INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL -...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Sección de Posgrado e Investigación Programa en Ciencias Quimicobiológicas “Inducción de mieloma murino” Q.F.B. Yessica Cristina Castellanos Esparza Director de tesis: Dr. Luis Antonio Jiménez Zamudio México D.F. 2010. T E S I S que como uno de los requisitos para obtener el grado de Maestría en Ciencias Químicobiológicas presenta:
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Sección de Posgrado e Investigación
Programa en Ciencias Quimicobiológicas
“Inducción de mieloma murino”
Q.F.B. Yessica Cristina Castellanos Esparza
Director de tesis:
Dr. Luis Antonio Jiménez Zamudio
México D.F. 2010.
T E S I S
que como uno de los requisitos para obtener el grado
de Maestría en Ciencias Químicobiológicas presenta:
ii
iii
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Inmunología Clínica I del
Departamento de Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Luis Antonio
Jiménez Zamudio.
Se contó con el apoyo de:
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) clave 232008.
Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) del
Instituto Politécnico Nacional con clave de proyecto 20090757.
Beca tesis del Instituto Politécnico Nacional.
iv
Dedicada a mis padres
Goyis, Vicky y Primi
v
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, mis hermanos Rodri, Lili, Missa, Aideé y Dani; mis tíos Mari, Abel,
Ángel y mi primo Luis, por alentarme a seguir adelante con mis sueños.
Al Dr. Luis Jiménez, primero por darme la oportunidad de trabajar con él, con
tan sólo un año por cursar la presente Maestría. Segundo, por su paciencia,
sabios consejos, comprensión y apoyo en los momentos difíciles.
A la Dra. Elba Reyes porque sin su ayuda no habría terminado a tiempo mi
trabajo, por estar siempre pendiente, disponible y por su estímulo para hacer
bien las cosas.
Al Dr. Víctor Hernández por su enorme colaboración sin esperar nada a cambio,
aún cuando varios días no le deje trabajar quitándole su tiempo o su microscopio,
no hay palabras suficientes para expresarle mi agradecimiento.
A la Dra. Ethel García por su comprensión, amabilidad y accesibilidad, pero
sobre todo por su apoyo más allá de lo académico.
A la Dra. Lilia Domínguez y Yola por su apoyo, recomendaciones y accesibilidad,
siempre dispuestas a cooperar y responder cualquier duda.
A la Dra. Laura Montiel y al Dr. Jorge Vela por sus excelentes observaciones,
correcciones y sugerencias en la elaboración de este trabajo.
A todos mis amigos Brenda, María de Jesús, Laura, Yael, Estefania, Marcos,
Mabel, Ye, Ariana, Juan, Aniux, Bere, Chucho y Sam.
A Maye por muchísimas razones… todo lo bueno y malo que hemos compartido,
risas, llanto, juegos, fiestas, trabajo, ñoñez… y por la lata que te di
acompañándome en la madrugada a urgencias del Ruben me muero.
A todos GRACIAS¡¡¡
vi
CONTENIDO
Página
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS viii
ABREVIATURAS xi
RESUMEN xiii
ABSTRACT xv
I. INTRODUCCIÓN 1
1.1 Mieloma múltiple 1
1.1.1 Etiología 2
1.1.2 Marcadores moleculares de la célula plasmática neoplásica 3
1.2 Mieloma murino 5
1.2.1 Etiología 6
1.2.2 Similitudes entre el mieloma humano y murino 8
1.2.3 Riñón 9
1.2.4 Bazo 9
1.2.5 Intestino delgado 10
1.2.6 Peritoneo 11
1.3 Justificación 13
1.4 Hipótesis 13
1.5 Objetivos 14
II MATERIAL Y MÉTODOS 15
2.1 Material 15
2.2 Grupos de estudio 16
2.3 Inducción con aceite pristano 16
2.4 Obtención de suero 16
vii
2.5 Obtención de células peritoneales 17
2.6 Obtención de órganos 17
2.7 Electroforesis en acetato de celulosa 17
2.8 Cuantificación de proteínas séricas totales 18
2.9 Análisis histológico 18
III. RESULTADOS 21
IV. DISCUSIÓN 35
V. CONCLUSIONES 39
VI. REFERENCIAS 40
VII. APÉNDICE 45
viii
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
Página
Tabla 1. Principales marcadores moleculares de la
célula neoplásica.
3
Tabla 2. Grupos de estudio. 16
Tabla 3. Concentración media de proteínas séricas
totales.
22
Figura 1. Células en forma de espejo de mano de la
cavidad peritoneal de ratones de ocho
meses post-inducción
21
Figura 2. Células con aspecto neoplásico de la cavidad
peritoneal de ratones de ocho meses post-
inducción
22
Figura 3. Electroforesis de proteínas séricas en
acetato de celulosa.
23
Figura 4. Ascitis en ratones de ocho meses post-
inducción.
24
Figura 5. Granulomas en el tejido mesentérico de
ratones de ocho meses post-inducción.
24
Figura 6. Órganos peritoneales cubiertos por
granulomas en ratones de ocho meses post-
inducción.
25
ix
Figura 7. Esplenomegalia, hepatomegalia y
decoloración hepática en ratones de ocho
meses post-inducción.
25
Figura 8. Corpúsculos renales de ratones de ocho
meses post-inducción.
26
Figura 9. Glomérulos renales de ratones de ocho
meses post-inducción.
27
Figura 10. Túbulos renales de ratones de ocho meses
post-inducción.
28
Figura 11. Infiltración celular perivascular en el riñón
de ratones de ocho meses post-inducción.
29
Figura 12. Infiltración celular perivascular en riñón de
ratones de ocho meses post-inducción.
30
Figura 13. Disminución de la pulpa roja en el bazo de
ratones de ocho meses post-inducción.
31
Figura 14. Infiltración celular en el bazo de ratón con
células plasmáticas de características
neoplásicas.
31
Figura 15. Intestino delgado de ratones de ocho
meses post-inducción.
32
Figura 16. Placa de Peyer del intestino delgado de
ratones de ocho meses post-inducción.
33
x
Figura 17. Lámina propia del intestino delgado de
ratones de ocho meses post-inducción.
33
Figura 18. Capa muscular y serosa del intestino
delgado de ratones de ocho meses post-
inducción.
34
Figura 19. Capa serosa del intestino delgado de
ratones de ocho meses post-inducción.
34
xi
ABREVIATURAS
AKT Familia de proteínas cinasas involucradas en procesos de transducción de señales intracelulares
APRIL Ligando inductor de proliferación
BAFF Factor activador de células B
CD Cluster of differentiation, nomenclatura asiganada para identificar moléculas de superficie celular
EGF Factor de crecimiento endotelial
GALT Tejido linfoide asociado a intestino
GMSI Gammapatía monoclonal de significado indeterminado
IgA Proteína inmunoglobulina A
IgD Proteína inmunoglobulina D
IgE Proteína inmunoglobulina E
IGF-1 Factor de crecimiento insulínico 1
IgG Proteína inmunoglobulina G
IgH Cadena pesada de las proteínas inmunoglobulinas
IgM Proteína inmunoglobulina M
IL-6 Interleucina 6
xii
IL-11 Interleucina 11
NF-B Factor nuclear kappa-B
PGE2 Prostaglandina E2
PI-3 Fosfatidil inositol 3
STAT3 Familia de señales de transducción y activación de factores de transcripción
VLA Very late antigen
xiii
RESUMEN
El mieloma múltiple es un cáncer incurable de células plasmáticas que representa 1% de
todas las neoplasias a nivel mundial y su etiopatología aún no es totalmente conocida. Los
modelos murinos de mieloma ofrecen sistemas experimentales para el estudio de los
mecanismos neoplásicos y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento que serían
imposibles llevar a cabo en humanos o en cultivos celulares in vitro. La mayoría de las
cepas de ratón comunes en el laboratorio son altamente resistentes a la inducción de
mieloma con aceite pristano, sólo la cepa BALB/c es susceptible en un alto porcentaje. Sin
embargo, la etiopatología del plasmacitoma inducido en el ratón no ha sido totalmente
estudiada. Por lo que, en este trabajo se analizaron histológicamente el riñón, bazo e
intestino delgado, a los tres y ocho meses después de la inyección de pristano con la
finalidad de conocer los cambios histopatológicos desarrollados en ratón y mejorar la
comprensión de la etiopatología de esta enfermedad.
