INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES TLR-6, MR Y DC-SIGN EN LA FAGOCITOSIS DE MLM

(Proyecto SIP 20080301)

INFORME FINAL Profesores participantes:

Oscar Rojas-Espinosa Patricia Arce-Paredes.

Alumnos participantes:

Mayra Silva Miranda José Luis Cid Gutiérrez

La mayoría de las figuras son fotografías a color tomadas en los microscopios de luz, de fluorescencia y confocal, y ocupan un gran espacio. Se omiten en este manuscrito para

reducir el tamaño del archivo cuyo tamaño original es de 23 MB. Con la información resultante de esta investigación, estamos preparando un artículo para publicación en una revista internacional especializada en el área.

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RESUMEN La lepra murina es una enfermedad natural del ratón. El agente causal de esta enfermedad es Mycobacterium lepraemurium (MLM), un parasito intracelular de los macrófagos. En contraste con otras micobacterias como M. Bovis BCG, MLM penetra en estas células sin inducir la producción de ROI (intermediarios reactivos del oxígeno), RNI (intermediarios reactivos del nitrógeno) o TNF . Este comportamiento diferencial resultante de la entrada de MLM y BCG a los macrófagos murinos, sugiere que las micobacterias usan diferentes receptores para entrar a las células y que estos inducen diferentes vías de señalización. Empleando técnicas de microscopia evaluamos el mecanismo de entrada de MLM. Mediante el uso citometría de flujo estudiamos el efecto del bloqueo de receptores membranales de macrófagos en la fagocitosis de MLM. Los receptores estudiados incluyeron TLR-2, TLR-4, TLR-6, MR, CD16/32, CD14, CD35 y DC-SIGN. Además estudiamos la participación de los “lipid rafts” en la fagocitosis de MLM. Nuestros resultados muestran que MLM ingresa en los macrófagos a través de estructuras presentes en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de la membrana celular y de ahí se mueven siguiendo la trayectoria de las extensiones citoplásmicas hasta localizarse ordenadamente alrededor del núcleo. Una vez ingerido, MLM no es destruido por los macrófagos, al contrario, utiliza el microambiente fagolisosomal para replicarse masivamente sin causar daño aparente a la célula. Los ensayos de bloqueo de receptores indicaron que TLR-6 y el Receptor de Manosa juegan un papel importante en la entrada de MLM a los macrófagos murinos. Ni los lipid-rafts ni DC-SIGN parecen participar en la fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos.

ABSTRACT Murine leprosy is a natural disease of the mouse. It is produced by Mycobacterium lepraemurium, an intracellular parasite of macrophages. Contrary to other mycobacteria such as M. bovis BCG, MLM infects macrophages without triggering these cells’ oxidative response. MLM-infected macrophages do not produce reactive oxygen intermediaries, reactive nitrogen intermediaries, TNF or nitric oxide. The differential outcome resulting from the macrophages’ infection with MLM or BCG suggests that these mycobacteria use different entry-receptors and might possibly trigger different signaling pathways. By means of several microscopy techniques and flow cytometry, we evaluated the effect of the blockade of several membrane receptors of macrophages on the phagocytosis of MLM. The receptors analyzed included TLR-2, TLR-4, TLR-6, MR, CD16/32, CD14, CD35 and DC-SIGN. In addition, we studied the participation of lipid rafts in the phagocytosis of MLM. The results showed that MLM enters to macrophages through unknown structures present in the apical ends of the macrophages’ cytoplasmic filaments and from here they move orderly to eventually locate, with a radial distribution, around the nucleus. Once ingested, MLM is not destroyed by the macrophages, on the contrary MLM takes advantage of the intraphagosomal microenvironment to survive and replicate without causing harm to the cell host. The blockade experiments showed that TLR-6 and MR play an important role in the entry of MLM to murine macrophages. Nor lipid rafts or DC-SIGN seem to participate in the phagocytosis of MLM by murine macrophages.

INTRODUCCIÓN Generalidades Desde hace varios años hemos estado interesados en el estudio de la lepra en cuanto a la relación que se establece entre el agente causal (Mycobacterium leprae) y su hospedero celular, el macrófago. Debido a la baja incidencia de la enfermedad en nuestra localidad y por razones éticas, el estudio con humanos sólo nos permite llegar hasta ciertos límites, y dado que el microorganismo no se reproduce en los medios bacteriológicos convencionales y tampoco tiene un huésped animal accesible (los armadillos de 9 bandas y ciertas especies de monos serían las alternativas), hemos aprovechado la existencia de un modelo de lepra animal para conocer los factores de patogenicidad de Mycobacterium lepraemurium, una micobacteria relacionada con M. leprae, y la respuesta que despierta en los macrófagos de los animales susceptibles. Aunque esencialmente diferentes, la lepra humana y la lepra murina, y los agentes que las producen, comparten varias características aunque difieren en otras. En cuanto a los padecimientos, ambas son enfermedades de naturaleza crónica-granulomatosa, que afectan la piel y, sin tratamiento, diversos órganos internos. La diferencia obvia entre estas dos enfermedades es la afección del sistema nervioso en la lepra humana y el respeto del mismo en la lepra murina. Desde el punto de vista inmunológico hay amplia congruencia entre las dos enfermedades ya que

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ambas provocan la pérdida de la inmunidad celular del hospedero contra el agente infeccioso respectivo sin modificar su capacidad de respuesta humoral. La pérdida de la respuesta inmune celular contra el agente infeccioso es la razón principal del progreso de la enfermedad en los individuos susceptibles. No se conocen los mecanismos responsables de la supresión específica de la respuesta inmune celular pero se sospecha que tienen que ver con el comportamiento del microorganismo bajo el microambiente tisular generado por la misma infección ya que la supresión celular no se manifiesta al inicio de la misma sino cuando el microorganismo, establecido ya en los macrófagos, modula las respuestas inflamatoria e inmunológica del hospedero. Esto es, los individuos que llegan a enfermar no son inmunodeficientes al inicio de la infección y la inmunodeficiencia que desarrollan la adquieren como resultado de las interacciones que se establecen entre el parásito y el hospedero. En cuanto a los microorganismos causantes de la lepra humana y murina, M. leprae y M. lepraemurium, ambos son micobacterias ácido resistentes, no cultivables en medios bacteriológicos convencionales, y estructuralmente parecidos entre sí. Su gruesa cubierta lipídica, al mismo tiempo que les confiere protección contra los mecanismos microbicidas del hospedero, los capacita para entrar casi de manera desapercibida a los macrófagos del mismo y para modular, en su favor, la respuesta inmunitaria de los individuos susceptibles. Ambos microorganismos, y contrario a M. bovis BCG, penetran a los macrófagos del hospedero sin estimular en ellos los mecanismos microbicidas dependientes del oxígeno y el nitrógeno, y tampoco inducen la producción de niveles significativos de TNF , una citocina relacionada con la activación de macrófagos. Tanto M. leprae como M. lepraemurium son bacterias muy evolucionadas que han “aprendido” a penetrar a las células hospederas sin inducir tampoco su muerte por apoptosis. En los ratones, M. lepraemurium suprime además la activación del sistema del complemento y no infecta al riñón, ni al sistema nervioso, preservando así la integridad del hospedero. Micobacterias Las micobacterias patógenas son parásitos obligados de los macrófagos, es decir, para producir enfermedad requieren multiplicarse dentro de estas células. Son varios los factores que determinan la patogenicidad de las micobacterias, entre ellos y de manera primordial, las características estructurales de los microorganismos y asociados a estas, los mecanismos de entrada a las células hospederas, las cascadas de señalización intracelular que se generan, la interacción de los microorganismos ingeridos con diversos organelos relacionados con la maduración de los fagolisosomas (el tránsito intracelular) y la activación de diversos factores de trascripción. Todo esto, en conjunto, determina la respuesta de las células ante la infección y decide el destino de los microorganismos, su replicación o su destrucción. Lepra murina M. lepraemurium (MLM) y la enfermedad que produce fueron descritos en 1902 por Stefansky en la ciudad de Odesa, Rusia, y posteriormente por Dean en Inglaterra, quien hizo notar la similitud entre la lepra humana y la lepra murina. Estas dos enfermedades presentan gran analogía en las lesiones que causan y también, en cierta forma, en el agente causal: Mycobacterium leprae (ML) y Mycobacterium lepraemurium (MLM) respectivamente. Por estas analogías, la lepra murina se tomó, durante mucho tiempo, como un modelo de estudio de la lepra humana. Ahora se sabe que estas enfermedades, y sus agentes etiológicos son en realidad diferentes, aunque mantienen un alto grado de similitud, lo que permite que la lepra murina se siga estudiando como un modelo aproximado de la lepra humana. Fuera de su grado de relación con la lepra humana, la lepra murina es en sí una enfermedad interesante que merece ser estudiada con detalle porque afecta de manera natural a la especie animal más popular en los laboratorios de investigación biomédica, el ratón. A diferencia de la lepra humana, la lepra murina se puede estudiar controladamente, a diferentes niveles, incluyendo el hospedero, el parásito, y la relación hospedero-parásito. Siendo M. lepraemurium, un parásito intracelular de los macrófagos, el modelo nos permite estudiar no sólo los mecanismos de la respuesta antibacteriana por parte de los macrófagos, sino también los mecanismos de infección y de evasión por parte de las bacterias. Mycobacterium lepraemurim (MLM) MLM es un bacilo delgado no móvil, pleomórfico, de 0.3 a 0.4 m de ancho por 2 a 7 m de longitud. Cerca del 40% de su peso son lípidos complejos y por esta característica la micobacteria se tiñe con fucshina fenicada y resiste la decoloración con alcohol acidulado (tinción de Ziehl Nelssen). MLM es una micobacteria no cultivable en el laboratorio aunque hay reportes (Mori, 1978) de que la cepa Douglas se ha logrado cultivar en un medio semisólido preparado a base de yema de huevo, parecido al medio de Lowenstein-Jensen. Otros laboratorios no han tenido éxito en el cultivo de otras cepas (entre ellas la cepa Hawai) y por esto el microorganismo se sigue propagando por infección en el ratón. En nuestro laboratorio trabajamos con la cepa Hawai que se preserva por infecciones seriadas en ratones NIH. Se conoce la existencia de cepas de ratones de distinta susceptibilidad a la infección por MLM; se sabe que

