INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL COORDINACION GENERAL...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

COORDINACION GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACION

INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACION EDUCATIVA ENERO – DICIEMBRE 2006

Este formato presenta los aspectos necesarios para la elaboración del Informe Técnico Final de los proyectos de investigación que se registraron en la Coordinación General de Postgrado e Investigación (CGPI) para su desarrollo durante el periodo enero – diciembre del 2006. La información que se solicita es la mínima necesaria para documentar y evaluar el avance de los proyectos de investigación, por lo que es indispensable que se requisite sin omisiones, agregando o anexando la información que se considere conveniente.

I. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO.

ESCUELA, CENTRO O UNIDAD: E.N.C.B., I.P.N. CLAVE DEL PROYECTO:

2006749

TITULO: ANÁLISIS DE SISTEMAS ENZIMATICOS DE PLANTAS Y CULTIVOS DE CELULAS VEGETALES EN SUSPENSIÓN, EN LA TRANSFORMACIÓN DE CONTAMINANTES ORGANICOS COMO HERRAMIENTAS PARA LA FITORREMEDIACIÓN. PROGRAMA EN DONDE SE UBICA EL PROYECTO:

1. PERIODO EN QUE SE REALIZO EL PROYECTO:

del Enero 2006 a Diciembre 2006

d m a d m a

II. RESPONSABILIDAD TÉCNICA Y ADMINISTRATIVA.

Indicar nombre e incluir firmas autógrafas (en el ejemplar impreso) de los responsables técnicos y administrativos. Vo. Bo.

Dra. Angélica Ma. Rodríguez Dorantes

Dr. Luis Jiménez Zamudio

Director(a) del proyecto Director(a) de la escuela, centro o unidad

Teléfono del director(a) del proyecto:

62332 Fecha de elaboración del informe:

12 Enero 06

d m a

2

1. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO: 1.1. RESUMEN. El presente proyecto de investigación, consistió en el estudio de los sistemas enzimáticos de

plantas in toto e in vitro (cultivo de células en suspensión), para evaluar la fitotoxicidad, la tasa

metabólica y la persistencia de los xenobioticos en las plantas. Está incluido dentro de la

continuación del estudio de la investigación básica sobre los mecanismos fisiológicos

particulares involucrados en la transformación de compuestos aromáticos, en particular con

fenantreno.

Esta propuesta 2006, reporta el estudio del sistema enzimático radical y foliar que pudiera estar

participando en los procesos de transformación de xenobióticos de una de las especies de

cyperáceas, consideradas como modelo dentro de la investigación que se ha desarrollado

desde hace tiempo, asociada a la exposición a fenantreno; así como los ensayos realizados

con cultivos de células en suspensión de dos especies vegetales que han sido empleadas

como modelos in vitro para evaluar respuestas a otras condiciones de estrés abiótico, y que en

este caso pudieran reflejar los mecanismos asociados a la remoción de este tipo de

contaminantes.

1.2.OBJETIVO GENERAL. Evaluar la eficiencia de los sistemas enzimáticos de plantas y cultivos de células vegetales en

suspensión en la transformación de hidrocarburos aromáticos. 2. MÉTODOS Y MATERIALES. 2.1.Evaluación de la actividad de la GST (glutation-transferasa) de material foliar y radical de Cyperus elegans expuesta a fenantreno y sus derivados: 2.1.1.Germinación de las semillas, obtención de plántulas y establecimiento de cultivos hidropónicos de Cyperus elegans: La germinación se realizó en germinadores con arena y agua destilada estéril a 36 °C, en

oscuridad. Posteriormente las plántulas se trasplantaron y mantuvieron para su crecimiento en

cultivos hidropónicos en contenedores de vidrio ámbar de 500 ml, con 400ml de solución

mineral: 0.20M NH4H2PO4, 0.50M NH4NO3, 1.15M Ca(NO3)2, 0.26M CaCl2, 0.20M MgCl2·6H2O,

0.20M Mg(NO3)2·6H2O, 0.40M MgSO4 7H2O, 0.20M KH2PO4, 1.20M KNO3, 0.50M K2SO4,

0.040M FeCl3·6H2O, 1.2 x 10-2M H3BO3, 1.2 x 10-4M CuCl2·H2O, 2.3 x 10-3M ZnCl2, 4.4 x 10-4M

MnCl2·4H2O, 6 x 10-6M Na2MoO4·H2O, EDTA and FeSO4·7H2O: pH 6 y bajo condiciones

controladas en invernadero, por 90 días, para su exposición con los contaminantes.

