Integrones y sus Clases en Patotipos de Escherichia coli y ...
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1 Integrones y sus Clases en Patotipos de Escherichia coli y E. coli Comensal Multiresistentes a Antibacterianos Aislados de una Población Pediátrica de Bucaramanga y su Área Metropolitana Castro Niño Karenn Julieth y Garzón del Valle Celeste Universidad de Santander Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico Bucaramanga 2021
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Integrones y sus Clases en Patotipos de Escherichia coli y E. coli Comensal
Multiresistentes a Antibacterianos Aislados de una Población Pediátrica de
Bucaramanga y su Área Metropolitana
Castro Niño Karenn Julieth y Garzón del Valle Celeste
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico
Bucaramanga
2021
2
Integrones y sus Clases en Patotipos de Escherichia coli y E. coli Comensal
Multiresistentes a Antibacterianos Aislados de una Población Pediátrica de
Bucaramanga y su Área Metropolitana
Castro Niño Karenn Julieth y Garzón del Valle Celeste
Trabajo de Grado para Optar por el Título de Bacteriólogas y Laboratoristas
Clínicas
Directora
Trejos Suárez Juanita
MSc. Ciencias Biomédicas
Codirectora
Farfán García Ana Elvira
MSc. Ciencias Básicas Biomédicas
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico
Bucaramanga
2021
3
4
5
Dedicatoria
A DIOS, nuestras familias, padres y hermanos.
6
Agradecimientos
Le damos gracias a Dios quien ha sido parte fundamental en toda nuestra carrera,
brindándonos sabiduría, entendimiento logrando así un aprendizaje óptimo para el
desarrollo de este proyecto.
A nuestras familias, en especial a nuestros padres siendo el pilar primordial en apoyo
para llevar a cabo nuestra culminación de la carrera con éxito.
A nuestros hermanos, por estar de manera incondicional brindándonos motivación,
amor y dedicación moral contribuyendo a alcanzar este gran logro en nuestras vidas.
A nuestra tutora, la profesora Juanita Trejos Suárez, por su paciencia, dedicación, y
entrega, por regalarnos su conocimiento para así poder llevar a cabo la culminación de
nuestro Proyecto de grado.
A la Universidad de Santander y al Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico,
por permitir las herramientas necesarias para el desarrollo de este proyecto.
7
Tabla de Contenido
pág.
Introducción ................................................................................................................... 18
1. Planteamiento del Problema ........................................................................ 21
2. Justificación .................................................................................................. 24
3. Objetivos ...................................................................................................... 26
3.1 Objetivo General .......................................................................................... 26
3.2 Objetivos Específicos ................................................................................... 26
4. Marco Referencial ........................................................................................ 27
4.1 Estado del Arte ............................................................................................. 27
4.2 Marco Teórico .............................................................................................. 38
4.2.1 Enfermedad Diarreica Aguda (EDA).. .......................................................... 38
4.2.1.1 Epidemiología. .............................................................................................. 38
4.2.1.2 Patología. ..................................................................................................... 41
4.2.1.3 Factores Asociados.. .................................................................................... 42
4.2.1.4 Signos y Síntomas.. ..................................................................................... 43
4.2.1.5 Tipos de Diarrea.. ......................................................................................... 44
4.2.1.6 Agentes Causales.. ...................................................................................... 45
4.2.1.7 Diagnóstico de la EDA.. ............................................................................... 46
4.2.1.8 Diagnóstico del Laboratorio. ......................................................................... 47
4.2.1.9 Tratamiento. ................................................................................................. 50
4.2.1.10 Escherichia coli.. .......................................................................................... 51
4.2.1.11 Patotipos de Escherichia coli ........................................................................ 52
8
4.2.2 Integrones.. .................................................................................................. 55
4.2.2.1 Integrasas.. ................................................................................................... 57
4.2.2.2 Sitios attI.. ..................................................................................................... 57
4.2.2.3 Genes Cassette. . ......................................................................................... 58
4.2.2.4 Clasificación de los Integrones. .................................................................... 59
5. Metodología .................................................................................................. 63
5.1 Diseño de Estudio ........................................................................................ 63
5.2 Área de Estudio ............................................................................................ 63
5.3 Universo ....................................................................................................... 63
5.4 Población ...................................................................................................... 63
5.5 Muestra ........................................................................................................ 64
5.6 Extracción de ADN ....................................................................................... 65
5.7 Identificación Molecular de los Genes .......................................................... 66
5.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR. . .......................................... 66
5.7.2 Determinación de las clases de Integrón...................................................... 67
5.8 Aspectos Éticos ............................................................................................ 67
6. Resultados ................................................................................................... 70
6.1 Identificación de los Integrones Clase 1, 2 y 3. ............................................ 70
6.1.1 Identificación Molecular de los Genes de Integrones.. ................................. 70
6.1.2 Clases de Integrones.. ................................................................................. 70
6.2 Presencia de los Genes de Integrones Según los Fenotipos de Resistencia
Bacteriana ..................................................................................................................... 71
6.2.1 Fenotipos de Resistencia Bacteriana en las Cepas de Estudio.. ................. 71
9
7. Discusión ...................................................................................................... 73
8. Conclusiones ................................................................................................ 75
9. Recomendación ........................................................................................... 76
Referencias Bibliográficas ............................................................................................. 77
10
Lista de Tablas
pág.
Tabla 1 Resistencia Antimicrobiana Asociada a los Integrones .................................... 28
Tabla 2 Número de Casos de Muerte por EDA Acumulados a la Semana 52 del 2015 a
Semana 5 de 2021 ........................................................................................................ 40
Tabla 3 Factores que Predisponen a una EDA ............................................................. 42
Tabla 4 Estimación del Grado de Deshidratación ......................................................... 43
Tabla 5 Tipos de Agentes Causales de Diarrea Infecciosa ........................................... 46
Tabla 6 Patrones de Sensibilidad Intermedia y Resistencia en las Cepas de Estudio .. 65
Tabla 7 Secuencia de Oligonucleótidos Utilizados en el Estudio .................................. 66
Tabla 8 Condiciones de Termociclador para la PCR ..................................................... 66
Tabla 9 Resultados de Fragmentos Generados con la RFLP ....................................... 67
Tabla 10 Patotipos de E. coli, E. coli Comensal y los Genes de Integrones Estudiados ...
.................................................................................................................. 71
Tabla 11 Fenotipos de Resistencia Bacteriana en las Cepas de Estudio ..................... 71
Tabla 12 Presencia de los Genes de Integrones con los Genes de Resistencia
Reportados en las Muestras de Estudio ........................................................................ 72
11
Lista de Figuras
pág.
Figura 1 Casos Notificados de EDA en Colombia 2017 – 2021 .............................. 39
Figura 2 Proporción de Incidencia y Morbilidad por EDA, por Grupos de Edad ...... 40
Figura 3 Morbilidad por EDA en Presencia de COVID 19 en el año 2020 a 2021 ... 41
Figura 4 Diagrama para el Diagnóstico de EDA ...................................................... 47
Figura 5 Estructura Morfológica de E. coli ............................................................... 52
Figura 6 Adherencia y Fisiopatología de los Diferentes Patotipos de E. coli ........... 55
Figura 7 Conformación Genética del Transposon Tn21. ......................................... 56
Figura 8 Sitio attI ...................................................................................................... 58
Figura 9 Estructura Básica de los Integrones .......................................................... 59
Figura 10 Estructura de Integrón de Clase 1 ............................................................. 60
Figura 11 Estructura del Integrón de Clase 2 ............................................................ 61
Figura 12 Estructura del Integrón de Clase 3 ............................................................ 61
Figura 13 Amplificación del Gen del Integrón ............................................................ 70
Figura 14 Resultado de la RFLP – PCR para la Clasificación de los Integrones ....... 70
12
Glosario
Antibacterianos: (Sin. Antibiótico) Sustancia que impide la progresión de
la reproducción y crecimiento de los microorganismos (1).
Comensal: Organismos que se encuentran en un mismo hospedero sin
causarle daño alguno (2).
Deshidratación: Déficit de líquidos que provoca desecación y alteración
en el funcionamiento del cuerpo (3).
Diarrea: Deposiciones de heces persistentes, líquida y acuosa en
diferentes horas o días (4).
Escherichia coli: Bacteria, bacilos Gramnegativo anaerobio facultativo
ubicado en el tracto gastrointestinal de los animales y humanos, con diferentes
patotipos productores de enfermedades y diarreas (5).
Genes de cassette: ADN circulante que se insertan en el sitio de unión
attC para conferir mecanismo de resistencia (6).
Integrones: Elementos genéticos que reconocen genes de resistencia
para insertarlos en sus sitios de recombinación para formar genes de cassete (7).
Mecanismos de resistencia: Estrategias de los microorganismos para
modificarse y diseñar genes que los ayuden a no ser destruidos por los antibióticos (8).
Patotipos: Mismo género con diferentes especies que son capaces de
expresar diferentes mecanismos de patogenicidad (9).
Transferencia genética horizontal: Es la capacidad de un microorganismo
para transferirle su material genético a otro microorganismo y esta confiera sus mismos
mecanismos de resistencia (10).
13
Transposón: Elementos de trasferencia de ADN que pueden insertarse en
sitios específicos del genoma (11).
14
Resumen
Título
Integrones y sus clases de Patotipos de Escherichia coli y E. coli Comensal
Multirresistentes a Antibacterianos Aislados de una Población Pediátrica de
Bucaramanga y su Área Metropolitana.
Autor (es)
Castro Niño Karen Julieth y Garzón Del Valle Celeste.
Palabras claves
Integrones, Escherichia coli, mecanismos de resistencia, diarrea.
Descripción
La resistencia antimicrobiana es un problema de salud pública a nivel mundial, las
bacterias tienen mecanismos de resistencia adquiridos que llevan a la aparición de
multirresistencia, uno de ellos es la presencia de los Integrones. Con base en lo
anterior, como objetivo se tuvo evaluar la presencia de Integrones de clase 1, 2 y 3 en
patotipos de Escherichia coli y Escherichia coli comensal multirresistente a
antibacterianos, aislados en una población pediátrica de Bucaramanga y su área
metropolitana. Se desarrolló bajo un estudio descriptivo experimental, realizando la
identificación de integrones de clase 1, 2 y 3 en 168 cepas de Escherichia coli y E. coli
comensal en pacientes pediátricos en Bucaramanga y su Área metropolitana con PCR
de punto final para la identificación de los genes intI 1, intI 2 e intI 3.
La amplificación de los genes se observó por electroforesis en gel de agarosa al 1.5%.
Finalmente, se identificó la presencia del gen intl 1 en un 41% de 168 cepas de estudio,
encontrándose frecuentemente en los diferentes patotipos de E. coli y E. coli comensal
15
ECEP (9%), ECET (1%), ECEI (1%), ECST 1%), ECEA (2%) y comensal (50%), de las
cuales presentaron mayor resistencia a antibióticos como Amoxicilina, Ampicilina,
Doxiciclina, Trimetropim/sulfametoxazol, asociados a genes blaTEM, blaSHV-2,
blaIMP-1,blaIRC-1,BLAspm-1,blaVim-2, gyrA,gyrB,parC,aaa(6’)Ib,qnrB y qnrS
expresado en la literatura. Se logró determinar la presencia de integrones de clase 1,
en los aislamientos de muestras pediátricas con un 41%, sin presencia de integrones
de clase 2 y 3.
Se pudo observar que de los diferentes patotipos de E. coli, la E.coli comensal
evidenció mayor cantidad fenotípica de resistencia demostrando así la transferencia
horizontal de genes que existe entre las cepas.
16
Abstract
Title
Integrones and Their Classes of Escherichia coli and Multiresistant Antibacterial
Pathotypes of Commensal E. coli Isolated From a Pediatric Population of Bucaramanga
and its Metropolitan Area.
Authors
Castro Niño Karen Julieth & Garzón del Valle Celeste.
Keywords
Integrons, Escherichia coli, resistance mechanisms, diarrhea.
Description
Antimicrobial resistance is a public health problem worldwide; bacteria have acquired
resistance mechanisms that lead to the appearance of multiresistance, one of them
being the presence of Integrons. To evaluate the presence of Integrons of classes 1, 2,
and 3 in Escherichia coli pathotypes and multiresistant commensal Escherichia coli
against antibacterials, isolated in a pediatric population of Bucaramanga and its
metropolitan area. Descriptive experimental study, the identification of class 1, 2, and 3
integrons was carried out in 168 Escherichia coli strains and commensal E. coli in
pediatric patients in Bucaramanga and its metropolitan area with end-point PCR for
gene identification. intI 1, intI 2 and intI 3.
