INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL …
69
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES MCT1, MCT2 Y MCT4 EN TEJIDOS DE CÁNCER PAPILAR DE TIROIDES DE PACIENTES MEXICANOS TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA P R E S E N T A: Felipe de Jesús Martínez García Directores de Tesis: Dra. Norma Estela Herrera González
Transcript of INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL …
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLÓGICAS
DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES
MCT1, MCT2 Y MCT4 EN TEJIDOS DE CÁNCER PAPILAR
DE TIROIDES DE PACIENTES MEXICANOS
TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO EN
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
P R E S E N T A:
Felipe de Jesús Martínez García
Directores de Tesis:
Dra. Norma Estela Herrera González
{ fÌ S T. I T' Lr V' û X} ü i, } T }i {: lN l t {} N /Á C l {} l\Ì /l I',,; ¡¡t:¡¿ t¡'r¿¡¡ia Ð I | ìN t,g,tl'I {;A(--ld¡¿ yloosr;'¡¡,.t,rto
CARTA CESION D]i DER.ECI.NS
ì:)r ia Ciudacl de ,-Méxioo.- --.e i cJÍa
-29 dci nres--litlcro-del ¿flo ..*-.2019 ,, ,,
el (la) quc susr:r'ìbc. ..Feli¡xr rjr: Jcsris 14aitínez Galcía- , alumno (a) del Prograrnrr
dc Ingenìelía Lr jo(ì tìiìll I cl a ci.li núiilcro c1c lcgistlci _20I4500831--, adsi:¡ìto
r lirc cl¡ \iacìnnrrl ,ìç t'iç,r, j2c lìjr.)ôgic¡,, nianìfiestâ qu'e es
âu1.ôr (a) jìllclecirÌal del presente tlabajo dc'lìcsìs bajo la dileccicin de I)la. Nor¡na Fìslela
IJcrrer¿r González--. *.... . -. y ccdç los tlcrloohos tiel ttabajo ìntitulaclo -Detclri.iinacióir
de la
expresión da los gc es À/tÛi ì, ì'1 i2 y iVtC')'4 er i-ráùcer ¡rapìlai cle l.irojcles de ¡raoìetrlcs
rloxicanos__., al hlslituto Politócnico NacionaI para su difusión, con fines acadómicos y dc
ìr,r r'sri¡r ', ió' r
ì,os usnalios de la infolnaciírn no debcn re¡rroducit ol contenido 1exlìÌâI. F-áficas o dalos del
lrabajo sìn el lrclnrjso er¡rtcso deì ¡Ìfîr \,/o diteclol del 1r'ahajo. Fslc Dr:ede sr-'r oblcniCo
escribicndo â [a sigujenic tlìrección., .1ì:lipcnai'lìnczL ?-34@gmail,conl ...... Si el ¡rertnìso
se olorJla, cl usuario debetai clal el a¡ladi:cinicnto concspolrdicnte ),cilar'ìa 1ì.rente iJeì nrìsnro.
.,' t:'..
Agradezco a mi madre, por ofrecerme todo lo que hubo a su alcance sin miedo
alguno del resultado, un pedido manufacturado sin señas ni fechas de entrega, por
la libertad que me obsequió atada a sus cuidados lejanos, la sutil guía.
A Karen que desde un inicio creyó en mí con una convicción auténtica y juntos
hemos celebrado muchos logros desde que tengo memoria.
A Gabriela que es un faro en esta ciudad alejada del mar pero que continuamente
se inunda.
Este trabajo se realizó en el laboratorio de Oncología Molecular, dentro de la sección
de posgrado de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional
bajo la dirección de la Dra. Norma Estela Herrera González.
Contenido
1. Introducción .................................................................................................... 1
1.1 ................................................................................................................................................. Cáncer
......................................................................................................................................................... 1
1.2 Glándula Tiroides ...................................................................................................................... 2
1.3 Nódulo tiroideo .......................................................................................................................... 3
1.4 Diagnóstico de nódulo tiroideo .................................................................................................. 4
1.5 Tratamiento de nódulos tiroideos malignos .............................................................................. 6
1.5.1 Radioterapia ....................................................................................................................... 6
1.5.2 Quimioterapia ..................................................................................................................... 7
1.6 Epidemiologia de cáncer de tiroides a nivel mundial ................................................................ 8
1.7 Epidemiologia de cáncer de tiroides en México ........................................................................ 8
1.8 Cáncer papilar de Tiroides ........................................................................................................ 8
1.9 Características histológicas ....................................................................................................... 9
1.10 Efecto Warburg ..................................................................................................................... 10
1.11 Fosforilación Oxidativa en Células tumorales ....................................................................... 12
1.12 Metabolismo de Lactato ........................................................................................................ 13
1.12.1 Reversa del Efecto Warburg .......................................................................................... 13
1.12.2 Simbiosis metabólica de Lactato .................................................................................... 14
1.13 La familia de Transportadores de monocarboxilatos ............................................................ 15
1.13.1 MCT1 .............................................................................................................................. 16
1.13.2 MCT2 .............................................................................................................................. 17
1.13.3 MCT4 .............................................................................................................................. 18
1.14 Expresión de Transportadores MCT en cáncer de tiroides .................................................. 19
1.15 Inhibición del Metabolismo de Lactato .................................................................................. 20
1.16 Estudios in vitro e in vivo de la inhibición de transportadores MCT...................................... 22
2. Justificación .................................................................................................. 24
3. Objetivos ....................................................................................................... 25
4. Materiales y métodos ................................................................................... 26
4.1 Material Biológico .................................................................................................................... 26
4.1.1 Criterios de colección de muestras .................................................................................. 26
4.2 Reactivos y equipo .................................................................................................................. 27
4.2.1 Extracción de RNA ........................................................................................................... 27
4.2.2 Retrosíntesis..................................................................................................................... 27
4.2.3 Electroforesis .................................................................................................................... 27
4.2.4 PCR Punto Final ............................................................................................................... 27
4.2.5 qPCR ................................................................................................................................ 27
4.2 Desarrollo experimental .......................................................................................................... 28
4.3 Métodos ................................................................................................................................... 29
4.3.1 Colección de muestras ..................................................................................................... 29
4.3.2 Extracción de RNA ........................................................................................................... 29
4.3.3 Electroforesis submarina .................................................................................................. 30
4.3.4 Tratamiento con DNAse ................................................................................................... 30
4.3.5 Retrosíntesis de cDNA ..................................................................................................... 31
4.3.6 PCR punto final ................................................................................................................ 31
4.3.7 qPCR ................................................................................................................................ 31
4.3.8 Método de 2-ΔΔCt (Livak, K. et al., 2001) ........................................................................... 33
5. Resultados………………………………………………………………………..34
5.1 Datos clínicos de los pacientes ............................................................................................... 34
5.2 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR) .......................................................................................... 38
6. Discusión ....................................................................................................... 47
6.1 Comportamiento de los transportadores de monocarboxilato en la población de tumores
cancerosos .................................................................................................................................... 50
7. Conclusiones ................................................................................................ 52
8. Bibliografía .................................................................................................... 53
A. Índice de Figuras
Figura 1. Imágenes de la Glándula Tiroides ______________________________ 3
Figura 2. Clasificación de nódulos de tiroides a partir de la prueba de Punción y
aspirado por aguja fina ______________________________________________ 5
Figura 3. Características histológicas del cáncer papilar de tiroides ___________ 9
Figura 4. Modelos de lanzaderas de lactato en cáncer ____________________ 14
Figura 5. Filogenia supuesta para la familia de MCT ______________________ 15
Figura 6. Localización celular de MCT1 ________________________________ 17
Figura 7.Localización celular de MCT _________________________________ 18
Figura 8. Localización celular de MCT4 ________________________________ 19
Figura 9.Modelo para blancos terapéuticos basado en el metabolismo simbiótico
de lactato _______________________________________________________ 21
Figura 10. Desarrollo experimental para la determinación de la expresión de
mRNA de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en tejidos de carcinoma papilar y
tejidos sanos. ____________________________________________________ 28
Figura 11. Evaluación de la integridad de RNA mediante electroforesis en gel de
agarosa. ________________________________________________________ 36
Figura 12. Electroforesis de los productos de la reacción de PCR punto final para
corroborar la síntesis de las muestras de cDNA. _________________________ 37
Figura 13. Amplificación de GAPDH en muestras de tejido maligno y tejido sano38
Figura 14. Valores calculados de la expresión genética relativa _____________ 41
Figura 15. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4
entre tejidos cancerosos y sanos. ____________________________________ 42
Figura 16. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en
tejidos cancerosos en referencia a su estadio ___________________________ 44
Figura 17. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en
tejidos cancerosos en referencia al tamaño del tumor _____________________ 44
Figura 18. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en
tejidos cancerosos en referencia al tamaño del tumor _____________________ 46
B. Índice de Cuadros
Cuadro 1. Estudios de inhibición de transportadores MCT in vitro e in vivo.
Modificado de (Baltazar et al. 2014) ___________________________________ 22
Cuadro 2. Material biológico ________________________________________ 26
Cuadro 3. Secuencia de los cebadores de los genes para las pruebas de
amplificación _____________________________________________________ 32
Cuadro 4. Características clínicas de los pacientes _______________________ 34
Cuadro 5. Valores de CT obtenidos de las muestras estandarizadas para los
genes GAPDH, MCT1, MCT2 y MCT4 _________________________________ 39
Cuadro 6. Valores calculados de la expresión genética relativa _____________ 40
C. Abreviaturas
ADP: Adenosín Difosfato
ATP: Adenosín Trifosfato
CHC: α-ciano-4-hidroxicinamato
cDNA: DNA complementario
LDH5: Lactato deshidrogenasa isoforma A
L-T4: Levotiroxina
MCT: Transportador de Monocarboxilatos
miRNA: micro RNA
mRNA: RNA mensajero
PAAF: Punción por aspiración de aguja fina
PET: Tomografía de Emisión de Positrones
THS: Hormona estimulante de la tiroides
131I: Yodo radioactivo 131
1
1. Introducción
1.1 Cáncer
El cáncer se origina a partir de una serie de alteraciones genéticas y epigenéticas
que conducen a la transformación maligna de células normales. Hace más de una
década que fueron propuestas por Hanahan y Weinberg las características
celulares adquiridas en el desarrollo y progresión del cáncer, las cuales son
compartidas por todos los tipos de cáncer en menor o mayor grado. Estás
características son: Autosuficiencia de los señalamientos moleculares que inducen
a la proliferación, insensibilidad a los señalamientos de anti-crecimiento, evasión de
la apoptosis, potencial ilimitado de la replicación celular, aumento de la
angiogénesis e invasión tisular y desarrollo de metástasis.Estos cambios radicales
en la célula dan origen a una proliferación descontrolada de células malignas, ya
que estás tienen ventaja sobre las células normales al presentar mutaciones en
distintos genes que les otorgan capacidades de supervivencia en un microambiente
altamente selectivo (Hanahan et al., 2000).
A medida que el tiempo pasa, se han propuesto nuevas características generales
en el cáncer, entre las que destacan la inestabilidad genómica, alteraciones en la
proliferación y diferenciación celular mediadas por miRNA, alteraciones en la
presencia antigénica celular, inmunosupresión en el microambiente tumoral y
reprogramación del metabolismo energético celular (Hanahan et al., 2011). No
obstante a que se han establecido características que comparten la mayoría de los
tipos de cáncer como inmortalidad replicativa permitida, invasión y metástasis,
evasión de la destrucción inmune y desregulación energética celular entre otros, es
menester el estudio de estas en cada subtipo de cáncer de cada órgano ya que
existe una variabilidad significativa, sumado a la diferencia que puede presentarse
también de paciente a paciente.
2
1.2 Glándula Tiroides
La glándula tiroides es una glándula endocrina bilobulada que está en la región
anterior del cuello y se compone de dos lóbulos laterales grandes unidos por un
istmo, que es una delgada banda de tejido tiroides. Los dos lóbulos, están situados
a ambos lados de la laringe y la porción proximal de la tráquea. El istmo cruza la
línea media por delante del extremo proximal de la tráquea. La glándula está
rodeada por una fina cápsula de tejido conjuntivo que envía tabiques hacia el interior
del parénquima para delimitar parcialmente lobulillos irregulares. La unidad
funcional y estructural de la tiroides es el folículo tiroideo, el cual se define como un
compartimiento de aspecto quístico, más o menos esferoidal que tiene una pared
formada por un epitelio simple cúbico o cilíndrico bajo, el epitelio folicular.