3

2.1.2.Exposición de los cultivos in toto de las especie de C. elegans a fenantreno y sus derivados: A cada uno de los contenedores se les adicionó fenantreno, fenantrol y fenantrenquinona, a las

concentraciones de: 10 y 40 ppm, a partir de la solución patrón de fenantreno de 100mg/10ml

(en etanol al 95%), exponiéndolos durante 3 días, considerando las plantas testigo sin adición

del contaminante. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Después de transcurrido el período de exposición de las plantas a los contaminantes, se

obtuvo el peso de la biomasa total epigea (material foliar) e hipogea (material radical) para

cada experimento, separando el sistema radical para la determinación de las GST.

2.1.3.Evaluación de la actividad de GST foliar y radical de Cyperus elegans: Separación de proteínas intracelulares foliares y radicales: Para el análisis de la actividad enzimática de las GTS intracelulares, la biomasa total hipogea y

epígea obtenida se pesó y se extrajeron las proteínas totales, moliendo esta biomasa en

mortero en frío (4ºC) con 10ml de regulador de fosfato de potasio 50 mM pH= 6.0, las muestras

se centrifugaron a 3500 rpm por 20 minutos a 4 °C, y se guardó el sobrenadante para la

determinación de la actividad enzimática.

Cuantificación de proteína radical total. Para todos los casos de extractos foliares y radicales, se cuantificó la cantidad de proteína total

para cada muestra de cada uno de los experimentos, empleando el método convencional de

Bradford.

Actividad específica de GST (glutation transferasa) de los extractos foliares y radicales:

La determinación de la actividad de glutation transferasas de los extractos radicales, se realizó

empleando el método espectrofotométrico de la oxidación de NADPH, depositando en las

celdas del espectrofotómetro: 1.5ml de regulador de fosfato de potasio 65mM pH= 7.4 + 100 μl

de muestra (extracto radical) + 500μl de glutation (GSH) 1.0mM + 500μl de 1-cloro-2,4-

dinitrobenceno (CDNB) 1.0mM, para iniciar la reacción. La mezcla se incubó a temperatura

ambiente y la reacción inició monitoreando la absorbancia a 340nm, cada 25 segundos durante

3 minutos. la tasa de cambio se determinó calculando la diferencia de absorbancia por la

oxidación del NADPH. Para la determinación de la actividad específica de la glutation

transferasa (nM NADPH oxidado / min / μg de proteína / g radical).

4

2.2.Caracterización de la capacidad de remoción y evaluación de la respuesta fisiológica y bioquímica de los cultivos de células en suspensión de dos especies de la familia Fouquieriaceae: Fouquieria splendens y Fouquieria fasciculata, bajo la presencia de fenantreno: 2.2.1.Obtención de tejido calloso de Fouquieria splendens y Fouquieria fasciculata. La obtención de tejido calloso se realizó a partir de material foliar de Fouquieria splendens y

Fouquieria fasciculata, que se lavó con agua corriente y jabón, durante 5 minutos, en vaso de

precipitados estéril. Se transfirió el material foliar a un vaso de precipitados estéril y se enjuagó

el material con agua destilada estéril con tres cambios de 5 minutos cada uno. Se desinfestó el

material foliar con solución de hipoclorito de sodio al 10% estéril, por 5 minutos y se enjuagaron

las hojas con agua destilada estéril, 4 veces, con cambios de 5 minutos cada uno.

Posteriormente bajo condiciones de esterilidad, se seccionó el material foliar en fragmentos de

1cm2 y se depositaron estas fracciones foliares en medio sólido Murashige-Skooge (MS) ¼ de

sales, con ácido naftalen acético (ANA) y bencil-amino purina (BAP), depositando de 3 a 4

fracciones por frasco, dejándose por un mes para la obtención y proliferación de tejido calloso,

bajo condiciones de fotoperíodo 12:12, a temperatura de 36ºC.

