INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL · 2020. 11. 11. · A mis queridas hermanas Gilda y Claudia por su...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
Departamento de Biotecnología
.
YAUTEPEC, MORELOS, ENERO DEL 2006
“ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS IN VITRO DE Ipomoea intrapilosa EN LUZ Y OSCURIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS CON
ACTIVIDAD INSECTICIDA CONTRA Spodoptera frugiperda SMITH, (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE), PLAGA DE INTERÉS AGRÍCOLA”.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
PRESENTA: BIOL. LAURA PATRICIA LINA GARCÍA.
DIRECTOR:
DR. ANTONIO RUPERTO JIMÉNEZ APARICIO
El trabajo: “Establecimiento de cultivos in vitro de Ipomoea intrapilosa en luz y oscuridad para la producción de sustancias con actividad insecticida contra Spodoptera frugiperda Smith, (Lepidoptera: Noctuidae), plaga de interés agrícola” fue
desarrollado en el Laboratorio de Control Biológico del Centro de
Investigación en Biotecnología (CEIB) de la Universidad Autónoma del
Estado de Morelos (UAEM) y en el Laboratorio de Cultivo de Células y
Tejidos Vegetales del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del
Instituto Politécnico Nacional (CeProBi – IPN), bajo la Dirección del Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio y la Tutoría de la Dra. Patricia Castillo España (CEIB-UAEM). Dicho Trabajo forma parte
del proyecto “Estudio de extractos vegetales con propiedades
insecticidas”. Para el desarrollo del mismo, se contó con
financiamiento de los Proyectos CONACYT 29065-B y 39562.
Asimismo, la sustentante contó con una Beca (parcial) otorgada por el
CONACYT para la realización de sus estudios.
El Comité Tutorial estuvo integrado por:
Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio
Dra Patricia Castillo España
Dr. Rene Arzuffi Barrera
Dr. Mario Rodríguez
El Comité de Revisión estuvo integrado por:
Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio
Dra. Patricia Castillo España
Dr. Rene Arzuffi Barrera
Dr. Mario Rodríguez
Dra. Martha Arenas
Dr. Eduardo Aranda Escobar
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de investigación en Biotecnología de la Universidad Autónoma
del Estado de Morelos por brindarme la oportunidad de superación.
Al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico
Nacional por abrirme sus puertas.
Al Dr. Antonio Jiménez Aparicio por la oportunidad brindada para mi
desarrollo académico y su optimismo.
A la Dra. Patricia Castillo España por su introducción y enseñanza en las
técnicas del cultivo in vitro.
Al Dr. Rene Arzuffi Barrera por sus enseñanzas, tolerancia y mucha
paciencia para conmigo, así como por sus palabras de aliento que siempre me
dieron ánimos.
Al Dr. Mario Rodríguez Monroy por tomarse el tiempo de leer y criticar
minuciosamente el escrito y por sus cuestionamientos durante el desarrollo de
este trabajo con el fin de hacer mejores estudiantes.
A la Dra. Martha Arenas por la revisión del escrito y recibirnos siempre con
una sonrisa.
Al Dr. Eduardo Aranda Escobar por su amistad, por permitirme colaborar
con el, por que siempre me ha dado su apoyo y confianza incondicional, por sus
enseñanzas y la oportunidad de mejorar, muchas gracias.
A la Dra. Laura Ortiz igualmente por darme la oportunidad de desarrollarme
académicamente.
Al M en C. Rodolfo Figueroa por el “aventón” mañanero para llegar a
tiempo a clases.
A las secretarias Gloria, Toñita y Sarita, así como a Lety y Marce por su
constante ayuda y recordatorios en los tramites a seguir.
Al Dr. Víctor por su constante ayuda, su máquina, por permitirme colaborar
con él y por su buen humor ante la vida.
A Mayra y Adán por que los aprecio mucho y por alegrarme en todo
momento la vida con sus ocurrencias.
A Anabel y los estudiantes que han estado y están en el laboratorio de
Control Biológico, ya que hacen agradable la jornada diaria.
A todos y cada uno de los compañeros de mi generación porque he
aprendido algo de cada uno de ellos.
DEDICATORIA
A mi Renata, el más grande tesoro con el que me ha premiado la vida,
gracias por tu tolerancia a la ausencia, a mis enojos y la espera constante para
estar contigo, pero a pesar de todo siempre has estado y estas presente en mi
pensamiento y en mi corazón.
A mi amá, la Sra. Hermenegilda García Andrade, por tu constante fortaleza
y carácter para salir siempre adelante, por tus enseñanzas, tu sacrificio y tu
ejemplo de superación, porque siempre estas pendiente de nosotras y por que te
quiero mucho.
A mis queridas hermanas Gilda y Claudia por su ejemplo de fortaleza a las
adversidades, por sus ganas de superación, por su lucha diaria, porque son parte
importante en mi vida y aunque estemos lejos seguimos siendo una sola familia.
A mis sobrinas Mariana y Valeria esperando logren todos sus sueños.
A mi misma, porque a veces es difícil ser madre, ama de casa, estudiante y
trabajadora a la vez.
Esta figura parece representar al árbol que los morelenses llaman hoy
”Cazahuate”. La planta posee dos características interesantes: la primera, que es
un árbol considerado mágico, hasta nuestros días, en todo el altiplano mexicano
por el hecho de florecer con vistosas flores blancas acampanadas en la época del
año en que menos agua disponible hay en la zona, “anunciando así la llegada de
las lluvias mientras se nutre sólo del agua profunda”. La segunda es que, al ser
alucinógenas, sus flores se usan en la medicina popular aplicadas sobre el
cuerpo para tratar padecimientos “del agua y del frío” (Lozoya, 1999).