El parénquima de la glándula tiroides está compuesto por un tejido epitelial que
posee dos tipos de células, las células foliculares (células principales) y las células
parafoliculares (células C). Estás células son importantes en la producción de tres
hormonas, cada una de las cuales es indispensable para el metabolismo normal y
la homeostasis:
Tiroxina (tetrayodotironina, T4) y triyodotironina (T3). Estas 2 hormonas son
sintetizadas y secretadas por las células foliculares. Ambas hormonas
regulan el metabolismo basal y la producción de calor de las células y los
tejidos e influyen sobre el crecimiento y el desarrollo corporales. La secreción
de estas hormonas es regulada por la TSH liberada por el lóbulo anterior de
la hipófisis.
Calcitonina (tirocalcitonina). Esta hormona es sintetizada por las células
parafoliculares (células C) y es un antagonista fisiológico de la hormona
paratiroidea (PTH). La calcitonina desempeña un papel importante en la
regulación de calcio (calcemia). En los animales inferiores la calcitonina
disminuye la calcemia al suprimir la acción reabsortiva de los osteoclastos y
promueve el depósito del calcio en los huesos al acrecentar el ritmo de
calcificación del osteoide. En seres humanos se desconoce su función
específica.
3
Existe otro componente importante el cual representa la porción principal del
material gelatinoso llamado coloide, contenido en los folículos tiroideos. Se trata de
una glucoproteína yodatada de gran tamaño (660 kDa), denominada tiroglobulina
que contiene unos 120 residuos de tirosina. En el coloide también hay varias
enzimas y glucoproteínas. La tiroglobulina no es una hormona sino la forma inactiva
que cumple la función de almacenamiento de las hormonas tiroideas. Las hormonas
tiroideas activas se extraen de la tiroglobulina y se liberan en los capilares
sanguíneos fenestrados que rodean los folículos sólo después de que se han
procesado adicionalmente dentro de las células foliculares. La tiroides es singular
entre las glándulas endocrinas por que almacena en forma extracelular grandes
cantidades de su producto de secreción (Ross et al., 2007).
1.3 Nódulo tiroideo
Un nódulo tiroideo se define como una lesión intratiroidea radiológicamente distinta
al parénquima que la rodea. El nódulo puede ser único o múltiple; son lesiones
mayores de 6 a 8 mm de diámetro y generalmente benignas. Su frecuencia es de 4
a 7 % en la población general si el diagnóstico se hace por palpación de cuello y
hasta de 30 a 50 % si es por ultrasonido o gammagrafía. La incidencia se incrementa
con la edad, es cuatro veces mayor en mujeres que en hombres y los nódulos únicos
predominan sobre los múltiples (Ambriz et al., 2000). En la mayoría de los casos se
trata de una alteración benigna, sin embargo, alrededor del 10 % – 15 % resultan
nódulos malignos (Kamran et al., 2012).
Figura 1. Imágenes de la Glándula Tiroides. A) Glándula Tiroides Normal. B) Cáncer
Papilar de Tiroides. Se observa el daño que ha recibido una glándula afectada por el cáncer. Tomadas de www.pathologyoutlines.com y www.humpath.com respectivamente.
4
1.4 Diagnóstico de nódulo tiroideo
En el paciente con nódulo único o múltiple, se debe considerar la edad, sexo, tiempo
de evolución, progresión o regresión del tamaño del nódulo tiroideo, antecedentes
familiares de patología tiroidea y cáncer, radiaciones y signo sintomatología
obstructiva. Después de la historia clínica y exploración física completas le siguen
los exámenes bioquímicos y de imagen que se consideren necesarios. Algunos
exámenes realizados son: Determinación de los niveles de hormona estimulantes
TSH, gammagrafía, ecosonografía y tomografía axial computarizada (Ambriz et al.,
2000).
La metodología principal para el diagnóstico de nódulos es la punción y aspiración
por aguja fina (PAAF), la cual tiene como principales ventajas (Zerpa et al., 2013):
Ser segura
Reduce los costos de atención médica
Es rápida en su elaboración
Permite seleccionar a los pacientes que serán sometidos a tratamiento
quirúrgico.
Sin embargo, a pesar de sus ventajas la PAAF sólo logra distinguir
aproximadamente el 70 % de las veces entre lesiones malignas y benignas, dejando
entre el 20-30 cómo nódulos con citología indeterminada los cuales podrían tener
altos riesgos de malignidad, pero están exentos de una certeza diagnostica (Roman-
González et al., 2013).
5
De acuerdo a los resultados de la PAAF los nódulos tiroideos se agrupan en 5
clasificaciones (Zerpa et al 2013.,):
Figura 2. Clasificación de nódulos de tiroides a partir de la prueba de Punción y
aspirado por aguja fina. La clasificación de los resultados brinda una mejor
perspectiva para el cómo actuar respecto al tratamiento del nódulo, excepto para la
clase 4, los nódulos clasificados como sospechosos es la limitante mayor de la
PAAF. (Zerpa et al., 2013)
La incapacidad de la prueba de PAAF para asegurar que los nódulos con citología
indeterminada están libres de cáncer conlleva a una lobectomía para la mayoría de
los pacientes, sin embargo la mayoría de los nódulos tiroideos removidos por cirugía
son benignos. Debido a esto, se han implementado marcadores tumorales que han
sido ampliamente validados y clínicamente usados en diagnósticos pre operativos
de cáncer de tiroides en muestras de PAAF. Algunos marcadores son las
mutaciones puntuales en el gen BRAF y RAS, así como también los arreglos de los
genes PAX8/PPARG, RET/PTC y NTRK1.
Resultados de la PAAF
Clase 1. No diagnostica (10-15%)
En caso de insuficiente número de células
Clase 2. Benigna (60-80%)
Nodulos coloides, hiperplásicos, quísticosy tiroiditis linfocíticas
Clase 3. Lesiones Foliculares (10-20%)
Hiperplasia adenomatosa, carcina oadenoma folicular, carcinoma de célulasHürtle y variante folicular de carcinomapapilar.
Clase 4. Sospechosa (2.5-10%)
Muestras con adecuada concentración decélulas pero que sus hallazgos nopermiten definir un criterio de malignidad
Clase 5. Maligna (3.5-10%)
Carcinoma papilar, folicular, medular,anaplásico, linfoma o metástasis
6
La identificación de cualquiera de estas mutaciones es un indicador conciso de
malignidad en nódulos tiroideos, aún sin tener en cuenta el diagnóstico citológico
(Nikiforova et al., 2016).
1.5 Tratamiento de nódulos tiroideos malignos
Una vez realizado el análisis de PAAF y clasificado el nódulo tiroideo como maligno
o cómo sospechoso de malignidad se recomienda generalmente la realización de
una tiroidectomía total. Se opta también por este tipo de cirugía en situaciones en
las que existe: una historia de radiación en la cabeza o cuello durante la niñez o
adolescencia, cuando se presentan antecedentes de familiares con cáncer de
tiroides; o cuándo el nódulo tiene una extensión mayor a 4 cm (Burman et al., 2015).
Una vez realizada la cirugía se proporciona radioterapia con yodo radioactivo, la
cual es el tratamiento estándar en varios países y dependiendo de la operación, se
puede implementar una terapia supresiva de la hormona estimulante de la tiroides
(THS) con levotiroxina (L-T4) con el fin de inhibir el crecimiento de la TSH, del tejido
tiroideo que pueda quedar tras el tratamiento inicial. El tratamiento con 131I permite
destruir los restos tiroideos que pudieran quedar en el lecho tiroides, disminuye las
recidivas (reaparición del tumor) y facilita el seguimiento con controles de
tiroglobulina. La tiroglobulina es una glicoproteína que se almacena en el espacio
tiroideo y en pacientes que han sido tiroidectomizado y tratado con yodo radiactivo
su presencia indica en la mayoría de los casos tejido tiroideo tumoral (Ríos et al.,
2015).
1.5.1 Radioterapia
La radioterapia externa del cuello es utilizada infrecuentemente, y suele indicarse
en tumores o recurrencias irresecables, sobre todo si no captan 131I (Ríos et al.,
2015). Este tipo de terapia debe ser planeada cuidadosamente para ofrecer al
paciente las mejores probabilidades de curación con la menor morbilidad posible.
7
La radioterapia externa en un estudio de supervivencia no mostró diferencias
significativas entre los pacientes que fueron sometidos únicamente a cirugía, cirugía
combinado con administración de 131I o radioterapia externa, o ambos tratamientos.
Sin embargo se concluyó que la radioterapia externa está justificada en pacientes
calificados de alto riesgo debido a que esta, junto con la administración de Iodo
radioactivo son terapias agresivas (Rodríguez-Cuevas et al., 2002).
La Sociedad Americana de Tiroides (ATA, por sus siglas en inglés) indica que este
tipo de terapia debe ser considerada en pacientes con edad igual o mayor a 45 años
que tienen una extensión extratiroidal excesiva al momento de la cirugía. En adición,
la ATA recomienda radioterapia para pacientes que después de la cirugía cuentan
con una gran cantidad de tumor residual en los que la terapia con yodo radioactivo
no es efectiva (Cooper et al., 2009).
1.5.2 Quimioterapia
La quimioterapia citotóxica tiene uso restringido en pacientes con una enfermedad
que progresa a pesar de la cirugía, lo cual ha sido estudiado en carcinoma folicular
y carcinoma tiroideo de célula Hürtle. La respuesta es baja y en el mejor de los
casos puede llegar hasta un 10-20 % para algunos compuestos cómo doxorrubicina
o una combinación de doxorrubicina-platino. Sin embargo la quimioterapia parece
ser mejor en carcinomas pobremente diferenciados y en casos avanzados este tipo
de terapia puede ser efectiva para reducir el tamaño tumoral y favorecer la cirugía
(Ríos et al., 2015).Otros compuestos como el metimazol y propiltiouracilo son de
poca utilidad en la enfermedad nodular tóxica, por que la tasa de recaídas es mayor
al 50 % después de dos años de tratamiento. Además, la gran mayoría son
pacientes ancianos, que requieren una pronta resolución de la enfermedad debido
a las complicaciones potenciales (Ambriz et al., 2000). Respecto al uso de
quimioterapéuticos, la Sociedad Americana de Tiroides no recomienda este tipo de
tratamientos debido a que los compuestos existentes han tenido resultados no
favorables (Cooper et al., 2009).
8
1.6 Epidemiologia de cáncer de tiroides a nivel mundial
De acuerdo al Reporte Mundial de Cáncer del 2014 por parte de la OMS:
El cáncer de tiroides es uno de los pocos cáncer sexo no específico que son
más frecuentes en mujeres, con un total de 77% de los casos ocurridos en
2012 de cáncer de tiroides por parte del género femenino.
En hombres, el cáncer de tiroides representa el 18° cáncer más frecuente y en
mujeres se encuentra en el número 8.
Se estima que el 37% de los nuevos casos ocurren en Europa y Norte America
y 48% en Asia (Stewart, B. W. K. P et al., 2014).
1.7 Epidemiologia de cáncer de tiroides en México
En el país, el cáncer de tiroides representa el 3.7 % del total de casos nuevos
diagnosticados. Esto es con respecto a las cifras presentadas por el Hospital
de Oncología del Centro Médico Siglo XXI y que corresponden al período del
2005-2012 (Martínez-Sánchez et al., 2014). Adicionalmente, al observar la
tendencia de los valores de incidencia en cáncer de tiroides a través del
período de tiempo estudiado, se puede inferir que el diagnostico de nuevos
casos aumenta constantemente, sin embargo esto puede deberse al desarrollo
de nuevas herramientas de diagnóstico más exactas y confiables (Stewart, B.
W. K. P et al., 2014).
1.8 Cáncer papilar de Tiroides
El cáncer papilar de Tiroides es el tipo de cáncer de tiroides más común en la Ciudad
de México, seguido por el cáncer folicular. La frecuencia correspondiente a cáncer
de tiroides diferenciado es mayor al 90 % (Flores et al., 2010). Los tumores papilares
de tiroides son la forma más común de cáncer de tiroides que se cree que es
resultado de una exposición a radiación. La esperanza de vida de pacientes con
este cáncer es relativa a su edad. El pronóstico es mejor para pacientes jóvenes
9
que para pacientes que superan los 45 años. Cerca del 11% de los pacientes con
cáncer papilar presentan metástasis fuera del cuello (Santacroce 2012).
1.9 Características histológicas
La mayoría de los carcinomas papilares contienen largos complejos de papilas que
tienen un núcleo fibrovascular cubierto por una sola capa de células tumorales. El
núcleo de las células de carcinoma papilar puede mostrar numerosos cambios,
entre ellos se incluyen: una apariencia a “vidrio esmerilado”, aumento de tamaño,
manchas pálidas, contorno irregular con surcos profundos, nucléolo discreto y
pseudo inclusiones resultantes de invaginaciones citoplasmas.
Figura 3. Características histológicas del cáncer papilar de tiroides, tinciones de Hematoxilina-Eosina. A) Papilas con estromas fibrosos. B) Sobreposición de núcleos con
superficie cristalina y surcos nucleares. C) Cuerpos de Psammoma (Hedinger, C 2012).