2.2.2.Obtención de cultivos de células en suspensión de F. splendens y F. fasciculata. Se transfirieron los cultivos de tejido calloso a medio líquido para la obtención de células en

suspensión, como sigue:

Se tomó 1g de biomasa de tejido calloso obtenido, que se disgregó con ayuda de pinzas y

bisturí, y se depositó en matraces Erlenmeyer de 125ml, conteniendo 50ml de medio MS ¼ de

sales, con ANA y BAP por duplicado; bajo condiciones de oscuridad, a 36ºC, con agitación.

Dejando por 8 días para subcultivo y mantenimiento del cultivo celular.

2.2.3.Exposición de los cultivos celulares de F. splendens y F. fasciculata ante fenantreno: Se transfirió 1ml de inóculo del cultivo celular madre a matraces Erlenmeyer de 50 ml que

contenían 25 ml de medio MS ¼ de sales con las siguientes concentraciones del fenantreno:

1mg/L, 5mg/L y 10mg/L, a partir de una solución patrón de fenantreno de 100mg/100ml (en

etanol al 95%), considerando los cultivos de células sin contaminante como testigo. Todos los

experimentos se realizaron por triplicado y se mantuvieron bajo condiciones de oscuridad a

temperatura ambiente (36ºC) y en agitación continua por 30 días, tomando alícuotas de 3ml

cada 10 días para evaluar la remoción de fenantreno del medio de cultivo, observaciones al

microscopio y la obtención de la biomasa celular para la cuantificación de proteína total y el

análisis bioquímico a través de la medición de la actividad de guaiacolperoxidasas y

hemoperoxidasas.

5

Evaluación del porcentaje de células viables en los cultivos en suspensión de F. splendens y F. fasciculata bajo la presencia del contaminante.

Para realizar la cuenta celular (% de células viables y no viables) se empleó la tinción con azul

de Evans, un colorante no permeable con baja toxicidad para las células, que comúnmente se

emplea por su selectividad al teñir solamente células muertas. La tinción consistió en adicionar

0.5ml de solución de azul de Evans al 0.05M a alícuotas de 0.5mL del material celular de amas

especies, resuspendido en el medio de cultivo de cada muestra experimental y cada cosecha.

Las muestras se centrifugaron a 3,000 rpm por 3 minutos a temperatura ambiente, se decantó

el colorante y se lavaron las células dos veces con 0.5mL de medio de cultivo MS ¼ de sales,

hasta eliminar el exceso del colorante, se depositó una alícuota de cada una de las muestras

teñidas en un portaobjetos excavado y se realizó la cuenta celular por triplicado, contando el

número de células viables (no teñidas) y no viables (azules), tomando 20 campos por cada

observación.El porcentaje de viabilidad se expresó como el número de células viables x 100

dividido entre el número de células totales.

Evaluación de la remoción del fenantreno por los cultivos en suspensión de F. splendens y F. fasciculata. A 1mL del medio recuperado por centrifugación para las tres cosechas de todos los

experimentos; se les adicionó 2ml de benceno para la extracción del fenantreno remanente,

dejando reposar por 10 minutos, para posteriormente separar la fase orgánica y evaporar el

benceno a sequedad al aire y resuspendiendo el material en 1ml de metanol grado HPLC.

Las muestras se analizaron también al espectrofotómetro en la región UV, registrándose las

lecturas de absorbancia a 292 nm, de cada una de las muestras experimentales, se realizó

también un análisis por cromatografía de alta resolución de líquidos (HPLC); con el objeto de

realizar la identificación del fenantreno y la posible detección de compuestos relacionados con

productos de transformación de éste; con la detección del contaminante a 254 nm y el empleo

de un detector con arreglo de diodos para la obtención de los espectros de absorción de los

compuestos resueltos en la cromatografía, para este análisis se empleó una columna

HICHRON C-18 Hypersil, de 10 μm x 4.6 mm x 25 cm, usando como fase móvil un gradiente

final de metanol-agua (50 a 95 % de metanol grado HPLC), con un corrimiento de 70 minutos a

una velocidad de flujo de1 mL/ min.

Análisis fisiológico y bioquímico de los cultivos de células en suspensión ante la presencia del contaminante: determinación de la actividad específica de guaiacol peroxidasas y hemoperoxidasas de F. splendens y F. fasciculata. El análisis de la respuesta ante la presencia del contaminante, para los cultivos en suspensión;

se realizó a través de la evaluación de su crecimiento con la cuantificación de proteínas totales

6

y el análisis de la actividad enzimática de proteínas posiblemente relacionadas con los

procesos de transformación del contaminante, en este caso la determinación de la actividad de

guaiacol peroxidasas y hemoperoxidasas, como sigue:

Obtención de proteínas celulares totales.