El aceite fue administrado intraperitonealmente en ratones BALB/c, de ambos sexos
con una edad entre 8-10 semanas; una segunda inducción se llevó a cabo a los 120 días
después de la primera administración. Los animales de estudio se dividieron en dos
grupos experimentales: A) tres meses post-inducción y B) ocho meses post-inducción;
cada uno con su respectivo testigo sin inducir y de la misma edad.
Al cumplir el tiempo indicado de post-inducción, a todos los grupos de estudio se les
practicó extracción de suero sanguíneo, de células de la cavidad peritoneal y de los
órganos riñón, bazo e intestino. Para obtener el suero sanguíneo, la sangre recolectada
por punción intracardiaca, coaguló a temperatura ambiente y por centrifugación se separó
el suero, el cual se congeló a -70°C hasta su uso en la determinación de proteínas séricas
totales y electroforesis en acetato de celulosa. Posteriormente, los ratones se sacrificaron
por dislocación cervical y las células peritoneales fueron obtenidas mediante lavados de la
cavidad peritoneal con medio de cultivo. Finalmente, se procedió al examen macroscópico
de la cavidad peritoneal, así como, a la extracción y fijación en formol de los órganos
riñón, bazo e intestino para su análisis histológico.
xiv
En ambos grupos experimentales, la concentración de proteína presente en el suero
no mostró cambios entre los grupos tratados con aceite y sus respectivos testigos;
asimismo, la tinción de los cortes histológicos con rojo congo fue negativa a la presencia
de proteína amiloide en todos los órganos estudiados.
En el grupo de tres meses post-inducción no se observaron células plasmáticas de
aspecto neoplásico en la cavidad peritoneal ni cambios histopatológicos en riñones, bazo
e intestino delgado.
En el grupo de ocho meses post-inducción, se observaron células plasmáticas
atípicas con características neoplásicas en la cavidad peritoneal, resultado que indica el
establecimiento del plasmacitoma. Por su parte, histológicamente los órganos no muestran
cambios importantes en su parénquima normal; sin embargo, se observan células de
aspecto linfoide distribuidas en los órganos estudiados, y algunas de ellas, con aspecto de
célula plasmática neoplásica. No obstante, otros estudios histoquímicos e
inmunohistoquímicos son requeridos para confirmar nuestros hallazgos.
Estos resultados sugieren que a los ocho meses después de la inyección de pristano
la enfermedad se encuentra en sus primeros estadios de desarrollo, asimismo, cambios
histológicos están presentes en este periodo y, además, que para evaluar el efecto de la
infiltración celular en los tejidos es necesario realizar análisis a mayores tiempos de post-
inducción.
xv
ABSTRACT
Multiple myeloma is an incurable cancer of plasma cells that represents 1% of all
cancers worldwide and its etiopathology still not completely known. Murine myeloma
models offer experimental systems for studying the mechanisms of neoplastic and
developing new treatment strategies that would be impossible to conduct in humans or in
cell cultures in vitro. The most common strains of laboratory mice are highly resistant to the
induction of pristane oil myeloma, only BALB/c strain is susceptible to a high percentage.
However, the etiopathology of plasmacytoma induced in mice has not been fully studied.
So, in this work were analyzed histologically the kidney, spleen and small intestine, at three
and eight months after pristane injection in order to know the histopathological changes
developed in mouse to understand the etiopathology of this disease.
The oil was administered intraperitoneally in BALB/c mice of both sexes ranging in
age from 8-10 weeks, a second induction was carried out at 120 days after the first
administration. The study animals were divided into two experimental groups: A) three
months post-induction and B) Eight months post-induction, each with its respective control
without inducing and of the same age.
When completing the indicated time post-induction, all study groups underwent
extraction of blood serum, cells from the peritoneal cavity and organs kidney, spleen and
small intestine. For serum, blood collected by intracardiac puncture, clotted at room
temperature and the serum was separated with centrifuge, which was frozen at -70 ° C
until use in the determination of total serum protein and cellulose acetate electrophoresis .
Subsequently, the mice were sacrificed by cervical dislocation and peritoneal cells were
obtained by washing the peritoneal cavity with culture medium. Finally, we proceeded to
gross examination of the peritoneal cavity, as well as the removal and formalin fixation of
kidney, spleen and small intestine for further histological analysis.
In both experimental groups, the concentration of protein in the serum was
unchanged between the groups treated with oil and their respective witnesses; also
staining of histological sections with congo red was negative for the presence of amyloid
protein in all organs studied.
xvi
In group three months post-induction, there was no looking neoplastic plasma cells
in the peritoneal cavity neither histopathological changes in kidneys, spleen and small
intestine.
In the group eight months post-induction, there were atypical plasma cells with
neoplastic characteristics in the peritoneal cavity, a result that indicates the establishment
of the plasmacytoma. For its part, the organs histologically showing no significant change
in their normal parenchyma, but looking cells with lymphoid features infiltrated in the
organs studied, and some of them , with malignant plasma cell appearance. However,
other histochemical and immunohistochemical studies are needed in order to confirm our
findings.
These results suggest that eight months after pristane injection, disease is in its
early stages of development; also, at this time histological changes are present and for to
assess significant histological changes are needed new analysis with larger times of post-
induction.
1
I. INTRODUCCIÓN
1.1 Mieloma múltiple
El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de células plasmáticas. De manera normal,
las células plasmáticas forman parte importante del sistema inmune ya que son las
responsables de la producción de anticuerpos.
El mieloma múltiple se caracteriza por la proliferación clonal de células plasmáticas
malignas que se acumulan en la médula ósea, la presencia de lesiones osteolíticas y una
alta concentración de inmunoglobulina monoclonal (o sus fragmentos) en sangre y/u ori na.
Las manifestaciones clínicas son variadas, derivadas de los efectos de la infiltración a la
médula ósea (anemia, inmunodeficiencia, trombocitopenia), la activación de osteoclastos
(descalcificación ósea, fracturas, dolor de hueso) y los altos niveles plasmáticos de
proteína y calcio (insuficiencia renal) (Bladé, 2001; Gadó et al., 2001; Avet et al., 2007).
Hasta hoy, el mieloma múltiple es un cáncer incurable que representa el 1% de todas
las neoplasias a nivel mundial; es el segundo cáncer hematológico más frecuente después
del linfoma. Se presenta en todas las razas y áreas geográficas con una ligera disminución
en asiáticos y leve incremento en la raza negra. Su incidencia no ha aumentado en las
últimas décadas, afecta a hombres y mujeres con edad promedio de 65 años y una
tendencia mayor sobre el sexo masculino (Gadó et al., 2001; Avet et al., 2007).
El mieloma múltiple frecuentemente se origina a partir de una entidad común llamada
gammapatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI). En la GMSI, la clona de
células plasmáticas permanece estable durante años (mediana de 10 años), en algunos
casos (hasta 25 %), esta clona estable escapa a los mecanismos reguladores que aún se
desconocen y se transforma en una proliferación tumoral que da lugar al mieloma
sintomático (Bladé, 2001).
La inmunoglobulina monoclonal (proteína M) más detectada es la IgG, constituyendo
50-60% de los todos casos; seguida de IgA (20-30%), proteína de Bence-Jones (15%), los
tipos IgD, IgE e IgM son raros. Además, existe aproximadamente 1% de individuos que no
presentan ningún tipo de proteína M (mieloma no secretor) (Bladé, 2001).
2
1.1.1 Etiología
Aunque la etiología del mieloma múltiple aún no es completamente conocida, diversas
investigaciones muestran que las células malignas han sufrido hipermutación somática,
cambio de isotipo de la cadena pesada y rearreglos en la región variable de las
inmunoglobulinas, así como, bajo índice de actividad proliferativa (Gadó et al., 2001;
Barillé et al., 2003; Harousseau et al., 2004; Yaccobi, 2005; Bataille et al., 2006).
Asimismo, estudios realizados tanto in vitro como in vivo han demostrado el papel
esencial que juega la interleucina 6 (IL-6) en la progresión y supervivencia de las células
malignas (Hideshima et al., 2001; Brocke et al., 2004; Yaccobi, 2005). La producción de
IL-6 se realiza tanto de manera autocrina (en células neoplásicas) como paracrina (células
estromales) (Barlogie, Epstein, 1990; Gadó et al., 2001).