A B
C
10
Estas características nucleares son importantes en el reconocimiento de carcinoma
papilar mediante PAAF, sin embargo aunque son de gran ayuda no siempre arrojan
un diagnóstico correcto. En una gran mayoría de tumores, una porción minoritaria
de células exhibirá estas características (Wright 1989).
Los carcinomas papilares se propagan hacía los nódulos linfáticos, pero pueden
también hacer metástasis hacía órganos distantes, particularmente pulmón. Las
variantes del carcinoma papilar son: carcinoma papilar variante convencional,
carcinoma papilar variante de mal pronóstico, carcinoma folicular, carcinoma de
células de Hürtle, carcinoma insular, carcinoma medular, carcinoma anaplásico
(Granados et al. 2009).
1.10 Efecto Warburg
Las células normales en presencia de Oxígeno degradan a la glucosa a través de
dos mecanismos catabólicos acoplados: la glicólisis, en la cual la glucosa es
oxidada hasta piruvato generando dos moléculas altamente energéticas de
Adenosina Trifosfato (ATP) y el ciclo de los ácidos tricarboxilicos (ciclo de Krebs).
El piruvato generado a partir de la glicólisis es sometido a una serie de reacciones
enzimáticas que permiten un flujo de electrones a través de la cadena respiratoria,
que a su vez produce la fosforilación de Adenosina difosfato (ADP), dando como
rendimiento un total de 38 moléculas de ATP por mol de glucosa (Locasale et al.
2010). Sin embargo, las células tumorales presentan una desregulación en su
metabolismo energético, ya que aún en presencia de oxígeno optan por llevar a
cabo una oxidación parcial de la glucosa a través de la glicólisis, en donde el
producto final es el lactato. A esta vía de obtención de energía de glucosa para las
células malignas se le denominó “glicólisis aerobia”. Otto Warburg adjudicó esta
descompensación en la utilización de la fosforilación oxidativa, a una falla
mitocondrial que impedía el correcto funcionamiento de esta vía de obtención de
ATP (Warburg 1956).
11
A partir de la reprogramación del mecanismo de obtención de energía de las células
tumorales (que aparentemente optan por una glicólisis aerobia) se producen otras
alteraciones en el microambiente celular, las cuales en conjunto son conocidas
como el fenotipo Warburg, ya que todas estas se derivan del metabolismo
hiperglicolítico de obtención de energía.
Las características más importantes del Efecto Warburg son:
1.- Acidificación del microambiente extracelular: el lactato producido al oxidar
parcialmente la glucosa es transportado al exterior de la célula mediante proteínas
simportadoras de protones, las cuales trasladan una molécula de lactato al exterior
e introducen a la célula un protón para regular el pH intracelular (Warburg 1956).
Estas proteínas se conocen como Transportadores de Monocarboxilatos (MCT’s),
las cuales se encuentran codificadas por el gen SLC16 y pertenecen a una familia
de 14 miembros (Doherty et al., 2013). La proteína MCT4 es la encargada de
transportar el lactato al exterior de la célula, provocando una acumulación de esta
molécula que disminuye el pH alrededor de las células tumorales y les confiere
ventajas sobre las células normales (Jose et al., 2011).
2.- Alta producción de anfibolitos: A pesar de que la célula tumoral obtiene una
limitada cantidad de energía a través de la glicólisis (dos moléculas de ATP), esta
aumenta los flujos normales de glucosa para producir una cantidad importante de
compuestos que son utilizados como base en la síntesis de moléculas para el
crecimiento celular. Como los aminoácidos para la formación de proteínas, los
lípidos para la formación de estructuras membranales y los ácidos nucleicos para la
formación del material genético (Jose et al., 2011).
3.- Aumento en el consumo de glucosa: El aumento en el consumo de glucosa se
encuentra mediado por la familia de proteínas GLUT, las cuales son transportadoras
de glucosa y se ha reportado que en varios tipos de cáncer se encuentran altamente
expresadas (Marín-Hernández 2009). Incluso, este aumento en el consumo de
glucosa se ha visualizado en cáncer de tiroides mediante la técnica de Tomografía
de Emisión de Positrones (PET), usando un análogo de la glucosa, el 18F-
Fluorodesoxiglucosa (Kim et al., 2005).
4.- Activación de HIF-1: HIF-1 es un factor de transcripción que se estabiliza en
respuesta a la hipoxia (bajas tensiones de oxígeno). La estabilización de este factor
12
se debe a la activación de varias vías oncogénicas aún en condiciones no hipóxicas,
dando como resultado una activación de la glicólisis (Kim, J et al., 2006).
1.11 Fosforilación Oxidativa en Células tumorales
Existen disyuntivas acerca de la vía preferencial de obtención de glucosa de las
células tumorales. A partir de la publicación de Otto Warburg, surgieron
investigaciones que intentan explicar y conocer más de este fenómeno, así como
determinar la validez del mismo. Weinhouse y sus colaboradores, el mismo año de
la publicación de Otto Warburg dieron a conocer un estudio en el cual se evaluaba
la respiración mitocondrial en células tumorales y en células normales. El resultado
mostró que no había diferencia en los niveles de utilización de oxígeno entre los dos
grupos estudiados (Weinhouse et al., 1956). Esto descartó la hipótesis de Warburg
acerca de una disfunción mitocondrial y sugirió que las células tumorales podían
valerse también de la fosforilación oxidativa para la obtención de energía.
Guppy et al en 2002, realizaron un estudio en el cual evaluaron el porcentaje de la
vía metabólica que contribuía mayormente a la obtención de energía en la línea
celular de cáncer de mamá MCF-7. Las células fueron incubadas utilizando glucosa,
glutamina, palmitato y ácido oleico. Los resultados mostraron que el 79.2 % del total
de ATP, era producido mediante una oxidación completa de la glucosa y el 20.8 %
restante se obtenía a partir de la glicólisis (Guppy et al., 2002).
En células tumorales, las vías principales de obtención de energía se encuentran
sometidas a la regulación por medio de los oncogenes HIF-1α, RAS, C-MYC, SRC
y a las proteínas como p53, los cuales influyen en la elección del mecanismo de
obtención de energía. Estos cambios siempre son a favor de la supervivencia de la
célula tumoral. Dado esto, existe la posibilidad de que las células tumorales pueden
cambiar un metabolismo glicolítico a uno oxidativo de acuerdo a los diferentes
estados de la célula en la progresión tumoral (Jose et al., 2011).
13
1.12 Metabolismo de Lactato
El lactato es producido a través de la transferencia de un protón y un electrón al
piruvato, reacción catalizada por la enzima Lactato Deshidrogenasa isoforma A
(LDH5). El flujo de este catabolito, de piruvato, butirato y otros cuerpos cetónicos al
interior y exterior de la célula, se encuentra mediado por proteínas transportadoras
de monocarboxilatos, especialmente MCT1, MCT2, MCT3 y MCT4, las cuales
tienen dos funciones principales: (Doherty et al., 2013)
1. Permitir el elevado flujo de glucosa en células hiperglicolíticas al regular el
flujo de lactato.
2. Mantener una homeostasis del pH, ya que son proteínas de simporte de
protones.
La utilización de lactato como fuente de carbono para la fosforilación oxidativa, fue
evaluada en líneas celulares de cáncer por Sonveaux y colaboradores en 2008. En
este estudio se determinó que las células tumorales pueden ingresar el lactato al
interior de la célula y además ser utilizado para la producción de energía. La
proteína encargada de mediar el ingreso de lactato a la célula fue la MCT1, ya que
esta proteína se ha localizada en la membrana plasmática de fibras musculares
oxidativas. A diferencia de la MCT1, la MCT4 se ha localizado en la membrana
plasmática de las fibras musculares glicolíticas (Sonveaux et al., 2008). La manera
en que operan estas lanzaderas de lactato se han explicado principalmente por dos
modelos: la reversa del efecto Warburg y la simbiosis metabólica de lactato.
1.12.1 Reversa del Efecto Warburg
Este modelo propone que las células tumorales pueden provocar que las células del
estroma que se encuentran aledañas al tumor tengan un metabolismo glicolitíco,
por lo tanto exportaran lactato (además de cetonas y piruvato) al microambiente
extracelular inmediato. Este lactato será transportado al interior de las células
tumorales a través de la MCT1 y utilizado en la fosforilación oxidativa (Figura 4A).
14
Dado que la fosforilación oxidativa conlleva a la formación inherente de especies
reactivas de oxígeno (siendo el más común H2O2), las células del estroma estarán
sometidas a un ambiente “pseudo-hipóxico”. Este ambiente será capaz de activar al
HIF-1α, el cual promoverá el carácter glicolítico de estas, generando a su vez más
lactato que será aprovechado por las células tumorales.
Figura 4. Modelos de lanzaderas de lactato en cáncer. (A) Reversa del Efecto Warburg. (B) Simbiosis de lactato. Imagen modificada de (Doherty et al. 2013).
1.12.2 Simbiosis metabólica de Lactato
Este modelo se ha propuesto que sucede entre células cancerígenas dentro de un
tumor, donde existen células sometidas a un estado de hipoxia por la estabilización
de HIF-1α. Estas células mantienen un perfil hiperglicolítico, pero existen otras que
no están en condiciones de hipoxia y estás llevan a cabo la fosforilación oxidativa
15
preferencialmente (Figura 4B). Las células glicolíticas producen un alto flujo de
lactato, el cuál es importado y metabolizado por las células oxidativas.
1.13 La familia de Transportadores de monocarboxilatos
Los transportadores de monocarboxilatos (MCTs) pertenecen a una familia de
transportadores codificados en la familia del gen SLC16 que se compone de 14
miembros. Las isoformas 1-4 han sido las mejor caracterizadas y la función de todas
las isoformas aún no se conoce del todo (Baltazar et al., 2014).
Figura 5. Filogenia supuesta para la familia de MCT. Los transportadores de monocarboxilato se agrupan de acuerdo a los sustratos a los que tienen afinidad, esto les hace compartir similitudes en su estructura proteíca. Modificada de Fisel et al., 2018
Acoplado a H+
Independiente de H+
Sustrato endógeno
16
Se ha predicho que todos los miembros de esta familia poseen 12 hélices
transmembranales con terminales intracelulares C- y N- y un largo lazo citosólico
entre la terminal 6 y la terminal 7 (Halestrap, A. 2012).
Dentro de la familia de los transportadores de monocarboxilato únicamente se ha
confirmado la función de co-transportadores de protones en MCT1 – MCT4. MCT10
fue identificado como un transportador de aminoácidos aromáticos y MCT8 ha
resultado ser un importante transportador de hormonas tiroideas. El transporte
mediado de MCT8 y MCT10 no involucra el transporte de protones (Meredith et al.,
2008). Es importante señalar que la función de los otros 8 transportadores de
monocarboxilato es desconocida. En adición a esto, la filogenia de la familia MCT
(Figura. 5) puede suponerse debido a que sus regiones transmembranales se han
mantenido bien conservadas (Jones et al., 2016).
Es importante aclarar que existe una discrepancia entre el número de la isoforma
de los MCT y la nomenclatura SLC16A, esto proviene del orden en el cual la
secuencia de los cDNA de cada MCT fue determinada y caracterizada (Jones et al.,
2016).
1.13.1 MCT1
MCT1 facilita el transporte transmembranal ligado al simporte de protones de
monocarboxilatos metabólicamente importantes como el lactato, el piruvato,
oxoácidos de cadena corta y los cuerpos cetónicos iodo acetato y β-hidroxibutirato.
MCT1 tiene una distribución ubicua (que está presente en todas partes) en tejidos
humanos, con una expresión importante en el corazón y músculo. Esta isoforma
tiene una afinidad intermedia por sus sustratos y está involucrada tanto en la
importación como en la exportación de monocarboxilatos (Jones et al., 2016)
17
1.13.2 MCT2
MCT2 es considerado un transportador de gran afinidad que traslada
monocarboxilatos al interior de la célula. Este se encuentra mayormente en tejidos
que usan lactato como fuente de carbono para la fosforilación oxidativa, cómo el
tejido cerebral, el cardíaco y músculo rojo. También se encuentra distribuido en el
riñón e hígado, dónde el lactato es el mayor sustrato gluconeogénico (Baltazar et
al., 2014).
Figura 6. Localización celular de MCT1. Se observa que la presencia de MCT1 predomina en la membrana plasmática facilitando el transporte de alfa ceto ácidos a la célula. Imagen provista por www.proteinatlas.org
Compartimentos sin detectar
MCT1 detectada en membrana plasmática y uniones celulares
18
1.13.3 MCT4
MCT4 es conocido como un transportador de baja afinidad y ha sido observado
particularmente en tejidos glicolíticos como las fibras musculares del esqueleto
blanco, astrocitos y células blancas de la sangre (Baltazar et al., 2014).