La extracción de las proteínas totales celulares se realizó tomando el paquete celular lavado de

las alícuotas de 3mL, de cada cosecha y para cada experimento, resuspendiendo éste en 2mL

de regulador de fosfatos 50mM, pH= 6.0 en frío, para homogenizar las células en un

homogenizador de tejidos (potter). Se obtuvieron los extractos celulares y éstos se guardaron a

4ºC, para la cuantificación de proteínas por el método convencional de Bradford y las

determinaciones enzimáticas.

Actividad especifica de guaiacol peroxidasas.

La determinación de la actividad de guaiacol peroxidasas de los extractos celulares de los

cultivos de ambas especies; se realizó empleando el método espectrofotométrico de la

oxidación de guaiacol, depositando en tubos de ensaye 100 μL de muestra (extracto celular) +

1mL de regulador de fosfato de potasio 100mM, pH= 6.0 + 32 μL de guaiacol 0.2M + 32 μL de

peróxido de hidrógeno 0.03M. Los tubos se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente y

se evidenció la actividad de éstas proteínas a través del desarrollo de la coloración café-rojiza

característica de la oxidación y polimerización del guaiacol; se leyó la absorbancia a 436nm,

para la determinación de la actividad específica de peroxidasas (nM guaiacol oxidado / min / μg

de proteína celular).

Actividad específica de hemoperoxidasas. La determinación de la actividad de hemoperoxidasas de los extractos celulares de los cultivos

de ambas especies; se realizó empleando el método espectrofotométrico de la oxidación de

TMBZ (tetrametilbencidina), depositando en tubos eppendorf de 1.5mL: 100 μL de muestra

(extracto celular) + 1mL de regulador de acetato de sodio 0.20M pH= 5.3 + 100μL de TMBZ +

50μL de peróxido de hidrógeno 0.17%. Los tubos se incubaron por 15 minutos a temperatura

ambiente y se evidenció la actividad de éstas proteínas a través del desarrollo de la coloración

azul característica de la oxidación de la tetrametilbencidina; se leyó la absorbancia a 652nm,

para la determinación de la actividad específica de hemoperoxidasas (nM TMBZ / min / μg de

proteína celular).

2.3.Análisis estadístico de los resultados. A todos los resultados obtenidos, se les aplicó un análisis de varianza (ANOVA) y prueba de

Tukey-Kramer de Comparación Múltiple, empleando el paquete estadístico GraphPad Instat,

V2.03.

7

3. METAS. El siguiente cronograma de avances, muestra los avances reales alcanzados para cada meta, durante el período establecido con algunos cambios que se dieron en este período que se reporta. 3.1. CALENDARIO DE ACTIVIDADES: (valoración de metas y su duración)

Programación de Actividades de Investigación Enero - Diciembre 2006

Número de meta

Valor % de cada

meta

Descripción de las actividades para cada meta:

Ener

o

Febr

ero

Mar

zo

Abr

il

May

o

Juni

o

Julio

Ago

sto

Sept

iem

bre

Oct

ubre

Nov

iem

bre

Dic

iem

bre

1

15%

Mantenimiento y desarrollo de plántulas en cultivos hidropónicos (dos y tres meses de crecimiento) y establecimiento de cultivos de células en suspensión.

X

X

X

X

X

X

X

2

15%

Exposición de los sistemas radicales de los cultivos hidropónicos de las plantas in toto y de los cultivos de células en suspensión, a diferentes concentraciones de los contaminantes y extracción y cuantificación de los contaminantes.

X

X

X

X

X

X

X

X

3

45%

Obtención de los extractos protéicos y determinación de la actividad de los sistemas enzimáticos de material foliar y radical, y de los cutlivos in vitro, para evaluar la transformación de los contaminantes.

X

X

X

X

X

X

X

X

4

15%

Caracterización por HPLC de los productos generados de la transformación del(los) contaminante(s), después de su exposición a los sistemas enzimáticos únicamente de los cultivos de células en suspensión.