Contenido Pag.
i Índice de figuras y cuadros I
ii Símbolos y abreviaciones II
iii Resumen III
iV Abstract IV
1.0 INTRODUCCIÓN 1
2.0 ANTECEDENTES 4
2.1 Insecticidas de origen vegetal 4
2.2 El cultivo de tejidos para la obtención de metabolitos
secundarios con actividad biológica 6
2.3 Factores que afectan el cultivo de tejidos 9
2.3.1 Reguladores de crecimiento vegetal 9
2.3.2 Efecto luz-oscuridad 11
2.4 Cultivo de células in vitro del género Ipomoea 13
2.5 Características fitoquímicas del género Ipomoea 15
2.6 Aspectos generales del género Ipomoea (Convolvulaceæ) 16
2.7 Actividad biológica del género Ipomoea 17
2.8 Actividad tóxica de callos de Ipomoea 18
2.9 Ipomoea intrapilosa Rose 19
2.10 Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera:Noctuidae) 19
3.0 JUSTIFICACIÓN 21
4.0 HIPÓTESIS 23
5.0 OBJETIVO GENERAL 23
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES 23
6.0 MATERIALES Y MÉTODOS 24
6.1 Materiales 24
6.1.1 Recolección y preparación del material vegetal 24
6.1.2 Reactivos 24
6.1.3 Medios de cultivo 24
6.1.4 Insecto 25
6.2 Iniciación del cultivo de callos 25
6.2.1 Desinfección de semillas 25
6.2.2 Germinación de semillas y obtención de plántulas 25
6.2.3 Inducción de callogénesis 25
6.2.4 Obtención de extractos 26
6.3 Bioensayos para determinar toxicidad 28
6.4 Morfología de tejidos 29
7.0 RESULTADOS 30
7.1 Inducción a formación de callo 30
7.2 Producción de biomasa 31
7.3 Rendimiento de extractos 34
7.4 Pruebas de toxicidad 36
7.5 Morfología de tejidos 38
7.6 CONCLUSIONES 43
8.0 PERSPECTIVAS 44
9.0 LITERATURA CITADA 45
10 APÉNDICES 54
I. Preparación del medio MS 54
II. Apéndice 2: Dieta de S. frugiperda 55
III. Apéndice 3: Fijación de tejidos 56
IV.Tinción 57
i. ÍNDICE DE FIGURAS Y CUADROS
Figuras Pag.
1. Comparación del peso seco de callos. 33
2. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con
los extractos de I. intrapilosa (ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM)
37
3. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con
los extractos de I. intrapilosa (ANA 18.09 µM)
37
4. Aspectos diversos de la estructura de callos de I. intrapilosa (luz) 40
5. Aspectos diversos de la estructura de callos de I. intrapilosa
(oscuridad)
42
Cuadros
1.- Estudios con diferentes especies del género Ipomoea. 2
2. Respuesta a callogénesis de I. intrapilosa. 32
3. Cuantificación de sólidos totales de extractos de I. intrapilosa. 35
I
ii. Abreviaturas y símbolos
AIA Ácido indolacético
ANA Ácido naftalénacético
2,4-D 2,4-diclorofenoxiacético
cm Centímetros
Cin Cinetina
hr Hora
mbar milibares
MIP Manejo integrado de plagas
ml Mililitros
mm Milímetros
MS Medio: Murashigue y Skoog
ºC Grados centígrados
p/v Peso a volumen
ppm Partes por millón
v/v Volumen a volumen
µl Microlitros
µM Micromolar
µmol Micromol
II
iii. RESUMEN
Durante la coexistencia entre plantas y otros organismos han aparecido los
herbívoros, quienes al intentar alimentarse de las plantas, éstas han generado
mecanismos de defensa: físicos y químicos para evitarlos o matarlos. No se sabe
con certeza en que momento el hombre empezó a utilizar estos compuestos para
contrarrestar la actividad de los insectos sobre sus cultivos. En la actualidad se ha
dado con relativo éxito, el uso de extractos vegetales y se ha impulsado la
búsqueda de nuevas moléculas de origen vegetal susceptibles de ser obtenidas
mediante procesos biotecnológicos. En el presente trabajo se reporta el efecto
insecticida de los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos obtenidos de
callos, generados a partir de explantes de hipocotilo de Ipomoea intrapilosa, sobre
larvas neonatas de Spodoptera frugiperda (plaga de interés agrícola). A partir de
plántulas asépticas provenientes de semillas se obtuvieron los callos en medio MS
adicionado con ANA 13.57 + cinetina 1.1 µM y ANA 18.09 µM, en condiciones de
luz y oscuridad constante. En condiciones de luz constante se obtuvieron callos
de consistencia compacta, mientras que los callos mantenidos en oscuridad
fueron blancos y de consistencia friable. Con relación a los extractos, para callos
obtenidos en luz y oscuridad constantes, se encontró que la concentración de los
sólidos totales fue mayor en los metanólicos; sin embargo, los hexánicos y
clorofórmicos fueron los que mostraron mayor actividad insecticida. En los callos
compactos, crecidos en luz constante, se observaron células parenquimatosas
isodiamétricas, sin espacios celulares, elementos traqueales en formación, restos
de haces vasculares del explante original y segmentos de pared secundaria. En
el caso de los callos friables crecidos en condiciones de oscuridad, se observaron
de manera similar células parenquimáticas, pero con abundantes espacios
intercelulares y con incipiente crecimiento de elementos traqueales. Se concluye
de manera general, que la actividad bioinsecticida que presenta I. intrapilosa se
mantuvo en los callos obtenidos in vitro, bajo condiciones de luz y oscuridad. No
hubo diferencias notables en la estructura general de los tejidos, la morfología
celular permitió reconocer que no hubo una rediferenciación clara de las células,
aunque con ANA 13.57 µM se observaron elementos traqueales de novo.