Figura 7.Localización celular de MCT2. Se observa que MCT2 tiene actividad a
nivel de la membrana plasmática y a diferencia de MCT1 Y MCT4 se encuentra
en el nucleoplasma para participar en mecanismos de reparación de DNA a
través del transporte de lactato. Imagen provista por www.proteinatlas.org.
Compartimentos sin detectar
MCT2 detectada en el nucleoplasma y en la membrana plasmática
19
1.14 Expresión de Transportadores MCT en cáncer de tiroides
La presencia de transportadores MCT, ha sido investigada en tejidos de carcinoma
papilar de tiroides y en cáncer anaplásico de tiroides usando ensayos de
inmunohistoquímica. Se encontró que la expresión de MCT1 en cáncer de tiroides
anaplásico era mayor a su expresión en cáncer papilar de tiroides. Estos resultados
los relacionan con la agresividad de cada tipo de tumor y el porcentaje de
supervivencia de cada uno (Johnson et al., 2015).
Figura 8. Localización celular de MCT4. Se observa que MCT4 se encuentra tanto en membrana plasmática como nuclear. Dada su baja afinidad por el lactato a diferencia de MCT1 y MCT4, esta proteína se encarga de la expulsión del lactato al exterior del núcleo y de la célula Imagen provista por www.proteinatlas.org
Compartimentos sin detectar
MCT4 en la membrana nuclear y membrana plasmática
20
1.15 Inhibición del Metabolismo de Lactato
Dado que los transportadores MCT son reguladores críticos del pH intracelular y
además modulan el flujo de lactato al interior y exterior de la célula favoreciendo la
obtención de energía mediante la fosforilación oxidativa, se ha propuesto que la
inhibición de su función transportadora sea un blanco terapéutico que contrarreste
el desarrollo tumoral. La vía de inhibición de los transportadores MCT es mediante
un quimioterapéutico, los cuales pueden clasificarse en 3 categorías:
Monocarboxilatos voluminosos o aromáticos. Ejemplo el α-ciano-4-
hidroxicinamato (CHC)
Compuestos anfipáticos. Ejemplo los bioflavonoides como la quercetina y
floretina
Compuestos derivados del estilbeno
La sensibilidad de cada inhibidor varía de acuerdo a la isoforma del transportador
MCT, debido a la afinidad de cada MCT por el quimioterapéutico (Baltazar et al.,
2014).
El MCT1 es el mejor candidato de los transportadores MCT, ya que al ser inhibido
desacelera el desarrollo tumoral al inducir una necrosis en células adyacentes a la
zona donde se bloquea el transporte de lactato al interior de la célula (Figura 9).
Considerando el modelo de lanzadera de Simbiosis metabólica de lactato, al actuar
un inhibidor de MCT1 sobre una célula que utiliza lactato como fuente de carbono
para la fosforilación oxidativa, se obliga a que esta célula opte por un metabolismo
glicolítico.
21
Esto ocasionará una redistribución de glucosa en el microambiente celular, debido
a que las células que presentan inhibición del MCT1 demandarán la glucosa que
estaba destinada a las células que se encuentran en estado de hipoxia y que tienen
un metabolismo glicolítico. Esto da como resultado una insuficiencia en el abasto de
glucosa que hará que algunas células sufran necrosis debido a la falta de fuente de
energía. (Sonveux et al., 2008).
Figura 9.Modelo para blancos terapéuticos basado en el metabolismo simbiótico
de lactato. Imagen modificada de Sonveaux, P et al., (2008).
22
1.16 Estudios in vitro e in vivo de la inhibición de transportadores
MCT
En el cuadro 1 se muestran algunos estudios realizados sobre el efecto de la
inhibición de transportadores de monocarboxilatos en células tumorales.
Cuadro 1. Estudios de inhibición de transportadores MCT in vitro e in vivo. Modificado de (Baltazar et al. 2014)
Inhibidor Tipo de cáncer Resultado Referencia
In vitro
Inhibición de
MCT1 con α-
ciano-4-
hidroxicinamato
(CHC)
Glioma
Tratamiento con
radiación mostró muerte
celular.
Colen et
al., 2006
Inhibidor AR-
C155858.
Inhibición de
MCT1/2
Fibroblastos
transformados-RAS
Inhibición de crecimiento
tumoral
Le Floch et
al., 2011
Silenciamiento de
genes MCT1 y
MCT4 con RNA
de interferencia
Líneas celulares de
cáncer de colon y
de cáncer de mama
Disminución de la
migración y aumento de
la zona de adhesión
focal.
Gallagher
et al.,
2007, 2009
23
Inhibidor Tipo de cáncer Resultado Referencia
In vivo
Inhibición de
MCT1 con CHC
Tumor de glioma
intracraneal en
ratones
Necrosis del tumor sin
efectos neurológicos
adversos.
Colen et
al., 2011
Inhibición de
MCT1 con CHC
Células de cáncer
colorrectal y cérvix
inyectadas en
ratones.
Reducción del tumor y
sensibilización a
radiación
Sonveux
et al.,
2008
Inhibición de
MCT1 con CHC
Cáncer de próstata
inducido en ratón
desnudo
MCT1 no mostró efecto
en el volumen del tumor,
pero sí un incremento en
la fracción necrótica.
Kim et al.,
2012
24
2. Justificación
Los transportadores de monocarboxilatos MCT, específicamente las isoformas 1, 2
y 4 son las más comunes y ampliamente distribuidas en distintos tipos de tejidos.
Estos transportadores están estrechamente involucrados con la regulación del pH
intracelular y con la catabolización del lactato a través de la fosforilación oxidativa
que sustenta el requerimiento energético para el desarrollo tumoral. La
caracterización de la expresión a nivel transcriptómico de estos transportadores,
permitiría un mejor entendimiento de la desregulación energética presente en el
cáncer de tiroides diferenciado y podría proponerlos como candidatos para ser
utilizados para el diagnóstico oportuno (marcadores moleculares). Además, la
identificación de la presencia de estos transportadores en los tejidos tumorales de
tiroides ofrecería una alternativa de tratamiento para contrarrestar el desarrollo
tumoral o para terapias de ablación para evitar la reincidencia. Sumado a lo anterior,
este trabajo determinaría por primera vez la expresión genética a nivel de mRNA de
los transportadores de monocarboxilatos en tejidos de cáncer de papilar de tiroides
y tejidos sanos de pacientes mexicanos.
25
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Determinar la expresión a nivel de mRNA de MCT1, MCT2 y MCT4 en tumores de
tiroides y tejidos sanos.
3.2 Objetivos particulares
• Elaborar una biblioteca de cDNA a partir de tejidos de cáncer de tiroides
papilar y de tejidos sanos.
• Determinar la repercusión bioquímica de la expresión de MCT1, MCT2 y
MCT4 en cáncer papilar de tiroides
• Asociar la expresión de los genes investigados con el perfil clínico de los
pacientes.
26
4. Materiales y métodos
4.1 Material Biológico
Para el desarrollo de este trabajo se utilizarán tejidos de carcinoma papilar tiroideo
y tejidos sanos, provenientes de pacientes del Hospital General de México “Dr.
Eduardo Liceaga” ubicado en Doctor Balmis 148, Doctores, 06720 Ciudad de
México, CDMX. De cada paciente se obtuvo el par de muestras de tejido sano y
maligno.
Cuadro 2. Material biológico
N= 42 muestras Estadio
Tipo de Tejido I II III IVA IVB NA
Cáncer papilar
de tiroides 9 1 6 1 2 -
Cáncer medular
de tiroides - - - 1 - -
Cáncer
anaplásico de
tiroides
- - - 1 - -
Tejido sano
(aledaño al
tumor)
- - - - - 21
4.1.1 Criterios de colección de muestras
Criterios de inclusión: Se incluyeron muestras de carcinoma papilar de tiroides,
de carcinoma medular de tiroides y de carcinoma anaplásico de tiroides, así como
una muestra de tejido sano aledaño al tumor perteneciente al mismo paciente.
Criterios de exclusión: Se excluyeron aquellos tumores malignos cuya
clasificación era la de carcinoma folicular y también aquellos tejidos que no tuvieran
su tejido de control sano.
27
4.2 Reactivos y equipo
4.2.1 Extracción de RNA
• Trizol®
• Etanol y 2-Propanol grado Biología Molecular Marca Sigma Aldrich (No. Cat
E7148 e I9516)
• Cloroformo absoluto
• Agua DEPC marca Invitrogen (No. Cat AM9922)
• Glucógeno libre de RNAsas de Thermo Scientific (No. Cat. R0551)
• DNAse I, RNAse free de Thermo Scientific (No. Cat. 18047019)
• Centrifuga Biofuge frescus Marca Heraeus
4.2.2 Retrosíntesis
• Superscript III Reverse Transcriptase Thermo Scientific (No. Cat.18080093)
• Ribolock RNAse Inhibitor de Thermo Scienific (No. Cat.EO0381)
• Oligo dT(20) de Thermo Scientific (No. Cat.18418020)
• Termociclador Master cycler gradient marca Eppendorf
4.2.3 Electroforesis
• Marcador de Peso Molecular marca Axygen (No. Cat. M-DNA-100BP)
• Colorante 200X Rojo de Cresol (No. Cat. 114472)
• Regulador de Carga DNA 6X Dye marca Thermo Scientific (No. Cat.R0611)
• Ultrapure® 10X TAE Buffer de Invitrogen (No. Cat.15558026)
• Balanza Analítica Scientech
• Material común de Laboratorio
4.2.4 PCR Punto Final
• Dream Taq Polymerase de Thermo Scientific (No. Cat. EP0711)
• Iniciadores sintetizados por la casa Sigma Aldrich
4.2.5 qPCR
• Iniciadores sintetizados por la casa Sigma Aldrich
• SYBR® Select Master Mix de Applied Biosystems (No. Cat.4472908)
• Lightcycler® Nano de Roche
28
4.2 Desarrollo experimental
En la figura 10 se muestra el desarrollo experimental, constituido por los métodos
anteriormente explicados para el procesamiento de las muestras biológicas.
Recolección de muestras
Extracción de RNA
Eliminación de DNA contaminante (DNAse)
Retrotranscripción de RNA
Evaluación de la integridad de
RNA mediante electroforesis
PCR punto final de cDNAs con gen
constitutivo
Amplificación de genes MCT1, MCT2 y MCT4 mediante
qPCR
Análisis de resultados
Figura 10. Desarrollo experimental para la determinación de la expresión de mRNA de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en tejidos de carcinoma papilar y tejidos sanos.
29
4.3 Métodos
4.3.1 Colección de muestras
Se colectaron de 21 muestras de tejido maligno de cáncer papilar de tiroides con su
respectivo control de tejido sano de tiroides en el período del 3 de Septiembre del
2015 al 26 de Octubre del 2017.
Las muestras fueron tomadas mediante consentimiento informado de pacientes que
acudieron al servicio de Cirugía General del Hospital de México, que por su
diagnóstico clínico fueron conducidos a cirugía diagnóstica como parte del protocolo
institucional. Una vez realizada la biopsia, una porción de las muestras se recibió
en tubos estériles y se almacenó en hielo seco. Los tejidos recolectados se
trasladaron al laboratorio de Oncología Molecular en la Escuela Superior de
Medicina donde se adicionó RNAlater® de la marca Thermo Scientific, el cual ayuda
en la preservación del RNA y se almacenaron a -70°C hasta su uso. Los resultados
diagnósticos así como los datos clínicos adicionales fueron proporcionados por el
Dr. Luis Mauricio Hurtado López, jefe del Servicio de Cirugía General y de la Clínica
de Tiroides del Hospital General de México.
4.3.2 Extracción de RNA
Se realizó una disrupción mecánica celular utilizando un mortero y con la adición
continua de Nitrógeno líquido para mantener congelado el tejido. Posteriormente el
tejido pulverizado se recibe en un tubo de 2 mL, el cual debe contener 1mL de
Trizol® por cada 30 mg de Tejido. La extracción de RNA total a partir del
homogeneizado se realizó de acuerdo al protocolo del reactivo Trizol®.El método
consiste en adicionar 200µL de Cloroformo frio a la muestra macerada y recuperada
en el tubo con Trizol®. Posterior a una incubación a 4°C durante 5 minutos, se
centrifuga a 13,000 rpm, durante 18 minutos a 4°C. Al término de la centrifugación,
se retira el sobrenadante, el cual contiene el RNA y se recibe en un tubo nuevo. Se
adicionan 700µL de Isopropanol frío al 70% y 1µL de Glucógeno (20mg/µL), se
incuba a -70°C durante 1.5 – 2 horas.