X

X

X

X

X

X

5

10%

Análisis de los resultados de la actividad enzimática de las enzimas aisladas de los sistemas vegetales in vitro e in toto. Conclusiones sobre la participación y eficiencia de transformación de contaminantes orgánicos por estos sistemas enzimáticos vegetales.

X

X

X

Porcentaje total de avance en el período reportado Enero – Diciembre del 2006: 100%

4. RESULTADOS. Se realizaron algunos cambios dentro del desarrollo del proyecto, por lo que se reportan aquí

los resultados de la evaluación de la actividad de las GST de los extractos de proteínas

radicales de Cyperus elegans, y los obtenidos con el ensayo de los cultivos de células en

suspensión de Foquieria splendens y Fouquieria fasciculata, expuestos a fenantreno.

Estos resultados se han expuesto nuevamente en congresos internacionales, como material

para publicaciones científicas y han participado en el mismo, alumnos para el desarrollo de su

Servicio Social como de Titulación por Tésis de Licenciatura, como se reporta en la Tabla y se

adjunta la documentación comprobatoria.

Se continúa con la línea de investigación sobre los sistemas vegetales in toto e in itro como

herramientas para la remoción de contaminantes.

4.1.Evaluación de la actividad de la GST (glutation-transferasa) de material radical de Cyperus elegans expuesta a fenantreno y sus derivados: 4.1.1.Cuantificación de la biomasa foliar y radical de Cyperus elegans, bajo la exposición a los contaminantes:

Se presentan a continuación en la Figura 1 los resultados que corresponden a la biomasa foliar

y radical obtenida de las plantas de Cyperus elegans expuestas a fenantreno, fenantrol y

fenantrenquinona, por tres días.

Biomasa total

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

test

igo

fena

ntre

no 1

0pp

m

fena

ntre

no 4

0pp

m

fena

ntro

l 10

ppm

fena

ntro

l 40

ppm

fena

ntre

nqui

nona

10 p

pm

fena

ntre

nqui

nona

40 p

pm

Experimentos

g foliarradical

Figura 1. Biomasa total foliar y radical de C. elegans

9

4.1.2. Cuantificación de la proteína total foliar y radical de Cyperus elegans, bajo la exposición a los contaminantes:

Se presentan a continuación en la Figura 2 los resultados que corresponden a la cuantificación

de proteína total foliar y radical obtenida de las plantas de Cyperus elegans expuestas a

fenantreno, fenantrol y fenantrenquinona, por tres días.

P ro te ín a to ta l

0

5

10

15

20

25

30

test

igo

fena

ntre

no 1

0pp

m

fena

ntre

no 4

0pp

m

fena

ntro

l 10

ppm

fena

ntro

l 40

ppm

fena

ntre

nqui

nona

10 p

pm

fena

ntre

nqui

nona

40 p

pm

Ex p e rim e n to s

ug/m

l fo l ia rra d ica l

Figura 2. Cuantificación de proteína total foliar y radical de C. elegans

4.1.3. Evaluación de la actividad de GST (glutation-transferasas) de los extractos de las proteínas totales radicales de Cyperus elegans, bajo la exposición a los contaminantes:

Se presentan a continuación en la Figura 3 los resultados que corresponden a la determinación

de la actividad de GST de los extractos de proteínas totales radicales de las plantas de

Cyperus elegans expuestas a fenantreno, fenantrol y fenantrenquinona, por tres días.

Figura 3. Actividad de GST radicales de C. elegans

0

10

20

30

40

50

60

fena

ntre

no10

mg/

L

fena

nten

o40

mg/

L

fena

ntro

l 10m

g/L

fena

ntro

l 40m

g/L

fena

ntre

nqui

nona

10 m

g/L

fena

ntre

nqui

nona

40 m

g/L

nM N

ADH/

min

/ug

prot

eina

/ g

peso

fres

co ra

dica

l

Experimentos

10

4.2.Caracterización de la capacidad de remoción y evaluación de la respuesta fisiológica y bioquímica de los cultivos de células en suspensión de dos especies de la familia Fouquieriaceae: Fouquieria splendens y Fouquieria fasciculata, bajo la presencia de fenantreno: 4.2.1.Determinación del porcentaje de viabilidad de las células expuestas ante fenantreno. Se presentan a continuación en las figuras: 4, 5 y 6, la cuantificación de las células viables y no

viables y el porcentaje de viabilidad de todos los experimentos a las diferentes cosechas de F.

splendens y en las figuras 7, 8 y 9, la cuantificación de las células viables y no viables y el

porcentaje de viabilidad de todos los experimentos a las diferentes cosechas de F. fasciculata.