III
IV ABSTRACT During the co-existence between plants and other organisms, herbivores
appeared, i.e. those organisms that usually feed of plants. As a response to this
action, the plants generated different physical and chemical defense mechanisms
to prevent damage that eventually could lead to death. It is not well understood in
which moment human beings bean began to use these compounds to avoid the
activity of insects against their crops. Today, the use of plant extracts, as well as
the search and production of new molecules using biotechnological processes, has
been increased with relative success. In this work, hexanic, methanolic and
chloroformic extracts were obtained from callus of Ipomea intrapillosa, generated
from plantlet´s hypocotile. The insecticide effect of the extracts was assessed
against Spodoptera frugiperda first-instar larvae (pest of agriculture importance).
Aseptically-germinated plantlets were obtained from seeds, and the callus were
generated in MS media added with 13.57 µmol of NAA plus 1.1 µmol of Kin and
18.09 µmol of NAA under constant conditions of illumination and darkness.
Compact calluses were obtained under illumination, while the callus maintained in
darkness had a friable consistence and whitish coloration in both types of callus.
Concentration of total solids was greater in methanolic extracts for callus cultured
under both conditions already mentioned. Nevertheless, hexanic and chlororformic
extracts showed the best insecticide activity. The internal structure of compact
callus was described using an optical microscope. Parenchymatose and
isodiametric cells, without intercellular spaces, tracheal-forming elements and
vascular bundle residues of the original explants, were observed, as well as
secondary cell-wall segments. In case of the friable callus grown in darkness
conditions, parenchymatose cells with abundant intercellular spaces and incipient
tracheal-forming elements were observed. We may conclude that the
bioinsecticide activity recorded by the I. intrapilosa native plants was maintained in
the callus tissue, under either illumination or darkness conditions. There are not
important differences in the general structure of the tissues, although the cell
morphology did not allow to recognize a clear cell rediferentiation.
IV
1. INTRODUCCIÓN
Aunque las plantas representan una fuente prácticamente ilimitada de
compuestos (metabolitos) resultantes de su metabolismo primario, y sobre todo de
su metabolismo secundario, el número de plantas estudiadas es aún muy limitado.
A nivel mundial, menos del 5 % del recurso vegetal ha sido estudiado para
conocer sus actividades biológicas y sólo alrededor del 15 % se ha estudiado
desde el punto de vista fitoquímico (Nugroho y Verpoorte, 2002; Degenhardt et al.,
2003). Los metabolitos secundarios con actividad insecticida son conocidos desde
hace varios siglos en culturas tradicionales alrededor de todo el mundo,
actualmente la producción biotecnológica de estos compuestos capaces de matar
o interferir con el ciclo biológico de los insectos plaga es una estrategia
prometedora (Degenhardt et al., 2003).
En este sentido, la biotecnología vegetal, a través del cultivo in vitro tiene,
entre otros propósitos, el plantear alternativas para el abastecimiento de aquellos
recursos vegetales que permitan la obtención de compuestos con alguna actividad
biológica terapéutica o con otras actividades y compuestos de interés comercial
(Alfermann y Petersen, 1995).
La selección de las condiciones de cultivo establecidas para cada especie
vegetal, dependerá de la respuesta del cultivo a las diferentes condiciones físicas
y químicas evaluadas. Particularmente, luz, temperatura y reguladores de
crecimiento tienen un efecto directo en el desarrollo morfológico de las plantas y
su variación puede modificar los diferentes procesos de síntesis de estructuras
celulares y de otros compuestos. Del mismo modo, también las células vegetales
cultivadas in vitro se ven afectadas en su morfología y capacidad de síntesis de
compuestos según las condiciones de cultivo empleadas (Piqueras y Debergh,
1999).
Así pues, la búsqueda y producción a gran escala de insecticidas de origen
vegetal forman una parte importante dentro de las nuevas estrategias del manejo
integrado de plagas (MIP) en el control de insectos nocivos para la producción de
alimentos y en el control de enfermedades transmitidas por ellos. Entre los
1
organismos vegetales con mayor potencial para el desarrollo de productos activos
están un número importante de especies de diferentes familias como las
Meliaceae, Solanaceae, Papaveraceae, Convolvulaceae y Rutaceae entre otras
más, de igual importancia (Dev y Koul, 1997; Rodríguez, 1998).
Dentro de la familia Convolvulaceae existen especies de gran interés por su
aplicación comercial y farmacológica. Tal es el caso de las formas arbóreas del
género Ipomoea, las cuales presentan actividad agrícola (insecticida) y
farmacológica. Varios estudios muestran que plantas intactas, así como diferentes
explantes cultivados in vitro, de algunas especies de este género producen
compuestos con actividad insecticida (cuadro 1).
Cuadro 1. Estudios con diferentes especies del género Ipomoea.
