual estáde acuerdocon nuestrosresultados,y el

tratamientocon 14 no pareceaumentarni los valorescirculantesde las IGFBPsni la

expresiónhepáticade su ARNm a los controles,aunquesu aumentocon respectoa

los animalesdiabéticosesevidenteen nuestrosresultados.Villafuerte y col. (1996)

han demostradoen cultivos de hepatocitosque la insulina estimulala transcripción

del gen de IGFBP-3, y que aumentala liberaciónde la proteína,pero ello no lo

hemosencontradoen nuestrotrabajo. Así pues, la IGFBP-3 duranteel periodo

adulto, en la diabetes,disminuyetanto en suerocomo la expresiónde suARNm, y

por tanto, parecereguladaa nivel transcripcional.Además, recientementese ha

demostradoqueenla diabetesseproduceun aumentoen actividadproteolíticade esta

proteína(Fowlkes, 1997; Rechíer,1998), lo queexplicaríatambiénlos bajosniveles

de IGFBP-3 encontradosen los animalesdiabéticos.

Hay que remarcarpues,que los resultadosobtenidoscon animalesdiabéticos

neonatalesy adultos,muestranunadisminuciónde IGF-I y de IGF-II en sueroenel

periodo neonatal, y de IGF-I en periodo adulto, con reducción en ambos de su

expresiónhepática,y que ello seacompañade una granreducciónde insulina y de

Gil circulanteen adulto,y enneonato,tansolo de insulina, aunque,en ambos,bajan

las hormonastiroideas. Las dosis de 14 restauranla Gil circulante y pituitaria en

neonatospero no la insulina, y rehabilitanel IGF-I en suero,así como la expresión

de su ARNm, cosaque no sucedeen adulto, ya que la Gil no aumenta,y por tanto,

no se restauranlos IGFs. Ello ratifica el papelde la GH como mediadorade las

accionesde las hormonastiroideassobrela secreciónde IGF-I enperiodoadulto, y

muestraque,enperiodoneonatal,en circunstanciasen lascualesla insulinaestábaja,

comoen los neonatosdiabéticostratadoscon T4, las hormomastiroideasconsiguen

rehabilitar los niveles de IGF-I a través de un aumentode Gil (Mathews, 1986;

Bichell, 1992).Estosdatos,junto con los obtenidosen ratasneonataleshipotiroideas,

parecenmostrarque en etapaneonatal,las hormonastiroideasejercensus acciones

sobre la secreciónde IGF-I en primer lugar, a través de la insulina y sólo, en

segundotérmino, cuandola insulinaestábloqueada,diabetesconSTZ, la mediadora

pasaa serla Gil, sin embargo,es la Gil siemprela mediadoraen periodoadulto.

212

Discusión

Estos resultadossobre animales diabéticosratifican pues los obtenidosen ratas

hipotiroideastratadascon 14, ya que los animaleshipotiroideosneonatalestratados

contiroxina tambiénrehabilitanparcialmenteel IGF-I conunaumentograndede GR.

Las IGFBPs, tanto las de 3OkDa como la IGFBP-3, parecenregularsesegún

unestadometabólicomuy complejoen ladiabetesquesedeberíaestudiara más largo

plazo, por lo cual sepuedeconcluir pocode esteestudio; tan solo se ve claramente,

una vez más, que en situaciónde francadiabetes,la IGFBP-1 seregula de forma

inversaa los nivelesde insulina.

4.4. ESTUDIO DE LAS VARIACIONES DE LOS TRANSPORTADORESDE

GLUCOSA (GLUTs) EN ANIMALES NEONATALES HIPOTIROIDEOS.

POSIBLE CORRELACION ENTRE LAS ACCIONES DE LAS HORMONAS

TIROIDEAS, GLUTs Y EL AXIS IGFs/IGFBPs.