Porcentaje de viabilidad de las células de Fouquieria splendens

0102030405060708090

100

10 días 20 días 30 días

%

testigo1 mg5mg10mg

Cuenta de células viables de Fouquieria splendens

0

10

20

30

40

50

60


ulas

de

cél

No.

Cuenta de células no viables de Fouquieria splendens

02468

1012141618


luN

o. d

e cé

las

Figuras: 4) cuantificación de células viables, 5) cuantificación de células no viables y 6) porcentaje de viabilidad de las células de los cultivos en suspensión no inmovilizados, de F. splendens expuestos a fenantreno: 10, 20 y 30 días.

11

Cuenta de células viables de Fouquieria fasciculata

01020

30405060

7080

10 días 20 días 30 díasN

o. d

e cé

lula

s

Cuenta de células no viables de Fouquieria fasciculata

02468

101214161820


No.

de

célu

las

Porcentaje de viabilidad de las células de Fouquieria fasciculata

0

20

40

60

80

100

120


% testigo3ul15ul30ul

Figuras: 7) cuantificación de células viables, 8) cuantificación de células no viables y 9) porcentaje de viabilidad de las células de los cultivos en suspensión no inmovilizados, de F. fasciculata expuestos a fenantreno: 10, 20 y 30 días.

12

4.2.2.Evaluación de la remoción de fenantreno por los cultivos de células en suspensión de F. splendens y F. fasciculata y su análisis por HPLC. Se presentan a continuación una selección de los resultados representativos correspondientes

al análisis cromatográfico de las muestras de los cultivos de células en suspensión de F.

splendens, expuestos a fenantreno, de los experimentos y cosechas.

35’58”Figura 10: Cromatograma con

espectro de absorción de fenantreno.

2’83” 38’38Figura 11: Cromatograma con espectro de absorción de la

muestra testigo, 10 días.

13

4.2.3.Comparación de los resultados de la cromatografía por HPLC del medio de cultivo de las células en suspensión de F. splendens y F. fasciculata y la remoción de fantreno. A continuación se presentan los resultados comparativos de los compuestos detectados por el

análisis de cromatografía por HPLC de las muestras del medio de cultivo de los cultivos de

células en suspensión de ambas especies de fouquieriaceas con y sin fenantreno con los

compuestos resueltos de acuerdo con su tiempo de retención y la cantidad de ellos, medida a

través del % de área de cada uno.

Experimento Testigo 10 días 20 días 30 días

Fouquieria splendens

3’ 38’’ → 6.31% 37’ 43’’ → 32.79% 38’ 68’’ → 24.25% 48’ 88’’ → 6.96%

2’ 83’’ → 13.18% 35’ 98’’ → 41.48% 37’ 55’’ → 11.85% 49’ 35 ‘’→ 5.46%

3’ 20’’ → 49.22% 38’ 13’’ → 22.40% 39’ 40’’ → 6.70% 49’ 10’’ → 3.53%

Fouquieria fasciculata

4’ 17’’ → 21.39%

38’ 17’’ → 4.90%

49’ 10’’ → 3.43%

3’ 60’’ → 28.52%

38’ 25’’ → 6.16%

49’ 30‘’→ 0.39%

3’ 55’’ → 11.51%

38’ 47’’ → 2.36%

Experimento 1mg/L 10 días 20 días 30 días

fenantreno: 35’ 85’’

(94.33%) fenantreno: 35’ 58’’

(96.83%)


2’ 90’’ → 18.75%

12’ 88’’ → 2.45%

36’ 02’’ → 8.96% 38’ 33’’ → 8.64%

39’ 58’’ → 18.46%

49’ 32’’ → 7.83%

2’ 70’’ → 18.56%

12’ 70’’ → 3.21%

35’ 68’’ → 2.69% 38’ 02’’ → 7.71%

39’ 22’’ → 3.51%

48’ 98’’ → 2.61%


(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%)