Toledo, 2001 Extractos orgánicos de I. arborescens, I. cuernavacensis, I. carnea, I. intrapilosa e I murucoides mostraron actividad insecticida sobe tres especies de insectos plaga
Gómez, 2001 Estudió condiciones hormonales y tipo de explante para inducción de callo con I. intrapilosa, mejores tratamientos fueron ANA 13.57 y 18.09 µM e hipocotilo y pecíolo respectivamente, se observa efecto sobre ninfas de Trialeurodes vaporariorum con extractos
Lina et al., 2001 Actividad insecticida de extractos de callos, flores y semillas de I. intrapilosa
Pichardo, 2004 Efecto de ANA, 2,4-D y tipo de explante para la inducción a callogénesis en I. murucoides, el hipocotilo con 2,4-D fue el mejor tratamiento, al evaluar actividad insecticida, el extracto hexánico de hipocotilo-ANA 4.52 µM presentó mayor actividad
Vázquez, 2002 Se intenta la transformación genética de I. intrapilosa, actividad insecticida de callos cultivados in vitro
García, 2002 Se intenta la transformación genética de I. murucoides, actividad insecticida de callos cultivados in vitro
Gómez, 2003 Morfología y estructura interna de callos de I. murucoides con diferentes reguladores de crecimiento
Cortés, 2004 Efecto de reguladores de crecimiento sobre explantes de I. arborescens, en luz y oscuridad, 100% de callos con ANA en luz constante
Vera, 2005 Actividad insecticida de callos de I. murucoides con diferentes reguladores de crecimiento, varía de acuerdo a la especie de insecto, actividad en callos desdiferenciados y morfogénicos
2
Con el objeto de conocer más acerca de la actividad insecticida de otras
especies de Ipomoea, en esta investigación se analizó el efecto que determinadas
condiciones de cultivo (luz y oscuridad constantes, así como combinaciones
diversas de reguladores de crecimiento) pudieran tener en la formación de callos
de I. intrapilosa, y que estas condiciones mantuvieran la actividad biológica
encontrada por varios autores que se han señalado anteriormente. El análisis
estuvo enfocado también a conocer si la actividad puediese incrementarse o
deteriorarse dependiendo de las condiciones de incubación de los callos
obtenidos.
3
2. ANTECEDENTES.
2.1 Insecticidas de origen vegetal.
Dada su capacidad fotosintética, las plantas representan la mayor
proporción de biomasa en la naturaleza. En cambio, los animales obtienen sus
nutrientes a partir de las plantas y de otros organismos heterótrofos. En
consecuencia, se ha desarrollado una estrecha relación de dependencia entre
organismos vegetales y animales a lo largo del tiempo, lo que se ha traducido en
la aparición de mecanismos de defensa eficientes en las plantas. Así, los
herbívoros, al buscar alimento, tienen que contender con estructuras vegetales
tales como espinas, escamas, ganchos, tricomas, tejidos lignificados y cutículas
cerosas, entre otras (Wink y Schimmer, 1999; Alonso-Amelot, 2003).
A lo largo de este proceso, muchos invertebrados, particularmente los
insectos, aprendieron a vencer estos mecanismos físicos de defensa, por lo que
nuevos caracteres tuvieron que aparecer. A su vez, este proceso se tradujo en
nuevas presiones sobre las plantas, obligándolas así a desarrollar defensas cada
vez más sofisticadas y complejas (Alonso-Amelot, 2003).
Tales formas defensivas han evolucionado más allá de las formas
puramente morfológicas, dando lugar a la producción de una serie de sustancias
químicas capaces de contener el embate de los herbívoros a través de la aparición
de una amplia gama de compuestos fitoquímicos. Tal es el caso de los glicósidos
cianogénicos, glucosinolatos, alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos, iridoides,
derivados indólicos y muchos otros compuestos. Estas sustancias no sólo les
sirven a las plantas para disuadir a los herbívoros, si no que también les permiten
responder a presiones ambientales como la escasez de agua y nutrientes, el
estrés térmico y de luz y aún para usarse como señales de comunicación entre
plantas y con otros organismos (Wink y Schimmer, 1999; Baldwin et al., 2002;
Sudha y Ravishankar, 2002).
Se sabe que los tejidos vulnerables y aquellos que participan en la
reproducción de la planta son mejor defendidos que los tejidos viejos o
4
senescentes. De igual manera se ha observado que los alcaloides con frecuencia
se encuentran en tejidos jóvenes o metabólicamente activos. No obstante, a pesar
de la presencia de estos compuestos, un número limitado de herbívoros han
logrado vencer las defensas químicas de las plantas y son capaces de utilizar a
las plantas como sus hospederos (Wink, 1999; Wink y Schimmer, 1999; Baldwin
et al., 2002; Alonso-Amelot, 2003; Degenhardt et al., 2003).
Las sustancias tóxicas producidas por los vegetales no solamente perturban
el metabolismo animal sino también el vegetal, dado que hay muchos procesos
bioquímicos comunes. Las plantas como productoras de tales compuestos deben
separar las toxinas para aislarlas de los demás procesos celulares propios y
exponerlas al enemigo solamente en caso necesario (Wink, 1999; Alonso-Amelot,
2003), por lo cual generalmente se almacenan en áreas especializadas (diferentes
al sitio de síntesis), como las vacuolas, organelo en el que se ubican la mayoría de
los compuestos disuasores de la alimentación.
Otra estrategia de almacenamiento de metabolitos secundarios son los
canales resiníferos que almacenan y posiblemente transportan lentamente las
sustancias hidrofóbicas. En otras ocasiones se produce el precursor del
compuesto activo, como es el caso del ácido cianhídrico (HCN). Así las plantas no
producen HCN directamente sino que sintetizan un precursor que no es tóxico per
se, como los glicósidos cianogénicos, pero que pueden descomponerse
rápidamente en HCN (Alonso-Amelot, 2003).
Los metabolitos secundarios pueden estar contenidos en semillas, flores,
hojas, tallos o raíces, pero la cantidad presente en las plantas varían según el
órgano en el que estén presentes, del estado fisiológico y la edad o estado
fenológico de los individuos (Alonso-Amelot, 2003).