Este estudio pretendeestablecerla posible existencia de una conexión,

mediadapor las hormonastiroideas,entre el patrón ontogénicode cambio de los

GLUTs y los IGEs. Se ha descrito que la transición del GLUT-1 (forma

predominanteen etapasinmaduras)al GLUT-4 (transportadortípico de la edad

adulta),en músculoy tejido adiposo,tiene lugarel día4 de vida (Santalucía,1992),

y quelas hormonastiroideasparecenretrasarestapautaontogénica(Castelló,1994).

Por otro lado, tambiénse sabeque el cambioenel predominiode la forma fetal de

los IGFs (IGF-II) a la adulta(IGF-I) se produceen la segundasemanade desarrollo

y que está influenciado por las hormonastiroideas (Gallo, 1991; Nanto-Salonen,

1991; Nanto-Salonen, 1992); así pues, se decidió estudiar un modelo de

hipotiroidismoa 2 y 4 díasde vida (momentodel cambiode los GLUTs) y a 8 y 20

días deedad(transiciónde los IGFs) paraevaluaren él las posiblesalteracionesen

los cambiosde estasproteínas(GLUTs e IGFs> y el papelquelas hormonastiroideas

desempeñabanendichamodificación de estaspautas.

El pesocorporaly los nivelescirculantesde hormonastiroideasdisminuyeron

enlosanimalesneonataleshipotiroideos,exceptoa los 2 díasde vida (Nanto-Salonen,

1991),aunqueel descensode estosparámetrosfue másacusadoenaquellosa los que

se les practicó la tiroidectomía,poblaciónde 8 y 20 días, respectoa aquellosque

recibieronel fármaco bociógeno,población de 2 y 4 días. Estos resultadosya se

habíanobtenido en aquellas poblacionesde animalesneonatales,10-20 días, que

213

Discusión

fueron sometidasa la operaciónquirúrgica frentea las que recibieronel MMI en la

primerapartede estetrabajo;así pues,enesteexperimentovamosapoderhablarde

dos grupos de animales hipotiroideos neonatales que van a presentar un

comportamientoparalelo al de las dos poblacionesantes citadas: tratadascon el

fármacoantitiroideo(MMI) y sacrificadasa 2 y 4 díasy tiroidectomizadas,población

sacrificadaa 8 y 20 días. El hechode que las ratasde 2 días no presentenun menor

pesocorporalpuedeestarmotivado por los cambioshormonalesdel momentodel

nacimientoy tambiénporquenecesitenun periodode latenciaentreel comienzode

la administracióndel MMI y la manifestaciónde sus efectos(Flórez, 1992). No

obstante, todos los neonatos hipotiroideos, incluidos los de 2 días de vida,

presentaronuna reducciónen los nivelesplasmáticosy el contenidohipofisariode

Gil, lo cual apoyael papel crucial de las hormonastiroideasen la regulaciónde la

síntesis de Gil (Seo, 1981). Se encontróun descensoen la insulinemia de los

animalesde 4 días, y un aumentoen las ratasneonatalessacrificadasa 8 y 20 días;

todo ello concuerdatotalmentecon lo que obtuvimosen la primerapartedel trabajo,

y ratifica nuestrosresultadosanteriores.

4.4.1. IGFs e IGFBPs: nivelesséricosy expresióndel ARNni hepático.

Se puso de manifiesto la existencia de un paralelismoentre los niveles

circulantesde insulina e IGF-I, de modo que los neonatostratadoscon MMI

presentaronunos valores inferioresa los de sus controles,mientrasque los animales

tiroidectomizadosmostraronunascifras de ambospéptidossuperioresa los de sus

controles,de modo análogoa lo que se habíadescritoparalas poblacionesneonatales

(apartado4.1).