Se han identificado tres categorías de factores que intervienen en su desarrollo:
a) La familia de citocinas IL-6, IL-10, factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) e
interferón (Bataille et al., 1989; Hideshima et al., 2001; Klein et al., 2003).
b) Factores de crecimiento capaces de unirse a CD138 como: factor de crecimiento
insulinico tipo 1 (IGF-1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y miembros
de la familia del factor de crecimiento epitelial (EGF) (Hideshima et al., 2001; Klein
et al., 2003).
c) Factor activador de células B (BAFF) o el ligando inductor de proliferación (APRIL)
que activan el factor nuclear kappa-B (NF-B) y los sistemas PI-3 cinasa/AKT
(Klein et al., 2003; Reyes et al., 2006).
Por otro lado, un miembro de la familia de señales de transducción y activación de
factores de transcripción, STAT3, se encuentra constitutivamente activado en células
malignas en la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (Broke et al., 2004).
Asimismo, se observa que las células malignas expresan receptores para la vitamina D3,
glucocorticoides y hormonas sexuales (estrógenos y progesterona) (Tatsumi et al., 1996).
Estudios citogenéticos recientes muestran gran diversidad de anormalidades
cromosómicas en mieloma múltiple. Entre los genes que se han encontrado desregulados
en las células neoplásicas se encuentran los factores de transcripción BLIMP-1, XBP-1,
Bcl-2, Bcl-6, PAX-5, MYC, p53 y RAS. Estos genes parecen estar involucrados, pero su
3
relación con el inicio y progresión del mieloma no está claro (Barlogie, Epstein, 1990;
Brocke et al., 2004; Cheung et al., 2004; Klein et al., 2003; Avet et al., 2007). Por otro
lado, se ha identificado que las translocaciones en el locus de la cadena pesada de las
inmunoglobulinas, como la t(14q32), son las más frecuentes en humanos. También,
deleciones en el gen del retinoblastoma se han referido hasta en 50% de los casos. Otras
anormalidades genéticas comunes en individuos con mieloma múltiple son: deleciones en
los cromosomas 8, 13 y 16; las translocaciones (11;14), (p13;q32), (4;14) y (p16;q32),
hiperploidía y la traslocación del gen c-MYC (8q24) (Bladé, 2001; Harousseau et al.,
2004).
1.1.2 Marcadores moleculares de la célula plasmática neoplásica
Los marcadores moleculares de superficie más comunes de la célula maligna se
presentan en la tabla 1 en comparación con la célula plasmática normal.
Tabla 1. Principales marcadores moleculares de la célula plasmática neoplásica
Molécula Normal Maligna
CD 138 +++ ++++
CD 38 ++++ +++
CD126 - +++
CD130 +/- +++
CD 56 - +++/-
VLA-4 ++ +++
VLA-5 ++ ++/-
CD117 +/ - +++
CD45 + -
CD 28 - +
CD 19 +/- -
CD 27 + +/-
CD 10 - +/-
Cadenas ligeras
Kappa y lambda +++ (ambas cadenas) +++ (solo una cadena)
Nivel de expresión: +/++ bajo, +++ medio, ++++ alto, - no presente. Información
tomada y modificada de Jackson et al., 1988; Rastrown et al., 2000; Bataille et al., 2006.
4
Como se observa en la tabla, todas las células plasmáticas normales y malignas
expresan CD38 y CD138. Sin embargo, el nivel de expresión es diferente y permite
distinguir las células plasmáticas normales de las malignas, ya que éstas últimas,
expresan de manera constante más CD138 y menos CD38 que las normales (Harada et
al., 1993; Bataille et al., 2006).
El CD138 (Syndecan-1) en las células neoplásicas tiene un papel como co-receptor
para numerosos factores de crecimiento como EGF, FGF, HGF, BAFF y APRIL. CD138
también se expresa en células epiteliales, mesenquimales y carcinomas (Hideshima et al.,
2001; Bataille et al., 2006).
Las moléculas CD126 y CD130 forman el receptor de la IL-6. La sobreexpresión de
CD126 de membrana (cadena alfa del complejo) se observa solamente en las células
neoplásicas; mientras que CD130 (gp130) se expresa tanto en células plasmáticas
neoplásicas como normales, aunque el nivel de expresión es mucho mayor en las células
malignas. El CD130 es también una señal de transducción común para IL -11, oncostatina
M, factor neurotrófico ciliar y el factor inhibidor de leucemia. Por su parte la forma soluble
de CD126, generada tanto por las células normales como malignas, puede unir IL-6 y
mediar señales de transducción a través de la unión a CD130 de membrana (Rawstron et
al., 2000).
La sobreexpresión de CD56 se observa en casi todos los mielomas (94%); no
obstante, el incremento sólo se observa en células de mieloma localizadas en médula
ósea, cavidad pleural y cavidad peritoneal. En cambio, en sangre periférica disminuye
significativamente esta expresión (Van Camp et al., 1990; Drach et al., 1991). El CD56
puede estar relacionado con la activación de los osteoclastos ya que participa en la
interaccion entre las células neoplásicas y los osteoclastos (Bataille et al., 2006).
Con respecto a la expresión de moléculas de adhesión, VLA-4 (very late antigen-4,
CD49d/CD29) es la principal integrina en mieloma múltiple, presente en todas las células
malignas y juega un papel importante en la migración y unión a las células estromales de
la médula ósea. Kawano y cols. han clasificado a las células de mieloma dentro de dos
subpoblaciones, las VLA-5 positivas y VLA-5 negativas (Kawano et al., 1993). También se
expresan en menor porcentaje ICAM-1, LFA-1, LFA-3, N-CAM, H-CAM, VCAM-1 y no se
observa expresión de MAC-1, VNR-β o LECAM-1 (Kawano et al., 1993; Tatsumi et al.,
1996; Olson et al., 2005).
5
1.2 Mieloma murino
Los modelos murinos de mieloma ofrecen sistemas experimentales para el estudio de los
mecanismos neoplásicos y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento que serían
imposibles llevar a cabo en humanos o en cultivos celulares in vitro. Los modelos murinos
incluyen a aquellos tumores que se originan espontáneamente en ratones longevos de la
subcepa C57BL/KaLwRij, el transplante de las células humanas cancerosas en ratones
SCID y los mielomas inducidos en BALB/c con inyecciones intraperitoneales de agentes
proinflamatorios como aceites, plásticos o silicones.
La gran mayoría de cepas animales comunes en el laboratorio son altamente
resistentes a la inducción de mieloma con los agentes proinflamatorios, sólo la cepa
BALB/c es susceptible en un alto porcentaje (70-80%), lo que sugiere que existe una base
genética para la susceptibilidad en ratones BALB/c. Aunque, la cepa C57BL/ KaLwRij
presenta plasmacitomas espontáneamente, es altamente resistente a la inducción. La
cepa NZB es susceptible cuando se hibridiza con ratones BALB/c (Potter, 1968; Feo et al.,
1992; Potter et al., 1994; Cheung et al., 2004).
En la cepa BALB/c, el plasmacitoma puede ser inducido en una alta frecuencia con
aceite mineral o aceite sintético “pristano” (2,4,10,14-tetrametilpentadecano) (Potter, 1968;
Potter, Wax, 1983). Este material persiste en la cavidad peritoneal durante largos
periodos, donde induce inflamación crónica antes del desarrollo de plasmacitomas. La
inducción no es efectiva si los agentes se administran en otros sitios ni tampoco en
ratones IL-6 knockout (Potter, 1968; Gadó et al., 2001). Además, las células malignas
pueden ser trasplantadas a receptores singénicos únicamente cuando éstos hayan sido
previamente condicionados intraperitonealmente con aceite pristano, ya que las células
neoplásicas parecen depender de los factores suplementados por las células inflamatorias
inducidas; sin embargo, esta dependencia puede perderse rápidamente con subsecuentes
transplantes (Potter et al., 1985).
Otra característica de este modelo, es la frecuencia con la que se encuentra la
translocación t(12:15) presente hasta en 90% de los plasmacitomas inducidos con
pristano. Esta translocación involucra a los genes que codifican la cadena pesada de las
inmunoglobulinas (IgH) y el gen myc (c-myc). Müller y cols. describieron que de manera
6
normal la cepa BALB/c tiene un pequeño número de células con estas translocaciones y,
aún más interesante, se encuentran fundamentalmente en el tejido linfoide asociado a
intestino (GALT). Al parecer, las recombinaciones IgH/c-myc se realizan de manera
azarosa (Müller et al., 1997).