3’ 17’’ → 3.61%

11’ 12’’ → 3.03%

36’ 13’’ → 3.75%

38’ 38’’ → 1.71%

39’ 65’’ → 1.27%

3’ 78’’ → 33.24%

12’ 90’’ → 0.86%

36’ 15’’ → 4.20%

38’ 33’’ → 7.30%

3’ 62’’ → 8.74%

12’ 82’’ → 0.27%

38’ 35’’ → 1.52%

14

Experimento 5 mg/L 10 días 20 días 30 días


(94.33%) fenantreno: 35’ 85’’

(94.33%) fenantreno: 35’ 85’’

(94.33%)


2’ 57’’ → 52.02%

12’ 70’’ → 8.60%

35’ 67’’ → 9.18%

37’ 98’’ → 23.27%

3’ 63’’ → 8.34%

13’ 03’’ → 4.14%

36’ 40’’ → 27.11%

38’ 60’’ → 3.89%

49’ 58’’ → 2.19%

3’ 53’’ → 3.44%

12’ 98’’ → 0.53%

36’ 30’’ → 5.93%

38’ 53’’ → 1.70%

49’ 48’’ → 1.17%


(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%)


3’ 65’’ → 9.37%

36’ 28’’ → 0.19%

38’ 50’’ → 2.30%

49’ 42’’ → 0.26%

3’ 82’’ → 20.62%

10’ 72’’ → 1.72%

12’ 93’’ → 2.37%

36’ 12’’ → 2.22%

38’ 30’’ → 4.75%

3’ 70’’ → 44.54%

12’ 82’’ → 1.49%

38’ 12’’ → 15.74%

Experimento 10 mg/L 10 días 20 días 30 días


(96.83%) fenantreno: 35’ 58’’

(96.83%)


2’ 70’’ → 4.09%

10’ 95’’ → 1.81%

12’ 60’’ → 0.66%

35’ 53’’ → 24.09%

38’ 98’’ → 2.13%

48’ 82’’ → 1.15%

2’ 67’’ → 8.08%

12’ 53’’ → 0.95%

35’ 42’’ → 24.90%

38’ 70’’ → 0.60%


(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%) fenantreno: 36’ 15’’

(91.81%)


3’ 77’’ → 11.67%

12’ 87’’ → 0.48%

36’ 27’’ → 0.56%

38’ 50’’ → 2.62%

49’ 55’’ → 0.23%

2’ 68’’ → 4.16%

10’ 30’’ → 0.98%

12’ 90’’ → 0.71%

36’ 23’’ → 6.44%

38’ 48’’ → 0.49%

3’ 52’’ → 20.91%

11’ 02’’ → 1.08%

12’ 75’’ → 0.88%

35’ 83’’ → 1.07%

38’ 07’’ → 7.42%

15

4.2.4.Cuantificación de la proteína total de los cultivos de células en suspensión no inmovilizados e inmovilizados de F. splendens y F. fasciculata de las células expuestas ante fenantreno. Se presentan a continuación los resultados que corresponden a la cuantificación de proteína

total celular de los cultivos en suspensión de F. splendens y F. fasciculata para cada experimento y cosecha, figuras 12 y 13, respectivamente.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4


Cosechas

ug/m

l pro

teín

a testigo1mg5mg10mg

0

5

10

15

20

25


ug/m

l pro

teín

a

Figuras 12 y 13: Cuantificación de proteína total celular de los cultivos en suspensiónexpuestos a fenantreno: 10, 20 y 30 días: 12) Fouquieria splendens 13) Fouquieria fasciculata

4.2.5.Evaluación de la actividad de guaiacol peroxidasas y hemoperoxidasas de los extractos celulares de los cultivos de células en suspensión de F. splendens y F. fasciculata de las células expuestas ante fenantreno:

Se presentan a continuación, los resultados que corresponden a la determinación de la

actividad de guaiacol peroxidasas de los extractos de las proteínas totales celulares de los

cultivos en suspensión de F. splendens para cada experimento y cosecha (figura 14)

solamente, ya que en el caso de F. fasciculata no se obtuvieron resultados para esta enzima.

16

Determinación de la actividad de GPX del cultivo de células de F. splendens expuestas a fenantreno

0

2

4

6

8

10

12

14

10 días 20 días 30 díasCosechas

nM/m

in/u

g de

pro

teín

a (x

10-6

)

testigo3ul15ul30ul

Figura 14. Determinación de la actividad de guaiacol peroxidasas de las proteínas celulares totales de los cultivos en suspensión de F. splendens expuestos a fenantreno:

10, 20 y 30 días.