Gene amplification was observed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The presence of
the intl 1 gene was identified in 41% of the 168 study strains, frequently found in the
different pathotypes of E. coli and commensal E. coli ECEP (9%), ECET (1%), ECEI (1
%), ECST 1%), ECEA (2%) and commensal (50%), of which showed greater resistance
17
to antibiotics such as Amoxicillin, Ampicillin, Doxycycline, Trimethoprim /
sulfamethoxazole, associated with genes blaTEM, blaSHV-2, blaIMP- 1, blaIRC-1,
BLAspm-1, blaVim-2, gyrA, gyrB, parC, aaa (6 ') Ib, qnrB and qnrS expressed in the
literature. The presence of class 1 integrons was determined in pediatric sample
isolates with 41%, without the presence of class 2 and 3 integrons.
It was observed that of the different pathotypes of E. coli, the commensal E. coli showed
a greater phenotypic amount of resistance, thus demonstrating the horizontal gene
transfer that exists between strains.
18
Introducción
Los Integrones son elementos genéticos que poseen genes de resistencia
antimicrobiana, los cuales están localizados en los cromosomas, plásmidos o
transposones, estos confieren a las bacterias la capacidad de almacenar y expresarse,
atribuyéndole al microorganismo mayor resistencia y por ende mayor patogenicidad.
“Los Integrones son una familia de elementos genéticos potencialmente móviles,
capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los antibióticos”(12,13).
Sin embargo, el concepto de resistencia se originó por estudios relacionadas con
plásmidos y el Transposón Tn21, por medio de la Integrasa que reconoce secuencias
específicas en los genes de resistencia o genes de cassette para así unirse al sitio de
recombinación attI del Integrón, gracias a esto se ha clasificado en Integrones de clase
1 (intI 1), 2 (intI 2) y 3 (intI 3) siendo el Integrón de clase 1 el más frecuentes en
bacterias Grampositivas y Gramnegativas, así mismos en las familias
Enterobacteriaceae y Vibrionaceae(12).
Por medio de estos mecanismos se encontró la capacidad de evadir la acción
antimicrobiana con una alta tasa de mutaciones y transferencia de material genético, el
cual, infieren en la evolución negativa del tratamiento antimicrobiano y por ende en la
evolución de la enfermedad (14).
En la actualidad, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la resistencia
antimicrobiana se ha denominado como un problema de salud pública a nivel mundial,
puesto que se encuentra una alta propagación de patógenos que adquieren nuevos
mecanismos de resistencia como una de las principales amenazas en la salud de la
población, por lo tanto, se convierte en un desafío para el personal médico en el
19
tratamiento de las infecciones comunes, incrementando costos en el sistema de salud,
y costos económicos en la estancias hospitalarias prolongadas(14).
La resistencia antimicrobiana genera gran impacto, el cual se puede observar con los
datos más recientemente encontrados en Colombia; al revisar el Sistema Nacional de
Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA), en el periodo 2012 al 2020 se observa un alto
porcentaje de resistencia en microorganismos Gramnegativos con un total de 2.530
aislamientos, de los cuales resaltan la resistencia atribuida a Colistina y
Carbapenémicos en Escherichia coli (44%), Salmonella spp. (6%) y Klebsiella
pneumoniae (2%)(15). Así mismo, en Santander se registró una mayor resistencia
antimicrobiana hasta el año 2020 en microorganismos Enterobacterales, frente a
antibióticos de la familia Oxazolidinonas (Linezolid) con un 24% y Colistina con un
22%(15).
En Bucaramanga-Santander se ha evidenciado muy pocos estudios publicados en los
últimos 5 años, relacionados con la resistencia antimicrobiana, sin embargo, se
encontraron dos; en el año 2016, se analizaron 120 muestras de E. coli uropatógenas
donde se obtuvo como resultados la presencia del gen blaTEM con un 52,8% siendo
este el principal productor de mecanismos de resistencia por medio de enzimas β-
lactamasas (16). Seguido a esto, en el año 2020, se encontró que el microorganismo
más frecuentemente aislado en infecciones de vías urinarias fue E. coli (83%), seguido
por especies de Klebsiella spp, las cuales presentan alta resistencia a betalactámicos y
resistencia intermedia a Cefalosporinas(17).
Se considera que la población más afectada por la multirresistencia de los
microorganismos es aquella que se encuentra en los extremos de la vida, siendo la
20
pediátrica una de las menos estudiadas, pero de mayor riesgo a causa de la inmadurez
de su sistema inmune, lo que conlleva a que sean más propensos a infecciones
difíciles de tratar. No obstante, un problema de este tipo, indica la importancia de
realizar estudios de investigación en la ciudad Bucaramanga y en su área
metropolitana para así determinar los patotipos de E. coli y E. coli comensales como
reservorios de genes intI 1, intI 2 e intl 3 mediados por Integrones que son
responsables de la expresión, reconocimiento y captura para generar la
multirresistencia en este tipo de microorganismos.
Para la identificación de estos genes se realizó inicialmente un aislamiento del
microorganismo, seguido de un perfil de resistencia a antibióticos, Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR), una técnica de Polimorfismo de Longitud de Fragmento de
Restricción (RFLP) y finalmente la visualización mediante Electroforesis para la
determinación de la presencia o no de los Integrones en estas cepas multirresistentes
aisladas de una población pediátrica de Bucaramanga y su área metropolitana.
Se ha estructurado este documento para identificar el problema de estudio, el estado
del arte que lo ha antecedido junto al marco teórico, la metodología, resultados,
discusión y conclusión, esperando con ello que el lector reconozca la importancia
epidemiológica y de salud pública que tiene este tema para la región.
21
1. Planteamiento del Problema
Se ha demostrado que la transferencia de genes de multirresistencia es favorecida
gracias a su distribución entre bacterias de la misma y diferente especie, proceso en el
que se encuentran implicados los Integrones; estos se encuentran en bacterias
Gramnegativas y Grampositivas, en los cuales se encuentra mayor prevalencia en
microorganismos como E. coli, K. pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pneumoniae y Salmonella spp (18).
La resistencia antimicrobiana es causada por múltiples factores, entre ellos y uno de los
más analizados, es el hecho que los antibióticos se adquieren en muchos países sin
prescripción médica causando su consumo excesivo y generando una presión positiva
sobre la microbiota normal del ser humano(19). Dada la necesidad de buscar una
solución a este problema, la Organización Mundial de la Salud (OMS) aprobó en mayo
de 2015, un plan sobre la resistencia antimicrobiana, llamado Sistema Mundial de
Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos (GLASS, por sus siglas en inglés),
dentro de sus resultados a la fecha logró evidenciar que en muestras de 500.000
personas de 22 países en las que se sospechaban infecciones bacterianas, había
presencia generalizada de resistencia a los antibióticos (19).
No obstante, se encontró una alta prevalencia por parte de los Integrones causando
multirresistencia antimicrobiana en poblaciones vulnerables, por lo que se describió a la
resistencia bacteriana como un problema de salud pública y a la presencia de
Integrones como una de sus causas, situación que provoca numerosas muertes
anuales, con datos que afectan la población pediátrica, pues alrededor de 11 millones
de niños (de los cuales más del 90% se producen en países en vía en desarrollo)(19).
22
Es por esto, que el Ministerio de Salud y Protección Social de Colombia, ha establecido
reglamentos para regular la fabricación y la venta de antimicrobianos, así como de
otros medicamentos para uso humano, no obstante, a pesar de la prohibición de la
adquisición de estos productos sin una fórmula médica, estos aún pueden ser
comprados en el país sin presentar la prescripción médica. Así lo demostró un estudio
realizado en Bogotá, en donde se encontró que en el 80% de las farmacias es posible
adquirir antibióticos sin un documento que avale su dispensación y un 44% de
personas de la población analizada compran antibióticos sin fórmula médica (20).
Por otra parte, en un estudio realizado en el estado plurinacional de Bolivia, en la
ciudad de La Paz, sobre la resistencia antimicrobiana asociada a Integrones en E. coli
enteropatógena causantes de diarrea infantil y E. coli comensal en niños menores de 5
años, se encontraron un total de 138 aislados bacterianos, de los cuales 100 provenían
de una colección de cepas de Enterobacterias patógenas y se detectó la presencia de
Integrones de clases 1, 2 y 3, siendo el Integrón de clase 2 el de mayor frecuencia
(62%), en comparación con los Integrones de clase 1 que tuvieron un 37% y los de
clase 3, un 5%, demostrándose además, que estos tres generaban resistencia para
Tetraciclina, Trimetroprim/sulfametoxazol, Ampicilina, Sulbactam y Gentamicina(21).
De la misma manera, en la ciudad de Bucaramanga- Santander se han realizado
estudios epidemiológicos que analizan la prevalencia de E. coli en muestras
provenientes de menores de edad, en algunos de ellos se ha identificado en un 9,5%
en niños menores de 5 años, en estos mismos se encontró que los patotipos
diarreagénicos de E. coli son frecuentes en niños con diarrea y sin diarrea, reportando
E. coli enteroinvasiva emergente con fenotipos de adherencia celular y formación de
23
biopelículas, además, en estas cepas se observaron antibióticos de resistencia
causados posiblemente por múltiples genes asociados con esta problemática (datos sin
publicar de nuestro grupo de investigación) (22).
Por lo anteriormente planteado, se considera que la población más afectada por la
multirresistencia de los microorganismos es la pediátrica a causa de la inmadurez de su
sistema inmune, siendo de esta manera más propensos a infecciones y que en estas
condiciones son más difíciles de tratar(18,20).
Sin embargo, un problema de este tipo, indica la importancia de realizar estudios de
investigación en la ciudad y en su área metropolitana para así determinar las posibles
causas genéticas de resistencia encontrados en E. coli (patotipos y comensales) como
reservorios de genes causantes de la multirresistencia mediados por Integrones.
Por lo cual, se pretende responder ¿Qué clase de Integrón se encuentra con más
prevalencia en las cepas de E. coli analizadas? ¿Cuál patotipo de E. coli presente en el
estudio, tiene mayor multirresistencia antimicrobiana asociada a los genes intI 1, intI 2 e
intl 3? Y, por último, ¿Qué relación presentan estos Integrones con la multirresistencia
observada en estas cepas, de acuerdo con lo que ya se ha registrado en la literatura
científica a nivel mundial?
24
2. Justificación
En los últimos años, ha habido un interés creciente en el uso inadecuado y excesivo de
antibióticos por la población, razones que, junto a otras, podrían explicar la resistencia
de las bacterias a los antimicrobianos que se encuentran en el mercado, lo cual
conlleva a la difícil erradicación de las infecciones bacterianas, por lo que se considera
como uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial (19).
Los Integrones resultan de vital importancia en cuanto al papel que les confieren a las
bacterias, integrando genes de resistencia e incorporándose en sus sitios de unión, lo
que impacta en el fenómeno de la multirresistencia a los antibióticos y permite así, que
las infecciones causadas por estas bacterias sean cada vez más difíciles de tratar (23).
Según la OMS, se destacó la significativa resistencia de E. coli a las cefalosporinas de
tercera generación y a las fluoroquinolonas, dos clases importantes y muy utilizadas de
fármacos antibacterianos. Si bien E. coli hace parte de la microbiota intestinal humana,
existen cepas patógenas que pueden causar infecciones gastrointestinales y
extraintestinales, y junto a la aparición y propagación de betalactamasas de espectro
extendido (BLEE), y a el aumento de múltiples cepas resistentes a los medicamentos,
por otros mecanismos que bloquean su tratamiento, conlleva a clasificar a este
microorganismo dentro de la lista de patógenos de prioridad crítica para luchar contra
este fenómeno (24).
Esta bacteria ha sido clasificada en múltiples patotipos, uno de ellos es E. coli
enteropatógena (EPEC), la cual es un causante importante de diarrea en niños en
países en vía de desarrollo, la diseminación de Integrones entre estas cepas podría
amenazar la utilidad del tratamiento con antibióticos en casos de diarreas persistentes
25
o graves. Según un estudio realizado por Farzad, se mostró que la prevalencia de los
Integrones de clase 1 es de 31,4% entre las cepas de EPEC aisladas de niños con o
sin diarrea en hospitales de Tehran, Irán. En todos los aislamientos de EPEC que
contenían Integrón de clase 1, se identificaron los genes qacEr1 y sul1. Estos genes
determinaron la resistencia a los antisépticos, desinfectantes y sulfonamidas,
respectivamente (25).
Es entonces que resulta pertinente investigar sobre las clases de Integrones que
intervienen en la incorporación de genes de resistencia en E. coli comensal y sus
demás patotipos. De este modo se pueden abordar y reconocer los genes que
intervienen en la resistencia de la misma, ayudando así a adoptar medidas que
permitan mejorar el tratamiento de infecciones causadas por este microorganismo (26).