Kovalchuk y cols. demostraron que el incremento de células con translocaciones
t(12:15) se produce durante eventos tempranos de malignidad, y probablemente, inicien
los eventos oncogénicos en el desarrollo de plasmacitomas inducidos por inflamación
peritoneal. La patogénesis de estas translocaciones es aún desconocida (Kovalchuk et
al., 2000).
Otro importante descubrimiento en el modelo de BALB/c ha sido la evidencia del
papel fundamental que juega la IL-6 en la supervivencia y desarrollo del proceso maligno
in vivo (Potter, 1985; Hinson, 1996).
Más de 60% de los animales inducidos con pristano producen anticuerpos tipo IgA,
seguido por IgG y rara vez IgM. Aproximadamente 5-10% de estos anticuerpos se unen a
ciertos haptenos como fosforilcolina, dinitrofenol, N-acetil-D-manosamina, N-acetil-D-
glucosamina, α-metil-D-glucosamina, α-dextranos y β- galactosa (Rudikoff et al., 1972; Loh
et al., 1979).
En este modelo, las características clínicas como: lesiones óseas, anemia y
disfunción renal no han sido descritas (Gadó et al., 2001).
Por su parte, el aceite no parece contener ningún químico carcinogénico, como
hidrocarbonos policíclicos u otros materiales UV absorbentes. Más aún, aceites con
diferentes propiedades fisicoquímicas y plásticos sólidos parecen ser igualmente efectivos
en la inducción de plasmacitomas (Potter, 1968).
1.2.1 Etiología
La inyección intraperitoneal de aceite pristano en el ratón BALB/c provoca en el tejido
peritoneal una fuerte inflamación aguda que continúa hasta convertirse en una inflamación
crónica caracterizada por la formación de granulomas, particularmente en el tejido
mesentérico.
El aceite es fagocitado por los macrófagos que al no poder degradarlo lo acumulan
en su interior, dando lugar a los llamados “macrófagos espumosos”. Estos macrófagos se
7
adhieren a otros y comienzan a organizarse dentro del tejido, posteriormente, constituyen
una masa amari llenta, dura y permanente que contiene altas concentraciones de células
inflamatorias como macrófagos, neutrófilos, células plasmáticas aisladas, plasmablastos y
fibroblastos. A los 120 días después de la inducción se observa ascitis (Takakura et al.,
1966; Potter, 1968; Potter et al., 1985; Gadó et al., 2001).
El tumor de células plasmáticas comienza a aparecer a los seis meses después de la
primera inyección de aceite y aumenta en los siguientes 14 meses (Takakura et al., 1967.;
Potter, 1968).
Cortes del granuloma tomados alrededor del tiempo en el que el plasmacitoma inicia
su aparición contienen colonias locales de células plasmáticas hipercromáticas con figuras
mitóticas. Las células malignas son mucho más grandes (casi el doble de tamaño) que las
células plasmáticas normales, además, contienen abundante citoplasma basófilo, un
retículo endoplásmico y aparato de Golgi bien desarrollados, núcleo excéntrico con
cromatina radiada y una zona perinuclear clara (Potter, 1968; Potter, 1985; Gadó et al.,
2001).
La neoplasia primaria se localiza solamente en dos lugares: las superficies
peritoneales y los ganglios linfáticos superiores del mediastino; en ambos, el desarrollo del
granuloma es coincidente. Sin embargo, la clona maligna no parece surgir de los nódulos
linfáticos, se sugiere que éstas son células metastásicas provenientes de células
plasmáticas malignas del peritoneo. La formación de tumores en los nódulos linfáticos en
ausencia de plasmacitomas peritoneales no ha sido observada. La médula ósea tampoco
parece estar involucrada en la formación del plasmacitoma (Potter, 1968).
El análisis de granulomas peritoneales realizado por Kovalchuk y cols. reveló la
presencia de clones que poseen la t(12;15)+ durante un largo periodo de latencia tumoral
antes de que se observe la neoplasia (Kovalchuk et al., 2000).
Existen pocos estudios sobre el efecto de la inyección de aceite en la fisiología de los
macrófagos y neutrófilos, pero se ha reportado que el aceite estimula a los macrófagos
peritoneales a producir localmente altas concentraciones de radicales libres
potencialmente tóxicos y mutagénicos. Además, en el granuloma se detectan niveles altos
de prostaglandina E2 (PGE2) que estimula la producción de IL-6 en los macrófagos y otras
células inflamatorias, lo cual es un factor relevante en la génesis de las células
neoplásicas de mieloma (Gadó et al., 2001).
8
Esto puede ocurrir tanto en el tejido peritoneal como en el espacio libre y ser el factor
para que se produzca la mutación en los linfocitos B que continuamente están entrando al
granuloma o transitan en el espacio peritoneal. Sin embargo, aún no queda claro si los
radicales libres están implicados en los eventos mutagénicos y si se producen de manera
endogéna en el linfocito B como respuesta a la inflamación crónica o el linfocito es
afectado por los radicales liberados por las células circundantes (Weitzman, 1990).
1.2.2 Similitudes entre el mieloma murino y humano
El mieloma inducido con aceite pristano en ratones BALB/c comparte un número de
características comunes con el mieloma humano. Es bien conocido que los plasmacitomas
de ratón al igual que su contraparte humana, son productores de inmunoglobulinas y
también dependen de IL-6 para su proliferación in vitro e in vivo. Además, las células
malignas, tanto humanas como murinas, han sufrido hipermutación somática, cambio de
isotipo de la cadena pesada y rearreglo en la región variable de las inmunoglubulinas.
Las células malignas tanto murinas como humanas expresan constitutivamente
STAT3. La activación de STAT3 es esencial para la supervivencia de las células de
mieloma y contribuye a la patogénesis de la enfermedad previniendo la apoptosis (Gadó et
al., 2001).
Aproximadamente 60% de los mielomas murinos producen IgA, mientras que en
humano la más común es IgG. En ratones, la presencia de IgG también ha sido descrita.
En ambos, los tipos IgM e IgE son relativamente raros (Gadó et al., 2001).
A diferencia del mieloma humano, la principal mutación en ratones BALB/c es la
translocación (12:15) tipo Ig/c-myc encontrada en 90% de los plasmacitomas (Kovalchuk
et al., 2000; Gadó et al., 2001). Mientras que en humano la diversidad de mutaciones es
mayor, siendo las translocaciones (14q32) en el locus de la cadena pesada de las
inmunoglobulinas, la más frecuente que ocurre en 10-40% de los tumores. También, hay
cierta evidencia que C-MYC esta sobreexpresado en mieloma humano. Asimismo, el
inmunofenotipo de las células de mieloma humano y murino expresan marcadores
similares como: CD38, CD138, CD126, CD130, VLA-4 y CD56 (Gadó et al., 2001; Bladé,
2001).
9
1.2.3 Riñón
Las características fisiológicas e histológicas del riñón murino son similares a la humana y
a la de otros mamíferos. Los riñones forman parte del aparato urinario y efectúan dos
funciones principales: excretan los productos terminales del metabolismo a través de la
orina y controlan las concentraciones de la mayor parte de los constituyentes de los
líquidos corporales. Además, participan en la eritropoyesis al formar la hormona
eritropoyetina, regulan el pH sanguíneo, la presión arterial secretando renina y la
activación de la vitamina D (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
Los riñones son órganos de color rojizo con forma de “frijol”, se localizan en la
cavidad abdominal en posición retroperitoneal, uno a cada lado de la columna vertebral.
En el ratón, miden en promedio de 0.9 a 1.1 cm de longitud y de 0.4 a 0.6 cm de anchura.
La unidad funcional y estructural de los riñones es la nefrona, compuesta esencialmente
por los glomérulos, el sistema tubular y su componente vascular (Tortora, 1981; Guyton,
1988).
El examen a simple vista de un corte longitudinal de riñón muestra dos regiones:
una externa llamada corteza y otra interna denominada médula. Histológicamente, en la
corteza se localizan los corpúsculos renales o de Malpighi (formados por el glomérulo y la
cápsula de Bowman), los túbulos contorneados proximales y distales, algunos túbulos
colectores, así como, las arteriolas eferentes y aferentes. El glomérulo es una red capilar
rodeada por las células de cápsula de Bowman; los túbulos contorneados proximales se
diferencian de los distales por la presencia de microvellosidades. Por su parte, la médula
de aspecto estriado, está formada por las pirámides medulares (o renales) que contienen
los túbulos rectos del asa de Henle, los túbulos colectores y los vasos capilares rectos
(Tortora, 1981; Guyton, 1988).