Se presentan a continuación, los resultados que corresponden a la determinación de la

actividad de hemoperoxidasas de los extractos de las proteínas totales celulares de los cultivos

en suspensión de F. splendens y F. fasciculata, para cada experimento y cosecha, figuras 15 y

16, respectivamente.

0123456789

10


nM/m

in/u

g de

pro

teín

a ( x

10-6

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

10 días 20 días 30 díasCosechas

nM/m

in/u

g de

pro

teín

a ( x

10-6

)

testigo1mg5mg10mg

Figuras 15 y 16: Determinación de la actividad de hemoperoxidasas de las proteínas celulares totales de los cultivos en suspensión expuestos a fenantreno: 10, 20 y 30 días. 15) Fouquieria splendens 16) Fouquieria fasciculata

17

5.Conclusiones de los resultados. En cuanto al ensayo sobre la remoción de fenantreno, realizado con los cultivos en suspensión

de Fouquieria splendens y Fouquieria fasciculata, permanecieron sin alteración en su

comportamiento celular además de promover la remoción del contaminante en las

concentraciones consideradas, lo que se observó con la disminución en la concentración del

fenantreno cuantificado en el medio de cultivo, después de cada tiempo de exposición de las

células ante el contaminante, evidencia obtenida a través de los análisis por cromatografía de

líquidos (HPLC), además de evidenciar un efecto inductivo sobre la actividad enzimática de dos

sistemas enzimáticos que pueden estar relacionados con la posible transformación del

contaminante, determinada a los diferentes tiempos de exposición.

La determinación de la actividad de GST radicales, no obstante que la actividad del testigo fue

mayor que en los ensayos con fenantreno y sus derivados, mostraron que la concentración

tanto de fenantreno como de fenantrol indujeron un incremento en la actividad de estas

transferarsas lo que no ocurrió con fenantroquinona, donde la mayor actividad se presentó en

la menor concentración de este compuesto aromático.

6. Impacto de la investigación desarrollada. Los resultados obtenidos en esta investigación a nivel básico, continúan siendo importantes

para el conocimiento del manejo de especies silvestres endémicas como herramientas para la

remoción de contaminantes orgánicos según su potencial.

Esta etapa de la investigación (período 2006), incluyó el inicio del análisis de la capacidad de

remoción de fenantreno en los cultivos de células en suspensión de dos especies de la familia

Fouquieriaceae: Fouquieria splendens y Fouquieria fasciculata, donde se evaluó no solamente

en este caso la remoción del contaminante, sino también su efecto sobre el crecimiento celular

además de la medición de la actividad de una fenoloxidasa y de una enzima relacionada de

manera indirecta con el citocromo P-450, que es un sistema conocido que participa en

procesos de transformación de xenobióticos, permitiendo el manejo de sistemas que pueden

ser empleados para extrapolar las respuestas a nivel celular in toto de las plantas.

En cuanto a la actividad de los sistemas enzimáticos de GST radicales medidos en una especie

de cyperácea: Cyperus elegans, expuesta fenantreno, fenantrol y fenantrenquinona, resultó un

indicio para los ensayos relacionados con la importancia del estudio de los sistemas

enzimáticos implicados en los posibles mecanismos asociados con la transformación de

compuestos policíclicos aromáticos.

Con lo anterior, se plantea para 2007, el indagar con mas detalle y con un mayor espectro de

especies biológicas el análisis de la naturaleza de los sistemas enzimáticos inducidos

considerados también como biomarcadores.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCOORDINACION GENERAL DE POSGRADO E INVESTIGACION IE E L I. I EEC2TP1dEa dmadma II. R IV D DDD T6F1dma 1 1 EE 1 E 2 2 2L 2A D 2 SPCP A L 2 2L 2SS 2 SE P E AL A E OL A L AL 2A 3E 3 PENV DEFMAMJJASOND 1 1M X X X X X X XCaracterización por HPLC de los productos generados de la transformación del(los) contaminante(s), después de su exposición a los sistemas enzimáticos únicamente de los cultivos de células en suspensión.Experimento TestigoExperimento 1mg/LExperimento 5 mg/LExperimento 10 mg/L123f(f( F 21 33421 3

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