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los ratones C3H se reconocen como los más susceptibles, los BALB/c como de susceptibilidad elevada y los ratones C57BL como los de mayor resistencia. Así mismo se han descrito cepas como CBA y NIH de susceptibilidad intermedia (Kawaguchi, 1959, Brown et al, 1982 y Brett, 1984). En nuestra experiencia los ratones NIH se comportan como los ratones BALB/c. La superficie de MLM esta constituida por una gruesa capa de lípidos que constituyen la pared de la micobacteria. Cerca del 60% de la pared celular esta constituida por lípidos y estos lípidos representan cerca del 40% del peso seco de la bacteria (Azuma et al, 1973). Dentro de los constituyentes lipídicos de la pared de las micobacterias en general, se incluyen varias familias, entre ellos: ácidos grasos ramificados, ácidos micólicos, glicolípidos, glicósidos del fenol-phthiocerol, peptidoglicolípidos, lipooligosacaridos y lipopolisacaridos (Luna Herrera, 1991). En cada familia se tiene un amplio número de componentes, algunos de los cuales como la lipoarabinomanana (LAM), han sido caracterizados como ligandos de receptores fagocíticos. En 1987, Gaylord y Brennan publicaron un modelo sobre la estructura de la pared de Mycobacterium leprae (ML) en el que proponen la ubicación que pudieran tener estos componentes. Sin embargo, hasta el momento no hay información sobre la estructura de la pared de Mycobacterium lepraemurium. En el modelo de M. leprae, dentro de los componentes más expuestos se encuentra la lipoarabinomana y el glicolípido fenólico. Por su localización, estos lípidos quizá estén dentro de los componentes más reconocidos por las células fagocíticas. Existen algunos reportes que indican que los lípidos de Mycobacterium leprae inactivan las funciones del macrófago y proponen que la pared de la micobacteria podría estar involucrada en su supervivencia en el hospedero (Moura et al, 1997). La respuesta macrofágica contra Mycobacterium lepraemurium MLM es un patógeno exitoso del macrófago ya que logra penetrar y residir en él sin despertar la respuesta antibacteriana de la célula. Al respecto, existen varias evidencias de que MLM, a diferencia de BCG, evade los mecanismos microbicidas de los macrófagos. Mycobacterium bovis BCG, es una micobacteria no patógena para el ratón y es, en cambio, un excelente inductor de la respuesta inmunitaria celular en este y otros animales (Rojas-Espinosa, O et al, 2002). De estas evidencias se sabe por ejemplo, que mientras BCG despierta los cambios oxidativos generadores de radicales libres del oxigeno (peróxido de hidrógeno y anión superóxido) al ingresar a los macrófagos, MLM no lo hace (Rojas-Espinosa et al, 1998). Por otro lado, MLM infecta a los macrófagos murinos sin estimular en ellos la producción de cantidades substanciales de TNF y .NO. BCG, en cambio, induce en estas células la producción de niveles muy elevados de estos mediadores (Rojas-Espinosa et al, 2002). Se sabe, por otro lado, que el sistema de la mieloperoxidasa (MPO) juega un papel importante en el control de la enfermedad causada en el ratón por MLM. Los bacilos forrados con PO (MLM-PO) produjeron una enfermedad que evolucionó más lentamente que la enfermedad producida por los bacilos intactos (Rojas-Espinosa et al, 2002b). Por su parte Maslov et al. (2000a y 2000b) determinaron que la administración oral de peroxidasa en ratones infectados con Mycobacterium leprae incrementaba la resistencia de los animales a la infección. La propiedad que tiene MLM de penetrar en los macrófagos sin despertar la respuesta antibacteriana en estas células sugiere que la bacteria penetra por alguna vía diferente a la utilizada por BCG. Proceso de fagocitosis Existen varias revisiones sobre el proceso de la fagocitosis en general y sobre la fagocitosis de micobacterias en particular (Ernst, 1998; Cosma et al., 2003; Rojas-Espinosa et al, 2003). En la Figura 1 se ilustra de manera resumida este proceso que incluye las etapas de: a) quimiotaxis, b) adherencia de las células con los microorganismos, c) endocitosis, d) formación del fagosoma, e) la fusión fagolisosomal y destrucción de microorganismos, y f) la exocitosis o eliminación de desechos.

Figura 1 omitida por reducción del tamaño del archivo

La fagocitosis de micobacterias patógenas y no patógenas es también un tema muy estudiado pero se sabe poco sobre la fagocitosis de MLM. Se desconocen las vías de entrada de esta micobacteria a los

Figura 1.- Proceso de fagocitosis. Tomado de Rojas-Espinosa et al. (2003).

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macrófagos murinos, los receptores participantes, las cascadas de señalización y la maduración de fagosomas entre otros eventos. También se desconocen los mecanismos de evasión del parásito. Es por esto que en el presente trabajo estudiaremos algunos de los eventos de la fagocitosis de MLM por macrófagos murinos. Receptores de macrófagos Una de las tareas del sistema inmune es la de reconocer y eliminar a un gran número de patógenos a través de su reconocimiento por receptores celulares. Ahora se sabe que el número de estos receptores es relativamente limitado porque reconocen patrones de ligandos conservados en casi todos los microorganismos (Aderem y Underhill, 1999). En conjunto, los ligandos presentes en los microorganismos reconocidos por receptores celulares se describen como PAMP(s) o patrones moleculares asociados a patógenos. Los receptores de reconocimiento de estos patrones moleculares se denominan PRR(s) o receptores de reconocimiento patrón. De estos PRR(s) existe un amplio grupo, entre ellos los TLR, los receptores para manosa, los receptores para carbohidratos, y otros que reconocen ligandos de una gran variedad de microorganismos (Janeway, 1992). En la tabla 1 se enlistan algunos de estos receptores y sus ligandos.

Tabla 1. Ligandos y receptores identificados en el reconocimiento de micobacterias.

PAMP(s) PRR(s)

Manosa y Fucosa Receptor de manosa (MR) o CD 206 Peptidoglicano, LAM CD14 Lipopolisacáridos Scavenger receptor (SR)

Complemento (C3b, C3bi, C4) CR1 (CD35), CR3 y CR4

Fc de anticuerpos Fc III/II/I R (CD16,32,64)

Lipocompuestos (como LAM y otros). TLR´s 1, 4, 6 o heterodímeros de ellos

Receptores involucrados en el ingreso de micobacterias en macrófagos Aunque existen varios reportes que indican la participación de receptores en la entrada de micobacterias a los macrófagos, los estudios que analizan la participación de más de un receptor en la interiorización de una micobacteria en particular son escasos. Algunos datos sobre la participación de receptores macrofágicos en la fagocitosis de micobacterias son los siguientes: Schlesinger, et al, 1990 y 1991 encontraron que M. leprae se internaliza en monocitos humanos y en macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM) a través de un proceso de fagocitosis convencional y que en la internalización participan los receptores CR1 y CR3 (Schlesinger, et al, 1990 y 1991). Schlesinger et al, 1991 y Zimmerli et al, 1996, reportaron que M. tuberculosis penetra a los macrófagos humanos a través de los receptores MR, CR3, CR4 y SR. Schlesinger (1993), reporta que el complemento y el receptor para complemento juegan un papel relevante en la fagocitosis de M. tuberculosis tanto de cepas virulentas (Erdman y H37Rv) como no virulentas (H37Ra). También observa que el receptor de manosa (MR) únicamente participa de manera importante en la fagocitosis de las cepas virulentas. Por su parte, Hirsch et al (1994), reportan que los macrófagos alveolares fagocitan a Mycobacterium tuberculosis a través del receptor CR4. Astarie-Dequeker et al, reportaron en 1996 que el receptor de manosa (MR) fue incapaz de distinguir entre micobacterias patógenas (M. kansasii) y no patógenas (M. smegmatis y M. phlei), pues ambas ingresaron de manera comparable en macrófagos derivados de monocitos (MDM) humanos. Bochud et al (2003), mostraron que el TLR2 juega un papel esencial en la respuesta inmune innata contra M. leprae y que CD14 potencia la respuesta inmune pero no participa en la activación del NF-B. Por su parte, TLR2 participa en el reconocimiento de LAM de micobacterias de rápido crecimiento pero TLR4 no. Por otro lado, las LAM de M. tuberculosis y M. bovis no inducen activación dependiente de TLRs (Means, et al. 1999).