1.2.4 Bazo
El bazo de ratón fisiológica e histológicamente es similar al bazo humano, en ambos
cumple las funciones de: órgano linfoide secundario importante en la inmunidad contra
patógenos sistémicos; participa en la maduración de los linfocitos B productores de
anticuerpos naturales, así como, en la eliminación de eritrocitos y plaquetas deteriorados.
10
Una de las diferencias entre ambas especies radica en que mientras en humanos el bazo
participa en la hematopoyesis sólo durante el periodo fetal, en ratón esta función
permanece durante toda la vida adulta, por lo que en cortes histológicos se observa una
combinación de megacariocitos y progenitores de las series eritroide y mieloide en
diferentes estadios de maduración (Tortora, 1981; Cesta, 2006).
El bazo es la masa de tejido linfático más grande del cuerpo, es un órgano
elongado y de forma oval; en ratones mide entre 1.5 a 1.9 cm de longitud. Se sitúa al lado
izquierdo entre el fondo del estómago y el diafragma (Tortora, 1981; Cesta, 2006).
El parénquima consiste en dos tipos de tejido: la pulpa blanca y la pulpa roja. En lo
esencial, la pulpa blanca es tejido linfático, en su mayor parte linfocitos, dispuestos
alrededor de las arterias centrales. En diversas áreas, los linfocitos forman nódulos
linfáticos llamados corpúsculos de Malpighi, donde también se encuentran asociados
macrófagos, células dendríticas y plasmáticas. Además, existe una región de la pulpa
blanca denominada zona marginal del bazo situada entre la interfase de la pulpa roja, los
folículos y la envoltura periarteriolar linfoide, formada principalmente por macrófagos
metalofílicos, células dendríticas y linfocitos B propios de esta zona. En muchos procesos
infecciosos el bazo aumenta su volumen al igual que se dilatan los ganglios linfáticos. Por
su parte, la pulpa roja está formada por senos venosos llenos de sangre y por los
cordones de Billroth que consisten en eritrocitos, macrófagos, linfocitos, plasmocitos y
granulocitos (Tortora, 1981; Cesta, 2006).
El bazo no filtra la linfa puesto que no tiene vasos linfáticos aferentes, por lo que se
considera un filtro de circulación sanguínea sistémica (Tortora, 1981; Guyton, 1988; Cesta
et al., 2006).
1.2.5 Intestino delgado
El intestino delgado forma parte del aparato gastrointestinal. Su función principal es
degradar los alimentos y absorber los nutrientes necesarios para el funcionamiento de las
células coporales. El intestino delgado se divide en tres segmentos: duodeno, yeyuno e
ileón. Es principalmente en el duodeno donde se realiza la digestión de prote ínas, lípidos,
ácidos nucleicos y carbohidratos.
11
Histológicamente, el intestino delgado está compuesto por cuatro capas básicas, de
adentro a afuera: mucosa, submucosa, muscular y serosa (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
La mucosa es una membrana que internamente recubre el tubo digestivo mediante
la producción de moco y se encuentra unida a una capa delgada de músculo liso. La
mucosa consiste en dos capas: el epitelio y el tejido conectivo. El epitelio es el tejido que
está en contacto con el contenido del tubo digestivo, tiene microvellosidades que se
encargan de la absorción de nutrientes. La capa de tejido conectivo o lámina propia,
contiene numerosos vasos sanguíneos y linfáticos, así como nódulos linfáticos dispersos
(placas de Peyer); esta capa brinda sostén y protección al epitelio; además, presenta las
criptas de Lieberkuhn que son glándulas que secretan jugo intestinal formado por agua,
moco y enzimas digestivas (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
La submucosa es tejido conectivo laxo que une la mucosa con la capa muscular. Es
un tejido muy vascularizado que contiene una parte del plaxo de Meissner que interviene
en la inervación autónoma del músculo y en la regulación de la secreción del tubo
digestivo. La submucosa posee glándulas de Brunner que producen moco que protege al
epitelio intestinal. Tanto la mucosa como la submucosa presentan células calciformes que
secretan moco adicional (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
La capa muscular formada por músculo liso, contiene la inervación principal del tubo
digestivo, el plexo de Auerbach, con fibras de ambas divisiones del sistema nervioso
autónomo y que se encarga de regular la mayor parte de la motilidad gastrointestinal
(Tortora, 1981; Guyton, 1988).
La capa serosa es la capa más externa del tubo digestivo y se compone de tejido
conectivo y epitelio. Forma parte del peritoneo y se le denomina peritoneo visceral
(Tortora, 1981; Guyton, 1988).
1.2.6 Peritoneo
El peritoneo es la capa serosa más extensa del organismo. Tiene una capa de
epitelio simple o mesotelio y otra subyacente de tejido conectivo que desempeña
funciones de sostén. El peritoneo parietal reviste la pared de la cavidad abdominal,
mientras que el peritoneo visceral cubre los órganos abdominales. Al espacio que hay
entre las dos capas se denomina cavidad peritoneal y contiene líquido seroso. En algunas
12
situaciones, esta cavidad se dilata como consecuencia de la acumulación de grandes
volúmenes de líquido, situación que se denomina: ascitis (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
El peritoneo tiene grandes pliegues que se invaginan entre las vísceras, uniendo los
órganos entre sí y con las paredes de la cavidad. Estos pliegues contienen vasos
sanguíneos, linfáticos, nódulos linfáticos y nervios de los órganos abdominales. Uno de
estos pliegues es el mesenterio, que es un pliegue de la serosa del intestino delgado y que
lo fija a la pared abdominal posterior (Tortora, 1981; Guyton, 1988).
13
1.3 Justificación
El mieloma múltiple es un cáncer incurable de etiología aún desconocida que representa
1% de todas las neoplasias a nivel mundial. Existen diversos modelos murinos que
permiten estudiar in vivo los mecanismos neoplásicos de la enfermedad. Uno de ellos, el
mieloma inducido con aceite pristano en la cepa de ratón BALB/c comparte diversas
características con el mieloma humano, sin embargo, su etiopatología no ha sido
totalmente estudiada por lo que resulta interesante analizar los cambios histopatológicos
en distintos órganos para mejorar la comprensión de su patología y su uso en estudios
ulteriores.
1.4. Hipótesis
Si las células neoplásicas aparecen alrededor de los seis meses post-inducción de
plasmacitoma en la cavidad peritoneal de los ratones BALB/c, se espera que a los ocho
meses post-inducción se observen alteraciones patológicas importantes en diversos
órganos.
14
1.5 Objetivos
Objetivo general
Determinar los cambios histopatológicos en riñón, bazo e intestino delgado de
ratones BALB/c con mieloma inducido por aceite pristano.
Objetivos particulares
Inducir mieloma en la cepa de ratón BALB/c.
Establecer la presencia de células neoplásicas en la cavidad peritoneal.
Cuantificar proteínas totales séricas.
Realizar electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa.
Analizar los cambios histopatológicos en riñón, bazo e intestino delgado a
diferentes períodos de tiempo post-inducción.
15
II. MATERIAL Y METÓDOS
2.1 Material
A. Animales
Ratones de la cepa BALB/c entre 8-10 semanas de edad y ambos sexos.
B. Reactivos
Aceite pristano.
Éter etílico.
Medio de cultivo RPMI 1640.
Reactivo de Biuret (ver apéndice).
Albúmina sérica bovina (BSA).
Etanol al 70%, 90% y absoluto.
Formol al 10%.
Xilol.
Ácido acético al 5 %.
Parafina para inclusión.
Colorantes: hematoxilina- eosina (HE), rojo congo, wrigth y rojo ponceau.
Membrana de acetato de celulosa (Bekman microzone plus).
Regulador de barbituratos (pH=8.8).
C. Equipo
Jeringas estériles de 1.0 mL.
Tubos eppendorf.
Jeringas estériles de 5 mL.
Portaobjetos desengrasados.
Tubos cónicos falcón de polipropileno con capacidad para 15 mL.
Tubos de polipropileno con capacidad para 5 mL.
Pipetas Pasteur estériles.
Micropipetas y puntas estériles.
Centrífuga.
16
Microscopio óptico.