Los animalesde 2 días de vida, que recibieronMMI, mostraronun pesoy

unosnivelescirculantesde hormonastiroideas,insulina eJGF-Isimilaresa los de las

ratascontrol y una GH disminuida, lo que parecesugeriruna vez más que, en las

etapasinmadurasdel desarrolloes la insulina, y no la Gil, la hormonaqueregulala

síntesisy secreciónde los IGFs (Rivero, 1995; Goya, 1996),tal como sesugiereen

la primerapartedel trabajo.

Por otro lado, tanto la tiroidectomíacomo el tratamientocon MMI, aunque

guardanel perfil normalde descensoprogresivode IGF-II asociadoa la edad,sus

valoresestuvieronporencimadelos controles(Latimer, 1993;Nanto-Salonen,1993).

La diferenciaentre los dos gruposde ratashipotiroideas,en cuantoa nivelesde IGF-

214

Discusión

II, se puedeexplicar por el efecto reguladorde la glucemiasobre el IGF-II en

periodosinmaduros(Rivero, 1995; Goya, 1998),dado quelos nivelesde glucosaen

sangredisminuyenen los animalestiroidectomizados,aunqueno en los tratadoscon

el fármacoantitiroideo.

De nuevo se encontró una correlación alta y positiva entre los niveles

circulantesde insulina e IGF-I, que se confirmó medianteel análisis de regresión

lineal, que además,ratificó la existenciade una pobrecorrelaciónentrelos valores

plasmáticosde Gil e IGF-I en estas poblaciones. Así pues, estos resultados

corroboraronla importancia de la insulina, y no la Gil, en la regulaciónde la

secreciónde IGF-I en estadios inmadurosde desarrollo (Bóni-Schnetzler,1991;

Rivero, 1995; Goya, 1996).

En la rata,existeuna secuenciade apariciónde las IGFBPs(Donovan,1989;

Rivero, 1995); enel periodoadulto, la mayorpartede los IGFs estápresenteen la

circulacióncomoun complejoproteicode l5OkDa (ALS) que prolongala semivida

en el plasmade los IGFs y proporcionauna reservade dichos factorespara los

tejidos. Sinembargo,enetapasinmaduras,el complejopredominante(5OkDa), ya no

estáformadopor IGFBP-3 sino por IGFBP-1 y 2, que no sondependientesde la Gil

comola IGFBP-3(Rivero, 1995;Goya, 1996). Estasproteínas,IGFBP-1 y 2, pueden

ejerceraccionesmetabólicasindependientesdelos IGFs (Lewitt, 1991;Baxter, 1995;

Rajaram,1997).

El hipotiroidismo, como hemos visto a lo largo de estetrabajo, altera los

niveles de las IGFBPs, y por tanto, la actividadbiológica de los IGFs. También,

como en otras ocasiones,tenemosdos grupos de animalesneonatales:las ratas

hipotiroideasde 2 y 4 días de vida, que muestranun comportamientosimilar al de

los neonatostratadosconMMI (descensode los nivelesde IGFBP-1 y 3, y aumento

de los de IGFBP-2), y los animalestiroidectomizadossacrificadosa 8 y 20 días de

edad (desciendeIGFBP-3 y aumentanIGFBP-1 y 2); al igual que sucedíaen la

primera parte del trabajo, y ello se produce tambiéncon un cuadro endocrino

diferente: uno, que cursa con insulopeniay normoglucemia(animalestratadoscon

MMI y sacrificadosa 2 y 4 días),y otro, con altosnivelesde insulinae hipoglucemia

(ratasde 8 y 20 días tiroidectomizadas).

Sin embargo,los animalesde 2 y 4 díastratadoscon MMI no mostrabanlos

valorescirculantesde 3OkDa aumentados,sino disminuidos;ello esporqueel cuadro

215

Discusión

metabólico, niveles de insulina y OH, no coincide totalmentecon los animales

neonatalesMMI de 10 días de la primera partedel trabajo. Sin embargo,si se

encuentra,por “Western inmunoblot’, los valoresde IGFBP-I disminuidosy los de

IGFBP-2 aumentados.Los animalessacrificadosa 8 y 20 días tiroidectomizadosse

comportan como los tiroidectomizadosde la primera parte en cuanto a las

concentracionescirculantey de ARNm de IGFBP-1 y 2, motivadopor la regulación

que ejerció la insulinasobreesasproteínastransportadoras(Baxter, 1995); esdecir,

encontramosresultadossimilares a los de la primera partedel trabajoen ambos

gruposde animalesneonatalestiroidectomizadosen cuantoa IGFBPs.