Posterior al incubado, se centrifuga a 13,000 rpm, durante 18 minutos a 4°C. Se
retira el sobrenadante sin tocar el botón que se ha formado en el fondo del tubo y
30
se realiza un lavado con Etanol frío al 75%, se centrifuga a 10,000 rpm durante 10
minutos a 4°C. El lavado se realiza por duplicado. Después de realizar el segundo
lavado, se retira lo más posible de sobrenadante y se deja secar el tubo boca arriba
con la tapa abierta dentro de una cámara que evite la entrada de partículas o materia
extraña.
El secado se realiza hasta evaporar la mayor parte de los residuos líquidos, con una
duración de 6 – 10 minutos. El botón se resuspende en agua libre de nucleasas y
dependiendo del tamaño del mismo se agregan de 20 – 30 µL (Sambrook et
al.,1989).
4.3.3 Electroforesis submarina
Se determinó la integridad del RNA total extraído mediante una electroforesis
submarina. La cantidad aproximada de material genético en los pozos del gel fue
de 500 ng/µL. El corrimiento se desarrolló utilizando solución de regulador TAE al
1X y aplicando un Voltaje de 84-92 Volts por 45 minutos. La concentración de Agar
en el gel es del 1.5% para RNA. Al término de la electroforesis se revela el gel con
luz ultravioleta (Sambrook et al., 1989).
4.3.4 Tratamiento con DNAse
Se eliminó el DNA existente en las muestras de RNA aisladas de acuerdo a la
metodología planteada por Sambrook et al. (1989). Se utilizó la DNAse I de Thermo
Scientific® a una concentración de 1 Unidades por 2 mg de RNA total cuantificado
en el espectrofotómetro Nanodrop 2000 de Thermo Scientific. La concentración final
del regulador de DNAse será de 1X y la concentración final de EDTA para desactivar
la enzima será de 2.5 mM. La reacción se llevó a cabo a 37°C por media hora. Se
detiene por calentamiento a 65°C durante 15 minutos y con la adición de EDTA (50
mM). La remoción de DNA se realiza para evitar falsos positivos de expresión
génica.
31
4.3.5 Retrosíntesis de cDNA
La transcripción inversa del mRNA se llevó a cabo utilizando 600 ng de RNA total y
empleando Oligo dT(20) como primer. El procedimiento se realizó de acuerdo al
protocolo de la enzima Superscript III® de Thermo Scientific. Los ciclos de reacción
en el termociclador fueron: 60 min a 45°C y desactivación a 70°C por 5 min. La
reacción de retrosíntesis se lleva a cabo para sintetizar una cadena complementaria
al RNA mensajero dando como resultado un DNA complementario (cDNA)
(Sambrook et al., 1989).
4.3.6 PCR punto final
Se llevaron a cabo las reacciones de PCR utilizando la Dream Taq DNA Polymerasa
de Thermo Scientific y siguiendo las concentraciones de reactivos especificadas en
el protocolo de esta enzima. Los ciclos se reacción en el termociclador fueron: 1)
desnaturalización inicial a 94°C por 5 minutos. 2) Desnaturalización a 94°C por 30
segundos, Alineación a 59°C por 30 segundos y fase de extensión a 72°C por 30
segundos. Esta secuencia se repite 35 veces. 3) Fase final de elongación a 72°C
por 5 minutos.
4.3.7 qPCR
Se llevaron a cabo las reacciones de PCR utilizando el Sybr® Select Master Mix de
Applied Biosystems. El reactivo Sybr® es un agente intercalante que se une a la
doble cadena del DNA y al hacerlo emite fluorescencia que es captada por el
termociclador y es proporcional al número de copias. En primer lugar se debe
evaluar el gen constitutivo propuesto para normalizar la expresión del grupo de
muestras a evaluar. Un gen constitutivo es aquel cuya expresión se mantiene
constante y no presenta variaciones bajo distintas condiciones experimentales. En
adición, este gen se expresa en toda la población estudiada (Dheda et al 2004). Los
genes constitutivos a evaluar son el gen GAPDH, el cual codifica para la enzima
gliceraldehido-3-fosfato-deshidrogenasa, la cual tiene una gran importancia en la
vía metabólica de la glicólisis (Tricarico., et al 2002).
32
Los cebadores de los genes a investigar serán proveídos por la empresa Sigma
Aldrich. La secuencia de estos se muestran en el cuadro 3.
Cuadro 3. Secuencia de los cebadores de los genes para las pruebas de amplificación
MCT1 (Forward) 5’-GTGACCATTGTGGAATGCTG-3’
MCT1 (Reverse) 5’-CATGTCATTGAGCCGACCTA-3’
MCT4 (Forward) 5’-GGGAAGGTCCAACCTTACACT-3’
MCT4 (Reverse) 5’-CCATCACAAACACATTCACCA-3’
MCT2 (Reverse) 5’-AAAGACTCTGGGACTCTTGGTG-3’
MCT2 (Forward) 5’-GGAGGTGGATGCACAGGT-3’
GAPDH (Forward) 5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’
GAPDH (Reverse) 5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’
El diseño de los primers se realizó utilizando el Software en línea Universal
ProbeLibrary Assay Design Center de la empresa Roche.
Los ciclos se reacción para la PCR cuantitativa son: 1) Activación de la Hot Start
Polymerase contenida en la mezcla maestra del reactivo Sybr®, calentamiento de
95°C por 10 minutos 2) Desnaturalización a 95°C durante 15 segundos. 3) La
alineación y la extensión se realiza de manera conjunta a 60°C durante 60
segundos. Se programan 45 ciclos que contienen los pasos de desnaturalización y
alineación/extensión.
33
4.3.8 Método de 2-ΔΔCt (Livak, K. et al., 2001)
El método de Livak consiste en una serie de operaciones aritméticas para obtener
el cambio relativo de la expresión de un gen en un grupo de estudio con respecto a
ese mismo gen en otro grupo utilizando un gen de referencia que debe ser un gen
constitutivo. La fórmula que se utiliza se muestra a continuación
Donde:
Ct blanco: Valor de Ct único para cada muestra que entrega el Software del equipo
de RT- qPCR Lightcycler Nano de Roche. Se tendrá un valor de Ct para cada gen
analizado (MCT1, MCT2 y MCT4).
Ct referencia: Valor de Ct único para cada muestra pero del gen constitutivo
(GAPDH)
Ct promedio blanco: Promedio de los valores de Ct blanco. Se tendrá un valor
promedio para cada gen
Ct promedio referencia: Promedio de los valores de Ct de referencia. Se tendrá un
promedio para el gen GAPDH en las muestras sanas y otro del mismo gen en las
muestras malignas.
2−[(Ct blanco−Ct referencia)−(Ct promedio blanco −Ct promedio referencia)]
34
5. Resultados
5.1 Datos clínicos de los pacientes
Se colectaron los datos clínicos de los 21 pacientes a los que pertenecían tanto los
tejidos cancerosos como los tejidos sanos de tiroides. Esto se llevó a cabo con el
consentimiento de ellos y autorizado por el Hospital General de México “Dr. Eduardo
Liceaga”. Los datos se muestran en el Cuadro 4. Se observa que la mayor parte de
las muestras pertenecen a pacientes del género femenino, los estadios que
preponderan son el I y estadios avanzados III y IV. El estadio N indica si el tumor se
ha diseminado a ganglios linfáticos, se clasifica como N0 si no hay presencia de
crecimiento en ganglios, N1a para crecimiento alrededor de la tiroides y N1b para
crecimiento a los lados del cuello o al pecho. Nuestro grupo de estudio presenta una
mayor densidad en estadio N0.
Respecto al estadio M, se clasifica como M0 a los pacientes exentos de metástasis
y como M1 a pacientes cuyo tumor se ha diseminado a otros órganos. De las
muestras estudiadas, ningún paciente mostró metástasis. Respecto a los puntajes,
el MACIS con un valor mayor al 7.99 presenta una supervivencia del 24% y menor
o igual a 7.99 con una supervivencia mayor o igual al 56%. Respecto al AGES un
valor mayor representa a 5.99 una supervivencia baja igual al 13% y un valor menor
o igual a 5.99 resulta una supervivencia mayor o igual al 67%.
Cuadro 4. Características clínicas de los pacientes
CARACTERÍSICAS PTC OTROS
Mujeres 18 1 Medular
1 Anaplásico
Hombres 1 0
Edad 50.3 (19 – 72) 52.5 (50 – 55)
Estadio
I
II
III
IV
IVA
IVB
9
1
6
5
1
2
0
0
0
2
2
0
35
CARACTERÍSICAS PTC OTROS
Estadio N
0
1a
1b
12
3
5
1
0
1
Estadio M
0
1
19
0
2
0
Puntaje MACIS
≤ 7.99
> 7
18
1
2
0
Puntaje AGES
≤ 5.99
> 5.99
14
5
0
2
Nivel AMES
Bajo Riesgo
Alto Riesgo
8
11
0
2
MACIS: Edad, Diámetro del tumor, Resección completa, Local, Invasión Vascular, Metástasis distante.
AGES: Edad del paciente, Grado histológico del tumor, extensión del tumor, tamaño del tumor primario.
AMES: Edad del paciente, Metástasis distante, Extensión y tamaño del tumor primario
La evaluación de la integridad de los RNA extraídos se muestra en la figura 11, en
donde se puede observar la presencia de las bandas correspondientes a los
ribosomas subunidad 18s y 28s con un tamaño de aproximadamente 700 pares de
bases y 1000 pares de bases respectivamente, de acuerdo al marcador de peso
molecular utilizado que es de 100 pares de bases por cada banda presente,
comenzando a contar desde la parte inferior.
De acuerdo a lo publicado por Sambrook et al., (1989) el valor obtenido al realizar el
cociente respecto a la intensidad de la banda de la subunidad 28s sobre la 18s
(28s:18s) debe ser igual a 2 para considerarse como una muestra no degradada.
Esta prueba se realizó cualitativamente y se aprecia que la banda 28s es más intensa
que la 18s, lo cual corresponde a una muestra en buen estado de conservación.
Todas las muestras de RNA se evaluaron de esta manera.
36
RNA 28S
RNA 18S 700 pb bpppb
1000 pb
TM 1 TS 1 TM 2 TS 2 MP
Figura 11. Evaluación de la integridad de RNA mediante electroforesis en gel de agarosa. Se muestran como ejemplo 2 muestras de tejidos malignos (TM 1 y TM 2) y 2
muestras de tejido sano (TS 1 y TS 2). MP: marcador de peso molecular de 100 pares de bases. Se observa que la banda 28s es más intensa que la banda de 18s lo cual indica una buena integridad de las muestras.
37
Las muestras de RNA que mostraron una buena integridad fueron sometidas al
proceso de síntesis de cDNA y posteriormente se les realizó una reacción de PCR
en punto final con el gen constitutivo GAPDH. Esta reacción de PCR se evaluó
mediante una electroforesis en gel de agarosa (figura 12), en donde para considerar
que el cDNA se había sintetizado de manera correcta, se debía manifestar la banda
correspondiente a la porción del gen amplificada (amplicón) que tiene un tamaño de
286 pares de bases.
Figura 12. Electroforesis de los productos de la reacción de PCR punto final para corroborar la síntesis de las muestras de cDNA. TM1: Tejido maligno 1, TS1: Tejido sano 1, TM2: Tejido maligno 2, TS2: Tejido sano 2, TM3: Tejido maligno 3, TS3: Tejido sano 3, TM3: Tejido maligno 3. Se observa que las bandas más intensas obtenidas de la amplificación (amplicones) se encuentran a la altura de las 300 pares de bases, lo cual coincide con el tamaño del gen constitutivo GAPDH utilizado que es de 286 pb.
TM 1 TS 1
Amplicones de 286 pb del gen GAPDH
TM 1 TS 1 TM 2 TS 2 TM 3 TS 3 TM 4
Marcador pb
38
5.2 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR)
Se realizó la amplificación en tiempo real (RT-qPCR) de las muestras de cDNA. Se
evaluaron estas muestras con los 3 genes blanco (MCT1, MCT2 y MCT4) y con el
gen constitutivo GAPDH. El software del equipo al finalizar la reacción proporciona
una gráfica como la de la figura 13. En esta gráfica se representa la amplificación
del gen constitutivo GAPDH para muestras de tejido sano y tejido maligno. El gen
constituvo tiene la característica de que se encuentra en la misma concentración en
la población de estudio y que la expresión no se ve afectada en los estados
fisiológicos estudiados, por tanto, se tendrían que observar todas las cinéticas con
la misma pendiente o ligeramente dispares.