En la actualidad se han aislado varias sustancias con actividad insecticida
(bioinsecticidas), cientos de disuasores de la alimentación y repelentes contra los
insectos, con usos potencialmente comerciales en el hogar y en la agricultura. Las
estructuras químicas son muy variadas, desde estructuras simples como el caso
del limoneno (monoterpeno) que se aísla de la cutícula de algunos cítricos, hasta
5
estructuras muy complejas que requieren muchos pasos de síntesis como la
clerodendrina obtenida del género Teucrium y la harrisonina obtenida de
Harrisonia abyssinica. Otro ejemplo notable es el de la azadiractina y otros
limonoides homólogos que se aíslan del aceite presente en las semillas del neem
(Azadirachta indica) (Rodríguez, 1998; Alonso-Amelot, 2003).
En el caso del crisantemo (Chrysanthemum cinerariaefolium) se han aislado
y purificado compuestos activos como las piretrinas que causan parálisis en
algunas especies de insectos. La juvabiona es un compuesto obtenido a partir de
Abies balsamica y produce un efecto análogo a la hormona juvenil de los insectos,
de tal forma que cuando esta sustancia está presente en las ultimas fases
larvarias impide la metamorfosis del organismo. Otro ejemplo es el de la nicotina,
la cual es uno de los productos más antiguos utilizado como insecticida, en el
mercado se puede encontrar como sulfato de nicotina al 40% (Primo, 1991).
En la búsqueda de productos vegetales con actividad insecticida el
conocimiento tradicional es muy importante. Al respecto, en un estudio realizado
por Boeke et al., (2004) se validó el efecto tóxico y repelente de 33 especies
vegetales usadas de forma empírica desde la antigüedad en África para el control
del escarabajo Callosobruchus maculatus, al hacer la evaluación en laboratorio se
refirió que los polvos de Nicotiana tabacum, Tephrosia vogelii y Securidaca
longepedunculata redujeron de forma significativa el número de progenie y en
cambio Clausena anisata, Dracaena arborea, T. vogelii, Momordica charantia y
Blumea aurita tuvieron actividad repelente, por lo que se concluyó que la mayoría
de las especies evaluadas usadas tradicionalmente por los pobladores
proporcionó un control efectivo contra este escarabajo.
2.2 El cultivo de tejidos para la obtención de metabolitos secundarios con actividad biológica
Debido a que los metabolitos secundarios son producidos en pequeñas
cantidades, en cantidades variables a lo largo del año, en un tipo particular de
células y que adicionalmente no siempre es fácil aislar el compuesto de interés de
la planta intacta, el cultivo de células vegetales es una alternativa para producir
6
estos compuestos de alto valor agregado de forma continua y bajo condiciones
controladas (Wink, 1999). Así mismo, permite manipular las condiciones de
producción no solo para obtener la misma calidad de compuestos (en algunos
casos exitosos ha permitido incrementar el flujo de las vías metabólicas
secundarias), sino incluso, para lograr la síntesis de compuestos novedosos
(Sudha y Ravishankar, 2002)..
En el cultivo in vitro se aprovecha la característica de totipotencialidad
celular, lo que significa que cada célula presenta la información genética necesaria
para producir un organismo con las mismas características de la planta de la cual
provino, al menos en teoría, ya que las células deben encontrarse en un estado
fisiológico competente que les permita reorientar su estado de diferenciación
(Constabel y Kurz, 1998; Verpoorte et al., 1999; von Arnold et al., 2002). Para que
una célula competente o porción de tejido sea capaz de responder al cultivo in
vitro, requiere que las células hayan pasando por una fase de desdiferenciación,
en este proceso las células pierden la función específica que tenían originalmente
y adquieren características de células meristemáticas o parenquimatosas,
formando una masa de tejido vegetal sin una organización aparente llamada callo
(Wetzstein y He, 2000).
La organización anatómica y características estructurales de un callo
dependen no solo del tipo y condición de las células usadas para iniciar el cultivo,
sino también del medio de cultivo y condiciones físicas utilizadas. La importancia
del cultivo de callos es que bajo circunstancias apropiadas las células pueden
inducirse a regenerar órganos y tejidos adventicios, para iniciar suspensiones
celulares o pueden ser usados para producir metabolitos biosintéticos (Wetzstein y
He, 2000).
El desarrollo de un callo se puede dividir en dos estados: inducción y
división, los cuales se caracterizan por cambios en el tamaño celular de la
población, así como en la estructura y condiciones metabólicas del tejido (Yeoman
y Yeoman, 1996).
7
Durante la primera fase, las células son preparadas para la división
mediante factores exógenos, pero morfológicamente éstas permanecen
prácticamente de tamaño constante (Violon et al., 1986; von Arnold et al., 2002).
En la etapa de división, se presenta un proceso de desdiferenciación en el cual el
tejido se revierte a un estado meristemático y las células se dividen mitóticamente,
por lo que se da una reducción del tamaño celular; las células resultantes poseen
pequeñas vacuolas y un arreglo de mitocondrias y plastidios que sugieren alta
actividad metabólica (Wetzstein y He, 2000).
Posteriormente se puede inducir la rediferenciación de la masa celular o
callo, proceso durante el cual las células toman un nuevo curso en su desarrollo y
se pueden obtener estructuras diferenciadas formadas por grupos celulares con
diferentes niveles de diferenciación metabólica y morfológica, estableciéndose un
tamaño celular más o menos constante (Salisbury y Ross, 1994; von Arnold et al.,
2002).
Respecto al aspecto morfológico externo de los callos, la agregación celular
parece ser importante para la productividad de algunos cultivos, la agregación da
como resultado un mayor contacto celular y por tanto una probable comunicación
física y química entre las células y el establecimiento de gradientes físicos y
químicos que pueden ser la clave entre cierta organización celular y la
acumulación de metabolitos (Ladd, 1989), por lo que el aspecto compacto o friable
de los callos puede ser determinante.