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Transito intracelular de micobacterias Inmediatamente después de llevarse a cabo la fagocitosis de la micobacteria, esta es enclaustrada en una vesícula perfectamente limitada conocida como fagosoma o endosoma. Después de formarse, el fagosoma sufre cambios graduales en su composición al interaccionar con vesículas o endosomas de variada naturaleza, que finalmente le permiten fusionarse con lisosomas los cuales terminan virtiendo su contenido intravesicular al interior del fagolisosoma. Dentro de esta estructura los microorganismos se enfrentan a condiciones inhóspitas (pH bajo, enzimas hidrolíticas, mieloperoxidasa, defensinas y otros péptidos bactericidas, metabolitos reactivos del oxígeno y metabolitos reactivos del nitrógeno) y terminan por ser destruidos (Abbas 2006, Rojas-Espinosa, 2003). En la Figura 2 se muestra un esquema sobre el proceso de maduración de un fagosoma desde su formación hasta su fusión con lisosomas, y se señalan diferentes marcadores moleculares que podrían utilizarse para monitorear el proceso de maduración de los fagosomas de MLM. Maduración de fagosomas Posterior a la formación del fagosoma que contiene al patógeno fagocitado y posiblemente un poco de material extracelular, esta vesícula empieza a modificarse estructuralmente en un proceso conocido como maduración (Garin et al, 2001 y Rink et al, 2005). El fagosoma inicial interacciona con endosomas tempranos para formar un fagosoma temprano que puede identificarse por la adquisición de Rab 5 y EEA1 (antígeno endosomal temprano 1). Las Rab son un grupo de GTPasas pequeñas parecidas a ras (Rink et al 2005) que tienen la habilidad de unirse a la membrana de los fagosomas promoviendo su maduración. También existen endosomas que no interaccionan con fagosomas y que son “reciclados”. Estos endosomas expresan en su membrana marcadores como Rab11 que les conduce hacia la membrana exterior, imposibilitando su posible fusión con lisosomas. Más adelante, el fagosoma temprano interacciona con otras vesículas o endosomas adquiriendo nuevos marcadores membranales como Rab7, Rab 9, el receptor de Manosa 6-Fosfato, sintaxina y algunos otros, para convertirse en un fagosoma tardío. La adquisición de estos marcadores ocurre como resultado de un proceso de fusión-fisión entre fagosomas y endosomas (Vieira et al., 2002 and Desjardin 1995). Más adelante, los fagosomas tardíos interaccionan con vesículas portadoras de protón-ATPasa e incorporan en su membrana este marcador cuya función es la de proveer al fagosoma con iónes H+, confiriéndoles un pH ácido (≤ 5.5). Por otro lado están los lisosomas los cuales son compartimentos vesiculares con una gran variedad de enzimas hidrolíticas, incluyendo catepsina-D que frecuentemente se usa como marcador de estas vesículas. Los lisosomas se fusionan temporalmente con los fagosomas maduros, intercambian componentes membranales y vierten su contenido en el interior de los fagosomas, los cuales (como fagolisosomas) se constituyen en sitios de destrucción de la mayoría de los microorganismos que son ingeridos. En relación a nuestro modelo de estudio, Hart et al (1972) encontraron por microscopia electrónica de transmisión, que M. lepraemurium es una bacteria fusiogénica o sea una bacteria que de alguna manera promueve la fusión fago-lisosomal, o cuando menos no interfiere con ella. No obstante, hasta el momento nada se sabe sobre la maduración de los fagosomas de MLM. M. lepraemurium no sólo resiste las condiciones hostiles de los fagolisosomas sino que las aprovecha y se replica en ellos, sin molestar, aparentemente, la célula donde se instala.


. Participación de “lipid rafts” en la fagocitosis de MLM Los “lipid rafts” o balsas lipídicas son estructuras dinámicas presentes en la membrana celular, ricas en colesterol y esfingolípidos. Se sabe que los “lipid rafts” (lipid rafts) participan en la entrada o fagocitosis de bacterias, virus, hongos y otros microorganismos entre los cuales están E.coli, Pseudomona aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Campylobacter jejuni, Brucella abortus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium (Zaas et al, 2005). En el caso especifico de micobacterias se ha reportado que Mycobacterium avium ingresa a macrófagos murinos a través de un

Figura 2. Cambios en la composición de los fagosomas durante su maduración. Modificada de Vieira et al, 2002

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proceso dependiente de lipid rafts (Maldonado-García G et al, 2004). También se sabe que la fagocitosis de Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis se reduce hasta en un 90% cuando se “secuestra” el colesterol de la membrana de células fagocíticas de manera experimental (Gatfield et al, 2000). Además se ha sugerido que el uso de lipid rafts como puertas de entrada a las células fagocíticas podría estar ligado a la capacidad de varios microorganismos de impedir la maduración de fagosomas y la fusión fagolisosomal (Lafont et al, 2005) lo cual podría explicar la interrupción de la fusión fagolisosomal en el caso de MTB. Sobre la participación de lipid rafts en la fagocitosis de MLM no hay información publicada. Aunque inicialmente nuestra intención era estudiar, comparativamente, la participación de lipid rafts en la endocitosis de MLM y MTB, debido a la formación de agregados irregulares en MTB, finalmente decidimos hacer el estudio comparativo entre MLM y Brucella abortus, una bacteria que utiliza los lipid rafts para ingresar a los macrófagos peritoneales de ratón (Lapaque et al, 2006). Señalización inducida por MLM al ingresar en macrófagos murinos vía TLRs. La participación de TLRs (toll like receptors) en la fagocitosis de diversos microorganismos es un tema ampliamente estudiado. Jo et al (2007) publicaron una recopilación sobre el papel de TLRs en la fagocitosis de micobacterias. En esta revisión resalta que la micobacteria más estudiada ha sido Mycobacterium tuberculosis, dada la alta incidencia de tuberculosis a nivel mundial. Para esta micobacteria el receptor mas importante es TLR2 como también lo es para M.bovis y M. smegmatis. La importancia de este receptor en la tuberculosis se señala además en otros trabajos, como el de Saguwara et al, que en 2003 reportaron que la infección con Mycobacterium tuberculosis en ratones KO a TLR2 induce cambios en el desarrollo de la enfermedad, las lesiones en pulmón son de mayor tamaño que en los animales WT y presentan un abundante infiltrado de neutrófilos. Por lo contrario, la infección en ratones KO a TLR-6 no mostró cambios al compararla con los ratones WT, sugiriendo que TLR-6 no juega un papel importante en el desarrollo de la tuberculosis murina experimental. Nicolle et al en el 2004 por su parte reportaron que la infección de macrófagos derivados de monocitos de medula ósea con M.bovis BCG no parece tener preferencia por TLR2, TLR4 o TLR-6. En este trabajo se emplearon ratones KO para estos receptores y en todos los casos la formación del granuloma, la activación celular y el control de la enfermedad fue la misma. Los autores concluyeron que la infección por M. bovis BCG ocurre independientemente de la expresión de alguno o más de estos receptores. o que ellos tienen un efecto redundante. Por otro lado, en la lepra (humana o murina) se sabe poco o nada sobre la participación de receptores TLRs en el ingreso de ML o MLM a macrófagos. En la Tabla 2, podemos observar que existen muy pocos reportes sobre la participación de TLRs en la lepra y ninguno en la lepra murina. Por esto, decidimos investigar la participación de diferentes receptores en la entrada de MLM a macrófagos murinos. Los resultados obtenidos indican que el Receptor de Manosa y TLR-6 parecen ser importantes en el ingreso de esta micobacteria a los macrófagos murinos. Dada la relevancia de TLR-6 como un posible (novel) receptor para una micobacteria, decidimos identificar algunas de las proteínas transductoras de señales derivadas de la activación de TLR-6 en respuesta a su contacto con MLM.

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Como resultado de la interacción de los TLRs con sus ligandos homólogos se activan dos vías de señalización, una de ellas dependiente de MyD88 y la otra independiente, aunque hay proteínas de transducción comunes a ambas vías. Hasta el momento no se conocen la(s) cascada(s) de señalización derivadas de la activación de TLR-6. A manera de inspección (screening) proponemos analizar la participación de MyD88, una molécula de activacion temprana, TRAF-6, una molécula de activación intermedia, y NFB, una molécula de activación tardía. En la Figura 3 se señalan las cascadas de señalización que se disparan cuando algunos componentes micobacterianos interaccionan con los algunos de los receptores TLR. Se muestran las proteínas de señalización identificadas en cada caso.

Figura 3 omitida por reducción del tamaño del archivo OBSERVACIONES DEL LABORATORIO Mycobacterium bovis BCG es un microorganismo no patógeno para los ratones inmunocompetentes. Penetra a los macrófagos del ratón despertando en ellos una respuesta microbicida eficiente caracterizada por la producción de niveles elevados de radicales libres del oxígeno (ROI), del nitrógeno (.NO) y de TNF. Por el contrario M. bovis BCG, penetra a los macrófagos de manera desordenada en la forma de pequeños grumos que luego son destruidos por los mecanismos microbicidas de las células. Mycobacterium lepraemurium es un microorganismo no toxigénico pero patógeno para el ratón. Penetra a los macrófagos en forma discreta, sin despertar en ellos ni la producción de TNF, ni la generación de radicales libres del oxígeno (ROI) y del nitrógeno (.NO) y lo hace en una forma ordenada principalmente a través de los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de las células. Dentro de los macrófagos los bacilos muestran una disposición radial lo que sugiere un ordenamiento particular del citoesqueleto. La replicación de los bacilos dentro de los macrófagos es continua pero los bacilos no parecen causarle ningún daño a sus hospederos excepto cuando las células estallan por no poder contener más bacilos. HIPOTESIS Mycobacterium lepraemurium penetra a los macrófagos murinos utilizando los mismos receptores utilizados por otras micobacterias y su entrada dispara las mismas vías de señalización que operan con otras micobacterias. HIPOTESIS ALTERNA Mycobacterium lepraemurium penetra a los macrófagos murinos utilizando receptores diferentes a los utilizados por otras micobacterias y esto trae como consecuencia que se disparen cascadas de señalización diferentes a las inducidas por otras micobacterias. OBJETIVO GENERAL: Identificar la vía de entrada de MLM a los macrófagos murinos OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Determinar la participación de los receptores de manosa (MR), TLR2, TLR4, TLR-6, CD35 (CR1), CD14, CD16/32 (Fc RIII/II) y DC-SIGN en la interiorización de MLM.

2. Estudiar el tránsito intracelular de MLM en macrófagos murinos mediante microscopía de luz, de fluorescencia y confocal.