Inte
nsi
dad
(U
nid
ades
Rel
ativ
as d
e Fl
uo
resc
enci
a)
Ciclo
Figura 13. Amplificación de GAPDH en muestras de tejido maligno y tejido sano
39
El valor que nos entrega el software se denomina “Ct” e indica el número fraccional
de ciclos en el cual la cantidad del gen amplificado alcanza el umbral fijo. Este
umbral debe ser superado por las muestras amplificadas para que se puedan
considerar como resultados positivos debido a que esta técnica es muy sensible y
existe mucho ruido de fondo en el análisis que puede llevar a un resultado
inespecífico. El valor del Ct es inversamente proporcional al número de copias del
gen buscado en la muestra. Esto es debido a que mientras haya un mayor número
de copias en la muestra, le tomará menos ciclos superar el umbral fijo (Livak, K. J.
1997). Para cada gen se obtuvieron gráficas como la mostrada en la figura 13 y por
lo tanto se obtuvo el valor de Ct para los genes GAPDH, MCT1, MCT2 y MCT4. Los
valores de Ct se muestran en el cuadro 5.
Cuadro 5. Valores de CT obtenidos de las muestras estandarizadas para los genes GAPDH, MCT1, MCT2 y MCT4
Numero de Tejido
MCT1 Sano
MCT1 Maligno
MCT2 Sano
MCT2 Maligno
MCT4 Sano
MCT4 Maligno
GAPDH Sano
GAPDH Maligno
1 27.7465 25.8951 27.5500 25.9479 25.5936 26.3745 19.5310 20.3789
2 26.5078 27.2684 26.4783 28.2474 25.6928 26.0862 19.0093 20.4348
3 30.5230 24.8829 30.0255 28.7983 29.7430 25.7334 24.7900 19.5354
4 27.6761 27.7270 28.4337 27.3878 27.8111 27.4667 21.5860 22.1810
5 28.1481 24.9101 30.4699 28.5287 28.9513 24.8124 20.9989 19.3732
6 25.7438 27.7349 30.7947 31.5410 25.2975 28.4082 19.0390 20.4543
7 25.5874 25.1907 38.0082 27.7625 25.1108 25.1220 19.9071 19.5939
8 25.9932 25.2278 27.0506 29.1535 25.3602 24.1825 18.9035 18.4349
9 28.7831 25.7968 27.2273 30.2271 28.8592 32.0200 21.1291 19.7915
10 25.1759 27.3403 30.7189 30.3853 25.2098 26.4316 18.7755 18.0779
11 26.0306 26.6989 27.2392 28.2046 25.6017 25.1409 19.7050 18.5943
12 25.6750 23.7582 27.3202 26.6520 25.0432 27.3588 21.0575 18.7685
13 26.8761 25.5531 27.5647 30.9085 25.6989 24.2033 21.7178 19.6227
14 26.9115 26.8979 28.8164 30.8518 27.1666 29.8465 20.7754 19.9592
15 26.4869 26.7692 30.9224 31.4561 26.2582 27.8360 20.3723 21.3839
16 27.4966 29.1100 27.9791 32.3765 26.9702 29.0913 21.3557 21.0401
17 28.7806 28.9658 27.8643 29.9760 29.4949 27.4032 22.9718 20.9199
18 27.1433 25.5800 28.8427 29.6410 26.8231 28.5748 21.1907 21.7912
19 25.2555 25.9813 29.5496 30.3588 26.7499 30.9571 19.8961 20.9242
20 28.3177 24.6085 27.9095 25.9363 27.5767 24.5398 22.3128 21.0400
21 24.7963 26.9451 25.0615 24.3293 23.9489 25.4997 20.1029 20.5276
PROMEDIO 26.7333 26.7333 28.7829 28.7829 26.9339 26.9339 20.4808 20.4808
40
Una vez obtenido los valores de Ct de todas las muestras, evaluadas con los genes
de estudio, se lleva a cabo el método de 2-ΔΔCt (Livak, K. et al., 2001). Este método
sirve para normalizar los valores de Ct de los genes blanco en referencia a los
valores obtenidos para los genes constitutivos para disminuir la variación de la
expresión entre la población estudiada (Cuadro 6).
El doble delta Ct de las muestras se determina de la siguiente manera (ejemplo de
cálculo utilizando el tejido número 1 y el gen MCT1):
𝟐−[(𝑪𝒕 𝒃𝒍𝒂𝒏𝒄𝒐−𝑪𝒕 𝒓𝒆𝒇𝒆𝒓𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂)−(𝑪𝒕 𝒑𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒃𝒍𝒂𝒏𝒄𝒐 −𝑪𝒕 𝒑𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒓𝒆𝒇𝒆𝒓𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂)]
Cambio relativo de la expresión = 𝟐−[(𝟏𝟗.𝟓𝟑𝟏𝟎−𝟐𝟕.𝟕𝟒𝟔𝟓)−(𝟐𝟔.𝟕𝟑𝟑𝟑 −𝟐𝟎.𝟒𝟖𝟎𝟖)]
Cambio relativo de la expresión = 0.2565
En el cuadro 4 se muestran los resultados dé cada uno de los tejidos y los valores
del cambio relativo de la expresión respectivamente.
Cuadro 6. Valores calculados de la expresión genética relativa
Número de Tejido
MCT1 Sano
MCT1 Tumor
MCT2 Sano
MCT2 Tumor
MCT4 Sano
MCT4 Tumor
1 0.2565 1.6659 1.2168 6.6489 1.3109 1.3732
2 0.4216 0.6684 1.7814 1.4039 0.8524 1.7431
3 1.4334 1.8725 8.3778 0.5138 2.8286 1.1934
4 1.1191 1.6318 2.7403 8.5461 1.1711 2.2460
5 0.5371 1.6422 0.4448 0.5535 0.3537 2.0193
6 0.7309 0.4903 0.0913 0.1451 1.1444 0.3534
7 1.4868 1.5754 0.0011 1.0969 2.3774 1.8986
8 0.5597 0.6876 1.1134 0.1873 0.9975 1.6307
9 0.3785 1.1869 4.6070 0.2279 0.4126 0.0183
10 0.9026 0.1241 0.0801 0.0623 1.0131 0.2678
11 0.9506 0.2770 1.7028 0.4038 1.4707 0.9373
12 2.1349 1.2501 5.4838 0.1264 5.5479 3.6616
13 1.0840 0.6215 1.1984 0.1660 1.0439 0.0925
14 1.1002 1.8241 0.2105 0.2932 1.4816 1.0007
15 1.2311 5.5162 1.5694 1.3682 1.7663 0.7952
16 1.8571 2.2900 0.3919 0.4561 0.7575 0.0836
17 1.1872 6.4263 6.5222 10.5983 2.2802 7.7451
18 0.4599 0.7531 2.4107 2.8729 1.2488 1.6296
19 2.9467 0.8919 10.1505 22.6335 6.0928 2.7914
20 0.7448 0.4465 1.2659 1.0362 1.3037 0.4709
21 0.6394 1.6919 3.1290 14.6454 1.1700 1.4062
41
A partir de los datos normalizados utilizando el método de Livak y que se muestran
en el Cuadro 6, se realizó una comparación del porcentaje de pacientes cuya
expresión de cada gen en el tejido canceroso sobrepasó la expresión del mismo
gen pero respecto al tejido sano. Los porcentajes obtenidos se muestran en la
Figura 14, aquí podemos observar que el único gen expresado a la alta en más del
50% de la población de estudio es el gen que codifica para la proteína MCT1. En
contraste, los otros 2 genes obtuvieron una expresión a la alta en menos del 50%
de los pacientes, lo que indica que en más la mitad de la población, estos genes
tienen una expresión más elevada en el tejido sano que en los tejidos cancerosos.
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Po
rc
en
taje
6 1 %
4 3 %3 9 %
M C T 1 M C T 2 M C T 4
Figura 14. Porcentaje tejidos tumorales que se expresan a la alta respecto al control sano. Se muestra la representación de los 21 tumores malignos que
se expresaron a la alta respecto a su control sano.
42
M C T 1 S a n o M C T 1 T u m o r
0
2
4
6
8
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .3 4
M C T 2 S a n o M C T 2 T u m o r
0
1 0
2 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .1 0 6
M C T 4 S a n o M C T 4 T u m o r
0
5
1 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .4 2 5
Figura 15. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 entre tejidos cancerosos y sanos. A) MCT1 B) MCT2 C) MCT4
A
B
C
43
Se llevó a cabo una comparación del cambio de expresión relativa de cada gen
entre la población de tejidos cancerosos y la población de tejidos sanos. Se analizó
mediante la prueba de Mann-Whitney para pruebas no paramétricas ya que el
comportamiento de nuestros valores no sigue una distribución normal (Fig. 15). No
se obtuvieron diferencias significativas entre las expresiones relativas de estas dos
poblaciones estudiadas.
Se realizó una serie de análisis para comparar el cambio relativo de la expresión de
estos tres genes con las características clínicas más influyentes en el desarrollo del
cáncer papilar de tiroides como lo es el estadio, la edad y el tamaño del tumor.
44
E s t a d io s I - I I
M C T 1 , T u m o r e s
E s t a d io s I I I - I V
M C T 1 , T u m o r e s
-2
0
2
4
6
8
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .0 6 5
E s t a d io s I - I I
M C T 2 , T u m o r e s
E s t a d io s I I I - I V
M C T 2 , T u m o r e s
-1 0
0
1 0
2 0
3 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .9 4
E s t a d io s I - I I
M C T 4 , T u m o r e s
E s t a d io s I I I - I V
M C T 4 , T u m o r e s
-2
0
2
4
6
8
1 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = > 0 .9 9 9
Figura 16. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4
en tejidos cancerosos en referencia a su estadio. A) MCT1 B) MCT2 C) MCT4
A
B
C
45
E d a d < 5 5
M C T 1 T u m o re s
E d a d > 5 5
M C T 1 T u m o re s
0
2
4
6
8
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .7 7
E d a d < 5 5
M C T 2 T u m o r e s
E d a d > 5 5
M C T 2 T u m o r e s
0
1 0
2 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .3 1
E d a d < 5 5
M C T 4 T u m o r e s
E d a d > 5 5
M C T 4 T u m o r e s
0
5
1 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .8 7
A
B
C
Figura 18 Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en tejidos cancerosos en referencia al tamaño del tumor. A) MCT1, B) MCT2, C)MCT4
46
E d a d < 5 5
M C T 1 T u m o re s
E d a d > 5 5
M C T 1 T u m o re s
-2
0
2
4
6
8
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .7 7
E d a d < 5 5
M C T 2 T u m o r e s
E d a d > 5 5
M C T 2 T u m o r e s
-1 0
0
1 0
2 0
3 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .3 1
E d a d < 5 5
M C T 4 T u m o r e s
E d a d > 5 5
M C T 4 T u m o r e s
-2
0
2
4
6
8
1 0
Ca
mb
io r
ela
tiv
o d
e l
a e
xp
re
sió
n
P = 0 .8 7
Figura 18. Cambio relativo de la expresión de los genes MCT1, MCT2 y MCT4 en tejidos cancerosos en referencia al tamaño del tumor. A) MCT1 B) MCT2 C) MCT4
A
B
C
47
6. Discusión
La glándula tiroides es responsable de una actividad con alta demanda de energía
dentro del cuerpo humano: la síntesis de hormonas. Las células de la tiroides, en
condiciones normales, llevan a cabo el mecanismo de fosforilación oxidativa en
condiciones de oxigeno disponible y realizan glicólisis cuando hay insuficiencia de
oxígeno en el micro ambiente (Ganapathy et al., 2008). La fosforilación oxidativa
tiene un rendimiento de 32 moléculas de ATP por mol de glucosa, mientras que de
la glicolisis se obtienen 2 moléculas de ATP por mol de glucosa (Pfeiffer et al., 2001).
Debido al rendimiento energético de cada mecanismo, se considera que las células
de la tiroides tienen una alta actividad oxidativa (Rovcanin et al., 2016). Sin
embargo, una de las características más comunes en distintos tipos de cáncer es la
alteración del metabolismo energético, provocando que las células aún en
condiciones óptimas de oxígeno para llevar a cabo la fosforilación oxidativa elijan
obtener energía a través de la glicólisis, fenotipo que lleva por nombre Efecto
Warburg. Los transportadores de monocarboxilato se encuentran involucrados en
pasos clave dentro de ambas vías de obtención de energías, por lo que su expresión
a nivel de RNA mensajero puede ser interpretada para conocer el comportamiento
del metabolismo que las células sanas de la tiroides y las células cancerosas
presentan. En la figura 14 se ilustra el porcentaje de muestras que presentaron una
expresión genética relativa mayor (Ct normalizado) entre cada par de tejido
canceroso o tejido sano de tiroides de los tres transportadores de monocarboxilatos.
Respecto a tejidos cancerosos, únicamente el gen MCT1 mostró una expresión
superior al 50% en comparación con los controles sanos. De acuerdo a lo reportado
(Sonveaux et al., 2008) el lactato puede ser incorporado a la célula mediante la
proteína transportadora MCT1, ser acoplado al ciclo de los ácidos tricarboxílicos,
cadena transportadora de electrones y finalmente a la fosforilación oxidativa. Debido
a la participación antes mencionada, el cambio de la expresión relativa de MCT1
indica un consumo de lactato como sustrato para la fosforilación oxidativa.