Densitométro.
Lector de ELISA con filtros de 540 y 600 nm.
2.2 Grupos de estudio
Tabla 2. Grupos de estudio
Cepa Grupo Tratamiento
Tiempo de sacrificio
post-inducción (meses)
n
BALB/c
Testigo A ----- 3 2
Experimental A Aceite
pristano 3
3
Testigo B ----- 8 4
Experimental B Aceite
pristano 8
6
2.3 Inducción con aceite pristano
1. Inyectar 0.5 ml de aceite pristano en la cavidad peritoneal de los grupos
experimentales A y B.
2. Repetir el procedimiento a los 120 días después de la primera inducción.
2.4 Obtención de suero
1. Anestesiar al ratón con éter, colocarlo en posición ventral extendiendo y fijando sus
extremidades.
2. Realizar una punción intracardiaca con una jeringa de 1 ml, posicionando la aguja
en un ángulo de 90°.
3. Depositar la sangre en un tubo eppendorf, esperar el tiempo suficiente para que
coagule y centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
4. Separar el suero y mantenerlo a -70°C hasta su análisis.
17
2.5 Obtención de células peritoneales
1. Posterior a la punción intracardiaca, sacrificar al animal por dislocación cervical y
rociar el peritoneo con alcohol al 70%.
2. Realizar una incisión en el tejido peritoneal cuidando de no dañar el epitelio que
recubre el interior de la cavidad peritoneal.
3. Efectuar un lavado del peritoneo con 5 mL de medio de cultivo RPMI frío,
inyectando 5 ml de medio en el interior de la cavidad tratando de no tocar el
intestino y efectuando un masaje suave.
4. Aspirar el líquido de la cavidad peritoneal y pasarlo a un tubo falcón de polipropileno
de 15 mL.
5. Repetir el lavado del peritoneo.
6. Centrifugar la suspensión a 1500 rpm durante 10 minutos a 4°C.
7. Decantar y resuspender el botón celular.
8. Realizar una impronta, dejar secar a temperatura ambiente y teñirla con colorante
de Wrigth. Observar al microscopio con objetivo de 100X buscando células
plasmáticas de aspecto neoplásico.
2.6 Obtención de órganos
1. Al término de la obtención de las células peritoneales, realizar una incisión en la
cavidad peritoneal para exponer los órganos internos.
2. Extraer con cuidado y rapidez el bazo, riñones e intestino delgado y depositarlos en
frascos con formol al 10%.
2.7 Electroforesis en acetato de celulosa
1. Descongelar las muestras de suero.
2. Humedecer la membrana de acetato de celulosa en el regulador de barbiturato
(pH= 8.8) durante 10 minutos. Secar entre dos papeles filtro.
3. Colocar la membrana en el equipo de electroforesis (Gelman 51156) previamente
llenado con regulador de barbiturato.
4. Depositar las muestras de suero en la membrana.
18
5. Dejar correr la muestra durante 20 minutos uti lizando una fuente de poder a 200
volts y 3 amperes.
6. Retirar la membrana y teñirla durante 10 minutos con solución de rojo Ponceau al
0.5% en acido tricloroacetico al 7.5%.
7. Decolorar la membrana con una solución de ácido acético 5%.
8. Pasar la membrana a la solución del reactivo A (ver apéndice) durante 2 minutos.
9. Pasar la membrana a la solución del reactivo B (ver apéndice) durante 1 minuto
exacto.
10. Montar la membrana en una placa de vidrio y dejar secar.
11. Leer la placa en un densitómetro.
2.8 Cuantificación de proteínas séricas totales por el método de Biuret
1. Descongelar las muestras de suero.
2. Realizar una curva estándar de BSA con concentraciones de 20, 15, 13, 10, 8, 7, 5,
3, 2 y 1 g/dL, utilizando medio de cultivo RPMI 1640 como diluyente.
3. Rotular los tubos correspondientes a cada muestra, al blanco y a las diluciones de
BSA.
4. Colocar 1 ml de medio RPMI y 1 mL de reactivo de Biuret en todos los tubos.
5. Agregar 25 L de muestra según corresponda a cada tubo, excepto al blanco.
Homogeneizar y dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Depositar 500 L de cada solución en una placa de ELISA y leer a 600 nm. Realizar
por duplicado.
7. Realizar la curva estándar con las absorbancias obtenidas y calcular las
concentraciones de cada muestra problema.
2.9 Análisis histológico
A. Inclusión en parafina
1. Colocar la muestra en formol al 10% durante 1 h.
2. Pasar la muestra a 4 soluciones de etanol al 96 % durante 1 h en cada
solución.
3. Pasar la muestra a 2 cambios de etanol absoluto durante 1 h en cada uno.
19
4. Pasar la muestra a 3 cambios de xi lol durante 1 h en cada uno.
5. Pasar la muestra a 2 soluciones de parafina fundida a temperatura entre 60-
65°C durante 1 h en cada solución.
6. Incluir la muestra en parafina y dejar solidificar. Moldear el bloque de
parafina y enfriar en el refrigerador durante media hora.
B. Corte en micrótomo
1. Ajustar el micrótomo.
2. Obtener los cortes en el micrótomo con un grosor de 4 -6 micras para cada
tejido de estudio.
3. Pasar los cortes al baño de flotación a 37°C.
4. Montar los cortes en el portaobjetos.
5. Dejar los portaobjetos con las muestras durante 30 minutos en la estufa a
70°C.
C. Tinción con Hematoxilina-Eosina
1. Desparafinar, sumergiendo los portaobjetos en dos soluciones de xilol
durante 5 minutos en cada una.
2. Efectuar 3 cambios de etanol absoluto.
3. Efectuar 3 cambios en tres soluciones diferentes de etanol al 96 %.
4. Hidratar los cortes sumergiendolos en agua corriente por 3 minutos.
5. Sumergir en hematoxilina de Harris durante 5-10 minutos.
6. Lavar con agua corriente.
7. Diferenciar en alcohol-ácido (80% etanol, 3 % ácido clorhídrico).
8. Lavar con agua corriente.
9. Virar en carbonato de litio (solución saturada) e hidróxido de amonio.
10. Lavar con agua corriente.
11. Teñir con solución de eosina (ver apéndice).
12. Lavar y deshidratar con 3 cambios de etanol al 96%.
13. Efectuar 3 cambios en etanol absoluto.
14. Realizar 3 cambios en xilol.
15. Resultados: núcleo azul, citoplasma rosa.
20
D. Tinción con rojo congo
1. Teñir el tejido desparafinado con rojo congo al 1% durante 1h.
2. Lavar con agua destilada.
3. Efectuar baños con la solución alcohol-alcalino (ver apéndice).
4. Lavar con agua destilada.
5. Teñir el núcleo con hematoxilina durante 5 minutos.
6. Lavar con agua destilada.
7. Deshidratar y aclarar con etanol al 95%, etanol absoluto y xileno. Dos
cambios de dos minutos en cada uno.
8. Resultados: sustancia amiloide de rosa a rojo y con luz polarizada emite un
color verde. Núcleo azul, citoplasma rosa.
21
III. RESULTADOS
A. Observación de células peritoneales
El mieloma en los ratones se determinó mediante la observación de células plasmáticas
de aspecto neoplásico en la cavidad peritoneal: células plasmáticas de mayor tamaño, con
núcleo excéntrico e hipercrómatico, cromatina radiada y con un halo perinuclear
(Takakura, 1967).
En el grupo de 3 meses post-inducción se observaron neutrófilos, macrófagos,
linfocitos y ninguna célula plasmática con aspecto neoplásico.
En el grupo de 8 meses post-inducción, en general se observó incremento en las
células mononucleares, linfocitos, neutrófilos, macrófagos, macrófagos espumosos,
plasmocitos y de manera interesante, en dos muestras se encontraron células en forma de
espejo de mano figura 1. Sólo se incluyeron en estudios posteriores a aquellos animales
de 8 meses post-inducción en los que se observaron células plasmáticas de aspecto
neoplásico figura 2.
Figura 1. Células en forma de “espejo de mano” de la cavidad peritoneal de ratones
de ocho meses post-inducción. Tinción de Wrigth, 100X.
22
B. Cuantificación de proteínas séricas totales
En la tabla 3 se muestran las concentraciones medias de proteínas séricas totales en las
cuales no se encontró diferencia entre los grupos tratados de 3 y 8 meses comparada con
sus grupos testigo correspondientes.