3. Determinar la participación de “lipid rafts” en la entrada de Mycobacterium lepraemurium a macrófagos murinos.

Tabla 2 .- Ligandos micobacterianos que son reconocidos por TLRs. Tomada de Jo et al., 2007.

Figura 3. Señalización a través de TLRs inducida por ligandos micobacterianos. Se indican las diferentes moléculas que se activan en respuesta al reconocimiento de la micobacteria. Tomada de Jo et al., 2007.

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MATERIAL Y MÉTODOS

A.- Cultivo de macrófagos peritoneales Como fuente de macrófagos se utilizaron ratones hembra de la cepa NIH de 22-25 g, mantenidos en condiciones adecuadas de bioterio. Los animales se sacrificaron por inhalación de cloroformo, se sangraron por punción cardiaca y se prepararon para extracción de células peritoneales. La extracción de células se hizo por lavado peritoneal con solución de Alsever, la suspensión celular obtenida se centrifugó a 240 g durante 3 minutos y el botón celular se lavó 3 veces con la misma solución de Alsever. Las células lavadas se resuspendieron en medio de cultivo DMEM adicionado con 10 % de suero fetal de ternera, luego se procedió a determinar el número de células por conteo con cristal violeta. Para los cultivos se sembraron 3X106 células por caja de Petri, cada una provista de un cubreobjeto limpio y estéril. Las células se incubaron durante una semana a 37º C con 5% de CO2 haciendo cambios de medio de cultivo cada 2 días. B.- Purificación de Mycobacterium lepraemurium MLM se aisló y purificó del hígado y bazo de ratones con 5 a 6 meses de infección mediante una modificación de las técnicas de Prabhakharan (1976) y Draper (1980) y la cantidad de bacterias se cuantificó utilizando una curva densitométrica de referencia. Una vez determinada la concentración de bacterias se prepararon alícuotas en medio 7H9 enriquecido con 10% de OADC y se conservaron a -70º C hasta su uso. El grado de viabilidad de las micobacteria en la suspension bacteriana se determinó por la técnica de Jarnagin et al (1980) utilizando los cromógenos fluorescentes diacetato de fluoresceína y bromuro de etidio. C.- Tinción de Mycobacterium lepraemurium con Rojo Texas Se preparó una solución Stock de Rojo Texas a la concentración de 1 mg por ml de dimetilsulfóxido. De esta solución se tomaron 5 l para teñir un promedio de 10 x109 bacterias. La mezcla se incubó con el colorante durante 30 minutos en la oscuridad. Pasado el tiempo se hicieron un mínimo de 4 lavados de la suspensión con PBS. Finalmente las bacterias teñidas se suspendieron en DMEM para proceder a las infecciones in Vitro. D.- Infección de macrófagos peritoneales con Mycobacterium lepraemurim. 1.- Los cultivos celulares se infectaron con diferentes cantidades (MOI, multiplicity of infection) de MLM. Para este experimento se usaron los cultivos con 3 x 106 células por placa y las infecciones se hicieron con MOIs de 5:1, 10:1 y 50:1. Los cultivos se mantuvieron en incubación por 15, 30, 60, 120 y 240 minutos, y 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de infección, las monocapas celulares se lavaron con PBS, se fijaron con Formol al 4% en PBS durante 5 minutos, y se tiñeron usando el procedimiento de Ziehl-Neelsen, contrastando con azul de toluidina. Finalmente las preparaciones se dejaron secar al aire y se montaron con resina sintética (SIGMA) entre porta- y cubreobjetos. E.- Microscopia electrónica de transmisión Se prepararon cultivos celulares con 3 x 106 macrófagos por caja y se infectaron con MLM a una MOI de 50:1. Después, los macrófagos infectados se mantuvieron en incubación durante 30, 60, 120 y 240 minutos, 24 horas, y 2, 7 y 14 días. Las bacterias que permanecieron fuera de los macrófagos se eliminaron por lavado con PBS. Al cabo de cada tiempo de incubación, las monocapas celulares se fijaron con glutaraldehído al 2.5% en cacodilato de sodio 0.1M, pH 7.4, durante 2 horas a 4° C. Posteriormente las células se separaron mecánicamente y se colectaron en un tubo de microcentrífuga para lavarse 3 veces por centrifugación (5 min/ 20800 g) con cacodilato de sodio 0.1 M. Las células lavadas se suspendieron en tetróxido de osmio (OsO4) al 1% diluido en cacodilato de sodio 0.1M durante 1 hora, en agitación. Después, las células se lavaron 3 veces con cacodilato de sodio 0.1M por centrifugación como antes. Enseguida, las preparaciones se deshidrataron en etanol al 70%, 80%, 90%, y 2 veces en alcohol absoluto durante 15 min en cada solución. Posteriormente las suspensiones celulares se deshidrataron en óxido de propileno 2 veces, durante 20-30 minutos cada vez. Las suspensiones se centrifugaron a 20800g y los paquetes celulares se mezclaron con resina Spurr y óxido de propileno (1:1). Las células en suspensión se incubaron en agitación durante 30 min, y luego de centrifugar, las células se suspendieron en resina Spurr-óxido de propileno (3:1), manteniéndose en agitación durante 30 minutos. Después de centrifugar nuevamente, las células se suspendieron en resina Spurr pura y las suspensiones se mantuvieron en agitación durante 4 horas. La inclusión en resina Spurr pura se repitió dos veces más. La mezcla de células en resina se dejó polimerizar a 58ºC durante 48 horas y luego se procedió a preparar

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“las pirámides” para su corte en microtomo. Las secciones obtenidas se recogieron en rejillas metálicas y contrastaron con acetato de uranilo al 6% durante 25 minutos y con nitrato de plomo (marca, Cat, stock comercial) por 2 minutos para su observación en el microscopio electrónico de transmisión. G.- Infecciones de macrófagos peritoneales con MLM Se prepararon cultivos de macrófagos y se infectaron con micobacterias teñidas con rojo Texas, a una MOI de 50:1, durante 15, 30, 60, 120, 240 minutos y 24 horas. Transcurrido el tiempo de infección los cultivos se lavaron con PBS, y se fijaron con una solución de glutaraldehído al 0.7% en PBS. Después, los cubreobjetos se recuperaron y se lavaron con PBS para luego montarse entre porta- y cubre-objetos con glicerol y propilgalato o Vecta shield. Las preparaciones se analizaron por microscopía de fluorescencia simple y confocal. H.- Bloqueo de receptores en macrófagos murinos Con la finalidad de determinar cual o cuales receptores utiliza MLM para su ingreso a los macrófagos peritoneales del ratón, recurrimos al bloqueo de los mismos con anticuerpos específicos. Los anticuerpos empleados fueron anti-Fc RIII/IIR (PharMingen) anti-CD 16/32, anti-CD 35, anti-TLR2, anti-TLR4, anti-TLR-6 (Santa Cruz Biotechonology), anti-CD14 (PharMingen), anti-DC-SIGN (CIRE) (eBiosciences), y mananas acopladas a BSA y FITC (SIGMA). Se prepararon cultivos de macrófagos y se incubaron individualmente con cada uno de los anticuerpos mencionados a una concentración de 10 g /millón de células, durante 30 minutos a 4ºC. También se hicieron incubaciones con mezclas de todos los anticuerpos. Después los cultivos se infectaron con MLM a una MOI de 50:1, durante 30 minutos a 37°C. Finalmente, los cultivos se lavaron con PBS, se fijaron con formaldehído al 2% en PBS, se lavaron con agua destilada, se dejaron secar al aire, se tiñeron con Fucsina Fenicada y azul de toluidina, y se montaron con resina sintética para su posterior observación. Se determinó el número de bacterias fagocitadas con cada tratamiento y los resultados se compararon con los obtenidos en ausencia de los bloqueadores de receptores. Para visualizar el bloqueo de CD35 y CD 16/32 con los anticuerpos respectivos se utilizaron bacterias opsonizadas con complemento de cobayo y anticuerpos de un ratón con lepra, respectivamente. I.- Análisis de bloqueo de receptores mediante citometría de flujo El efecto del bloqueo de los receptores también se analizó por Citometría de Flujo usando un citómetro FACScalibur Cell Quest (Beckton Dickinson, Estados Unidos). Para aumentar la cantidad de células, se administró 1 ml de aceite mineral ligero por vía intraperitoneal. Después de 4 días se procedió a la colección, lavado y preparación de células como ya se ha descrito antes. Para este experimento se utilizaron tubos de nalgeno de 13 x 100 mm. Se incubaron 1X106 células por tubo y se mantuvieron a 37°C y 5% CO2 durante 30 min. Posteriormente los tubos se enfriaron a 4°C para hacer los bloqueos de los receptores con anticuerpos y ligandos específicos de los receptores. La incubación se realizó a 4°C durante 30 min con la finalidad de reducir la endocitosis del anticuerpo. La concentración de cada anticuerpo fue de 1 o 2 g por cada millón de células. Una vez transcurrido el tiempo de incubación las células se lavaron por centrifugación a 1500 rpm y luego se infectaron con MLM teñido con rojo Texas a una MOI de 50: 1. Las micobacterias se mantuvieron en contacto con las células durante 30 min a 37°C y posteriormente se lavaron para eliminar las bacterias no ingeridas. Finalmente las células se fijaron con 500 l de paraformaldehído al 1% en PBS. Así fijadas, las células se conservaron a 4°C hasta su adquisición en el citofluorómetro protegidas de la luz. Para el análisis con el Programa CellQuestPro, se seleccionó la ventana de las células CD11b+ y se incluyeron los controles de isotipo correspondientes. Expresión de TLR-6 y Receptor de Manosa en macrófagos murinos infectados con MLM. Para medir la expresión de receptores TLR-6 y MR en los macrófagos murinos infectados con MLM, las células se infectaron con la micobacteria a una MOI de 50:1 durante 30 min a 37ºC eliminando las bacterias extracelulares por lavado con PBS tibio. Después de lavarse, las células se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 minutos. Las células fijadas se lavaron con PBS y luego se incubaron con albúmina bovina al 3% durante 30 minutos antes de adicionar de manera individual, el anticuerpo anti-TLR-6 y las mananas-BSA-FITC. Las preparaciones incubadas con anti-TLR-6 se lavaron e incubaron con un anticuerpo anti cabra acoplado a FITC a una dilución 1:200 (SIGMA F 2016) y finalmente todas las preparaciones se lavaron con PBS, se montaron sobre portaobjetos con Vecta Shield y se analizaron por microscopía confocal.