48
Adicionalmente, la expresión de los genes MCT2 y MCT4 no fue superior al 50% en
la población de tumores, de hecho se obtuvieron mayores valores de expresión en
los tejidos sanos respecto a sus contrapartes tumorales. El hecho de que la
expresión de MCT4 se vea disminuida en los tejidos cancerosos respalda que en
este tipo de cáncer se tenga una alta actividad oxidativa, ya que la sobreexpresión
de MCT4 está relacionada con una sobre regulación de la glícolisis, afectando de
manera distinta al microambiente celular y también definiendo un metabolismo
energético característico para cada tipo de cáncer (Fisel et al., 2018). La
comparación de la expresión de MCT2 entre tejidos sanos contra tejidos tumorales
no mostró una diferencia notable ya que ambas poblaciones se mantuvieron muy
cerca del 50%.
Se determinó a su vez la diferencia estadística en el cambio relativo de la expresión
de los genes en los tejidos tumorales respecto a los tejidos sanos a través de un
análisis de Mann-Whitney para pruebas no paramétricas (Fig. 15). La gráfica nos
muestra que no hay diferencia significativa para ninguno de los tres genes. Esto nos
indica que para la población de estudio, el cambio de la expresión de estas proteínas
cuando sucede la instauración del cáncer no tiene un aumento lo suficientemente
elevado para identificarse mediante el análisis realizado. Este resultado contrasta
con lo reportado por lo reportado por (Nahm et al., 2017) quienes informan haber
obtenido diferencia significativa en la expresión proteica de MCT4 y otras proteínas
de la glícolisis utilizando inmunohistoquímica. Sin embargo la diferencia de nuestro
estudio con el antes mencionado reside en que el primero realiza una comparación
entre tejidos sanos y tumorales pertenecientes al mismo paciente, mientras que el
último determina su comparación únicamente entre un grupo de tejidos de cáncer
papilar de tiroides. Por otra parte, la ausencia de una diferencia significativa de la
expresión de estos genes en tejidos tumorales y tejidos sanos fue afectada también
por el número de muestras con las que se trabajó, debido a la dificultad que se
experimentó para conseguir cada uno de los tumores. Dicho esto, no se descarta
que al aumentar el tamaño del grupo de estudio se pueda encontrar que la expresión
relativa de uno de estos tres genes sea estadísticamente diferente entre los tejidos
cancerosos y los tejidos sanos.
49
Respecto a MCT2 en la figura 15B se muestra que en la población de tumores
existen tejidos que presentan una expresión elevada (los puntos que sobresalen)
en comparación con la media de la expresión del mismo gen en los tejidos sanos.
El cambio del comportamiento de estos tejidos una vez que el cáncer comenzó su
desarrollo se debe a que éste gen es propenso a sufrir regulaciones epigenéticas,
las cuales son modificaciones que ocurren en el DNA. Estas modificaciones no
cambian la secuencia del DNA, sino que ocasionan modificaciones en la histona,
como nuevas metilaciones o ausencia de metilaciones. En el caso de MCT2 se ha
reportado que en cáncer de próstata este gen sufre una hipometilación (ausencia
de metilación) en una región interna del promotor y una hipermetilación (metilación
del DNA) en un promotor río arriba que encamina la expresión de una isoforma
alternativa de MCT2, que difiere únicamente en la región 5’UTR, ocasionando una
sobreexpresión del gen en comparación con un tejido sano (Pertega-Gomes et al.,
2015).
El efecto de la sobreexpresión de MCT2 no tiene un efecto a nivel metabólico como
MCT1 y MCT4, sino que MCT2 tiene participación en mecanismos de reparación
del DNA celular a través de su metabolito de transporte que es el lactato. La proteína
MCT2 se encuentra ubicada principalmente en el núcleo plasmático y en la
membrana plasmática (Fig 7). El Lactato es un importante efector en la regulación
epigenética de la función de la cromatina, este es transportado a compartimentos
intracelulares, propiciando la inhibición de acetilasas de histonas de clase I y clase
II. Esta inhibición resulta en la hiperacetilación de las histonas H3 y H4, relajación
de la cromatina, sobre regulación de los genes de reparación del DNA y activación
de las kinasas dependientes de DNA (Wagner et al., 2015) que son enzimas que
participan en el mecanismo de reparación de quiebres en la doble hélice (Smith et
al., 1999).
50
6.1 Comportamiento de los transportadores de monocarboxilato en
la población de tumores cancerosos
Se realizaron comparaciones entre subgrupos de la población de tejidos cancerosos
y los genes estudiados respecto a las características clínicas de los pacientes para
determinar si alguna de estas se encontraba relacionada con la expresión de los
transportadores de monocarboxilato. En primera instancia se analizó el cambio de
la expresión en la población de tumores respecto a los estadios (Fig. 16) teniendo
dos subgrupos, estadio I-II y estadio III-IV ya que a partir del estadio III se presentan
características como crecimiento extratiroideo y metástasis, adicionalmente se
considera la edad crítica, a partir de la cual el paciente puede tener un diagnóstico
menos favorable (Edge et al., 2010). A pesar de que ninguno de los tres genes tuvo
un valor de p significativo, MCT1 tuvo el valor más bajo (0.065) y con tendencia a
que al aumentar el número de muestras exista una diferencia significativa en el
cambio relativo de la expresión cuando los tumores se encuentran en estadios III y
IV. La sobreexpresión de MCT1 en estadios superiores se encuentra modulada por
factores de transcripción MYC ya que el gen de MCT1 contiene sitios de unión en
su promotor a estas oncoproteínas, las cuales no solo tienen una participación
modulando el metabolismo en tumores sino también el crecimiento y la división
celular continua (Doherty et al., 2014), lo cual se refleja en el aumento del tamaño
del tumor y crecimiento extratiroidal. Lo anterior se puede observar también en la
figura 17, donde se compara el cambio de la expresión de los genes en la población
de tumores respecto al tamaño del nódulo maligno, obteniendo para MCT1 el menor
valor de p de los tres genes. Aunque la diferencia no fue significativa se observa
una tendencia de sobreexpresión de MCT1 al aumentar el tamaño del nódulo por
arriba de los 4 cm.
De la regulación de MCT4 se conoce que este gen tiene sitios de unión río arriba
(sobre expresión) en el punto de inicio de la transcripción para dos elementos de
respuesta a la hipoxia (Ullah et al., 2006). Por tanto, al no estar MCT4 sobre
expresado como se muestra en las figuras 16C y 17C, los niveles de hipoxia no
aumentan a medida que los estadios y tamaños de tumores avanzan. Este resultado
contrasta por lo reportado por Burrows y colaboradores (Burrows et al., 2010)
51
quienes al trabajar con líneas celulares de cáncer de tiroides encontraron sobre
expresado el factor de inducción de hipoxia (HIF-1α) en cáncer papilar de tiroides,
cáncer folicular de tiroides y cáncer anaplásico, siendo mucho menor la sobre
expresión en el cáncer papilar que en los otros 2.
Adicionalmente se realizó una comparación entre dos subgrupos de los tejidos
tumorales (Fig. 18), divididos de acuerdo a la edad que se ha reportado, es la edad
crítica para un pronóstico poco favorable (HaugenBryan et al., 2016). Lo que
podemos observar en esta gráfica es que la expresión de los tres transportadores
de monocarboxilato se mantiene al mismo nivel en ambos grupos de edades, lo que
indica que la edad no tiene un impacto significativo a nivel de mRNA, a diferencia
del tamaño del tumor y del estadio.
La desregulación energética en cáncer es un campo aún poco investigado. Las vías
metabólicas constan de elementos clave para comprender el desarrollo tumoral y
definir acciones que puedan frenarlo. A su vez, los cambios metabólicos pueden
originar comportamientos anormales en moléculas que pueden aprovecharse como
marcadores para un diagnóstico oportuno de la enfermedad. Este estudio muestra
el comportamiento de los transportadores de monocarboxilato en el cáncer papilar
de tiroides en pacientes mexicanos para una mejor comprensión del metabolismo
de este tipo de cáncer y su repercusión en las características clínicas, enriqueciendo
la escasa información que se tiene de esta enfermedad en México
52
7. Conclusiones
En cáncer papilar de tiroides de pacientes mexicanos el transportador de
monocarboxilatos MCT1 se expresa con mayor diferencia en los tejidos cancerosos
que en los tejidos sanos. Esta expresión se relaciona con un consumo de lactato
como fuente de carbono para la fosforilación oxidativa. Por tanto, el cáncer papilar
de tiroides se inclina por un metabolismo oxidativo que por un glicolítico.
La expresión de MCT1 aumenta cuando el tamaño del tumor incrementa y también
es superior en pacientes que se encuentran en estadio III y IV. La expresión de
MCT2 y MCT4 no se mostró afectada por éstas características clínicas. La edad
resultó ser un factor que no afecta la expresión de ninguno de los tres genes.
El estudio de estos genes en poblaciones más numerosas de cáncer papilar de
tiroides y con otras técnicas ayudaría a un mejor conocimiento de los cambios
metabólicos presentes en esta enfermedad para la obtención de mejores métodos
de diagnóstico.
53
8. Bibliografía
1. Ambriz, P. T., Salazar, E. H., Portilla, N. C., Galeana, I. S., Zavala, M. A.,
& Bárcena, D. G. (2000). Diagnóstico y tratamiento del nódulo
tiroideo. Revista de Endocrinología y Nutrición, 8(3), 87-93.
2. Baltazar, F., Pinheiro, C., Santos, F. M., Silva, J. A., Queirós, O., Preto,
A., & Casal, M. (2014). Monocarboxylate transporters as targets and
mediators in cancer therapy response. Histology and histopathology. 29:
000-000
3. Burman, K. D., & Wartofsky, L. (2015). Thyroid nodules. New England
Journal of Medicine, 373(24), 2347-2356.
4. Burrows, N., Resch, J., Cowen, R. L., von Wasielewski, R., Hoang-Vu, C.,
West, C. M., ... & Brabant, G. (2010). Expression of hypoxia-inducible
factor 1α in thyroid carcinomas. Endocrine-related cancer, 17(1), 61-72.
5. Colen, C. B., Seraji-Bozorgzad, N., Marples, B., Galloway, M. P., Sloan,
A. E., & Mathupala, S. P. (2006). Metabolic remodeling of malignant
gliomas for enhanced sensitization during radiotherapy: an in vitro
study. Neurosurgery, 59(6), 1313-1324.
6. Colen, C. B., Shen, Y., Ghoddoussi, F., Yu, P., Francis, T. B., Koch, B. J.,
Mathupala, S. P. (2011). Metabolic targeting of lactate efflux by malignant
glioma inhibits invasiveness and induces necrosis: an in vivo
study. Neoplasia, 13(7), 620-632.
7. Cooper, D. S., Doherty, G. M., Haugen, B. R., Kloos, R. T., Lee, S. L.,
Mandel, S. J, Sherman, S. I. (2009). Revised American Thyroid
Association management guidelines for patients with thyroid nodules and
differentiated thyroid cancer: the American Thyroid Association (ATA)
guidelines taskforce on thyroid nodules and differentiated thyroid
cancer. Thyroid, 19(11): 1167-1214.
8. Dimmer, K. S., FRIEDRICH, B., Florian, L. A. N. G., Deitmer, J. W., &
BRÖER, S. (2000). The low-affinity monocarboxylate transporter MCT4 is
54
adapted to the export of lactate in highly glycolytic cells. Biochemical
Journal, 350(1), 219-227.
9. Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G., Zumla,
A. (2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA
expression in real-time PCR. Biotechniques, 37, 112-119.
10. Doherty, J. R., Cleveland, J. L. (2013). Targeting lactate metabolism for
cancer therapeutics. The Journal of clinical investigation, 123(9), 3685-
3692.
11. Doherty, J. R., Yang, C., Scott, K. E., Cameron, M. D., Fallahi, M., Li, W.,
... & Tortosa, M. (2014). Blocking lactate export by inhibiting the Myc target
MCT1 Disables glycolysis and glutathione synthesis. Cancer
research, 74(3), 908-920.
12. Edge, S. B., & American Joint Committee on Cancer. (2010). AJCC
cancer staging handbook: from the AJCC cancer staging manual (Vol.
2010, p. 718). New York: Springer.
13. Eilertsen, M., Andersen, S., Al-Saad, S., Kiselev, Y., Donnem, T.,
Stenvold, H., Bremnes, R. M. (2014). Monocarboxylate transporters 1–4
in NSCLC: MCT1 is an independent prognostic marker for survival. PloS
one, 9(9), e105038.