Dado que el explante usado para iniciar un cultivo de callos esta compuesto
de una mezcla heterogénea de tipos celulares, determinadas regiones dentro de la
masa de callo pueden mostrar diferencias significativas respecto a su fisiología y
citología, aunque el callo al exterior parezca una masa amorfa homogénea. Por
ejemplo, callos derivados de embriones inmaduros de maíz se pueden clasificar
de acuerdo a si están compuestos por células elongadas y vacuolas
redondeadas; células citoplásmicamente densas con vacuolas alongadas, o
células meristemáticas cubriendo un corazón de células alongadas y espaciadas
(Wetzstein y He, 2000).
8
De forma semejante a las vacuolas, las vesículas caracterizan cierto grado
de citodiferenciación y en ocasiones estas estructuras pueden ser condición
necesaria para la acumulación de metabolitos. Callos cultivados in vitro, pueden
presentar síntesis y acumulación de compuestos como flavonoides, alcaloides y
glicósidos que se almacenan principalmente en células vacuoladas. En Berberis
wilsoniae al menos dos de las ocho enzimas involucradas en la biosíntesis de
alcaloides isoquinólicos se encontraban asociadas con vesículas las cuales
además, son el único sitio de la biosíntesis de alcaloides (Constabel y Kurz, 1998).
2.3 Factores que afectan el cultivo de tejidos
Los cambios en la morfología (forma y estructura) y desarrollo de las
plantas micropropagadas, así como el crecimiento y diferenciación de células
vegetales cultivadas in vitro, depende en gran medida de diversos factores;
algunos son muy obvios, como las combinaciones de reguladores de crecimiento,
la fuente de carbono y los minerales disponibles; otros, no tan conspicuos pero
igualmente importantes, son las condiciones físicas (luz, temperatura y humedad).
Todos ellos juegan un papel importante, no sólo en el crecimiento de las células y
en su respuesta morfogénica, sino también en la gama de compuestos que las
células producen ante condiciones determinadas (Piqueras y Debergh, 1999).
2.3.1 Reguladores de crecimiento vegetal
Debido a que el desarrollo de las plantas es continuo, su vida esta
gobernada por la integración de las condiciones ambientales en las cuales esta
creciendo, su estado fisiológico y estado de desarrollo. La forma de integrar y
regular esta información, es a través de moléculas de señalización que no tienen
función metabólica (no son nutrientes), lo que permite un nivel más sutil y
sofisticado de control. Los reguladores de crecimiento son sustancias orgánicas
que participan en la regulación de los procesos fisiológicos (crecimiento,
diferenciación y desarrollo) de las plantas y los tejidos cultivados in vitro. Aunque
se producen naturalmente en las plantas, los tejidos y células cultivados in vitro
generalmente no producen suficientes cantidades, por lo que deben ser
adicionados selectivamente al medio (Ottoline, 1998; Kyte y Kleyn, 2003).
9
Como característica general, los reguladores de crecimiento son
sintetizados por la misma planta, se caracterizan por actuar a muy bajas
concentraciones (10-6M), son transportados desde el sitio de producción hasta el
sitio de acción, actúan uniéndose de forma no covalente y afectan los patrones de
crecimiento y desarrollo; así mismo, el tipo y concentración de reguladores de
crecimiento varía de acuerdo al tipo de planta y tejido propuesto (Ottoline, 1998;
Kyte y Kleyn, 2003).
La importancia del tipo y concentración de los reguladores de crecimiento
es que proporcionan información acerca del tipo celular, la salud y el estado
nutricional de las células y de las características del ambiente; su transporte puede
proporcionar información de posición, particularmente si este es direccional
(Ottoline, 1998).
Los principales reguladores de crecimiento son las auxinas, citocininas y
giberelinas, entre otros.
En plantas intactas, las auxinas son normalmente producidas por los
primordios foliares y hojas jóvenes, son transportadas activamente corriente abajo
por el tallo hacia la raíz estimulando su crecimiento primario y el de la raíz,
determinan la dominancia apical, la división celular en el cambium vascular,
promueven la formación de xilema secundario, inducen formación de raíces
adventicias, inhiben la abscisión de hojas y frutos, estimulan la síntesis de etileno
e inhiben o promueven la floración. Son comúnmente incorporados en los medios
usados para cultivo tejidos y células in vitro, promueven el alargamiento celular,
formación de raíces, dominancia apical y la división de las células, sobre todos si
se adicionaban en combinación con citocininas (Rost et al., 1997; Kyte y Kleyn,
2003).
La auxina natural conocida es el ácido indol-3-acético (AIA) que se sintetiza
a partir del triptofano principalmente, promueve el enraizamiento. Existen otras
auxinas sintéticas como el ácido 1-naftalenacético (ANA) usado en los medios
como inductor de raíz y para promover el crecimiento de callo; el ácido 2,4-
10
diclorofenoxiacético (2,4-D) es conocido principalmente por matar malas hierbas,
es utilizado ampliamente para inducir el crecimiento de callo (Kyte y Kleyn, 2003).
Las citocininas son reguladores de crecimiento que, en plantas maduras,
son producidos en raíz a partir de derivados de la adenina, aunque también se
encuentran en embriones y endospermo. Son transportadas vía xilema hacia las
partes aéreas. Promueven la división celular y coordinan el crecimiento entre la
parte aérea y la raíz y retardan la senescencia, tienen influencia en el transporte
de auxinas. En cultivo de tejidos se usan para inducir la división celular, procesos
de morfogénesis, la multiplicación de brotes, la proliferación de yemas axilares y
el rompimiento de la dominancia apical (Rost et al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).