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Expresión de DC-SIGN en macrófagos murinos peritoneales. Para medir la expresión de la molécula DC-SIGN, los cultivos de macrófagos se incubaron con IL-4 (60 pg/ ml y 250 pg/ ml), IL-10 (0.6 ng ml y 2 ng/ ml) o TGF- (0.6 pg/ ml y 2 ng/ ml) durante 24 horas. Las concentraciones se emplearon por 1 X 106 células. Después de eliminar las citocinas por lavado con DMEM, los cultivos se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 40 min, se lavaron 3x con PBS, se incubaron con suero de ratón al 2% o albúmina sérica bovina al 3% en PBS durante 30 min, se lavaron 2x con PBS, se incubaron con un anticuerpo de rata anti-CIRE (DC-SIGN, 1:250) durante la noche a TA, se lavaron 2x con PBS, se incubaron con un anticuerpo secundario (anti-rata-TRICT, 1:250) por 2 horas a TA, se lavaron con PBS, y se montaron con Vecta Shield para su observación al microscopio. Algunas preparaciones celulares tratadas con las citocinas mencionadas se infectaron con MLM teñido con Rojo Texas para averiguar si hay o no colocalización de MLM y DC-SIGN. Participación de “lipid rafts” en la entrada de MLM a macrófagos murinos Se prepararon cultivos de macrófagos y se infectaron con MLM o con Brucella mellitensis (control positivo del fenómeno) por diferentes tiempos (15, 30 y 60 min). Las bacterias se pretiñeron con Rojo Texas. Algunos cultivos de macrófagos se trataron por una hora con metil--ciclodextrina (SIGMA), una molécula que secuestra e inmoviliza colesterol en la membrana celular, antes de la infección. Al cabo de cada tiempo de infección los cultivos celulares se lavaron con PBS (3 veces) se fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min, se lavaron 3x con PBS, se incubaron con suero de ratón al 2% durante 30 min, se lavaron 3x con PBS, y se incubaron con la fracción de la toxina del cólera acoplada a FITC (0.5 g/ ml) por 1 hora a TA. Finalmente las células se lavaron con PBS (4 veces) y se montaron sobre portaobjetos con Vecta Shield para su observación por microscopia de fluorescencia y confocal.

RESULTADOS

Durante mucho tiempo hemos estudiado a la lepra murina como modelo de una enfermedad relacionada con la lepra (humana). En este trabajo profundizamos un poco más en el estudio de la relación macrófago-MLM, identificando los receptores membranales que participan en la entrada natural de la micobacteria a la célula, así como el proceso de maduración de los fagosomas de MLM. Infección de macrófagos peritoneales con MLM Los macrófagos peritoneales de ratón empleados en el estudio fueron células que se obtuvieron mediante lavado peritoneal y que no fueron activados de ninguna manera experimental dado que nuestro interés fue determinar el comportamiento de estas células bajo condiciones similares a las encontradas in vivo. En cultivo, las células se adhieren a la placa que las contiene y posteriormente empiezan a “alargarse” hasta adquirir la clásica morfología de macrófagos. Al cabo de una semana de cultivo las células muestran una morfología “normal” adecuada para evaluar la fagocitosis y otros procesos relacionados. La infección de macrófagos peritoneales con Mycobacterium lepraemurium (MLM) induce cambios en la célula que no se presentan o que no se han reportado en infecciones por otras micobacterias como Mycobacterium tuberculosis (MTB) o M. bovis BCG. El proceso de la fagocitosis inicia cuando la bacteria hace contacto con las células. En el caso particular de MLM, este microorganismo es atrapado por los macrófagos inicialmente a través de estructuras desconocidas situadas en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de las células (Figura 5)


Figura 5. La fagocitosis de MLM por los macrófagos peritoneales de ratón se inicia con la adhesión de la bacteria a estructuras, hasta ahora desconocidas, presentes en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de las células.

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Aunque la adhesión de MLM a las células ocurre desde el inicio, la endocitosis de las bacterias sólo se hace evidente hacia los 15 minutos después del contacto, y el proceso de ingestión continúa hasta varios días después. (Figura 6).

Figura 6 omitida por reducción del tamaño del archivo Las células que ingieren MLM mantienen una morfología saludable hasta varios días después de su infección (Figura 7). Hemos podido mantener macrófagos infectados por MLM hasta por 3 semanas, después las células se empiezan a despegar y deteriorar.

Figura 7 omitida por reducción del tamaño del archivo El proceso de ingestión se completa cuando MLM se aloja en los macrófagos de una manera radialmente ordenada, al principio alrededor del núcleo y después en la totalidad del citoplasma respetando siempre una región circular adyacente al núcleo donde no se hemos podido identificar estructuras definidas. El comportamiento de BCG en este proceso es claramente diferente, las bacterias ingeridas se agregan formando grumos de forma y tamaño variables (Figura 8) La respuesta de los macrófagos a la ingestión de MLM y BCG también es diferente pues mientras los macrófagos infectados con MLM permanecen adheridos al plástico, los macrófagos infectados con BCG en su mayoría se despegan.



El tránsito de MLM dentro de la célula fagocítica también es un proceso ordenado y su movimiento centrípeto parece depender de microtúbulos ya que la micobacteria se desplaza como si estuviera usando esas estructuras para hacerlo. La figura 9 muestra algunas imágenes seleccionadas de las fotografías tomadas cada 6 segundos dentro de un periodo de tiempo de 40 min que ilustran el desplazamiento intracelular de MLM. La última imagen es una fotografía tomada con el microscopio electrónico que muestra el ordenamiento con el cual penetra MLM a los macrófagos murinos a partir de las extensiones citoplásmicas y en forma alineada. La organización del citoesqueleto y la participación de los microtúbulos en el movimiento intracelular de MLM es un aspecto que debe estudiarse con más detalle.

B.- Replicación de MLM en macrófagos murinos. Desde que realizamos los estudios de fagocitosis de MLM en macrófagos peritoneales nos dimos cuenta de que la cantidad de bacterias usada para infectar no correspondía a la observada en días posteriores. Un

Figura 7. La ingestión de MLM por los macrófagos peritoneales de ratón es un proceso continuo y ocurre paralelamente a la adaptación de los macrófagos al cultivo in vitro. En el experimento mostrado, los cultivos de macrófagos se infectaron con MLM preteñidos con Rojo Texas, a una MOI de 50:1. Cinco días después de la infección los macrófagos muestran una morfología saludable.

Fig. 8. Fagocitosis de MLM y BCG por macrófagos murinos. Mientras que MLM es ingerido de manera ordenada, manteniendo una disposición radial, BCG es ingerido de manera desordenada, formando grumos que se distribuyen al azar.

Figura 6 .Fagocitosis de Mycobacterium lepraemurium por macrófagos murinos. La figura muestra el cultivo de macrófagos no infectados (A), y cultivos de macrófagos infectados durante 15 min (B), 60 min (C), y 120 min (D) con MLM preteñido con Rojo-Texas. Los bacilos interactúan con moléculas no identificadas en la parte apical de las extensiones citoplásmicas de los macrófagos y penetran a estas células a través de estas estructuras.

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experimento de infección de macrófagos murinos con MLM a una MOI de 50:1, permitió medir el número de bacterias por macrófago al inicio de la infección y a lo largo de 3, 5, 7 y 12 días de cultivo. Con esto pudimos calcular que el tiempo de replicación de MLM es incluso menor que el reportado por Silbaq et al. (1989), quienes encontraron que MLM se replica cada 0.5 días en la almohadilla plantar del ratón en los primeros días de la infección y que el tiempo de replicación se alarga hasta 9-11 días en las etapas tardías de la misma. Estos resultados se ilustran en la Figura 10.


La infección por MLM no molesta visiblemente a los macrófagos ya que estos no modifican su morfología, no se desprenden de las placas de cultivo y no muestran signos de daño ni necrótico ni apoptótico. La Figura 11 muestra un cultivo de macrófagos con 12 días de infección por MLM con una MOI original de 50:1. Es notorio que la mayoría de los macrófagos se infectan con el microorganismo y que pueden alojar cantidades enormes de bacilos.


No obstante la enorme cantidad de bacilos contenidos, los macrófagos no pierden la capacidad de fagocitar otros microorganismos, lo que sugiere que las vías de entrada son diferentes y que los mecanismos de endocitosis son particulares para cada microorganismo. La Figura 12 muestra la coinfección de un macrófago con MLM y levaduras. Para corroborar esta observación, se realizaron experimentos en los cuales los macrófagos primero se infectaron con levaduras de pan y después con MLM; los resultados mostraron que la infección de macrófagos con levaduras induce cambios en las células pero no evita la infección posterior con MLM, aunque esta ya no ocurre de manera ordenada.

Figura 12 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 12. (A) Infección de macrófagos peritoneales de ratón, primero con MLM y luego con levaduras, (B) Infección de macrófagos peritoneales primero con levaduras y luego con MLM. La fagocitosis de cada microorganismo no parece interferir con la fagocitosis del otro, aunque la fagocitosis primero de levaduras evita que MLM se ingiera de manera ordenada.