Este estudio está enfocado en la población pediátrica, en la cual se evaluaron
Integrones de clase 1, 2 y 3 en diferentes patotipos de E. coli y E. coli comensal
multirresistentes a antimicrobianos. La identificación de los Integrones de clase 1, 2 y 3
fue evaluado mediante RFLP – PCR con enzimas de restricción (RsaI – HinfI),
permitiendo aplicar una metodología altamente comprobada en múltiples estudios a
nivel mundial, lo que permitirá beneficiar a la población pediátrica mostrando otra
perspectiva en cuanto a la forma en cómo estos microorganismos adquieren resistencia
a los antibióticos, dado que serían los primeros datos de este tipo de aislados con la
presencia de los Integrones de tipo 1, 2 y 3 involucrados en la resistencia de E. coli y
sus patotipos en Santander y cederá información epidemiológica a proyectos
posteriores acerca de los Integrones y la resistencia antimicrobiana en la población ya
mencionada.
26
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Evaluar la presencia de Integrones de clase 1, 2 y 3 en patotipos de Escherichia coli y
Escherichia coli comensal multirresistente a antibacterianos, aislados en una población
pediátrica de Bucaramanga y su área metropolitana.
3.2 Objetivos Específicos
Identificar la presencia de los Integrones de clase 1, 2 y 3 mediante
técnicas moleculares en las cepas de estudio.
Describir la presencia de los genes intI 1, intI 2 e intI 3 relacionados según
la literatura con los fenotipos de resistencia bacteriana en las cepas de Escherichia coli
estudiadas.
Comparar la presencia de los genes intI 1, intI 2 e intI 3 con los genes de
resistencia encontrados en cepas de Escherichia coli estudiadas.
27
4. Marco Referencial
4.1 Estado del Arte
A lo largo del tiempo el concepto de Integrones se ha venido actualizando y a su vez se
ha mejorado la identificación del mismo; gran parte porque los diferentes países han
aportado cambios de perspectiva desde el laboratorio para su identificación, utilizando
muestras de agua, alimentos, animales hasta llegar al humano (27).
En la actualidad debido al impacto generado por la COVID-19, la población incrementó
el consumo de antibióticos y el uso inadecuado de biocidas, lo cual facilita el desarrollo
de bacterias multirresistentes, debido a esto, el Plan Nacional frente a la Resistencia a
los Antibióticos (PNRA) sugirió que los casos de pacientes con COVID-19 eviten la
utilización generalizada de antibióticos, para prevenir que en un futuro se genere
eficacia ineficiente del tratamiento para otras patologías que requieran de
antibióticos(28).
Sin embargo, se ha demostrado que la utilización de biocidas masificado en la
Pandemia, puede permitir que los microorganismos generen mecanismos de
resistencia como bombas de flujo, proteínas transportadoras pertenecientes a las
familias filogenéticas de tipo resistencia pequeña a multifármacos (SMR)
principalmente en bacterias Grampositivas y Gramnegativas (29). Por otro lado, se ha
identificado que la asociación de los Integrones con los plásmidos R contribuyen a la
disfunción horizontal de los genes cassette en este tipo de microorganismos, lo que
resulta importante para conocer el mecanismo de adquisición de genes
multirresistentes(30).
28
El análisis de la información científica sobre Integrones se realiza según la distribución
geográfica del tema y lo descrito en la última década, rango de tiempo donde se han
observado la mayor cantidad de avances en el tema. La búsqueda bibliográfica de
fuentes primarias en las bases de datos arrojó un total de 2403 artículos originales de
estudios que establecieron la relación entre los Integrones y la resistencia bacteriana
en la base de datos de SCOPUS y 1046 resultados en Pubmed, encontrándose
principalmente, asociación entre los Integrones, genes y antimicrobianos descritos a
continuación (tabla 1).
Tabla 1
Resistencia Antimicrobiana Asociada a los Integrones
Integrón Genes Antimicrobianos Referencia IntI 1 blaTEM, blaCTX-M, Cefalosporinas de
tercera generación, BLEE
(31,32) blaSHV-2, blaIBC-1
blaVIM Imipenem florR, tetR y tetA Cloranfenicol/Florfenicol
y Tetraciclina dfrA12, orfF, aadA2, blaCTX-M-15
Trimetoprim, Estreptomicina, Espectinomicina y Estreptotricina
(33)
aacA4, aac(6’)Ib Aminoglucósidos gyrA,gyrB, parC Fluorquinolonas (34) qnrB y qnrS Quinolonas (35)
IntI 2 dfrA1, sat2, aadA Trimetoprim, Estreptomicina, Espectinomicina y Estreptotricina
(35) IntI 3 blaIMP-1 Carbapenémicos
blaGES-1
Nota. Resistencia antimicrobiana asociada a los integrones según la literatura. 2021.
En India, Dureja et al. detectaron la presencia de genes que codifican Integrones, BLEE
y resistencia a otros antimicrobianos en aislamientos comensales de E. coli en adultos
sanos en Chandigarh. En la mayoría de los aislamientos se encontraron Integrones de
clase 1; en los cuales se identificó los genes de cassette que causan resistencia para
29
Trimetoprim, Estreptomicina, Espectinomicina y Estreptotricina. Los genes dfrA12, orfF
y aadA2 fueron los más comúnmente encontrados en aislamientos positivos para intI1,
así mismo se halló que E. coli productora de BLEE albergaba el gen blaCTX-M-15, lo que
indica la relevancia de la resistencia a antimicrobianos en cepas comensales de E. coli
(33).
En Irán, Hadizadeh et al., investigaron la importancia de los genes qnr, intI 1 e intI 2 en
E. coli productora de BLEE aislada de muestras clínicas, estos fueron analizados y se
evaluaron las relaciones entre los diferentes genes y la resistencia a los antibióticos.
Así mismo se identificó que la Ampicilina es el antibiótico con mayor tasa de
resistencia, y en gran parte de los aislamientos se observó genes intI 1, por lo que se
asoció la producción de BLEE y el gen de Integrón de clase 1 en aislamientos de E.
coli(35).
En este mismo país, Haghi et al., investigaron la frecuencia de aislamientos de E. coli
Enteroagregativa (EAEC) productora de betalactamasas afectando a niños pequeños
con diarrea, detectando a este patotipo en mayor frecuencia en estos pacientes, en
comparación a niños sin diarrea. Esta misma demostró resistencia de alto nivel al
Aztreonam, Amoxicilina y Tetraciclina. Además, los aislamientos de E. coli fueron
resistentes al menos a tres clases diferentes de agentes antimicrobianos referentes a
los fármacos. El blaTEM fue el gen que codifica para las betalactamasas amplificado más
frecuentemente, adicionalmente, se detectó que los aislamientos de EAEC que
producen BLEE tenían alta frecuencia del gen blaCTX-M (34).
En Indonesia, Sarassari et al., evaluaron el riesgo potencial de contagio de
Enterobacteriaceae productoras de BLEE mediante la caracterización de las
30
propiedades genotípicas de cepas de E. coli tipo BLEE productoras de CTX- M, en
donde se aislaron 82 enterobacterias productoras de BLEE, incluidas 75 E. coli y 7 K.
pneumoniae de 79 estudiantes (56,0%). En las 75 E. coli productoras de BLEE, blaCTX-
M-15 fue el gen más prevalente (44,0%). Aunque los resultados de XbaI-PFGE
mostraron antecedentes genéticos de los aislados de E. coli que producen CTX-M tipo
BLEE, estos fueron diversos, se observaron cinco casos de diseminación clonal de
ciertos aislamientos de BLEE de tipo CTX-M de E. coli entre los estudiantes de
medicina. Por lo que se concluyó que las enterobacterias productoras de BLEE podrían
estar circulando entre los estudiantes de medicina a través de un ambiente
contaminado, como en una universidad o comunidades a las que pertenecían(36).
En Corea, Kwang et al., investigaron la prevalencia y las características de E. coli
resistentes a Cefalosporinas de tercera generación productora de BLEE aisladas de
una población parental de pollos de engorde. Entre 51 aislamientos de E. coli
resistentes a Cefotaxima, 45 se identificaron como multirresistentes (88,2%) y 21
aislados mostraron características fenotípicas y genotípicas de E. coli productora de
CTX-M; en los cuales se detectaron los genes blaCTX-M-14 (10 aislados), blaCTX-M-15 (7
especímenes), blaCTX-M-1 (3 cepas) y blaCTX-M-65 (1 aislado). Adicionalmente, se
estudiaron 13 secuencias de ADN de los genes tipo CTX-M, en todas se observó la
presencia en la región 5´ de los genes ISEcp1 o IS26 + ISEcp1 y en la región 3´ se
identificaron, en la secuencia 9 el gen orf477 y en la secuencia 10 la secuencia IS903.
Otro resultado que resaltó fue la presencia de Integrones de clase 1 en 13 de los 21
aislamientos, con 4 diferentes genes cassettes dfrA1 (n = 4), aadA1 (n = 2), dfrA17 (n =
31
2), y aadA1+dfrA1 (n = 2), además de la presencia del gen blaCTX-M-1 en un plásmido
tipo replicón(37).
En Uganda, Weiss et al., realizaron un estudio, referente a E. coli e Integrones de clase
1 analizando 1.685 aislamientos de personas, animales domésticos y primates
salvajes. La frecuencia de resistencia en los aislamientos de personas fue de 57,4%,
animales domésticos 19,5% y primates salvajes 16,3%, de los cuales los aislamientos
de ganado y primates mostraron patrones de resistencia a múltiples fármacos idénticos
a los de los aislados de origen humano. De las muestras analizadas 499 aislados
(29,6%) fueron resistentes a 11 antibióticos. En ellos se halló con mayor frecuencia
resistencia a Trimetoprim-Sulfametoxazol con un 20,3% y con menor frecuencia para
los antibióticos Ciprofloxacina (0,4%), Gentamicina (0,2%) y Ceftiofur (0,1%). Entre los
aislamientos fenotípicos de resistencia se encontraron Integrones de clase 1 con un
33,2% que contenían 11 genes de resistencia ubicados en 9 genes cassettes distintos,
5 de los cuales se encontraban en los diferentes aislamientos analizados. Por lo que se
concluye que la resistencia fenotípica y los Integrones de clase 1 se distribuyen
ampliamente entre los aislados de E. coli de diferentes especies hospedadoras en esta
región, en donde las condiciones socioeconómicas y ecológicas locales pueden facilitar
la difusión de bacterias o elementos genéticos que confieren resistencia(38).
Un estudio realizado en Tanzania, por Manyahi et al., evaluaron los mecanismos de
resistencia en 123 aislamientos de microorganismos Gramnegativos resistentes a
Cotrimoxazol, 69 especímenes de muestras sanguíneas y 54 obtenidos de orinas, en
donde se identificaron genes sul en el 98% (121/123) de los aislamientos. De los cuales
en K. pneumoniae se encontraron genes como sul1, dfrA15 y dfrA5, mientras que en E.
32
coli se aislaron genes como sul2 y dfrA1, asociando con mayor frecuencia a Integrones
de clase 1 con genes cassettes dfrA5, dfrA1 y aadA1, seguido de Integrones de clase 2
con genes cassettes dfrA1, sat2 y aadA1. Al presentarse diversa expresión de genes
en estos microorganismos se demostró una alta expresión de mecanismos de
resistencia frente a Cotrimoxazol (39).
En Noruega, Marianne et al., analizaron 331 aislamientos de E. coli en muestras
humanas y en alimentos como la carne, identificando plásmidos con presencia de
Integrones de clase 1 asociados a genes cassettes como dfrA1-aadA1, aadA1, dfrA12-
orfF-aadA2, oxa-30-aadA1 e Integrones de clase 2 con los genes dfrA1-sat1-aadA1.
Siendo los Integrones de clase 1 más frecuentes aislados en humanos y en carnes. Sin
embargo la aparición de plásmidos de resistencia múltiple, similares en bacterias de
una fuente de alimento y de una muestra clínica humana destacó el posible papel de la
carne como el principal elemento de origen que transmita bacterias patógenas
resistentes (40).
En Francia, Jové et al., determinaron que los Integrones de clase 1 y 2 se encontraron
presentes en entornos clínicos y ambientales. Indicando que la estructura de regulación
de los promotores intI y Pc en Integrones de clase 1 y 2 desempeñan un papel
regulador en la respuesta SOS en la expresión del gen intI en Integrones de clase 1 en
comparación con los de clase 2, los cuales se caracterizan por su promotor PintI2, lo
que demuestra que la expresión del gen intI 2 no está regulada a través de la respuesta
SOS. Por lo anterior, al analizar la diferencia entre los Integrones de clase 1 sobre los
de clase 2, estos poseen no uno, sino dos promotores de Pc activos que se encuentran
dentro de la región attI2. Lo cual denota un modelo evolutivo para Integrones de clase 2
33
en ausencia de expresión del gen integrasa que conduce a mutaciones que resultan en
integrasa inactiva o variantes de Pc de actividad más débil, reduciendo así el impacto
que generan en la resistencia antimicrobiana sin la expresión de estos (41).