Las IGFBPsde bajo pesomolecular(IGFBP-1 y 2) disminuyeronconforme

aumentabala edaddel animal en los controles.Los nivelesde IGFBP-3 en sueroy

la expresiónde su ARNm en hígadodescendieronen el hipotiroidismo, lo cual es

debido a los bajos nivelesde Gil registrados(ilervás, 1975).

4.4.2.GLUTs:nivelesenmembranacrudadecorazón,hígado,cuadriceps

y gastrocnemius.

La regulaciónde los transportadoresde glucosapor las hormonastiroideasu

otros factoresesdiferenteen función del tejido de que setrate, e incluso, depende

del transportadorde glucosa considerado(Postic, 1993b). En el corazón,en los

animalescontrol,nuestrosresultadosmuestranclaramenteel descensoenel contenido

de GLUT-1 y el incrementode GLUT-4 asociadoa la edad (Santalucia,1992). El

hipotiroidismocausóun descensoen el contenidode GLUT-4 y aumentóla cantidad

de GLUT-1; otros autoreshan mostradotambiénestasmismas variacionesen la

expresiónde estos transportadoresdurantela etapaperinatal(Castelló, 1994). Se ha

descritoun aumentodosis-dependientede la expresiónde GLUT-4 porel tratamiento

con 13 en cardiomiocitosprocedentesde ratas adultas(Gosteli-Peter,1996). Por

tanto, parececlaro que el déficit de hormonastiroideasconducea un desajustedel

descensode GLUT-1 que ocurre en la etapaperinatal, a la vez que disminuye el

aumentoen la cantidadde GLUT-4 típico del periodoadulto; seproduceun retraso

en el cambiodel patrónontogénicode expresiónde los transportadoresde glucosa.

El hígadojuega un papel fundamentalen la regulaciónde la homeostasis

glucídica, y en él, el GLUT-2 está mayoritariamentesituado en la membrana

plasmática(Stephens,1995) y el transportede glucosava a dependerdirectamente

de la cantidadde GLUT-2.

216

Discusión

Nuestrosresultadosmuestranclaramentetresaspectos:1)el GLUT-2hepático

seva incrementandoa lo largo del desarrollode acuerdocon Rubio y col. (1997)y

Posticy col. (1994)en los controles;2) el hipotiroidismoafectaal contenidohepático

de este transportadorde glucosa de acuerdocon Weinstein y col. (1994); 3) el

GLUT-1 aumentaen hígadoen los animaleshipotiroideosrespectoa los valores

control. Luegoparece,que en estosanimaleshipotiroideos,tanto en corazóncomo

en hígado, se produceun retardo en la aparición de ambos transportadores.Sin

embargo,esdifícil e imposiblecon los datosactualespoderrelacionarlos nivelesde

IGF-I alterados en dichos animales y las variaciones encontradas en los

transportadoresde glucosa,realmenteparecenprocesossin correlaciónentreellos.

En los músculosesqueléticos(cuadricepsy gastrocnemius),al igual queenel

corazón y todos los tejidos insulino~sensibles,se expresandos isoformas de

transportador:GLUT-4 y GLUT-1, siendoel primeroel másabundante(80-90%)y

responsablede másdel 85% de la captaciónde glucosaestimuladapor la insulina.

Del mismomodoqueenel corazón,pudimosobservaren los animalescontrolcomo

durantela etapaneonatal,el transportadorpredominanteera el GLUT-1, pero fue

sustituidoporel GLUT-4 conformeavanzabala edaddel animal (Santalucía,1992).