C.- Fagocitosis de MLM visualizada por microscopía electrónica de transmisión Las características del proceso de fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos descrito anteriormente, ahora se analizan por microscopía electrónica de transmisión. Se observó que la bacteria penetra a los macrófagos en fagosomas únicos y que luego estos se fusionan para formar fagosomas gigantes. También se observó que los macrófagos parasitados no muestran las prolongaciones y extensiones citoplásmicas características de los macrófagos activados lo cual sugiere la nula agresión de MLM a las células (Figuras 13 y 14). En cuanto a los cambios intracelulares, aparte de la presencia de bacilos, no hay alteraciones aparentes y el núcleo muestra una morfología normal. Por su parte, los bacilos ingeridos no muestran evidencias de daño a pesar de tener cinco días dentro de los macrófagos. Probablemente la presencia del material transparente a los electrones (lípidos de la pared bacteriana) tenga que ver con la integridad de las bacterias al funcionar como una berrera de protección química y mecánica

Figura 11. Los macrófagos peritoneales de ratón tienen una alta capacidad de fagocitar microorganismos, y en el caso de MLM, de soportar su proliferación masiva sin sufrir cambios aparentes durante varias semanas de cultivo. Tinción con Ziehl-Neelsen, 100X.

Figura 10. Replicación de MLM en macrófagos peritoneales de ratón (NIH). Los macrófagos se infectaron con 5 bacilos por célula (MOI 5:1) y se mantuvieron en cultivo durante 12 días.

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Figura 14 omitida por reducción del tamaño del archivo D.- Participación de receptores fagocíticos en la entrada de MLM a macrófagos murinos. Una vez conocida la manera general en la que MLM es ingerido por los macrófagos murinos, era necesario identificar los receptores relacionados con su ingestión. Para ello analizamos la participación de algunos de los receptores más importantes de los macrófagos. Estos fueron CD16/32 (receptor para FcRII/III), CD14, CD35 (receptor para complemento), MR (receptor para Manosa), TLR-2, TLR-4, TLR-6 y DC-SIGN. Para el estudio, los receptores se bloquearon con anticuerpos o con ligandos específicos para ellos. El bloqueo se hizo a 4°C para evitar la endocitosis de anticuerpos y ligandos. En el caso de CD35 y CD16/32 las bacterias se incubaron con anticuerpos (suero de ratón leproso) o complemento de cobayo, observando que la infección con MLM-complemento o MLM-anticuerpos facilita la fagocitosis y que ésta disminuye cuando los macrófagos se tratan con los antagonistas correspondientes. El tratamiento de los macrófagos con los diferentes anticuerpos condujo a una disminución significativa de la fagocitosis de MLM sólo cuando los macrófagos se preincubaron con los antagonistas de TLR-6 y de MR. Con los otros anticuerpos no sé observó tal efecto. En la Figura 15 podemos observar el efecto del bloqueo de receptores de manera individual. Algunos experimentos de bloqueo se hicieron con mezclas de todos los anticuerpos o con mezclas de algunos de ellos.

Figura 15 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 15. Bloqueo de receptores fagocíticos. El bloqueo de los receptores se realizó incubando las células con anticuerpos o ligandos específicos durante 30 minutos a 4° C La fagocitosis de MLM se evaluó 30 minutos después de la infección. Sólo se muestran las imágenes de las células con mayor grado de infección en cada caso. E.- Participación de receptores fagocíticos en la entrada de MLM analizada por citometría de flujo. La citometría de flujo nos permitió obtener datos cuantitativos sobre la participación de receptores macrofágicos en la entrada de MLM. Para esta determinación se inyectaron animales con 1 mL de aceite mineral por la vía intraperitoneal con la finalidad de estimular el arribo de más células al peritoneo, y para obtener suspensiones enriquecidas en macrófagos. La Figura 16 muestra la dispersión de puntos (“dot plot”) correspondiente a la suspensión de células peritoneales obtenida de esta manera. Haciendo el análisis de esta suspensión en función de los parámetros tamaño (FSC-M) y granularidad (SSC-H) observamos que la mayoría de las células se distribuye en las regiones correspondientes a los monocitos/macrófagos y a los linfocitos.

Figura 14. Microfotografías de macrófagos peritoneales de ratón: sin infectar (A) o infectados con MLM a los 15 min de infección (B), a las 24 horas de infección y a los 5 días de infección (D). Los macrófagos se infectaron con MLM a una MOI de 50:1 y las microfotografías se tomaron al microscopio electrónico de transmisión. Se observa la apariencia normal de un macrófago no infectado (A), la presencia de MLM en una región citoplásmica cercana a la membrana durante la infección temprana (B), la localización citoplásmica de la bacteria ingerida, y (C) la gran cantidad de bacterias dentro del macrófago resultante de la proliferación del microorganismo.

Figura 13. Microfotografía obtenida por Microscopia Electrónica de Transmisión de un macrófago peritoneal infectado con MLM. Se observa que MLM reside en fagosomas sin mostrar daño aparente. La imagen en el rectángulo insertado muestra la estructura sólida de la bacteria y la región transparente a los electrones que la protege.

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Figura 16 omitida por reducción del tamaño del archivo Para establecer el grado de fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos, las bacterias se pretiñeron con Rojo Texas. En la Figura 17 se muestra la distribución de las células en relación a los parámetros de tamaño y granularidad (panel de la izquierda), la población seleccionada de macrófagos teñidos con un anticuerpo anti-CD11b fluoresceinado se muestra en el panel central (FITC contra granularidad), y la población de macrófagos CD11b+ no infectada, leída en los canales FL3-H (Rojo Texas) y FL1-H (FITC) se muestra en el panel de la derecha.

Figura 17 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 17. Citometría de flujo de las células peritoneales obtenidas de 6 ratones no infectados (mezcla). La imagen de la izquierda muestra la distribución general de las células donde se indica la localización de los monocitos/macrófagos (ventana) y de los linfocitos (óvalo). La imagen central muestra las células CD11b+ en la región de monocitos/macrófagos. En la imagen de la derecha se muestra la distribución de las células CD11b visualizada en los canales FL1-H (CD11b) y FL3-H (rojo Texas). Como era de esperarse, las células no infectadas no dan lectura en el canal FL3-H. El uso de bacterias teñidas con Rojo Texas permitió medir el grado de fagocitosis de MLM por los macrófagos del exudado peritoneal de manera muy precisa. La Figura 18 muestra el grado de fagocitosis en función del número de bacterias por célula (MOI). Mientras más bacterias se adicionan mayor es la lectura en FL3-H y esto representa el grado de fagocitosis. El bloqueo de los receptores comprometidos con la ingestión de MLM deberá mostrar un grado disminuido de fagocitosis (menor valor en la escala del canal FL3-H).

Figura 18 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 18. Fagocitosis de MLM por macrófagos peritoneales de ratón. Los macrófagos se infectaron con MLM a diferentes MOI: 10:1, 20:1 y 50:1 durante 1 hora a 37ºC. La población celular no fue teñida para su detección en el canal FL1-M. La Figura 19 muestra los resultados globales de al menos cuatro experimentos independientes. El control se refiere a la cantidad de bacteria ingerida (intensidad de Rojo Texas) en ausencia de bloqueadores de receptores; este valor se tomó como 100% de fagocitosis. Cada barra indica el promedio y desviación estándar de estos cuatro experimentos. El efecto del bloqueo de los receptores en la fagocitosis de MLM se observa como una disminución en la intensidad del colorante.


Figura 19.- Efecto del bloqueo de receptores de macrófagos en la fagocitosis de Mycobacterium lepraemurium. Se muestra el grado de fagocitosis en los macrófagos intactos (control) y en los macrófagos “bloqueados” con anticuerpos o ligandos específicos. El estudio se hizo por citometría de flujo. Se muestran los resultados de la media ± 1 DE de cuatro experimentos independientes (*p< 0.05 en relación al control).

Figura 16.- Distribución de las células del exudado peritoneal de ratones estimulados con aceite mineral ligero en función de los parámetros de tamaño y granularidad. La mayoría de las células se localiza en las regiones de los linfocitos y monocitos/macrófagos.

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La Figura 20, muestra los histogramas correspondientes a los macrófagos control infectados y no infectados, y a los macrófagos pre-tratados con anticuerpo anti-TLR-6 o con Manosa-Albúmina antes de su infección con MLM.


Figura 20.- Participación de los receptores TLR-6 y MR en la fagocitosis de MLM. El control negativo corresponde a macrófagos no infectados; el control positivo a macrófagos infectados con MLM (50:1/ 30 min). El bloqueo de TLR-6 y de MR disminuye apreciablemente la fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos. Contrario a lo que se sugiere para M. leprae y M. tuberculosis, DC-SIGN no parece participar en la fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos. F.- Expresión de TLR-6 y MR en macrófagos infectados con MLM Mediante microscopia confocal y microscopia de fluorescencia se determinó la expresión de TLR-6 en macrófagos no infectados y en macrófagos infectados con MLM. En la Figura 21 se observa un incremento en la expresión de TLR-6 en los macrófagos infectados con MLM y el incremento es mayor conforme aumenta el tiempo de infección (30 vs 60 min). Las imágenes por microscopía confocal de los macrófagos infectados con MLM muestran que la expresión de TLR-6 tiende a concentrarse en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de los macrófagos (a través de estructuras con esta localización inicia la endocitosis de MLM) (Figuras 22 y 23).

Figura 21 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 21.- Expresión y distribución de TLR-6 en macrófagos murinos. (A) macrófagos no infectados. (B) macrófagos infectados con MLM durante 30 min (C) macrófagos infectados con MLM durante 60 min (Microscopia confocal, 63X).


Figura 22. Panel superior: Expresión y distribución de TLR-6 en macrófagos murinos. (A) Macrófagos infectados con MLM por 30 min. (B) macrófagos infectados por 60 min con MLM (microscopía confocal). Panel inferior: Gráficas de colocalización de MLM (rojo) y TLR-6 (verde).