En Turquía, Kürekci et al., realizaron un estudio sobre la presencia de E. coli
productora de BLEE aislada de muestras de queso Sürk. Para llevarlo a cabo, se
aislaron 87 cepas de E. coli de muestras de queso. Identificando la presencia de
Integrones de clase 1 y 2, entre ellos se encontraron 9 aislamientos para los Integrones
de clase 1, y 2 aislamientos en Integrones de clase 2. Sin embargo, se halló la
presencia de genes sul1 en 2 aislamientos y sul1 + sul2 en otros dos aislamientos. El
estudio evidenció una alta tasa de E. coli que produce enzimas CTX-M-15, lo que
indica una fuente significativa en este tipo de alimentos para causar resistencia en
ciertos antibióticos como Tetraciclinas, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Doxiciclina y
Cloranfenicol (42).
En Australia, Gündoǧdu et al., analizaron la prevalencia de E. coli productora de BLEE
en aguas residuales hospitalarias no tratadas (ARHNT) y en dos plantas de tratamiento
de aguas residuales (PTAR). Una selección de 252 aislamientos de E. coli productores
de BLEE de ARHNT y PTAR se tipificaron y se analizaron para determinar la
resistencia a 17 agentes antimicrobianos y la presencia de integrasas asociadas a
Integrones (gen intI). Identificando en las muestras de agua cepas de E. coli
productoras de BLEE resistentes a 9 antibióticos. En los aislamientos de tipo ARHNT
se presentó resistencia de tipo BLEE al igual que en los aislamientos obtenidos en
PTAR con presencia de resistencia tipo BLEE con genes blaCTX-M. La prevalencia del
gen intI no difirió entre las fuentes de los aislamientos, pero se encontró ciertas E. coli
34
productoras de BLEE que fueron dominantes en las aguas residuales de los hospitales
(43).
En China Deng et al., analizaron las restricciones de ciertos estudios e investigaciones
que limitan la información de búsqueda en los Integrones de clase 1, teniendo mayor
importancia las bacterias Gramnegativas, de igual manera los microorganismos
Grampositivos junto con los Integrones de clase 2, 3, y 4 que son muy pocos
frecuentes en la literatura, lo que les permitió concluir que este era un tema
preocupante debido a que los Integrones son potencialmente determinantes en
resistencia antimicrobiana, encontrándose frecuentemente los Integrones de clase 1 en
microorganismos como Staphylococcus aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus
asociado a genes como sull y ORF5. Microorganismos también como E. coli en
Integrones de clase 2 con genes como dfrA1, sat2 y aadA1, Integrones de clase 3 en
Serratia marcescens con genes como aacA4 y finalmente Integrones de clase 4 en
Vibrio cholerae no identificando genes en sus sitios de secuencia. Debido a esto
concluyeron que se requiere investigar ya que los microorganismos son capaces de
obtener genes de resistencia constantemente por medio de mutación genética o
transferencia horizontal que permite una alta resistencia a los antimicrobianos por su
distribución y propagación (44).
En México, Arriaga et al., determinaron la frecuencia de algunos factores de resistencia
a los antibióticos de E. coli en aislados de productos cárnicos en plantas industriales.
Se analizaron 3 plantas de tipo de inspección federal (TIF) con 90 muestras: 10 de
productos cárnicos crudos (carne de bovino, cerdo y pavo), 10 de productos cárnicos
acabados y 70 de utensilios de trabajo, de las cuales se aislaron 18 cepas de E. coli
35
(20%) de la materia prima, 2 de producto terminado y 13 de utensilios de trabajo. Estos
mostraron altos niveles de resistencia a antibióticos como Ampicilina (88,8%),
Cefalotina (88,8%), Carbenicilina (83,3%) y Cloranfenicol (61,1%). Así mismo se
encontró relación entre cepas de E. coli resistentes a la Ampicilina y Cloranfenicol, en
presencia de genes como Pse-1, floR, y Cs3 Cs5 estos últimos más comunes en
Integrones de clase 1. Los resultados indicaron que la resistencia a los antimicrobianos
y los factores de resistencia genética están presentes en E. coli aisladas en los
alimentos de plantas de procesamiento, lo que sugiere que pueden transmitirse a la
microbiota intestinal de la población humana por contaminación y el consumo de
productos mal procesados lo que hace que se conviertan en un factor de riesgo para la
salud de la población(45).
En Argentina, Turina et al., realizaron un estudio donde se encontraron en total 64
Integrones de clase 1 en 35 aislamientos de Proteus mirabilis provenientes de cinco
hospitales, en los cuales se distinguieron 12 genes cassettes diferentes en su zona
variable, que incluyen la combinación de 9 cassettes, 8 de los cuales corresponden a
genes de resistencia a antimicrobianos que codifican para la resistencia a antibióticos
Betalactámicos, Aminoglucósidos, Trimetoprim y Cloranfenicol, en donde se encontró
un único gen cassette aadB, de resistencia a Gentamicina presente en el 40% de los
aislamientos. El Integrón de clase 1 más frecuente fue Intl 35, detectado en el 71,43%
de las muestras, la resistencia a la Gentamicina fue del 31,43% mientras que el 17,14%
de los especímenes presentó t y la resistencia a la Amikacina fue del 91,43%, mientras
que el 2,86% de las cepas presentó sensibilidad intermedia (46).
36
En Brasil, Clarisse et al., identificaron la presencia de Integrones de clase 1 en
aislamientos de E. coli en pacientes sanos y en pacientes con infección urinaria,
hallando estos genes en el 65% de E. coli uropatógena (UPEC) y 11,9% en E. coli
comensal. De los cuales 8 de los 31 aislamientos positivos para intI 1 identificados en
UPEC, albergaron genes no clasificados. Sin embargo 23 aislamientos codificaban
genes cassettes para E. coli comensal y UPEC resistentes a Betalactámicos (blaOXA-1),
Aminoglucósidos (aadA-aadA5), y Trimetoprim (dfrA1 y dfrA17). Adicionalmente, se
identificaron otros genes cassettes como blaOXA-1 asociado a Integrones de clase 1
causantes de resistencia a carbapenémicos en comparación al gen dfr relacionado a la
resistencia de Trimetoprim- Sulfametoxazol ejercida sobre UPEC(47).
En Colombia, en un estudio realizado en Bogotá, Velandia et al., hicieron una revisión
bibliográfica en la cual fueron identificados los principales genes de resistencia a
antibióticos, su origen, evolución y diseminación a microorganismos mediante la
transferencia horizontal de genes presentes en bacilos Gramnegativos. Se identificó
que los microorganismos que desarrollan resistencia antimicrobiana frente a BLEE son
los más difíciles para orientar adecuadamente un tratamiento; debido al fracaso
terapéutico y complicaciones clínicas que se desencadenan. Se demostró también que
este tipo de bacterias tienen diferentes mecanismos por los cuales adquieren
mutaciones puntuales a nivel cromosómico o transferencia horizontal de material
genético entre especies relacionadas o no, facilitada por algunos elementos móviles los
cuales tienen la capacidad de diseminarse, dicha característica ha generado un
incremento alarmante de la resistencia a antibióticos en todo el mundo(48).
37
En Bucaramanga (Santander), Farfán et al., analizaron los patotipos diarreagénicos de
E. coli de los cuales fueron identificados en 9,3% de casos y en 10% de los controles.
Se detectaron en todos los patotipos de E. coli con excepción de la E. coli productora
de toxina Shiga. Las diferencias entre los patotipos de E. coli de casos y controles no
fue estadísticamente significativa. Además, se identificaron dos cepas de E. coli
enteroinvasiva (EIEC) con adherencia agregativa y formación de biopelículas similares
a E. coli enteroagregativa (ECEA). Por lo que se concluye que los patotipos
diarreogénicas de E. coli son frecuentes en niños con diarrea y sin diarrea, reportando
E. coli enteroinvasora (ECEI) emergentes con fenotipos de adherencia celular y
formación de biopelículas similares a la ECEA (49).
Estas cepas obtenidas del anterior proyecto han sido utilizadas en investigaciones
formativas realizadas por estudiantes del Programa de Bacteriología y Laboratorio
Clínico, mostrando una alta resistencia a antimicrobianos por diversos mecanismos
genéticos entre los cuales se puede observar resistencia a antibióticos tales como
Ácido Nalidíxico y Ciprofloxacina destacando genes gyrA (100%), gyrB (100%) y parC
(100%), de los genes plasmídicos, se obtuvieron con mayor frecuencia qnrB (18,2%),
qnrS (13,6%), aac6´Ibcr (6,2%)(50). Otra investigación obtuvo datos sobre la bomba de
eflujo mdfA asociada a las proteínas ASL30596.1 (41,44%) y ARD54462.1
(41,18%)(51), además, se identificaron en las 66 cepas con patrones de resistencia a
Quinolonas y Fluoroquinolonas, los genes mdtk (100%) y tolc (96%) como principales
responsables en el mecanismo de acción de la bomba de eflujo, no obstante, aún con
la presencia de los genes no se logró explicar las diferencias de los patrones
fenotípicos de los antibióticos (52).
38
También se encontró resistencia para Ampicilina (86%) y Amoxicilina (87%) con
sensibilidad a Cefoxitina (72%) relacionadas a la presencia del gen blaTEM (69%)(53).
En cuanto a las resistencias dadas por los elementos móviles, para Colistina se
estudiaron los genes mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4 y mcr-5 siendo más común el gen de
resistencia móvil mcr-1 con un 5,55% (54).
4.2 Marco Teórico
4.2.1 Enfermedad Diarreica Aguda (EDA). La diarrea es un síndrome clínico
causado por una variedad de agentes etiológicos y caracterizado por la expulsión
frecuente de heces blandas o acuosas acompañada frecuentemente con vómitos o
fiebre. Los agentes infecciosos (bacterias, parásitos, virus) causantes de la gran
mayoría de los casos. La diarrea indica una pérdida aguda de líquidos y electrolitos,
que lleva a la deshidratación, siendo ésta una de las causas más importantes de
mortalidad en países en desarrollo, fundamentalmente entre niños menores de cinco
años(55).
4.2.1.1 Epidemiología. Las enfermedades diarreicas son la segunda mayor
causa de muerte de niños menores de cinco años(56).
En Colombia, el microorganismo identificado más frecuentemente en niños menores de
5 años con EDA es el Rotavirus y las bacterias más frecuentemente implicadas son E.
coli (enteropatógena y enterotoxigénica, principalmente) y Salmonella spp (alrededor
del 10%); con menor frecuencia se aíslan Campylobacter spp. y Shigella spp. (menos
de 6%) y no se identifican microorganismos patógenos hasta en el 45% de los niños en
quienes se busca la etiología de la EDA(49).
39
En Colombia, en la semana epidemiológica 9 del 2021, fue notificado por el sistema de
información para Vigilancia en Salud Pública-SIVIGILA, 1’260.200 casos de
enfermedad diarreica aguda, cifra que, en el año 2020 fueron notificados 884.545
casos del evento, observándose un aumento de 375.655 casos menos respecto al
respectivo año figura 1 (57).
Figura 1
Casos Notificados de EDA en Colombia 2017 – 2021
Nota. SIVIGILA, Instituto Nacional de Salud, Colombia, 2021(57).
Desde el año 2009, el Ministerio de Salud y Protección Social incluyó la EDA entre las
enfermedades prioritarias para el desarrollo de una Guía de Atención Integral (58).
Se notificó que en todos los grupos de edades se reportan usualmente casos de EDA;
el grupo que presentó el mayor número de casos según SIVIGILA fue el de los
menores de un año (62,7 casos), con una incidencia nacional por cada 1000
habitantes, sin embargo, el grupo de 1 a 4 años es la segunda población con mayor
porcentaje de casos notificados de 51,1 por 1000 habitantes (figura 2) (57).
40
Figura 2
Proporción de Incidencia y Morbilidad por EDA, por Grupos de Edad
Nota. Datos de Colombia en la semana epidemiológica 9 de 2021 SIVIGILA, Instituto Nacional de Salud, Colombia, 2021. (57).
La tasa de mortalidad nacional por EDA en los últimos 6 años acumulados a la semana
52, y el año 2021 hasta la semana 20, registró un total de 701.6 casos en niños
menores de 5 años. Se observa una variabilidad en descenso y aumento de casos
(tabla 2) (56,57,59,62).
Tabla 2
Número de Casos de Muerte por EDA Acumulados a la Semana 52 del 2015 a Semana
5 de 2021
Año Número de casos de muerte por EDA
2015 124 2016 133 2017 116 2018 172 2019 105 2020 34.8 2021 (Semana 9) 16.8
Total 701.6 Nota. SIVIGILA, Instituto Nacional de Salud, Colombia, 2015-2021 (56,57,59–62).