La expresiónde los transportadoresdel músculoesqueléticoestácontrolada

por varios factores. Se habíadescrito que la administraciónde T3 aumentabala

expresióndel GLUT-4 en el músculoesqueléticode las ratasadultas(CasIa, 1990;

Weinstein, 1991; Torrance, 1997a), e inducía la diferenciaciónde esascélulas in

viti-o (Shimokawa,1997)y, se habíademostradoque las hormonastiroideasposeían

una acción directa sobrela expresiónde estetransportador,puestoque el gen del

GLUT-4 poseeunelementode respuestaa estashormonas(Ezaki, 1997; Shimokawa,

1997). No obstante,tambiénla insulina parecíatenerun importantepapel en este

tejido y sobreestetransportador,al igual que enel corazón(Fischer,1997>; bajo el

efecto insulínico,unapequeñaproporciónde GLUT-1 intracelularse relocalizabaen

la membranaplasmáticaen la fibra muscular(Napoli, 1995), aunque,el fenómeno

tiene muchamás importanciaparael GLUT-4, dadoque la insulinapuedeaumentar

suproporciónen la superficie celularde 15 a 20 veces,en tantoque el GLUT-1 sólo

incrementade 3 a 5 veces(Camps,1992; Gould, 1993). Además,estudiosin viti-o

(miocitosL6) mostraronque el GLUT- 1, frenteal GLUT-4, era menossensiblea la

regulaciónpor glucosaque por la insulina (Koivisto, 1991).

217

Discusión

La regulaciónde los transportadoresde glucosaparece, por tanto, que se

realizacon la participaciónde las hormonastiroideasy de la insulina. Asípues,el

hechode que encontremosun incrementoen la cantidadde GLUT-1 y GLUT-4 en

las ratastiroidectomizadas,que presentaronaltosniveles de insulinemia, podríaser

explicadopor el fuerteefectoestimulantede estahormonasobreel transportador.A

los 4 díasde vida se produjoun descensoenel contenidode los dos transportadores,

puestoque disminuyeron los nivelesde las dos hormonasestimulantes,hormonas

tiroidease insulina (Shetty, 1996). Por último, a los 2 días de edad, cuandolos

animaleserannormoinsulinémicosy eutiroideos,sólo seprodujo un aumentoen el

contenidode GLUT-1 en el cuadriceps(se encontróuna tendenciaanálogaen el

gastroenemius)que podría ser debido a un retraso en el cambio del patrón

ontogénico.

Se podría pensar que el aumento en los animales tiroidectomizadosy

sacrificadosa 8 y 20 díasde vida del GLUT-4y GLUT-1, y el descensodel GLUT-4

a 2 y 4 días,podríaestarpropiciadoporel aumentoy descensodel IGF-I que, como

él, va asociadoa unavariaciónparalelade la insulina,perosin duda,esestahormona

lacausantede los cambiosen los transportadores.Por tanto, los datosestudiadosde

GLUT-1 y GLUT-4 en los animaleshipotiroideosparecenmostrarque no existeuna

relación directa entre las variacionesde GLUTs y de IGFs en los animales

tiroidectomizados,sino que ambasvariacionesenperiodoneonatal,dependende los

nivelesde insulinaalteradosa su vezpor Ja falta de hormonastiroideas.

218

CONCLUSIONES

Car~mes

5. CONCLUSIONES.

Animaleshinotiroideosneonatales,destetadosy adultos

.