Tabla 3. Concentración media de proteínas séricas totales
Grupo experimental Concentración media
(g/dL)
Testigo A 9.4
3 meses post-inducción 10.4
Testigo B 12
8 meses post-inducción 11.9
C. Electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa
El análisis de las membranas de acetato de celulosa mediante densitómetro figura 3, no
mostró diferencias en los porcentajes promedio de las proteínas séricas ni aumento en el
área de las inmunoglobulinas que pudiera corresponder a una proteína monoclonal en
ninguno de los grupos experimentales.
Figura 2. Células con aspecto neoplásico de la cavidad pertinoneal de ratones
de ocho meses post-inducción. Tinción de Wrigth, 100X.
23
D. Observación macroscópica de la cavidad peritoneal
En el grupo de 3 meses post-inducción se observaron algunos granulomas en el tejido
mesentérico y pequeños cúmulos celulares libres dentro de la cavidad peritoneal. El resto
de los órganos no presentó alteración macroscópica y no se observó ascitis.
En el grupo de 8 meses post-inducción, la ascitis fue evidente figura 4. Se observo
una gran cantidad de granulomas en el tejido mesentérico, así como, cúmulos celulares
pequeños y libres en la cavidad peritoneal figura 5. Además, los órganos como estómago,
bazo, riñones, diafragma y todo el epitelio peritoneal estaban cubiertos por granulomas
permanentes, excepto las paredes del intestino figura 6. También se presentó
esplenomegalia, hepatomegalia y decoloración hepática figura 7.
Figura 3. Electroforesis de proteínas séricas en acetato de celulosa. G rupos tratados (carriles 5,6,7) de A) 3 meses y de B) 8 meses con sus respectivos grupos testigo (carriles
2,3,4). Imágenes obtenidas del densitómetro.
A) B)
2 3 4 5 6 7
24
Figura 4. Ascitis en ratones de ocho meses post-inducción. A)
ratón testigo B) Ratón tratado con aceite pristano.
A) B)
Figura 5. Granulomas en el tejido mesentérico de ratones de ocho meses
post-inducción. A) ratón testigo B) Ratón tratado con aceite pristano.
A) B)
Granulomas
Mesenterio
25
Figura 6. Órganos peritoneales cubiertos por granulomas permanentes en ratones de ocho meses post-inducción. A) ratón testigo B) Ratón tratado con aceite pristano.
A) B)
Estómago
Bazo
Riñón
Intestino
Bazo Hígado
Figura 7. Esplenomegalia, hepatomegalia y decoloración hepática en ratones de ocho meses post-inducción. A) ratón testigo B) Ratón tratado con aceite pristano.
A) B)
Hígado
Bazo
26
E. Análisis histológico
La tinción para la sustancia amiloide con rojo congo resulto negativa en todas las muestras
de tejido de ambos grupos de estudio.
1. Riñón
En general, las estructuras renales como el glomérulo figuras 8- 9, túbulos figura 10 y
tejido conectivo no mostraron alteraciones; los vasos sanguíneos se encontraron
congestivos con eritrocitos tanto en los grupos tratados como testigos de tres y ocho
meses.
Figura 8. Corpúsculos renales de ratones de ocho meses post-inducción. A)
Testigo y B) grupo tratado. Tinción Hematoxilina-Eosina, 10X.
A)
B)
Glomérulo
Glomérulo
27
Figura 9. Glomérulos renales de ratones de ocho meses post-inducción. A)
Testigo, B) grupo tratado. G= glomérulo, TP= túbulo proximal, TD= túbulo distal,
CB= cápsula de Bowman. Tinción Hematoxilina-Eosina, 40X.
CB
G
TD
TP
CB
G
TP
B)
A)
28
Figura 10. Túbulos renales de ratones de ocho meses post-inducción. A) Testigo B) Tratados. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 40X. TP=túbulo
proximal, TD= túbulo distal
B)
A)
TP
TD
TP
29
En el grupo de 8 meses post-inducción se observó infiltración perivascular de células con
aspecto linfoide y algunas con características de células plasmáticas atípicas con núcleo
excéntrico, cromatina radiada e hipercromática, nucléolo prominente y abundante
citoplasma basófilo figuras 11-12.
B) B)
A)
Figura 11. Infiltración celular perivascular en riñón de ratones de ocho meses post-inducción. A) Testigo B) Tratados. Tinción
de Hematoxilina-Eosina, 10X. IC= infiltración celular, VS= vaso sanguíneo.
VS
VS
IC IC
VS
30
2. Bazo
El bazo del grupo de 3 meses post-inducción no presentó cambios morfológicos evidentes
en comparación con su grupo testigo correspondiente.
Por su parte, en el grupo de 8 meses post-inducción se observó marcada
esplenomegalia, histológicamente representada por aumento significativo de la pulpa
blanca con la consecuente disminución de la pulpa roja, del número de megacariocitos y
de progenitores de la serie eritroide figura 13. Dentro de la pulpa blanca se observaron
linfocitos en diferentes estadios de desarrollo y la presencia de células plasmáticas con el
típico aspecto de la célula neoplásica, como núcleo excéntrico, cromatina radiada e
hipercromática y nucléolo prominente figura 14.
Figura 12. Infiltración celular perivascular en riñón de ratones de ocho meses post-inducción. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 40X.
31
Figura 14. Infiltración celular en el bazo de ratón con células plasmáticas de características neoplásicas. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 100X.
Figura 13. Disminución de la pulpa roja en el bazo de ratones de ocho meses post -inducción. A) Testigo B) Grupo tratado. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 10X. PR= pulpa roja, PB= pulpa
blanca.
B)
PB
PB
PR
PR
A) A)
B)
PB
PB
32
3. Intestino delgado
El intestino delgado del grupo de 3 meses post-inducción no mostró cambios histo lógicos
en el epitelio intestinal, solamente se observó ligera infiltración celular en la lámina propia
principalmente por células de aspecto linfoide, así como, leve irritación en la capa serosa.
En el grupo de 8 meses post-inducción la mucosa intestinal no mostró cambios
histológicos figura 15; no obstante, se encontró una gran infiltración celular en las placas
de Peyer figura 16 y la lámina propia figura 17. Dentro de la lámina propia se observaron
células de aspecto linfoide, células plasmáticas normales y atípicas, además, de células
con características neoplásicas. Las placas de Peyer mostraron principalmente células de
aspecto linfoide. Por su parte, la capa muscular se encontró engrosada y la capa serosa
irritada e infiltrada con macrófagos espumosos figuras 18-19.
Figura 15. Intestino delgado de ratones
de ocho meses post-inducción. A) Testigo B) Grupo tratads. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 10X. EI= epitelio intestinal, LP=
lámina propia.
A)
B)
LP
LP
LP
EI
EI
33
Figura 16. Placa de Peyer del intestino delgado de ratones de ocho meses post -inducción.
A) Testigo B) Grupo tratado. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 10X. PP= placa de Peyer.
PP
PP
A) B)
Figura 17. Lámina propia del intestino delgado de ratones de ocho meses post-inducción. A)
Testigo B) Grupo tratado. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 10X. LP= lámina propia.
LP
LP
A)
B)
34
Figura 18. Capa muscular y serosa del intestino delgado de ratones de ocho meses post -
inducción. A) Testigo B) Grupo tratado. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 10X. CM= capa muscular, S= serosa.
CM S CM
S
A) B)
Figura 19. Capa serosa del intestino delgado de ratones de ocho
meses post-inducción. Tinción de Hematoxilina-Eosina, 40X.
Macrófago “espumoso”
35
IV. DISCUSIÓN
El mieloma inducido con aceite pristano en ratones BALB/c es una herramienta útil para el
estudio de los mecanismos neoplásicos in vivo ya que comparte diversas características
con el mieloma humano. Aunque el proceso inflamatorio y los cambios histopatológicos
desarrollados en la cavidad peritoneal del ratón BALB/c después de la administración de
aceite han sido bien documentados, no se han estudiado las probables alteraciones que
podrían estar ocurriendo en otros órganos como riñón, bazo, hígado, corazón o cerebro;
hecho que representa una desventaja para la integración de la patología del ratón y sus
aplicaciones en la investigación del mieloma múltiple.