Figura 23 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 23. Expresión y distribución de TLR-6 en macrófagos infectados por 60 min con MLM. Se observa que la expresión de esta molécula se concentra en las zonas apicales de las prolongaciones celulares, regiones donde con frecuencia observamos el primer contacto con la micobacteria. En cuanto a la participación del MR, la Figura 24 muestra la expresión de este receptor en macrófagos no infectados y en macrófagos infectados con MLM. MLM parece recubrirse de este receptor al ser

A B C

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fagocitado (Imagen C). Este evento no es raro ya que se sabe que este receptor se endocita junto con las bacterias ingeridas y posteriormente se recicla hacia la membrana celular (Taylor et al. 2005).

Figura 24 (Panel superior) omitida por reducción del tamaño del archivo

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Distance (µm)

0

50

100

150

200

250Intensity

Intensity Ch1 Intensity Ch2 Figura 24. Panel superior: Expresión y distribución del Receptor de Manosa en macrófagos peritoneales. A: macrófagos normales, B macrófagos infectados por 30 min con MLM-Rojo Texas, C macrófagos infectados por 60 min con MLM. El MR se detectó por su reacción con albúmina-manosilada acoplada a FITC. Panel inferior: Gráficas de colocalización de ML (rojo) y MR (verde). Estas gráficas se construyeron a partir de la imagen B. G. Expresión de DC-SIGN y participación en la fagocitosis de MLM. DC-SIGN (dendritic cell (DC)-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3) grabbing nonintegrin), una proteína transmembranal tipo II recientemente descubierta sobre células dendríticas, se une a ICAM-3 sobre las células T en los órganos linfoides secundarios y promueve el contacto inicial entre estas células durante el establecimiento de la inmunidad celular. Inicialmente DC-SIGN se consideró como un receptor exclusivo de las células dendríticas (de ahí su nombre). Sin embargo, en 2005 y 2006 dos grupos de investigación reportaron la presencia de este receptor en las lesiones de la tuberculosis y la lepra. Demostraron que DC-SIGN se sobreexpresa en macrófagos alveolares en la Tb y en macrófagos de las lesiones dérmicas en pacientes con lepra lepromatosa (Soilleux et al, 2006 y Tailleux et al, 2005). Se consideró que DC-SIGN podría jugar un papel en la entrada de las micobacterias a los macrófagos. Por su similitud con la lepra humana pensamos que DC-SIGN también podría jugar un papel en la entrada de MLM a los macrófagos murinos. Sin embargo, la infección in Vitro de los macrófagos con MLM no indujo la expresión de DC-SIGN aún en los cultivos infectados mantenidos durante varios días. DC-SIGN tampoco se expresó en las células sin infectar. Algunos reportes indican que DC-SIGN requiere de un microambiente con predominio de citocinas tipo 2 para expresarse (Relloso et al., 2002; Bechetoille et al., 2006). Por ello decidimos incubar macrófagos murinos no infectados con IL-4, IL-10 y TGF, y posteriormente evaluamos la expresión de DC-SIGN como receptor de membrana. Sólo se logró clara expresión de DC-SIGN cuando las células se incubaron con IL-10. (Figura 25). Ni la IL-4 ni el TGF indujeron la expresión de DC-SIGN en las células normales (Figura 26).


Figura 26 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 26. Expresión de DC-SIGN (verde) en macrófagos murinos. (A) macrófagos no tratados. (B): Macrófagos incubados con TGF (2 ng/ml) e infectados con MLM-Rojo Texas. Un resultado similar (negativo) se observó con el pretratamiento de los macrófagos con IL-4.

Figura 25. Expresión de DC-SIGN inducida por IL-10 en macrófagos murinos no infectados. (A) Macrófagos cultivados en ausencia de IL-4. (B y C) Macrófagos murinos incubados con IL-4 durante 24 h. Las flechas señalan los sitios de expresión de DC-SIGN, esta ocurre marcadamente en los extremos apicales de las prolongaciones celulares.

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I.- Papel de los “lipid rafts” en la entrada de MLM en macrófagos murinos. Una variedad de microorganismos utilizan lipid rafts como puerta de entrada a las células fagocíticas (Maldonado-Garcia et al., 2004; Lafont, 2005; Zaas, 2005). La participación de estas estructuras favorece la adecuada señalización a través del reclutamiento de uno o varios receptores y moléculas. Aunque se sabe que algunas micobacterias patógenas como M. tuberculosis y M. avium ingresan a las células fagocíticas a través de lípid rafts (Maldonado-García et al., 2004; Welin., 2008), no se sabe si M. leprae y MLM también utilizan este mecanismo de interiorización. Otros microorganismos como Brucella abortus y B. mellitensis hacen uso de este mecanismo de entrada a las células fagocíticas promoviendo cambios en la distribución de estas estructuras. La Figura 27 muestra que la infección de los macrófagos peritoneales de ratón con Brucella induce la acumulación de lipid rafts en el sitio de contacto con la bacteria. El tratamiento de los macrófagos con ciclodextrina previo a la infección con Brucella impide la movilización de los lipid rafts e interfiere con la fagocitosis del microorganismo. Por el contrario, la infección de los macrófagos murinos con MLM no induce la redistribución de lipid rafts observada con Brucella (Figura 28 y 29). El tratamiento de los macrófagos con ciclodextrina no evita ni el contacto, ni la entrada del microorganismo a los macrófagos (Figura 30). Curiosamente los lipid rafts no se encuentran concentrados en los extremos apicales de las extensiones citoplásmicas de los macrófagos, sitios donde los macrófagos hacen contacto con MLM.

Figura 27 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 27. Los “Lipid rafts” participan en la fagocitosis de Brucella mellitensis por los macrófagos murinos. A y C, macrófagos preteñidos con toxina colérica-FITC infectados con B.mellitensis-Rojo Texas (canal verde). B y D, macrófagos preteñidos con toxina colérica-FITC e infectados con B.mellitensis-Rojo Texas (canal rojo). La infección con B.mellitensis induce la redistribución de lipid rafts y su acumulación en la zona de infección.

Figura 28 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 28. Los “Lipid rafts” no participan en la fagocitosis de Mycobacterium lepraemurium. A: Lipid rafts en un macrófago no infectado. B: MLM-Rojo Texas. C: Lipid rafts (verde) en macrófagos infectados con MLM-Rojo Texas. D: Lipid rafts en macrófagos infectados con MLM-Rojo Texas (rojo) (Análisis por microscopía de epifluorescencia)

Figura 29 omitida por reducción del tamaño del archivo Figura 29. El tratamiento de los macrófagos con ciclodextrina (10 mM/ 1 h) induce cambios en la distribución de lipid rafts pero no afecta la fagocitosis de MLM. Las imágenes son sobreposiciones de fotografías tomadas en el microscopio de epifluorescencia en el canal rojo (bacilos) y en el canal verde (lipid rafts). La sobreposición produjo algunos artefactos alrededor de las bacterias (región oscura).


Figura 30. Expresión y distribución de lipid rafts en macrófagos murinos. A: macrófagos normales, B y C: macrófagos infectados con MLM (MOI 10:1, 30 min). MLM no induce la reorganización de los lipid rafts (Imágenes por microscopia confocal, 63X).