Neonatales

1. La comparaciónde resultadosde los parámetrosestudiadosmuestraun cuadro

metabólico distinto entre las dos poblacionesneonataleshipotiroideasestudiadas,

según se produzcala deficienciade hormonastiroideaspor tiroidectomía,o por

tratamiento con MMI. Gil e insulina están altas en los animales neonatales

tiroidectomizados,y disminuidas en los tratados con MMI, la glucemia está

disminuidaen los tiroidectomizadose igual a los controlesen los MMI. Con dicho

cuadrometabólico, los animalestiroidectomizadosaumentansu IGF-I circulante,

mientrasdesciendeen los tratadoscon MMI. La expresiónde su ARNm hepático

guarda un paralelismo con sus niveles en suero, sugiriendo una regulación

transcripcional-

2. El IGF-II circulanteparecereguladopor la glucemiade formapositiva; disminuye

en los animalestiroidectomizadosy no se alteraen los hipotiroideos-MMI.El estudio

de la expresiónde suARNm sugiereuna regulacióntranscripcional.

3. El análisis de correlaciónlineal de ambaspoblacionesneonatales,entrevalores

plasmáticosde insulina e IGF-I, muestraunacorrelaciónpositiva concoeficientede

correlaciónmuy alto, r=0.91, mientras la correlaciónes muy baja para valores

plasmáticosde Gil.

4. El estudiode las proteínasligadorasde IGFs muestraque el aumentoencontrado

del complejo de 3OkDa (IGFBP-1 y 2) en los animaleshipotiroideosneonataleses

más grandeen los hipotiroideos-MMI que en los tiroidectomizados,y tanto los

resultadosde “Western immunoblot’, como la expresiónde su ARNm hepático,

parecenmostrarque ello se debea un aumentode IGFBP-2, propiciado, sin duda,

porel cuadrometabólicocaracterísticode los animalesMMI. La IGFBP-1 no parece

regularseen los animalesneonatalesde forma inversa a la insulina comoocurre en

adultos. La IGFBP-3 disminuyeen ambaspoblacioneshipotiroideasneonatalesy,

como la IGFBP-2, parecesugerirseuna regulacióntranscripcional.

220

5. Por último, los estudios realizadosbloqueandola secreciónde insulina con

estreptozotocina(SIZ), en los animalesneonatalestiroidectomizados,ratifican la

correlaciónpositiva encontradaentrevalorescirculantesde insulina y de IGF-I, así

comomuestranqueel IGF-II aumentacon la hiperglucemia,y enambos,se sugiere

una regulacióntranscripcional.En cuantoa las proteínasligadoras,la IGFBP-3 no

varíaen plasma,y prácticamentetampocola expresiónde su ARNm. En estecaso

de clara diabetes,la IGFBP-1 aumentaal disminuir la insulina, y la IGFBP-2vuelve

a mostraruna sutil regulaciónsegúnel cuadrometabólicodel animal.

Destetadosy adultos

6. Estosanimalestiroidectomizadosdestetadosy adultosmuestranunadisminución

de IGF-I debidaa la falta de hormonastiroideas,y cuyacausapareceser la hormona

de crecimientodisminuida. La regulaciónparecehacersea nivel transcripcional.

7. El análisisde correlaciónlineal muestraunacorrelaciónalta entrenivelesde Gil

y de IGF-1, y bajacon la insulina.

8. En los animalestiroidectomizados,destetadosy adultos,disminuyeel complejode

3OkDa (IGFBP-l y -2), y tambiénlaproteínaligadoraIGFBP-3. Las dosisde insulina

administradasa los hipotiroideosadultosno alteran los nivelesde IGEs ni de las

proteínasligadoras.

9. Se concluyeque el mediadorde las accionesde las hormonastiroideassobreel

axis IGFs/IGFBPsen periodoneonatalpareceser la insulina, pasandoa ser la Gil

en periodoadulto.

Rehabilitación

.

LO. Los experimentosde rehabilitacióncon tiroxina, en periodoneonatalo enperiodo

adulto, muestranque la vía idóneade rehabilitaciónesel pellet,y no la inyecciónde

tiroxina.