41
Desde el inicio de la pandemia por COVID 19, la incidencia de Morbilidad por EDA ha
disminuido desde el periodo III de 2019, observándose un incremento de 38% en el año
2021 desde el periodo III a la semana 9 (figura 3) (57).
Figura 3
Morbilidad por EDA en Presencia de COVID 19 en el año 2020 a 2021
Nota. SIVIGILA, Instituto Nacional de Salud, Colombia, 2021(57).
4.2.1.2 Patología. La EDA, según la OMS, se define por la presencia de tres o
más deposiciones en un periodo de 24 horas, con una disminución de la consistencia
habitual y una duración menor de 14 días (63).
Dentro de las patologías asociadas a E. coli se encuentran:
Diarrea del viajero: Cuadro clínico que aparece durante el viaje a un país
con recursos limitados, o durante los 14 días siguientes al regreso, consistente en tres
o más deposiciones no formadas durante un plazo de 24 horas. Este cuadro se
acompaña con frecuencia de dolor abdominal, fiebre, heces y náuseas y vómitos.
Agente causal implicado E. coli Enterotoxigénica (ECET) (64).
42
Colitis hemorrágica: Es una infección causada por E. coli
enterohemorrágica (ECEH) siendo una enfermedad emergente asociada al Síndrome
Hemolítico Urémico (SHU) con más frecuencia en niños, se presenta síntomas como
calambres abdominales, diarrea, y puede ir acompañada de sangre; además, es
trasmitida por los alimentos como carne de bovino molida, y otros animales
principalmente en países de desarrollo, otra fuente puede ser yogur, frutas y verduras
contaminadas con heces de bovino (64,65).
Insuficiencia renal: La Insuficiencia renal más frecuente en niños menores
5 años es el tipo aguda, provocando una disminución de horas a semanas de la función
renal y como consecuencia de ella, una retención nitrogenada, conllevando a una
disminución de la perfusión renal, como ocurre en deshidratación, hipotensión arterial,
hemorragia aguda, insuficiencia cardiaca congestiva, hipoalbuminemia severa, hasta
provocar una insuficiencia renal crónica seguido de la muerte del paciente (66).
4.2.1.3 Factores Asociados. Existen tres grupos de factores que predisponen
la generación de la EDA, estos grupos son: Factores conductuales, Factores del
hospedero y las Variaciones Climáticas (tabla 3)(67).
Tabla 3
Factores que Predisponen a una EDA
Factores conductuales
El no consumo de lactancia materna exclusiva (durante los primeros 6 meses de vida).
Usar biberones (higiene).
Conservar los alimentos a temperatura ambiente durante varias horas antes de su consumo (almacenamiento).
Deficiencias en higiene personal (contacto con heces), doméstica y ambiental. Factores del hospedero
Desnutrición.
Inmadurez del Sistema Inmune.
Inmunosupresión por infecciones virales. Variaciones climáticas
Diarreas virales se incrementan durante el invierno.
Diarreas por bacterias se incrementan en épocas de sequía.
Nota. Modificado de Castro et al (2014)(67).
43
4.2.1.4 Signos y Síntomas. Los pacientes que padecen de EDA, además del
aumento del número de deposiciones líquidas, suelen tener malestar general, náuseas,
vómitos, dolor abdominal cólico (tipo retorcijón) seguido con sensación de distensión
abdominal que mejoran con la deposición, a veces dolor de cabeza, fiebre, y
deshidratación (67).
Deshidratación: La amenaza más grave de la EDA es la deshidratación.
Durante un episodio de diarrea, se pierde agua y electrolitos (sodio, cloruro, potasio y
bicarbonato) en las heces líquidas, los vómitos, el sudor, la orina y la respiración.
Cuando estas pérdidas no se restituyen, se produce deshidratación(68).
La OMS clasificó el grado de deshidratación en tres escalas (tabla 4):
1. Deshidratación grave (al menos dos de los signos siguientes): letargo o
pérdida de conocimiento; ojos hundidos; retorno lento (2 segundos o más) a la
normalidad después de pellizcar la piel(68).
2. Deshidratación moderada (al menos dos de los signos siguientes):
desasosiego o irritabilidad; ojos hundidos; bebe con ganas, tiene sed(68).
3. Ausencia de deshidratación: no hay signos suficientes para diagnosticar
una deshidratación grave o moderada(68).
Tabla 4
Estimación del Grado de Deshidratación
Grado de Deshidratación Leve (+) Moderado (++) Marcado (+++)
Pérdida de peso
Lactancia
Niños mayores
5% 3%
10% 6%
15% 9%
Pulso Normal Lig. alto Muy alto Tensión arterial Normal Normal o bajo Normal o bajo
Llenado capilar <2 seg 3- 5 seg >6 seg
Fontanela anterior Normal Lig. Bajo Muy bajo
Tono ocular Normal Lig. bajo Muy bajo
Lágrimas durante el llanto Presente Bajo No presente
44
Tabla 4 (Continuación)
Grado de Deshidratación Leve (+) Moderado (++) Marcado (+++)
Mucosa oral Hidratada Seca Muy seca
Sed leve Moderado No puede beber
Turgencia de la piel Normal Bajo Sin turgencia
Estado neurológico Alerta Irritable Letárgico
Gasto urinario Normal Bajo Anuria
Nota. Botas Soto et al (2011)(69).
4.2.1.5 Tipos de Diarrea. Diarrea acuosa o secretora: la forma más común de
gastroenteritis se caracteriza por evacuaciones intestinales líquidas frecuentes. La
diarrea está provocada por mecanismos patogénicos que atacan el intestino delgado
proximal, porción del intestino en la que se produce más del 90% de la absorción
fisiológica de fluidos. La forma más pura de diarrea acuosa es la producida por
bacterias secretoras de enterotoxinas, como por ejemplo Vibrio cholerae o ECET (70).
Diarrea invasiva o disentería: La disentería comienza con evacuaciones
intestinales frecuentes, pero las heces son de menor volumen que en la diarrea acuosa
y contienen sangre, moco y pus. La fiebre, el dolor abdominal y el tenesmo son
síntomas habituales. En la disentería, la patología se centra en el colon. Los
microorganismos que causan disentería pueden provocar cambios inflamatorios y
destructivos en la mucosa del colon, por invasión directa o mediante la producción de
toxinas citotóxicas. Este daño es responsable del pus y la sangre observados en las
heces, pero no origina una pérdida importante de fluido, debido a que la capacidad de
absorción y secreción del colon es mucho menor que la del intestino delgado(70).
Diarrea relacionada con el hospital: El medio ambiente hospitalario no
debe permitir la diseminación de los agentes habituales de infección intestinal
endémica. Cuando se produce tal infección, en general puede atribuirse a un empleado
que continúa trabajando mientras está enfermo o bien es portador sano o a comidas
45
contaminadas, preparadas en el propio hospital o bien fuera del hospital y que entran
en éste a través de familiares o amigos del paciente. Dos casos especiales de diarrea
asociada con el hospital son las causadas por E. coli enteropatógenas (ECEP) en
lactantes y por Clostridium difficile en pacientes con tratamiento antibiótico(70).
4.2.1.6 Agentes Causales. A nivel mundial, la enfermedad diarreica constituye
un problema grave para la salud pública de infantes y niños, con altas tasas de
morbilidad y mortalidad, especialmente en países en vías de desarrollo. Las diarreas de
origen infeccioso pueden ser de etiología bacteriana, viral o parasitaria y son frecuentes
las asociaciones de dos o más agentes. Entre los agentes bacterianos se puede
señalar a Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia spp., Campylobacter
spp., Clostridium difficile y Escherichia coli diarreagénico (ECD), entre otros(71).
Al tenerse un origen infeccioso, la mayoría de las veces se considera que existen
cuatro mecanismos implicados en la fisiopatología de la diarrea(72):
Aumento de la osmolaridad del contenido luminal (diarrea osmótica).
Disminución de la absorción o aumento en la secreción intestinal (diarrea
secretora).
Alteraciones en la motilidad.
Exudación de sangre, moco y proteínas (diarrea inflamatoria).
La mayoría de las infecciones del tracto gastrointestinal van a causar diarrea por un
mecanismo secretor (bacterias enterotoxigénicas) o inflamatorio (bacterias
enteroinvasivas, Entamoeba histolytica, etc.). Las toxinas bacterianas se pueden
clasificar en citotónicas (Vibrio, ECET, etc.) y citotóxicas (Shigella, ECEH, etc.). Las
primeras aumentan la secreción intestinal por activación de enzimas intracelulares
46
(como la Adenilato ciclasa) sin producir daño en la superficie epitelial, mientras que las
segundas inducen la secreción por daño directo sobre el enterocito. En ocasiones,
puede existir una diarrea osmótica en relación con una mala absorción de disacáridos
como consecuencia de una afectación de las vellosidades intestinales (Giardia
duodenalis o virus) (72).
Tabla 5
Tipos de Agentes Causales de Diarrea Infecciosa
Diarrea viral
Rotavirus Grupo A Adenovirus entérico Astrovirus Calicivirus humanos (Norovirus, Sapovirus)
Diarrea bacteriana
Salmonella (S. typhi y paratyphi) Salmonella no tifoidea (S. enteritidis y S. typhimurium) Shigella S. sonnei Campylobacter C. jejuni Yersenia Y. enterocolitica Escherichia coli (enteropatógena, enterotoxigénica, enteroinvasiva, enterohemorrágica, enteroadherente, enteroagregativa) Aeromonas
Diarrea parasitaria
Giardia lamblia Cryptosporidium parvum
Nota. Román et al., (73).
4.2.1.7 Diagnóstico de la EDA. El diagnóstico de la EDA se realiza según las
especificaciones técnicas de cada país, en Colombia, el Ministerio de Salud y
Protección Social junto con la Dirección General de Promoción y Prevención, elaboró
una Guía de Atención de la Enfermedad Diarreica Aguda, en la que se indican los
procedimientos que se pueden implementar ante cada caso según corresponda (figura
4)(74).
47
Figura 4
Diagrama para el Diagnóstico de EDA
Nota. Modificado de Castro. et al (74).
4.2.1.8 Diagnóstico del Laboratorio. A nivel mundial, el uso de pruebas de
laboratorio en el niño con diarrea es poco usado, sin embargo, en algunos pacientes
con EDA podría estar justificado el uso de estudios de laboratorio en la aproximación
diagnóstica, para ello el médico podría solicitar:
Coprológico: La prueba más útil es el recuento de leucocitos, cuando es
más de 5 por campo de alto poder (CAP), con predominio de PMN se asoció
significativamente con EDA por gérmenes invasores de la mucosa intestinal. Más de 2
cruces de leucocitos en el coprológico se han asociado como un parámetro predictor
significativo de prolongación de la diarrea por 7 a 15 días(75).
48
Coprocultivo: El uso de los medios para la determinación de los
patógenos bacterianos entéricos causantes de enfermedades gastrointestinales más
comunes son los siguientes(76):
1. Para detectar los géneros de Salmonella spp y Shigella spp se usa un
medio selectivo y diferencial, como MacConkey o Eosin metylene blue agar (EMB),
dado que inhiben los microorganismos Grampositivos.
2. Para diferenciar los géneros de Salmonella spp de Proteus spp en Agar
con triple azúcar de hierro (TSI), se analiza la enzima ureasa. Esta no es producida por
Salmonella spp. pero si por Proteus spp.
3. Campylobacter jejuni se desarrolla en medios de cultivo como Agar
Skirrow, a 42°C.
4. pH alcalino para etiología toxigénica, bacteriana o invasiva y el pH ácido
para daño de la vellosidad intestinal por Rotavirus, E. coli EP, Giardia spp
Hemograma: dentro de los parámetros del cuadro hemático encontramos
alterado(77):
1. Electrolitos séricos: Trastornos electrolíticos, sodio aumentado, cloro
aumentado, potasio disminuido.
2. Gasometría arterial: Trastorno ácido base, acidosis metabólica con hiato
aniónico normal.
3. Creatinina y nitrógeno ureico: Si se sospecha falla renal secundaria,
elevados en la deshidratación intensa.
Orina: Densidad aumentada, cilindros hialinos o granulosos, algunos
leucocitos y hematíes y 30-100 mg/dL de proteinuria(77).
49
En Colombia, se utiliza la Guía de Vigilancia por Laboratorio de EDA proporcionada por
el Instituto Nacional de Salud, esta guía proporciona las pautas para la Identificación de
E. coli de acuerdo a la siguiente forma(78):
Microorganismo: Escherichia coli.
Realizar suspensión de materia fecal (directa o de medio de transporte),
en 2 ML de solución salina al 0,85%.