Existe una amplia variedad de citocininas, pero la más comúnmente usada
en el cultivo de tejidos es la 6-benzilaminopurina (BAP) para promover el
crecimiento de yemas axilares; la 6-furfurilaminopurina (cinetina) que se adiciona
para promover la división celular en los cultivos; la 6-(4-hidroxi-3-metilbut-2-
enliamino) purina (zeatina) se usa para inducir una rápida división celular (Rost et
al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).
Es simplista resumir la diversidad de reguladores de crecimiento y sus
efectos ya que existe un amplio rango de interacciones entre los diferentes
reguladores de crecimiento, así como interacciones de estos con otros químicos.
Por otro lado el efecto inducido por los reguladores de crecimiento también se ve
afectado por la especie vegetal en cuestión y por factores ambientales como luz y
temperatura (Ottoline, 1998; Kyte y Kleyn, 2003).
2.3.2 Efecto luz-oscuridad
Aunque normalmente la fotosíntesis proporciona a las plantas un
suplemento suficiente de energía, la síntesis de estructuras y compuestos
celulares, en el cultivo in vitro de tejidos y células, las condiciones frecuentemente
no son suficientes como para soportar un desarrollo autótrofo, así que la
fotosíntesis generalmente no es funcional aunque el cultivo sea verde; no
11
obstante, incrementando la luz y proporcionando CO2 es posible conseguir la
autotrofía de algunos cultivos (Piqueras y Debergh, 1999; Scrags, 2000).
En el cultivo in vitro de células y tejidos, los principales parámetros físicos a
controlar son la calidad e intensidad de luz empleada y la temperatura (Piqueras y
Debergh, 1999; Scrags, 2000). Dado que en la micropropagación la luz de día es
completamente reemplazada por fuentes de luz artificial con diferente espectro,
tales cambios pueden inducir respuesta inhibitoria del crecimiento de células y
tejidos vegetales; en otros casos la luz puede incrementar el crecimiento de callos
y la investigación se ha dirigido a determinar si la presencia de luz con diferentes
longitudes de onda tiene efectos distintos; sin embargo, dado que los resultados
han sido contradictorios es necesario hacer más estudios al respecto (Piqueras y
Debergh, 1999).
Dado que la presencia-ausencia de luz es importante, Ekiz y Konzac (1997)
reportaron que en trigo (Triticum aestivum L.) la oscuridad constante durante la
inducción a callo incrementó la formación de callo así como la regeneración de
plantas a partir de éstos y por el contrario, la luz continua disminuyó
significativamente tanto la producción de callo como la regeneración de plantas.
Sin embargo, cuando aplicaron cantidades bajas de luz continua (80 µmol m-2 s-1)
o bien fotoperiodo de 8 h luz/16 oscuridad no se afectó de manera significativa la
inducción a callo respecto a la aplicación de oscuridad continua, concluyendo que
es la cantidad y no la calidad de luz el factor que más afectaba la inducción a callo
(Ekiz y Konzac, 1997).
Desde hace varios años algunos trabajos se han centrado en los efectos de
la luz en la biosíntesis y acumulación de metabolitos secundarios (Scrags, 2000).
Se conoce actualmente que la fotosíntesis es un proceso altamente dinámico que
puede redirigir el metabolismo secundario y afectar el nivel de formación de
productos. Es precisamente durante la fotosíntesis cuando las células elaboran
agentes reductores y varios cofactores enzimáticos importantes en algunas vías
metabólicas (Constabel y Kurz, 1998). Por otro lado también se ha visto que
aunque los cultivos no sean generalmente fotosintéticos, la fotoperiodicidad así
12
como la calidad e intensidad de luz pueden influir en el crecimiento de los cultivos,
aún cuando se usen bajos niveles de iluminación (Scrags, 2000; Wetzstein y He,
2000).
Para el caso del nitrógeno, que es uno de los elementos limitantes en las
plantas, la asimilación de N inorgánico hasta aminoácidos como la glutamina y la
asparagina, es fuertemente regulada por luz ya que induce la expresión de genes
involucrados en la biosíntesis de diversas enzimas. Así mismo, en presencia de
luz, cuando los esqueletos de carbono son abundantes, el amonio es asimilado en
glutamina, aminoácido que puede ser utilizado en diferentes reacciones
anabólicas, pero en oscuridad la glutamina es convertida en asparagina, un
aminoácido inerte usado para almacenar nitrógeno (Oliveira et al., 2001)
En plántulas intactas de tabaco en sus primeros estados de desarrollo, la
síntesis y acumulación de nicotina se ve abatida aún por un breve pulso de luz; sin
embargo, si las plántulas se exponen a un fotoperíodo de 10 h luz después que los
cotiledones abrieron, se incrementa un 70 % el contenido de nicotina (Weeks y
Bush, 1974). De igual modo, el patrón de alcaloides extraídos de plántulas de
Catharanthus roseus se ve afectado por la presencia de luz, en plántulas etioladas
se acumula tabersonina (último precursor de vindolina) y solo después de un
período de iluminación continua, se acumula vindolina debido a que la enzima
participante (tabersonina 16-hidroxilasa) en plántulas esta regulada por luz
(Vazquez-Flota y De Luca, 1998).
2.4 Cultivo de células in vitro del género Ipomea.
Debido a la presencia de una gama importante de sustancias bioactivas y
dado que en la actualidad muchas especies del género Ipomea se encuentran
restringidas en ecosistemas específicos, el cultivo de células y tejidos vegetales
representa una alternativa biotecnológica importante, tanto para la conservación
de las diferentes especies, como para la producción de metabolitos secundarios
(Khafagi et al., 2003).