En el presente trabajo se han estudiado histológicamente el riñón, bazo y el
intestino delgado del ratón BALB/c, a los tres y ocho meses después de la administración
intrapertoneal del aceite inductor. Estos períodos, que corresponden a un estado de pre-
mieloma y post-mieloma, fueron determinados con base en los estudios realizados por
Takakura y Potter que muestran que las células malignas aparecen en la cavidad
peritoneal alrededor de los seis meses post-inducción (Takakura et al., 1967; Potter,
1968). Este hecho fue corroborado por la observación de células neoplásicas en la
cavidad peritoneal y otras características comunes al desarrollo de mieloma como ascitis,
abundantes granulomas tanto mesentéricos como distribuidos por todo el peritoneo de los
ratones del grupo experimental de ocho meses; mientras que el grupo de tres meses no
presentó estas características. Datos que concuerdan con los resultados de Takakura y
Potter.
Cuantificación y electroforesis de proteínas séricas totales
La concentración y el porcentaje de las proteínas séricas totales en los ratones de ocho
meses post-inducción no mostraron diferencia con respecto al testigo, lo que sugiere que
la producción de inmunoglobulinas monoclonales o de cadenas ligeras es escasa e incluso
nula. Es posible que la cantidad de células plasmáticas neoplásicas aún no alcance un
número suficiente, capaz de reflejar aumento evidente en la cantidad de proteína sérica
total ni en la zona correspondiente a las gamma-globulinas en la electroforesis.
36
Histología
La tinción con el colorante rojo congo fue negativa en los todos los cortes histológicos
analizados. Esta tinción permite evidenciar la sustancia amiloide depositada en los tejidos
observándose una birrefringencia color verde con la luz polarizada. Estos resultados
concuerdan con los obtenidos en la cuantificación de proteínas séricas totales y la
electroforesis, confirmando que no hay incremento en la concentración sérica de cadenas
ligeras en el grupo de ocho meses post-inducción.
Riñón
En personas con mieloma múltiple, el riñón es uno de los principales órganos afectados
por esta patología, ya que hasta 20% de los enfermos llega a desarrollar disfunción renal.
Siendo la nefropatía por cilindros la complicación más frecuente, causada por las altas
concentraciones séricas de las proteínas de Bence-Jones (Iggo et al., 1997; Goldschmid et
al., 2000).
En roedores, Sakar demostró que el transplante de la línea de células plasmáticas
neoplásicas (Adj-PC-5) en ratones BALB/c (donde primariamente se originó), se disemina
rápidamente de manera heterogénea por varios órganos, entre ellos los capilares
glomerulares (Sakar, et al., 1972). En humanos la invasión de células plasmáticas
malignas en riñón es sumamente rara pero también ha sido reportada (Kyle et al., 2003;
Saito et al., 2004). Winearls menciona que la invasión de células metástasicas al riñón
generalmente conlleva a glomerulonefritis (Winearls, 1995).
En los ratones con ocho meses post-inducción, la histología del riñón no muestra
alteraciones morfológicas en el parénquima renal; aunque, se observó infiltración celular
de localización perivascular, compuesta principalmente por células de aspecto linfoide,
algunas con características de células plasmáticas atípicas. Se requiere de más estudios
histoquímicos e inmunohístoquímicos para establecer la naturaleza de dichas células.
También son necesarios estudios histológicos y bioquímicos a tiempos mayores de post-
inducción para evaluar el efecto de las células infiltradas sobre el riñón.
37
Bazo
En humanos, la principal alteración del bazo a consecuencia del mieloma múltiple se debe
a la amiloidosis AL, que provoca esplenomegalia.
El bazo de los ratones de ocho meses post-inducción presentó esplenomegalia,
aumento de la pulpa blanca con la consecuente disminución de la pulpa roja, número de
megacariocitos y de progenitores mielo-eritrocíticos. La pulpa blanca se halló compuesta
principalmente por linfocitos, dentro de los cuales se observaron células plasmáticas de
aspecto neoplásico.
Henry y Watson observaron que hasta 80% de las personas con mieloma múltiple
tienen un alto porcentaje de células neoplásicas en el bazo (Henry, Watson,. 1953).
Sherwood y cols. reportan un caso de ruptura esplénica espontánea debida a la infiltración
de células malignas en el bazo sin ninguna evidencia de amiloidosis o cualquier otro
factor; mientras que Ho reporta un caso similar pero con hematopoyesis extramedular y
amiloidisis. En ambos reportes, la causa no fue definitivamente establecida (Sherwood et
al., 1996; Ho et al., 2008).
En roedores, además del estudio de Sakar, Janz y cols. mostraron que el aceite
pristano es detectable en la sangre hasta por 64 días posterior a su administración y que
sus niveles varían en algunos tejidos como nódulos linfáticos y médula ósea pero existe
una clara tendencia a acumularse en hígado, riñón y bazo (Janz et al., 1995). Este
depósito podría explicar el crecimiento de la pulpa blanca puesto que se incrementa la
posibilidad de interacción entre las células residentes en el bazo y el aceite; todo aunado a
la infiltración de células neóplasicas y a la participación que tiene el bazo en la respuesta
inflamatoria como órgano linfático secundario.
Intestino delgado
Los estudios llevados a cabo por Takakura, Potter y Kovalchuk muestran que el intestino
delgado y el mesenterio juegan un papel fundamental en el desarrollo del mieloma murino
al ser los sitios probables de donde surja la clona maligna (Takakura et al., 1967; Potter,
1985; Kovalchuk, 2000). En los ratones de ocho meses post-inducción tanto las placas de
Peyer, la lámina propia y la serosa responden a la presencia del aceite pristano y a la
38
inflamación peritoneal que este desencadena; mientras que el epitelio intestinal conserva
intacta su morfología. Las placas de Peyer aumentan de tamaño, en la lámina propia se
incrementa la infi ltración de células inmunológicas, especialmente linfocitos, plasmablastos
y macrófagos. Resulta interesante señalar que la capa serosa del intestino no es rodeada
por los granulomas permanentes como la mayor parte de las estructuras peritoneales, a
pesar de que se encuentra en contacto directo con el aceite peritoneal y que contiene
macrófagos espumosos en su superficie.
De igual manera, en el grupo tratado de tres meses, la lámina propia y la capa
serosa participan en la reacción inflamatoria aunque aún no muestran grandes cambios
morfológicos.
Los resultados obtenidos sugieren que el microambiente inflamatorio responsable
de la patología en el ratón se encuentra en el espacio peritoneal, como lo sostienen las
investigaciones de Takakura, Potter y Kovalchuk, razón que explica las pocas
modificaciones en la morfología intestinal (Takakura et al., 1967; Potter, 1985; Kovalchuk,
2000).
39
V. CONCLUSIONES
A los tres meses post-inducción no se observaron células neoplásicas ni
cambios histopatológicos en riñón, bazo e intestino delgado.
Los resultados histológicos y la cuantificación de proteínas séricas, sugieren que
a los ocho meses post-inducción la enfermedad se encuentra en sus primeros
estadios de desarrollo.
A los ocho meses post-inducción, se observan células de aspecto linfoide
distribuidas en los órganos estudiados, la morfología celular sugiere la presencia
de células plasmáticas de características neoplásicas; sin embargo, es
necesario realizar otros estudios histológicos y bioquímicos a mayores tiempos
de post-inducción para evaluar tanto la naturaleza como el efecto de la
infiltración celular en riñón, bazo e intestino delgado.
40
VI. REFERENCIAS
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45
VII. APÉNDICE
Reactivo de Biuret
Tartrato de sodio y potasio 9.0 g
Sulfato de cobre 3.0 g
Yoduro de potasio 5.0 g
Hidróxido de sodio 0.2 N 1 litro
Disolver el tartrato de sodio y potasio, el sulfato de cobre y el yoduro de potasio en
400 ml de con hidróxido de sodio 0.2N y, posteriormente, aforar a 1 litro. Almacenar
en un frasco color ámbar.
Reactivo A
Mezclar 95 ml de etanol absoluto y 5 ml de isopropanol.
Reactivo B
Mezclar 70 ml de reactivo A y 30 ml de ciclohexanona.
Solución de eosina
Preparar una solución madre de eosina Y con 10 g de eosina y aforar a 1 litro con etanol
al 96%. De esta solución, tomar 120 ml y mezclarlo con 380 ml de etanol al 80% y 3 ml
de ácido acético.
Solución alcohol-alcalino
Mezclar 1 ml de hidróxido de sodio al 1% y 99 ml de etanol al 50%.
46