14. Fisel, P., Schaeffeler, E., & Schwab, M. (2018). Clinical and Functional
Relevance of the Monocarboxylate Transporter Family in Disease
Pathophysiology and Drug Therapy. Clinical and translational science.
15. Flores Ortega, A., Rivera López, E., Guillén González, M. A., Vergara
López, A. (2010). Cáncer de tiroides: Revisión de casos del Centro
Médico Nacional 20 de Noviembre. Revista de Endocrinología y
Nutrición, 18(1), 11-17.
16. Gallagher, S. M., Castorino, J. J., Wang, D., Philp, N. J. (2007).
Monocarboxylate transporter 4 regulates maturation and trafficking of
CD147 to the plasma membrane in the metastatic breast cancer cell line
MDA-MB-231. Cancer research, 67(9), 4182-4189.
17. Gallagher, S. M., Castorino, J. J., Philp, N. J. (2009). Interaction of
monocarboxylate transporter 4 with β 1-integrin and its role in cell
55
migration. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 296(3), C414-
C421.
18. Ganapathy, V., Thangaraju, M., Prasad, D. P. (2008) Nutrient transporters
in cáncer: Relevance to Warburg hypothesis and beyond. Pharmacology
and Therapeutics. 121, 29-40.
19. Globocan.iarc.fr. (2016). Graphs > bar chart by populations. [online]
Disponible en: http://globocan.iarc.fr/Pages/bar_site_sel.aspx
[Consultado 23 Sep. 2016].
20. Granados García, M., Estrada Lobato, E., Apodaca Cruz, A. (2009).
Cáncer diferenciado de la tiroides: aspectos
generales. Cancerología, 4(2).
21. Guppy, M., Leedman, P., XinLin, Z. U., & Russell, V. (2002). Contribution
by different fuels and metabolic pathways to the total ATP turnover of
proliferating MCF-7 breast cancer cells. Biochemical Journal, 364(1), 309-
315.
22. HaugenBryan, R., AlexanderErik, K., BibleKeith, C., DohertyGerard, M.,
MandelSusan, J., NikiforovYuri, E., ... & Ann, S. (2016). 2015 American
Thyroid Association management guidelines for adult patients with thyroid
nodules and differentiated thyroid cancer: the American Thyroid
Association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated
thyroid cancer. Thyroid.
23. Halestrap, A. P. (2012). The monocarboxylate transporter family—
structure and functional characterization. IUBMB life, 64(1), 1-9.
24. Hanahan, D., Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of
cancer. cell, 100(1): 57-70.
25. Hanahan, D., Weinberg, R. A. (2011). Hallmarks of cancer: the next
generation. cell, 144(5): 646-674.
26. Hedinger, C. (2012). Histological typing of thyroid tumours. Springer
Science & Business Media.
27. Hong, C. S., Graham, N. A., Gu, W., Camacho, C. E., Mah, V., Maresh,
E. L., Behbahan, I. S. (2016). MCT1 modulates cancer cell pyruvate export
56
and growth of tumors that co-express MCT1 and MCT4. Cell
reports, 14(7): 1590-1601.
28. Locasale, J. W., Cantley, L. C. (2010). Altered metabolism in cancer. Bmc
Biology, 8(1): 1.
29. Johnson, J. M., Lai, S. Y., Cotzia, P., Cognetti, D., Luginbuhl, A., Pribitkin,
E. A., Campling, B. (2015, December). Mitochondrial Metabolism as a
Treatment Target in Anaplastic Thyroid Cancer. In Seminars in
oncology .42, (6): 915-922.
30. Jones, R. S., Morris, M. E. (2016). Monocarboxylate Transporters:
Therapeutic targets and prognostic factors in disease. Clinical
Pharmacology & Therapeutics, 100(5): 454-463.
31. Jose, C., Bellance, N., Rossignol, R. (2011). Choosing between glycolysis
and oxidative phosphorylation: a tumor's dilemma?. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1807(6): 552-561.
32. Kamran, S. C., Marqusee, E., Kim, M. I., Frates, M. C., Ritner, J., Peters,
H., Cho, N. (2012). Thyroid nodule size and prediction of cancer. The
Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 98(2): 564-570.
33. Kim, T. Y., Kim, W. B., Ryu, J. S., Gong, G., Hong, S. J., Shong, Y. K.
(2005). 18F‐fluorodeoxyglucose uptake in thyroid from positron emission
tomogram (PET) for evaluation in cancer patients: High prevalence of
malignancy in thyroid PET incidentaloma. The Laryngoscope, 115(6):
1074-1078.
34. Kim, J. W., Dang, C. V. (2006). Cancer's molecular sweet tooth and the
Warburg effect. Cancer research, 66(18): 8927-8930.
35. Kim, H. S., Masko, E. M., Poulton, S. L., Kennedy, K. M., Pizzo, S. V.,
Dewhirst, M. W., Freedland, S. J. (2012). Carbohydrate restriction and
lactate transporter inhibition in a mouse xenograft model of human
prostate cancer. BJU international, 110(7): 1062-1069.
36. Le Floch, R., Chiche, J., Marchiq, I., Naiken, T., Ilc, K., Murray, C. M.,
Pouysségur, J. (2011). CD147 subunit of lactate/H+ symporters MCT1
and hypoxia-inducible MCT4 is critical for energetics and growth of
57
glycolytic tumors. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 108(40): 16663-16668.
37. Lin, R., Vera, J. C., Chaganti, R. S. K., Golde, D. W. (1998). Human
Monocarboxylate Transporter 2 (MCT2) Is a High Affinity Piruvate
Transporter. The Journal of Biological Chemistry. 273,(44):28959-28965.
38. Livak, K. J. (1997). ABI Prism 7700 sequence detection system. User
bulletin, 2, 1-36.
39. Livak, K. J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene
expression data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT
method. methods, 25(4): 402-408.
40. Marín-Hernández, Alvaro. (2009). El factor inducido por la hipoxia-
(HIF1). Revista de Educación Bioquímica, 28(2): 42-51.
41. Martínez-Sánchez, Y. L., Escudero-de los Ríos, P. M., Arias-Flores, R.,
Barrios-Bautista, F. (2013). Epidemiología del cáncer en pacientes
adultos del Hospital de Oncología del Centro Médico Siglo XXI, Instituto
Mexicano del Seguro Social. Cirugía y Cirujanos, 81(6).
42. Meredith, D., Christian, H. C. (2008). The SLC16 monocaboxylate
transporter family. Xenobiotica, 38(7-8): 1072-1106.
43. Ullah, M. S., Davies, A. J., & Halestrap, A. P. (2006). The plasma
membrane lactate transporter MCT4, but not MCT1, is up-regulated by
hypoxia through a HIF-1α-dependent mechanism. Journal of Biological
Chemistry, 281(14), 9030-9037.
44. Nahm, J. H., Kim, H. M., & Koo, J. S. (2017). Glycolysis-related protein
expression in thyroid cancer. Tumor Biology, 39(3), 1010428317695922.
45. Nikiforova, M. N., & Nikiforov, Y. E. (2016). Thyroid Cancer. In Molecular
Pathology in Clinical Practice. 471-485
46. Pertega-Gomes, N., Vizcaino, J. R., Felisbino, S., Warren, A. Y., Shaw,
G., Kay, J., ... & Massie, C. E. (2015). Epigenetic and oncogenic regulation
of SLC16A7 (MCT2) results in protein over-expression, impacting on
signalling and cellular phenotypes in prostate cancer. Oncotarget, 6(25),
21675.
58
47. Pfeiffer, T., Schuster, S., & Bonhoeffer, S. (2001). Cooperation and
competition in the evolution of ATP-producing
pathways. Science, 292(5516), 504-507.
48. Pinheiro, C., Longatto-Filho, A., Scapulatempo, C., Ferreira, L., Martins,
S., Pellerin, L., Baltazar, F. (2008). Increased expression of
monocarboxylate transporters 1, 2, and 4 in colorectal
carcinomas. Virchows Archiv, 452(2): 139-146.
49. Pinheiro, C., Albergaria, A., Paredes, J., Sousa, B., Dufloth, R., Vieira, D.,
Baltazar, F. (2010). Monocarboxylate transporter 1 is up‐regulated in
basal‐like breast carcinoma. Histopathology, 56(7): 860-867.
50. Pinheiro, C., Albergaria, A., Paredes, J., Sousa, B., Dufloth, R., Vieira, D.,
Baltazar, F. (2010). Monocarboxylate transporter 1 is up‐regulated in
basal‐like breast carcinoma. Histopathology, 56(7): 860-867.
51. Pinheiro, C., Longatto-Filho, A., Azevedo-Silva, J., Casal, M., Schmitt, F.
C., Baltazar, F. (2012). Role of monocarboxylate transporters in human
cancers: state of the art. Journal of bioenergetics and
biomembranes, 44(1): 127-139.
52. Ríos, A., Rodríguez, J. M., Parrilla, P. (2015). Tratamiento del carcinoma
folicular de tiroides. Cirugía Española, 93(10): 611-618.
53. Rodríguez-Cuevas, S., Labastida-Almedaro, S., Cortés-Arroyo, H.,
López-Garza, J., Barroso-Bravo, S. (2002). Tratamiento racional del
cáncer diferenciado de tiroides mediante asignación de grupo de
riesgo. Cirugía y Cirujanos, 70(4): 232-238.
54. Román-González, A., Giraldo, L. R., Monsalve, C. A., Vélez, A., Restrepo,
J. G. (2013). Nódulo tiroideo, enfoque y manejo. Revisión de la
literatura.Iatreia, 26(2): 197-206.
55. Ross, M. H., Pawlina, W. H. (2007). Texto y atlas color con biología celular
y molecular. China: Editorial Médica Panamericana.
56. Rovcanin, B. R., Gopcevic, K. R., Kekic, D. L., Zivaljevic, V. R., Diklic, A.
D., & Paunovic, I. R. (2016). Papillary thyroid carcinoma: A malignant
tumor with increased antioxidant defense capacity. The Tohoku journal of
experimental medicine, 240(2), 101-111.
59
57. Santacroce, L. (2012). Papillary Thyroid Carcinoma. Retrieved March, 3,
2014.
58. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning. (2):
14-9
59. Smith, G. C., & Jackson, S. P. (1999). The DNA-dependent protein
kinase. Genes & development, 13(8), 916-934.
60. Sonveaux, P., Végran, F., Schroeder, T., Wergin, M. C., Verrax, J.,
Rabbani, Z. N., Kelley, M. J. (2008). Targeting lactate-fueled respiration
selectively kills hypoxic tumor cells in mice. The Journal of clinical
investigation, 118(12): 3930-3942
61. Stewart, B. W. K. P., & Wild, C. P. (2014). World cancer report 2014. Self.
62. Tricarico, C., Pinzani, P., Bianchi, S., Paglierani, M., Distante, V.,
Pazzagli, M., Orlando, C. (2002). Quantitative real-time reverse
transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single
housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Analytical
biochemistry, 309(2): 293-300.
63. Ullah, M. S., Davies, A. J., Halestrap, A. P. (2006). The plasma membrane
lactate transporter MCT4, but not MCT1, is up-regulated by hypoxia
through a HIF-1α-dependent mechanism. Journal of Biological
Chemistry, 281(14): 9030-9037.
64. Valdespino-Gómez, V. M., Valdespino-Castillo, V. E. (2010). Alteraciones
celulares y moleculares no clásicas en el desarrollo del cáncer. Gaceta
médica de México. 146(3): 185-198.
65. Warburg, O. (1956). On the origin of cancer cells. Science, 123(3191):
309-314.
66. Wagner, W., Ciszewski, W. M., & Kania, K. D. (2015). L-and D-lactate
enhance DNA repair and modulate the resistance of cervical carcinoma
cells to anticancer drugs via histone deacetylase inhibition and
hydroxycarboxylic acid receptor 1 activation. Cell Communication and
Signaling, 13(1), 36
67. Wright, D. H. (1989). Histological typing of thyroid tumours. Springer. 159:
269-336
60
68. Weinhouse, S., Warburg, O., Burk, D., Schade, A. L. (1956). On
respiratory impairment in cancer cells. Science, 124(3215): 267-272
69. Xiao, D. X., Shi, X. S., Hai, P. J., Yan, W. C., Yong, H. W., Xue C. Y., You,
L. W., Xin, S. W., Hai, T. N. (2015) Warburg Effect or Reverse Warburg
Effect? A Review of Cancer Metabolism. Oncology Research and
Treatment.38: 117-122.
70. Zerpa, Y., Vergel, M. A., Azkoul, J., Gil, V., de Endocrinología Mérida, G.
(2013). Guía práctica para el diagnóstico y tratamiento del nódulo
tiroideo. Rev Venez Endocrinol Metab, 11(2).