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DISCUSIÓN

Durante algún tiempo la Lepra murina se considero como un modelo apropiado para el estudio de la lepra humana y esto motivo mucho trabajo sobre la enfermedad en el ratón. Sin embargo, los avances en el conocimiento de estas dos enfermedades finalmente llevaron a establecer que la lepra humana y la lepra murina eran en realidad dos enfermedades diferentes tanto en sus manifestaciones como en sus agentes etiológicos. Esto trajo como consecuencia que el estudio de la lepra murina como modelo de la lepra humana se fuera abandonando poco a poco. No obstante, algunos investigadores consideraron que la lepra murina era en sí interesante no solo por tratarse de una enfermedad natural del ratón (el animal más utilizado en investigación biomédica) sino también porque representa un modelo para el estudio de la relación huésped-parásito donde el parásito es un microorganismo intracelular. Así resurgió el estudio de la lepra murina, esta vez encaminado al análisis de los mecanismos de la inmunidad en esta micobacteriosis. Un recuento de los estudios realizados en este contexto se encuentra compilado en Rojas-Espinosa, 2008 (Murine Leprosy Revisited, Special Immunology Book, Research Sign Post, India). En nuestro laboratorio este modelo a sido tema de estudio durante mucho tiempo; gran parte de la información obtenida se centra en el análisis de la respuesta inmune, los cambios histopatológicos asociados a la enfermedad, y la respuesta de los macrófagos a la infección por MLM. En este trabajo analizamos la participación de algunos receptores que utiliza MLM para ingresar a los macrófagos, y los cambios intracelulares relacionados con la infección. Una de las primeras observaciones interesantes de este trabajo fue que MLM se internaliza en los macrófagos de manera muy diferente a como lo hace M. bovis BCG. Para empezar, MLM interacciona con los macrófagos preferencialmente a través de estructuras presentes en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de los macrófagos cuya caracterización aun no se ha realizado, mientras que BCG parece ingerirse de manera “más abierta” utilizando casi cualquier sitio de la membrana citoplásmica. De antemano, esto sugiere la participación de receptores diferentes, o diferente participación de los mismos receptores. Después, el contacto con BCG y su ingestión, provoca cambios morfológicos en las células fagocíticas que hacen que estas se despeguen de las superficies donde se mantienen durante su cultivo in vitro. MLM por el contrario, infecta a los macrófagos sin modificar su morfología y sin inducir su desprendimiento. Finalmente, una vez ingerido, BCG se distribuye dentro de los macrófagos de manera desordenada, en pequeños “grumos”, mientras que MLM lo hace de manera ordenada, se distribuye radialmente alrededor del núcleo y siempre respeta una zona adyacente al núcleo donde hasta ahora no hemos observado estructura alguna por microscopía electrónica. La ingestión de los bacilos por los macrófagos no es un proceso inmediato como ocurre con otras partículas (Champion y Mitragotri, 2006), requiere un tiempo y comienza a observarse hacia los 15 minutos después de adicionar las bacterias a los cultivos celulares. Una vez instaladas, las bacterias fagocitadas empiezan su proceso de replicación, manteniendo un estado de simbiosis con sus hospederos; las bacterias no muestran evidencias de daño ni aún en cultivos de tiempos largos, y los macrófagos no muestran signos ni de necrosis ni de apoptosis, y se mantienen adheridas hasta que ya no pueden contener más bacilos. Hasta lo que hemos podido conocer de la literatura, ningún otro microorganismo se comporta de manera similar a MLM, quizá una excepción se M. leprae, pero por increíble que parezca esta bacteria también esta poco estudiada (Yang y Lew, 1971; Samuel et al, 1973; Ryter et al, 1984; Prabhakaran et al, 2000). En la literatura también existe mucha información respecto a la participación de receptores en la entrada de microorganismos a células fagocíticas y no fagocíticas. Dentro de las micobacterias, la más estudiada es M. tuberculosis claramente porque es el causante de la tuberculosis, la enfermedad micobacteriana de mayor incidencia a nivel mundial. Sobra decir que no hay estudios sistemáticos sobre la participación de receptores en la entrada de MLM a los macrófagos murinos. En el presente trabajo estudiamos la participación de 8 clases de receptores dentro de los cuales dos, TLR6 y el receptor de manosa (MR), parecen jugar un papel preponderante en la fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos. No obstante, otros receptores pudieran jugar un papel significativo en este fenómeno ya que MLM tiene diversos PAMPs a través de los cuales pudiera ser reconocido. En cuanto a TLR6, este receptor reconoce lipocompuestos, los cuales son abundantes en la pared de MLM y otras micobacterias (Kanetsuna et al, 1968; Gaylord y Brenan, 1987; Luna-Herrera, 1991; Brennan y Draper, 1994) pero no parece participar en la ingestión de BCG, por ejemplo (Nicolle et al, 2004). Esto lo determinaron porque utilizaron ratones Knock Out para TLR2, TLR4 y TLR6 no encontraron diferencias en la infección por BCG entre los ratones KO y los ratones silvestres. En otro estudio, (Sugawara et al, 2003) encontraron que ni TLR2 ni TLR6 son importantes para la infección de macrófagos murinos por M. tuberculosis. Nuestros resultados muestran, además, que TLR6 se concentra en las regiones apicales de las prolongaciones apicales de los macrófagos a través de las cuales ocurre el contacto inicial con MLM.

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El caso de receptor de manosa es muy diferente y se conoce bien el destino de este receptor después del contacto con las partículas que ingiere (Tietze et al, 1982; Taylor et al, 2005). Nuestros resultados muestran que los fagosomas de MLM contienen MR y es quizá este el principal receptor que participa en la entrada de MLM a los macrófagos. El papel de TLR6 como receptor no esta bien entendido pues hasta ahora TLR6 se ha considerado como un receptor de señalización más que un mediador directo de fagocitosis (Krutzik y Modlin, 2004; Jo et al, 2007). Por la importancia de nuestros hallazgos con TLR6, el estudio de este receptor en cuento a su localización, su destino y su función, son aspectos que deben estudiarse con más profundidad en el modelo de la lepra murina. Otro receptor relevante dada su participación reconocida en la fagocitosis de micobacterias en la tuberculosis y la lepra humana, era DC-SIGN (Soilleux et al, 2006 y Tailleux et al, 2005). En el modelo de la lepra murina DC-SIGN no parece ser un receptor requerido para la entrada de MLM a los macrófagos murinos. Ni su presencia constitutiva ni su sobreexpresión inducida tuvieron relación con la fagocitosis del microorganismo. La sobreexpresión de DC-SIGN por pretratamiento de los macrófagos con IL-10, aunque ocurrió, no mejoro el grado de ingestión del microorganismo. En nuestras manos el pretratamiento de los macrófagos murinos con otras citocinas tipo 2 (IL-4 y TGFβ) no indujo la expresión de esta molécula, no obstante que otros trabajos reporten lo contrario. Sin embargo, la mayoría de los reportes sobre expresión de DC-SIGN se refiere a células dendríticas y no a macrófagos en sí (Geijtenbeek et al, 2003; Geijtenbeek et al, 2000a y 200b). Relloso et al (2002) por ejemplo, reportan que la IL-4 tiene la capacidad de inducir la expresión de DC-SIGN en células dendríticas derivadas de monocitos. En cuento a la lepra, Soilleux et al (2006) encontraron que comparadas con las lesiones de la lepra tuberculoide (TT), las lesiones de la lepra lepromatosa (LL) tienen una alta expresión de DC-SIGN; hasta ahora se considera que los granulomas de la LL están formados principalmente por macrófagos (Rojas-Espinosa, 2007). Los autores mencionan que DC-SIGN es un receptor potencial para el ingreso de ML a células fagocíticas y sustentan esta información transfectando células raji con el gene para DC-SIGN. Observaron que las células transfectadas expresan el receptor y además ingieren bacilos dela lepra. En el presente trabajo, pudimos observar que la IL-4 efectivamente induce la expresión de DC-SIGN de los macrófagos murinos sin embargo no pudimos analizar la capacidad de los macrófagos para ingerir MLM. Consideramos que las lesiones de la lepra contienen células con una variedad de fenotipos y actividades y que alguna (s) de esta (s) podría (n) participar en la inducción de DC-SIGN no necesariamente en la etapa temprana de la infección sino en etapas tardías, cuando el bacilo ya se ha instalado dentro de los macrófagos. En cuanto a los fagosomas de MLM, Hart et al (1972) reportaron que MLM es una bacteria fusiogénica, es decir que no interfiere con la formación de fagolisosomas y que la bacteria mantiene una apariencia saludable dentro de los fagolisosomas aun a los cuatro días de cultivo. De manera general, una vez ingerido el microorganismo por las células fagocíticas queda enclaustrado dentro de una vacuola fagocitica (fagosoma) que interacciona con diversos organelos antes de interaccionar con lisosomas. A este proceso se le llama maduración e incluye la interacción reversible con diversas vesículas y la adquisición de marcadores moleculares tales como Rab-5, Rab-7 y Protón ATP-asa, entre otros. Nuestros resultados indican que los fagosomas de MLM adquieren todos estos marcadores y terminan fusionándose con los lisosomas. Aunque los tiempos no son precisos, la adquisición de estos marcadores ocurrió hacia los 15 min para Rab-5, hacia los 30 min para Rab-7, y hacia los 60 min para ATP-asa vacuolar y Catepsina D. Es claro que los fagosomas de MLM maduran hasta el estado de fagolisosoma pero no esta del todo claro como es que MLM resiste, sobrevive y se replica dentro del ambiente toxico del fagolisosoma; probablemente su gruesa y compleja de pared sea la respuesta a esta pregunta. De nuestras observaciones y de las observaciones de Hart (1987), no parece que MLM tenga la habilidad de escapar de sus fagosomas para instalarse en el citoplasma de las células como lo hacen M. leprae y M. tuberculosis (Van der Wel et al, 2007); MLM tampoco interfiere con la maduración de sus fagosomas como lo hace M. tuberculosis (Rusell et al, 2002). Finalmente, en cuanto a la participación lipid-rafts en la fagocitosis de MLM por los macrófagos murinos, estos no parecen ser relevantes. En otras instancias, los lipid-rafts parecen participar en la movilización de receptores y moléculas accesorias a los sitios de contacto entre las células y los microorganismos, optimizando el proceso fagocítico. Los lipid-rafts pueden funcionar como puertas de entrada para algunos microorganismos (Zaas et al, 2005) entre ellos algunas micobacterias. Se sabe por ejemplo, que M. avium (Maldonado- García et al, 2004) y M. tuberculosis (Gatfield et al, 2000) emplean estas estructuras para ingresar a células fagocíticas. Sobre el papel de los lipid-rafts en la entrada de MLM a los macrófagos murinos no se sabe nada. Nuestros resultados sugieren que en este modelo, los lipid-rafts no son relevantes; la eliminación de colesterol, uno de los componentes importantes de los lipid-rafts, por el uso de β- metilciclodextrina, no interfiere con la ingestión de MLM. El resultado fue contrastante con lo observado en el caso de Brucella

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abortus. La ingestión de Brucella estuvo asociada con la movilización de lipid-rafts y el tratamiento de las células con ciclodextrina inhibió la ingestión de la bacteria, ambas observaciones previamente reportadas por Lapaque et al (2006). En este punto, vale la pena reflexionar sobre el trabajo futuro. Es necesario estudiar con mayor detalle: (a) la naturaleza de las estructuras presentes en los extremos apicales de las prolongaciones citoplásmicas de las células fagocíticas a través de las cuales MLM parece hacer su primer contacto con las células, (b) el papel de TRL6 como probable receptor fagocítico de los macrófagos y/o su papel como inductor de señales, (c) la aparente irrelevancia de DC-SIGN en la entrada de la bacteria a los macrófagos, (d) la maduración de los fagosomas utilizando técnicas adicionales a la microscopia (citofluorometria y Wester –Blot, por ejemplo), (e)las cascadas de señalización que se generan en la entrada de MLM a lo9s macrófagos murinos, (f) la expresión de TLR6, DC-SIGN, lipid-rafts, marcadores de maduración fagosomal en las lesiones de la lepra murina por técnicas inmunohistoquimicas, y (g) el estudio comparativo de todos estos aspectos en la infección de los macrófagos por BCG.

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