Caldo de enriquecimiento: Agregar 300μL suspensión en caldo selenito
cisteína.
Periodo de incubación: T° = 37°C±1°C, 8 horas a 18 horas, Atmósfera
aerobia.
Cultivo de caldo enriquecimiento en agar selectivo: Agar MacConkey,
Sorbitol.
Periodo de incubación: T° = 37°C±1°C, 8 horas a 18 horas, Atmósfera
aerobia.
Lectura: Colonia sorbitol negativa.
Cultivo de identificación: Agar no selectivo, Brain Heart Infusión (BHI),
Tripticasa Soya (TS).
Periodo de incubación: T° = 37°C±1°C, 8 horas a 18 horas, Atmósfera
aerobia.
Pruebas bioquímicas presuntivas: LIA: K/K, Gas-, H2S-, Fermentador de
sorbitol: Negativo, Movilidad: Móvil.
50
4.2.1.9 Tratamiento. Rehidratación oral: una vez diagnosticada la diarrea, la
primera medida que debe adoptarse es la rehidratación por vía oral. Para rehidratar se
recomiendan las soluciones de rehidratación oral, cuya utilización está basada en el
hecho de que los mecanismos de absorción activa del sodio permanecen indemnes, o
al menos muy eficaces, en todos los tipos de diarrea aguda. Estos mecanismos pueden
ser estimulados por numerosos nutrientes (glucosa, galactosa, glicina y péptidos), de
tal manera que la absorción de sodio y glucosa se ve facilitada por la presencia
conjunta de ambos elementos en la luz intestinal(78).
Tratamientos farmacológicos: Algunos de ellos presentan consecuencias
negativas con su uso.
Modificadores de motilidad intestinal:
Loperamida: Letargo, Íleon, depresión respiratoria y coma.
Difenoxilato: Aumenta la capacidad del intestino para retener líquidos.
Agentes anticolinérgicos:
Atropina: Tienen peligro de producir íleo paralítico y sobre crecimiento
bacteriano, por lo que se recomienda muy poco su uso (79).
Sustancias antisecretoras:
Salicilato de bismuto: No está recomendado porque produce toxicidad,
Racecadotrilo: inhiben a la encefalinasas que es un neuropéptido de la
pared intestinal que se opone a la síntesis del AMP cíclico ejerciendo acción
antisecretora, provocando efectos sobre la diarrea, disminuye el volumen y el número
de deposiciones(79).
Antibióticos:
51
Trimetropim/Sulfametoxazol: Dosis 8-10 MG./Kg. /día c/12 h - 5 días.
Indicado en diarrea por: Shigellosis, Salmonella typhi, E. coli enteropatógena(79).
Ácido Nalidíxico: Su espectro de actividad incluye la mayoría de las
bacterias Gramnegativas, excepto Pseudomona aeruginosa. Dosis: 15 - 25 MG/Kg./día
c/ 6 h 5 días, es útil en el tratamiento de la diarrea por Shigella spp, entre sus efectos
adversos más comunes: náuseas, molestias abdominales, cefalea y mareos y
Síndrome de pseudo tumor cerebral(79).
4.2.1.10 Escherichia coli. Bacilo Gramnegativo, oxidasa negativa, anaerobio
facultativo, móvil por flagelos perítricos, no forma esporas, es capaz de fermentar la
glucosa y la lactosa, es perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Fue descrito por
primera vez en 1885, por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la
denominó Bacterium coli y posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de E.
coli, en honor a quien lo descubrió(5).
Este microorganismo presenta múltiples estudios, debido a su estrecha participación en
brotes epidémicos de enteritis grave en lactantes y a su serovariabilidad, está
involucrado en diarreas graves, lo que representa la primera o segunda causa de
muerte por EDA en la mayoría de los países en vía de desarrollo, fundamentalmente en
niños, como consecuencia de estados de deshidratación, y por lo tanto constituye una
patología muy prevalente en esta población (5).
De acuerdo con la estructura de E. coli consta de tres elementos: la membrana
citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico
constituido por péptido glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su forma y
52
rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas
(figura 5)(5).
Figura 5
Estructura Morfológica de E. coli
Nota. Adaptada de Gonzáles (80).
4.2.1.11 Patotipos de Escherichia coli. Con base en los mecanismos de
patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de E. coli causantes de diarrea se clasifican
en siete grupos: E. coli enteropatógena (ECEP), E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli
enteroinvasora (ECEI), E. coli shigatoxigénica (ECST), E. coli enteroagregativa (ECEA),
E. coli adherente difusa (ECAD) y E. coli adherente invasora (ECAI)(5).
E. coli enteropatógena (EPEC): Es el agente causal de diarrea en niños
menores de dos años, que causa frecuentemente brotes epidémicos en lugares
cerrados como guarderías y hospitales. La enfermedad puede ser de moderada a
grave y se ha asociado a un alto índice de mortalidad (10-40%), principalmente en los
países en vías de desarrollo. El período de incubación es de 3 a 24 h y el cuadro
diarreico puede tornarse persistente y acompañarse de fiebre y vómito. Los
53
mecanismos fisiopatológicos que originan el cuadro diarreico se relacionan
principalmente con la alteración de la célula intestinal debido a la lesión de adhesión y
borrado (A/E: attaching/effacing) y a la formación de pedestales(5).
E. coli enterotoxigénica (ECET): Es uno de los agentes más
frecuentemente identificados en diarrea aguda. Se conoce como diarrea del viajero y
tiene amplia distribución en países en vías de desarrollo. En algunos casos la diarrea
puede ser leve, sin presencia de moco o sangre; en otros casos puede ser profusa
causando deshidratación grave y en algunos casos presentar cefalea y vómito(5).
Sus principales mecanismos de patogenicidad son las toxinas y la adhesión
denominados factores de colonización (CFs: Colonization factors) y que en ECET son
llamados antígenos de superficie coli (CSs: Coli surface antigens), antígenos de los
factores de colonización (CFAs: colonization factor antigens) o PCFs (putative
colonization factors).
E. coli enteroinvasora (ECEI): Se asocian más a brotes que a casos
aislados, en los que la transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de
alimentos y agua contaminada. Se caracteriza por presentar diarrea acuosa, con
sangre, moco y dolor abdominal, pero en algunos casos sólo se presenta diarrea, lo
cual la hace indiferenciable de la producida por ECET y menos grave que la causada
por Shigella spp. Los principales mecanismos de patogenicidad de ECEI son adhesión
al epitelio, la invasión, la supervivencia dentro de los macrófagos y la formación de
biopelículas(5).
E. coli shigatoxigénica (ECST): Es un patógeno de carácter zoonótico,
que causa dolor abdominal, diarrea sanguinolenta y poca fiebre. Es el principal agente
54
etiológico del síndrome hemolítico urémico (SHU), debido a que produce una o más
toxinas Shiga (Stx) similares a las producidas por Shigella dysenteriae tipo 1, por lo que
se les denomina shigatoxigénicas. También se han descrito como E. coli
enterohemorrágica (EHEC, del inglés enterohemorragic E. coli) y E. coli verotoxigénica
(VTEC, del inglés verotoxigenic E. coli)(5).
E. coli enteroagregativa (ECEA): Causa diarrea aguda o persistente, tanto
en niños como en adultos, en países en vías de desarrollo y se identifica con frecuencia
en cuadros diarreicos de personas de países industrializados y en pacientes infectados
por el Virus de Inmunodeficiencia Humana. Este patotipo se adhiere a la mucosa
intestinal, la coloniza y produce un efecto citotóxico que causa diarrea de tipo acuosa
sin fiebre, con secreción de moco(5).
E. coli adherente difusa (ECAD): Estas cepas se han asociado más a
procesos diarreicos de tipo agudo y persistente en niños que en adultos. Los adultos, al
igual que los niños, pueden ser portadores asintomáticos. Dentro de las principales
características observadas en la patogénesis de ECAD están las siguientes: Unión
mediante adhesinas a la mucosa intestinal, formación de microcolonias típicas en forma
de ladrillos apilados, producción de citotoxinas y enterotoxinas y desarrollo de una
inflamación grave de la mucosa(5).
E. coli adherente invasora (ECAI): La presencia de ECAI en el lumen
intestinal es causante de la enfermedad de Crohn. Sus principales características de
patogenicidad son la adhesión epitelial, la invasión, la supervivencia dentro de los
macrófagos y la formación de biopelículas(5).
55
En la figura 6, se observa los patrones de adherencia de E. coli según su patotipo,
debido a que requiere la adherencia al epitelio del hospedero como se nombró
anteriormente(81).
Figura 6
Adherencia y Fisiopatología de los Diferentes Patotipos de E. coli
Nota. Adaptada de García et al (9).
4.2.2 Integrones. En la década de los 70, el objeto de estudio eran los
plásmidos, pero durante y finales de esos años hubo avances que en la actualidad
siguen siendo un foco de estudio, como los transposones, seguido a ello, el interés se
centró en una nueva clase de elementos genéticos: los Integrones(82).
Las primeras pistas sobre la existencia de esta clase de elementos se obtuvieron
estudiando el transposón Tn21, al analizar las funciones de este elemento, se logró
observar una clase de recombinante sitio específico, diferente a los producidos por la
Transposasa e independiente de la misma y de los extremos invertidos del transposón.
El estudio detallado de estos recombinantes y de las secuencias requeridas para su
56
obtención, revelaron la presencia de un elemento independiente, denominado Integrón,
dentro del transposón Tn21(82) (figura 7).
Figura 7
Conformación Genética del Transposon Tn21.
Nota. Adaptado de Paredes et al (6).
El concepto más actual de Integrones fue descrito por Hall y Collis en el año 1995, en
la cual se define al Integrón como un elemento que contiene los determinantes
genéticos para mediar la recombinación sitio específica, siendo capaz de reconocer y
capturar genes cassettes móviles. La estructura básica de un Integrón consta de un
gen que codifica para la integrasa (intI), un sitio de recombinación (attI) y un promotor
que permite la expresión del o los genes cassettes que sean incorporados en forma
consecutiva río abajo del gen de la integrasa(83).
57
4.2.2.1 Integrasas. Son enzimas que pertenecen a la superfamilia de las
Tirosin recombinasas, las cuales emplean un residuo de tirosina para las reacciones de
intercambio entre hebras de ADN, están agrupadas en una superfamilia debido a que
poseen regiones cortas similares y con residuos conservados en un dominio C-terminal
de 180 aminoácidos, en donde se localiza el sitio catalítico. Dentro de esta superfamilia
de recombinasas se encuentra una familia denominada intI, la cual se caracteriza no
solo por los motivos conservados propios de las Tirosin recombinasas, sino que
también contienen un motivo propio de estas proteínas, denominado motivo intI. Las
integrasas intI recombinan dos tipos de sitios: sitios attI, ubicados en Integrones, y
sitios attC, encontrados en genes en cassette(84).
4.2.2.2 Sitios attI. Son regiones de ADN que se localizan posteriores al gen de
la integrasa. El sitio attI 1 ha sido el más estudiado en cuanto a su estructura en
comparación con los otros sitios de recombinación en las otras clases de Integrones.
Sin embargo, se han encontrado algunas regiones similares a las del sitio attI 1 en los
sitios attI 2 y attI 3.
El sitio attI1 está compuesto de una región simple, en la cual se encuentra el punto de
recombinación y dos regiones de unión a la intI1, las cuales son secuencias invertidas
conservadas de 7pb (generalmente: GTTRRRY, siendo R= purinas y Y= pirimidinas)
observado en la figura 8.
De otro modo, el tamaño del sitio attI1 es variable, pero tanto la región simple como las
regiones de unión a la intI1 son esenciales en la actividad de recombinación entre sitios
attI y attC(85).
58
Figura 8
Sitio attI
Nota. Adaptado de Paredes et al (6).
4.2.2.3 Genes Cassette. Los genes en cassette son unidades discretas de
ADN, las cuales portan un marco abierto de lectura o el gen completo de resistencia
asociado con un elemento denominado 59-be o sitio de recombinación attC. Cada gen
posee un elemento attC particular en secuencia y longitud (6).
La estructura básica de los Integrones, cassettes génicos y esquema de la
recombinación sitio específica se puede observar en la figura 9:
1. Las plataformas de recombinación sitio específica (Integrones) presentan en
su estructura un gen intI que codifica una integrasa y su promotor Pint, un sitio de
recombinación attI y uno o dos promotores Pc, P2.
2. Los cassettes génicos son elementos móviles de ADN circular compuestos
por un marco de lectura abierto y un sitio de recombinación attC.
59
Figura 9
Estructura Básica de los Integrones
Nota. Cassettes Génicos y Esquema de la Recombinación Sitio Específico. Adaptado de Paredes et al (6).