Li. Los animalesneonatalestratadoscon 1.SggIlOOgde pesode 14 durante5 días

no consiguenrehabilitarsus valorescirculantesde IGF-I ni los de IGF-II. Tampoco

consiguenrebajara los valorescontrol su insulinaalta ni su GH plasmática,asícomo

221

wh&ones

la glucemiadisminuida;todo ello porquetampocorehabilitan,con la dosisutilizada,

los nivelesde las hormonastiroideas.

12. Las proteínastransportadorasde 3OkDa y de 45kDa se rehabilitanen la etapa

neonatalcon las dosisde T4 empleada.

13. Los animalesdestetadosy adultostiroidectomizadostratadoscon 1 .75~g/10Ogde

pesode tiroxina durante5 días rehabilitantodoslos parámetrosdelaxis IGFs/IGFBPs

estudiados.

14. El análisisde correlaciónlineal entreinsulinay nivelesde IGF-I enneonatos,así

como entrenivelesde GH e IGF-I en adultos,muestrauna correlaciónpositiva alta

en estosanimalesrehabilitados.Dicha correlaciónes mayoren los animalestratados

conpelletsen todaslas poblacionesy másclara en animalesadultos.

Diabetes

.

15. Los animalesneonatalesdiabéticosporSTZ tratadoscon tiroxina rehabilitanlos

valorescirculantesde IGF-I y la expresiónde su ARNm hepáticode IGF-I y II, así

como susproteínasligadoras,con aumentode GH y no de insulina. Sin embargo,los

animalesdiabéticosadultostratadoscon T4 no rehabilitan,con la dosisadministrada,

los parámetrosde IGFs, ya que no aumentantampoco la Gil ni las hormonas

tiroideashastalos nivelescontrol.

Transportadoresde 21uc0sa

.

16. Las alteracionesencontradasendiversostejidosde los transportadoresde glucosa

en animalesneonataleshipotiroideos, muestranque no pareceexistir correlación

directa entre las variacionesde IGFs y de GLUTs, sino que ambas alteraciones

parecendependientesde los nivelesde insulina, a su vez alteradospor el déficit de

hormonastiroideas-

En resumen,esteestudio realizadoen animalestiroidectomizados,desdela

etapaneonatala la adulta de la rata, muestraque la influencia de las hormonas

tirodeassobreel axis IGFs/IGFBPsvaría segúnla edaddel animal queseconsidere,

siendo el mediadorde dichaacción la insulina en periodosneonatales,y pasandoa

222

Conch&ones

ser la GH la hormonamediadoraenperiodoadulto. El estudiode las variacionesde

las proteínastransportadorasenestosanimalestiroidectomizadosponede manifiesto

la importanciadel estadometabólicoensuregulación,sobretodo, paralas proteínas

ligadorasde bajopesomolecularabundantesen etapaneonatal.La IGFBP-3 parece

mostrar una regulaciónmediadapor la hormonade crecimiento, sobre todo en

periodo adulto. Los estudios con animales hipotiroideos, neonatalesy adultos,

rehabilitadoscontiroxinaratificaronlos resultadosanteriores,no obstante,en periodo

neonatalestosestudios,junto con los realizadosdandotiroxina a animalesdiabéticos

neonatales,muestranque las hormonastiroideasen situacioneslímites de falta de

insulina tambiénactuanrehabilitandolos nivelesde IGF-I a travésde su acciónsobre

la hormonade crecimiento.Estos datos,y los obtenidossobrela regulaciónde los

transportadoresde glucosa,ponende relieve que las hormonastiroideassonfactores

endocrinosdecisivosen la regulacióndel desarrollo, no sólo por sus conocidas

accionesespecificassobre el Sistema Nervioso Central, sino porque producen

desequilibriosenvertientemetabólica,alterandootras hormonascomo la insulina y

laGil, quea su vezprovocanvariacionesen la secreciónde factoresde crecimiento,

IGFs, totalmenteimplicadoscomo reguladoresde] crecimientoen los mamíferos.

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