La integrasa codificada por el gen intI reconoce el sitio attC en el cassette génico y
cataliza su recombinación en el sitio attI, de esta manera el último cassette insertado en
la plataforma se encuentra en la región más próxima al gen intI. Todos los genes
insertados en la región variable del Integrón se expresan gracias a los promotores
localizados en el gen intI o el sitio attl (6).
4.2.2.4 Clasificación de los Integrones. Integrón de clase 1: estos han sido
reconocidos en diferentes sitios en plásmidos y transposones no relacionados, así
como en cromosomas bacterianos, que contienen variedad de genes de resistencia en
diferentes arreglos. Este tipo de Integrones se encuentran con frecuencia en aislados
clínicos y su presencia se ha correlacionado con la multirresistencia. Su estructura
consta de una región variable flanqueada por dos segmentos conservados.
60
El segmento 5’ conservado o 5’CS incluye al gen de la integrasa (intI1), uno o dos
promotores que aseguran la expresión de los genes en la región variable y el sitio
adyacente de recombinación attI1. El segmento 3’ conservado o 3’CS, frecuentemente,
incluye al gen qacED1, que codifica resistencia a compuestos de amonio cuaternario;
sul1, gen de resistencia a sulfonamidas y un marco de lectura abierto, orf5, con función
desconocida (figura 10)(6).
Figura 10
Estructura de Integrón de Clase 1
Nota. Adaptado de Paredes et al (6).
Integrón de clase 2: Al igual que los Integrones de clase 1, presentan una región
5’CS, donde se localiza el gen intI2, que codifica una integrasa 2; secuencias
promotoras y el sitio de recombinación attI2. Usualmente en el segmento 3’CS se
encuentran uno o varios genes involucrados en procesos de transposición tnsA, tnsB,
tnsC, tnsD y tnsE. Según se observa en la figura 11, en los Integrones clase 2 de
muestras clínicas se han descrito pocas combinaciones de genes en la región variable,
la más frecuentemente reportada es dfrA, sat2, aadA1. La cual confiere resistencia a
Trimetoprima, Estreptomicina y Espectinomicina(6).
61
Figura 11
Estructura del Integrón de Clase 2
Nota. Adaptado de Paredes et al (6).
Integrón de clase 3: Este Integrón es el menos común nombrado en la literatura,
debido a esto se conoce muy poca información. Posee una localización plasmídica y se
desconoce si tiene presente una región 3’ conservada, contiene una Integrasa IntI 3 y
un sitio de recombinación attI 3 y una región variable (figura 12), se ha aislado en
microorganismos como Serratia marscescens resistente a antibióticos como
Carbapenémicos, involucrando genes gen bla-IMP (6).
Figura 12
Estructura del Integrón de Clase 3
Nota. Adaptado de Paredes et al (6).
62
Integrón de clase 4: También llamados “superintegrones”, nombrados así
por la gran estructura que poseen, la cual cuenta con 50 a 200 casetes con resistencia
a sulfametoxazol, trimetoprim y estreptomicina. Estos han sido identificados
principalmente en el cromosoma de Vibrio cholerae, cuentan con una única localización
cromosómica, poseen un alto grado de identidad entre las secuencias attC de los
casetes, y presentan una descendencia principalmente lineal entre un grupo
determinado de microorganismos(84,86).
Integrón de clase 5: Estos han sido localizados en transposones
asociados a plásmidos en Alivibrio salmonicida, Shewanella, Xantomonas,
Pseudomonas, Nitrosomonas, Geobacter y Vibrio(31).
63
5. Metodología
5.1 Diseño de Estudio
Estudio de tipo descriptivo y experimental transversal en el que se identificaron los
genes relacionados con los Integrones de clase 1, 2 y 3 en cepas de patotipos y
comensales de E. coli.
5.2 Área de Estudio
Bucaramanga y su Área Metropolitana.
5.3 Universo
Material biológico aislado de heces de pacientes pediátricos menores de 5 años,
específicamente Enterobacterias de la especie Escherichia coli, diarreogénicas y no
diarreogénicas (comensales).
5.4 Población
Las cepas (n=2699), aislados clínicos pediátricos, de E. coli diarreogénicas de los
patotipos: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC/STEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli de adherencia
difusa (DAEC) y E. coli comensales fueron previamente identificados en un estudio de
casos y controles de EDA en una población de Bucaramanga y su Área Metropolitana,
en el periodo comprendido entre julio de 2013 y diciembre de 2014 y financiado por el
National Institutes of Health (NIH) de Estados Unidos (“Studies on emergent of E. coli
pathogens. Clinic study”) (49). Las muestras fueron recolectadas en 6 Entidades
Prestadoras de Salud (EPS): Centro de Salud El Rosario (Bucaramanga), Clínica
Materno Infantil San Luis (Bucaramanga), Fundación Oftalmológica de Santander
Carlos Ardila Lulle (FOSCAL - Floridablanca), Hospital Local del Norte (Bucaramanga),
64
Hospital San Juan de Dios de Floridablanca (Floridablanca) y Unidad Intermedia
Materno Infantil Santa Teresita (UIMIST - Bucaramanga).
De estas cepas posteriormente, se tomaron por selección pseudorandómica, 258
especímenes, los cuales fueron procesadas frente a 21 antibióticos en un estudio de
Resistencia fenotípica y molecular financiado por convocatoria interna de la
Universidad de Santander, UDES (Acta 059-16), permitiendo definir el Antibiotipo de
cada uno de los patotipos de E. coli y E. coli comensales.
5.5 Muestra
De la población de estudio, se definió como muestra para esta investigación 168
aislados que presentaron patrones fenotípicos de Sensibilidad Intermedia y Resistencia
a Amoxacilina, Amoxacilina/Ácido Clavulánico, Ampicilina, Ácido Nalidíxico,
Ciprofloxacina, Cefotaxima, Ceftazidima, Ceftriaxona, Cloranfenicol, Doxiciclina,
Gentamicina, Meropenem y Trimetroprim/sulfametoxazol, además, muchas de ellas con
patrones de Multidrogorresistencia y Ultrarresistencia frente a los demás antibióticos.
En el objetivo específico 2 del presente proyecto se planteó describir la relación entre la
presencia de los genes intI 1, intI 2 e intI 3 y los patrones de resistencia de las cepas de
estudio, antibiotipo que como se aclaró anteriormente, fue procesado por el grupo de
investigación del proyecto del que se deriva este estudio, por lo que a continuación se
presentan las prevalencias de Sensibilidad Intermedia y Resistencia a los antibióticos
ya descritos (tabla 6), como información antecedente de importancia para el análisis de
los resultados en su respectivo capítulo.
65
Tabla 6
Patrones de Sensibilidad Intermedia y Resistencia en las Cepas de Estudio
Antibiótico Familia SI* R*
Amoxicilina Betalactámicos (Aminopenicilinas) 6,9% 55,8% Amoxicilina/Ácido Clavulánico
Betalactámicos/Inhibidor de Betalactamasa 12,0% 6,5%
Ampicilina Betalactámicos (Penicilinas) 4,2% 53,8% Ácido Nalidíxico Quinolona 3,8% 13,9% Ciprofloxacina Fluoroquinolona 2,7% 0,34% Cefotaxima Cefalosporina de tercera generación 24,4% 13,5% Ceftazidima Cefalosporina de tercera generación 4,6% 10,4% Ceftriaxona Cefalosporina de tercera generación 3,8% 10,0% Cloranfenicol Anfenicoles 0,0% 33,7% Doxiciclina Tetraciclinas 12,0% 41,8% Gentamicina Aminoglucósidos 25,9 24,0% Meropenem Carbapenémico 1,5% 0,0% Trimetroprim/sulfametoxazol Inhibidores de la Dihidrofolato reductasa 1,9% 36,8%
Nota. *SI: Sensibilidad Intermedia. *R: Resistencia.
5.6 Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó mediante lisis por ebullición en el estudio de
resistencia fenotípica y molecular financiado por convocatoria interna de la Universidad
de Santander, UDES (Acta 059-16). Sin embargo, en aquellos casos en los que fue
necesario volver a extraer porque el volumen se había agotado o cuando la
confirmación de la calidad del ADN así lo ameritaba, se realizó como se describe a
continuación. Brevemente, se centrifugaron los caldos de Lisogenia con las
respectivas cepas en estudio a 3500 rpm durante 10 minutos, se descartó el
sobrenadante invirtiendo el tubo en hipoclorito, posteriormente se tomaron 200µL de
sedimento y se agregó a 1 ml de agua molecular. Se centrifugó a 1200 rpm por un
tiempo de 5 minutos, nuevamente se descartó el sobrenadante y se adicionaron 200 µL
de agua molecular y se mezclaron en un vórtex. Se llevó a 100°C durante 10 minutos
en el bloque seco y posteriormente se transfirieron a -20°C por 10 minutos. Se procedió
a centrifugar a 12000 rpm durante 3 minutos y se separó el sobrenadante en un vial
66
estéril y finalmente se conservó a -20°C. La calidad y la concentración se determinaron
utilizando un espectrofotómetro NanoDrop™ 2000c (Thermo Scientific, USA)(87),
donde los valores de la medición A260/230 se situaron en torno a 1.8 - 2.2 mostrando
la calidad óptima del ADN(88).
5.7 Identificación Molecular de los Genes
5.7.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa – PCR. Para estandarizar la
PCR, se tuvo en cuenta el protocolo del kit Platinium PCR SuperMix High Fidelity
(Thermo Scientific, USA). Los oligonucleótidos degenerados que se usaron para la
identificación de los genes intI 1,2 y 3 son tomados de la literatura, previo análisis de
diversos artículos, donde B= C o G o T, K= G o T, R= A o G y Y= C o T (tabla 7).
Tabla 7
Secuencia de Oligonucleótidos Utilizados en el Estudio
Oligonucleótidos Secuencia (5’ - 3’) Tamaño
Hep 35 5’-TGCGGGTYAARGATBTKGATTT-’3 491pb Hep 36 5’-CARCACATGCGTRTARAT-’3
La PCR se realizó con un volumen final de 50 µL, Platinium PCR SuperMix High
Fidelity 25 µL, Oligonucleótidos (0,5 µM) 3 µL, ADN (10 ng) 2 µL y Agua grado
molecular 17 µL. Como controles de la amplificación se utilizó como control positivo una
cepa de Burkholderia cepacia portadora de los genes y como control negativo agua
grado molecular.
Las condiciones que se tuvieron en cuenta para el termociclado se presentan en la
tabla 8.
Tabla 8
Condiciones de Termociclador para la PCR
Desnaturalización 35 ciclos Extensión Tamaño Ref.
67
Inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión final (pb)
95°C, 2 min 94°C, 30 seg 55°C, 90 seg 72°C, 45 seg
72°C, 2 min 491 (89)
5.7.2 Determinación de las clases de Integrón. Para determinar las clases de
Integrones, los productos de PCR se analizarán adicionalmente por Polimorfismo de
longitud de fragmento de restricción (RFLP) después de la digestión usando RsaI (MBI,
Fermentas, Lituania). Para la digestión de restricción, se hizo una digestión de 10μl de
los productos de PCR en una mezcla de reacción de 32μl, la cual tuvo 2μl de RsaI y 2μl
del tampón de restricción apropiado, así como 18 μl de agua destilada desionizada a
37°C por 16 h. El tamaño y el número de fragmentos generados se muestran en la
tabla 10.
Tabla 9
Resultados de Fragmentos Generados con la RFLP
Producto de PCR Enzima No. de Fragmentos Tamaño del Fragmento (bp)
Int1 RsaI 1 491 Int2 RsaI 2 300, 191 Int3 RsaI 2 119, 372
5.7.3 Electroforesis. Todos los productos obtenidos de la PCR y RFLP se
visualizaron mediante la realización de electroforesis en gel de agarosa al 1,5% en
buffer TAE (Tris, Acetato y EDTA) a una concentración de 1X. Se usó el marcador de
peso molecular de 1000 pb. La corrida electroforética se llevó a cabo a 80V por 60 min
en una cámara de electroforesis horizontal y posteriormente, se analizó de acuerdo con
el patrón de bandas observadas según la tabla 9. Para la visualizaron se utilizó el
equipo transiluminador UV MiniBISpro.
5.8 Aspectos Éticos
Esta investigación utilizó aislamientos clínicos previamente obtenidos bajo la
aprobación del Comité de Bioética de la UDES. Este trabajo no implicó investigación en
68
seres humanos. Para este estudio se usaron cepas de referencia y cepas de E. coli
previamente aisladas en el estudio de casos y controles realizado en niños menores de
cinco años financiado por el NIH de Estados Unidos “Studies on emergent of E. coli
pathogens. Clinic study”. Las muestras de material fecal de las cuales se aislaron las
cepas bacterianas fueron obtenidas con la firma de consentimiento informado de los
padres de los niños incluidos y en éste se autorizó el uso de material biológico para
futuros estudios. De acuerdo con la Resolución Nº 008430 de 1993 del Ministerio de
Salud de la República de Colombia del 4 de octubre de 1993, por la cual se establecen
las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud, esta
investigación tuvo en cuenta el Título IV de la bioseguridad de las investigaciones,
Capítulo I de la investigación con microorganismos patógenos o material biológico que
pueda contenerlos. Principalmente, en sus artículos 63-66, 68 y 71 en donde se
dispone la normatividad para el manejo de estos microorganismos. Las bacterias que
se utilizaron en este estudio hacen parte del grupo de riesgo II (riesgo moderado
individual y riesgo comunitario limitado). En cuanto a la manipulación de estas
bacterias, el artículo 68 dispone que deben procesarse en laboratorios básicos de
microbiología empleando gabinetes de seguridad cuando se considere necesario, estas
muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Investigaciones Biomédicas y
Biotecnológicas –LIBB y el ADN extraído almacenado bajo los estándares de
Bioseguridad.
Uno de los pilares que se tuvo en cuenta antes de la entrega de las muestras por parte
del “Studies on emergent of E. coli pathogens. Clinic study” fueron los cuatro principios
69
básicos de la bioética estipulado por Beauchamp y Childress en 1974 (90) para la
investigación con seres humanos en la medicina, dentro de ellos están:
1. Autonomía: El paciente no fue persuadido para ser parte de este
proyecto, se orientó con la información acerca de los procedimientos que se iban a
realizar, se dejó a criterio bajo su propia responsabilidad de toma de decisión, recibió
un consentimiento informado, sin violar su confidencialidad en donde se le aclaró que
su muestra podía participar en posteriores investigaciones(90)
2. Justicia: La intervención de cada ciudadano involucrado en este proceso
se tuvo en cuenta a modo de igualdad, en busca de los beneficios individuales y
sociales sobre la afectación de E. coli causante de EDA en la población pediátrica(90)
3. No maleficencia: No se suministró daño, ni dolor o angustia a ninguno de
los pacientes involucrados, siempre se mantuvo el respeto y ética profesional en todo el
proceso(90).
4. Beneficencia: Se resaltó la protección, cuidado de cada paciente en
busca de ayudar y defender los derechos humanos de cada individuo(90).
Las cepas almacenadas de este proyecto y de los que lo anteceden se encuentran
registradas en la Colección Biológica CBUDES de la Universidad de Santander,
cumpliendo con la normativa del Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible en su
Decreto 1375 de 2013 (91).
70
6. Resultados
6.1 Identificación de los Integrones Clase 1, 2 y 3.
6.1.1 Identificación Molecular de los Genes de Integrones. Se realizó PCR
para conocer la presencia del gen del Integrón, lo que evidenció la presencia en 41%
de las cepas de estudio (figura 13).
Figura 13
Amplificación del Gen del Integrón
Nota. Electroforesis en Gel de Agarosa al 1,5%. Pozo 1 y 8: corresponden al marcador de peso molecular (1000 pb DNA Ladder). Pozo 2 a 6: muestras con amplificados para el gen del Integrón (491 pb). Pozo 7: Control negativo.
6.1.2 Clases de Integrones. Después de la RFLP se definió que la presencia
de los Integrones fueron solo de la clase 1 (41%), no se observó ningún cambio en el
patrón del bandeo, por lo que no hubo presencia de los genes intI 2 e intI 3 (figura 14).
Figura 14
Resultado de la RFLP – PCR para la Clasificación de los Integrones
71
Nota. Pozo 1: Control Negativo. Pozo 2 y 3: Muestras con presencia del gen intI 1 (491 pb). Pozo 4: Marcador de peso molecular (1000 pb DNA Ladder).
El análisis del ADN de 168 cepas de patotipos de E. coli y E. coli comensales, permitió
encontrar la siguiente distribución según el tipo de los especímenes estudiados (tabla
9) y los genes encontrados (figura 15).
En las siguientes tablas número 10,11 y 12. Los valores expresados en la tabla se reflejan
como valor en porcentaje y absoluto.
Tabla 10
Patotipos de E. coli, E. coli Comensal y los Genes de Integrones Estudiados
Patotipos Frecuencia (%) intI 1 (%)
ECEP 43 9 ECET 14 1 ECEI 1 1 ECST 2 1 ECEA 56 12 ECAD 2 2 Comensal 50 15
6.2 Presencia de los Genes de Integrones Según los Fenotipos de Resistencia
Bacteriana
6.2.1 Fenotipos de Resistencia Bacteriana en las Cepas de Estudio. Al
analizar los resultados entregados a las investigadoras de este estudio, sobre los
patrones de resistencia bacteriana, se pudo clasificar de la siguiente forma (tabla 11).
Tabla 11
Fenotipos de Resistencia Bacteriana en las Cepas de Estudio
Patotipo AML AMC AMP ATM CTX CAZ CRO C DO CN SXT KF FOX CXM
ECEP 26.0 25.0 26.0 21.4 35.7 28.6 31.8 25.0 18.8 15.3 25.0 32.9 33.3 29.4 ECET 9.3 8.3 9.3 0.0 7.2 14.3 31.8 5.0 13.0 7.6 12.5 10.0 0.0 5.8 ECEI 0.6 0.0 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 2.6 1.1 0.0 0.0 0.0 ECST 1.2 2.1 0.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 ECEA 32.1 25.0 34.0 35.6 32.1 23.8 4.6 30.0 35.2 30.7 38.6 28.6 16.7 35.4 ECAD 0.6 4.2 1.3 0.0 0.0 0.0 0.0 5.0 2.4 2.6 2.3 2.9 0.0 0.0 Comensal 30.2 35.4 28.0 43.0 25.0 33.3 31.8 35.0 29.4 41.2 20.5 25.6 50.0 29.4
Nota. AML: Amoxicilina. AMC: Amoxicilina/Ácido Clavulánico. AMP: Ampicilina. CTX: Cefotaxima. CAZ: Ceftazidima. CRO: Ceftriaxona. C: Cloranfenicol. DO: Doxiciclina. CN: Gentamicina. SXT: Trimetropim/sulfametoxazol. KF: Cefalotina AZT: Aztreonam FOX: Cefoxitina CXM: Cefuroxima. 2021.
72
6.3 Comparación de la Presencia de los Genes de Integrones con los Genes de
Resistencia Reportados en las Muestras de Estudio.
En los diferentes estudios de investigación formativa realizados por los estudiantes del
Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander,
UDES, campus Bucaramanga, se han identificado los genes blaTEM, blaSHV-2.
blaIMP-1, blaIBC-1. blaSPM-1, blaVIM-2, gyrA, gyrB, parC, aac(6’)Ib, qnrB y qnrS en
las cepas de estudio. De acuerdo con la literatura, estos genes se han asociado con los
Integrones clase 1, 2 y 3, por lo que fue de interés para las autoras, realizar esta
comparación, una vez estaba disponible esta información para el grupo de
investigadoras y no se ha reportado en ninguno de los trabajos realizados (tabla 12).
Tabla 12
Presencia de los Genes de Integrones con los Genes de Resistencia Reportados en las
Muestras de Estudio
Patotipo Integrones
Genes de Resistencia (%)
blaTE
M blaSHV
-2 blaIMP
-1 blaIBC
-1 blaSPM.
1 blaVIM
-2 gyrA
gyrB
parC
aac(6’)Ib
qnrB
qnrS
ECEP IntI 1 4 5 0 0 0 4 6 6 6 1 3 2 ECET IntI 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 ECEI IntI 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 ECST IntI 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 ECEA IntI 1 11 5 0 0 0 5 3 3 3 1 3 0 ECAD IntI 1 2 2 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 Comensal
IntI 1 14 13 0 0 0 11 6 1 6 0 1 0
Nota. En los resultados se evidenció que el gen intI 1 fue el de mayor presencia (41%) esto explica la resistencia a antibióticos como Tetraciclina (florR, tetR y tetA), Trimetroprim/Sulfametoxazol (dfrA12, orfF, aadA2, blaCTX-M-15), Ampicilina (blaSHV-2, blaIBC-1), Sulbactam (blaSHV-2, blaIBC-1) y Gentamicina (aacA4, aac(6’)Ib).2021.
73
7. Discusión
La enfermedad diarreica aguda ha sido una de las principales enfermedades causantes
de muerte en niños menores de 5 años a través del tiempo, pero, recientemente la
preocupación ha aumentado debido a la presencia de resistencia antimicrobiana de E.
coli y sus distintos patotipos como causantes de EDA, con un total 701.6 muertes por
año (56).
Los integrones son elementos genéticos que hacen presencia a un más fuerte en
microorganismos como E. coli debido a que sus genes tienen la capacidad de
transformarse y no permitir que los antimicrobianos causen algún efecto en ellos (12),
lo anterior puede generarse a que actualmente la población se automedica sin tener
conciencia del gran impacto que se ejercerá positivamente en el microorganismo, no se
ha educado a la comunidad independientemente su estrato social sobre las
consecuencias negativas que se presentan con por estas prácticas (92).
Colombia, no es uno de los principales pioneros sobre la investigación en integrones, la
información recopilada a lo largo de este tiempo ha sido mínima, solamente dos
estudios han causado gran impacto, en Bogotá una revisión bibliográfica de los cuales
se investigaron los principales genes de resistencia antimicrobiana y su proceso de
evolución mediante la transferencia horizontal de genes presentes en bacilos
Gramnegativos (49), y en Bucaramanga (Santander), Farfán G., et al. (2015), el análisis
de los diferentes patotipos diarreagénicos de E. coli de los cuales fueron identificados
en 9,3% de casos y en 10% de los controles detectando a todos los patotipos E. coli
excepto de la E. coli enterotoxigénica productora de la toxina Shiga.
74
Sin embargo, estas informaciones ha sido la orientación para el reconocimiento de
resistencia antimicrobiana frente antibióticos en la tabla 10, donde se presenta la
resistencia fenotípica a Amoxicilina, Amoxicilina/Ácido Clavulánico, Ampicilina, Ácido
Nalidíxico, Ciprofloxacina, Cefotaxima, Ceftazidima, Ceftriaxona, Cloranfenicol,
Doxiciclina, Gentamicina, Trimetroprim/sulfametoxazol. Evidenciando la presencia de
cepas productoras de betalactamasas de amplio espectro y extendido.
Mediante la técnica de PCR se pudo identificar la presencia/ausencia de integrones de
clase 1, 2 y 3. En donde se evidenció que el gen intI 1 se encontraba en mayor
proporción que los demás genes, lo cual guarda relación con otros estudios realizados,
Young, H et al (2005), González, G et al (2004) y Dureja, C et al (2014) indicaron la
prevalencia de integrones de clase 1 en los aislados de E. coli sobre las demás clases
de integrones, lo cual contribuye directamente a la resistencia a Trimetoprim,
Aminoglucósidos y Sulfonamidas (82). Sin embargo, en nuestro estudio no se observó
presencia simultanea de integrones de clase 1 y 2 o 3, tal como lo indica un estudio
realizado por Ozgumus, O et al (2009), lo cual revela que la presencia de estas clases
de integrones conduce a la bacteria a ser un reservorio de genes de resistencia a
antibióticos en el medio ambiente (93), esto conlleva a la multiresistencia bacteriana de
E.coli para Trimetoprim, Aminoglucósidos y Estreptomicina, lo que sugiere que hay una
elevada exposición de esta multiresistencia en sujetos sanos que están libres de
exposición reciente a antimicrobianos (33), como es el caso de nuestra población de
estudio.
75
8. Conclusiones
Se logró determinar la presencia de Integrones de clase 1, en los
aislamientos de muestras pediátricas amplificadas mediante PCR de punto final, donde
se utilizaron oligonucleótidos específicos de la secuencia, dando como resultado la
amplificación de genes intI 1, sin presencia de genes intI 2 y 3.
Se evidencio el gen IntI 1 en los diferentes patotipos de E. coli, siendo
más frecuente en E. coli comensal con un 50 %.
De acuerdo con los fenotipos de resistencia bacteriana en las cepas de
estudio se tuvo más prevalencia en antibióticos como Amoxicilina, Ampicilina,
Doxiciclina, Trimetropim/Sulfametoxazol.
Se pudo observar que de los diferentes patotipos de E. coli, la E.coli
comensal evidenció mayor cantidad fenotípica de resistencia demostrando así la
transferencia horizontal de genes que existe entre las cepas.
76
9. Recomendación
Después de analizar los resultados obtenidos en este estudio se sugiere realizar
investigaciones orientadas a identificar los plásmidos que pueden ser reservorios de
genes de resistencia a antibióticos en este tipo de muestras provenientes de
poblaciones pediátricas
77
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