Al respecto, se han realizado trabajos en los que se ha inducido la
formación de callo en I. murucoides e I. intrapilosa utilizando medio MS
13
(Murashigue y Skoog) adicionado con los reguladores de crecimiento ácido
naftalénacético (ANA), indolacético (AIA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a partir
de explantes de hipocotilo, pecíolo, hojas cotiledonares y raíz. En estos trabajos
se observó que los mejores tratamientos para la formación de callo se obtuvieron
usando hipocótilo como explante y 2,4-D (4.52 y 13.57 µM) como regulador de
crecimiento para I. murucoides; e hipocótilo y pecíolo usando ANA (13.57 µM)
para el caso de I. intrapilosa (Gómez, 2001; García, 2002; Pichardo, 2004; Vera,
2004).
Al hacer un estudio histológico sobre la morfología y estructura interna de
callos de 8 semanas de I. murucoides crecidos en medio MS adicionado con ANA,
AIA y 2,4-D (13.57 µM), Gómez (2003) observó que el proceso de
desdiferenciación se produjo a partir de las células parenquimáticas que rodeaban
a los haces vasculares y que los callos estaban constituidos por células
meristemáticas y parenquimáticas. Adicionalmente durante el proceso de
rediferenciación celular observó rizogénesis directa e indirecta para los diferentes
tratamientos.
En cuanto a la comparación entre callos embriogénicos y no embriogénicos
de I. batatas hay diferencias morfológicas, fisiológicas, histológicas y bioquímicas;
en el caso de los callos embriogénicos fueron de aspecto compacto, desarrollaron
poco crecimiento pero con mas materia seca, proteínas y bajo contenido de
azúcar y una apariencia nodular; los callos no embriogénicos presentaron un
buen crecimiento y mayor contenido de azúcares y su aspecto fue frágil
(Mukherjee et al., 2001)
Respecto a I. intrapilosa, Gómez (2001) realizó un estudio para evaluar el
potencial de morfogénesis y citodiferenciación en callos obtenidos de explantes de
hipocotilo, pecíolo, raíz y hojas cotiledonares, utilizando para el cultivo medio MS
adicionado con diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento
ANA, AIA y 2,4-D. En este estudio se pudo observar que a los 35 días de cultivo
los callos crecidos en ANA presentaron un tamaño importante, particularmente en
14
los tratamientos con 4.52, 9.04, 13.57 y 18.09 µM, y de éstos, los crecidos en ANA
13.57 y 18.09 µM.
Cortés (2004) evaluó el efecto de diferentes reguladores de crecimiento
sobre varios explantes de I. arborescens, para la inducción a callo en condiciones
de luz y oscuridad; generando el 100% de callos con ANA 18.09 µM y cotiledón en
luz constante.
2.5 Características fitoquímicas del género Ipomoea
Existen reportados en la literatura diversos estudios sobre los
constituyentes químicos del género Ipomoea, en los que se han aislado y
determinado la estructura de varios compuestos. Steward y Keeler (1998)
identificaron varios alcaloides indólicos en 19 especies. En las raíces de I.
orizabensis se caracterizaron seis glucósidos (escammoninas I y II), así como 4
nuevos tetrasacáridos del ácido jalapinólico (Hernández et al., 1999). Las semillas
y raíces de I. tricolor e I. batatas presentaron alcaloides indólicos, la amida del
ácido lisérgico e isolisérgico, chanoclavina, una gran variedad de resinas
glicosídicas y los glucósidos kauranoicos, turbicorina y corimbosina; éstos últimos,
adicionalmente se encuentran presentes en varias especies del género e incluso
se pueden utilizar como marcadores taxonómicos (Pérez-Amador et al., 1992;
Pereda y Moustapha, 2003). En las partes aéreas de I. hederifolia , I. neei e I. x
perigrenium se han identificado 47 alcaloides pirrolizidínicos del tipo ipangulinas y
platinecina que la planta almacena como alcaloides terciarios (Jenett-Siems,
1998).
Una de las características anatómicas más notable del género Ipomea es la
presencia de células que secretan resinas glicosídicas en el tejido foliar así como
en las raíces. En un estudio realizado también con raíces de I. orizabensis se
extrajeron dos glucorresinas cuyas estructuras estaban formadas por un ácido
graso glucosilado unido a ácidos volátiles. De igual manera las glicorresinas
tricolorina A y B, mostraron actividad específica contra Staphylococcus aureus y
Mycobacterium tuberculosis y todas las tricolorinas y orizabinas tienen
características antifúngica. En I. stans (conocida como “Tumbavaqueros”) se
15
caracterizaron 3 nuevos tetrasacáridos glucosídicos que presentaron actividad
contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis (Reynolds et al., 1995).
Dentro de la familia de las Convolvuláceas existen numerosas especies que
presentan actividad biológica (Dev y Koul, 1997; Toledo, 2001). Por ejemplo, los
géneros Convolvulus, Exogonium, Ipomoea, Merremia y Operculina sintetizan
diversos tipos de alcaloides y glicorresinas los cuales presentan una actividad
fitoquímica importante (Pereda y Moustapha, 2003), así mismo la mayoría de las
especies del género Ipomoea presentan una gran variedad de alcaloides que
funcionan como defensa antiherbívoro (Steward y Keeler, 1988.
El análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
de las hojas de I. murucoides que reporta Tello (2005), muestra la presencia de
compuestos como terpenos, ácidos grasos y alcaloides tipo pirrolizidínico, así
como 1 metil pirrol, el cual no había sido reportado para las hojas de esta planta.
De estos compuestos los terpenos fueron los más abundantes, fundamentalmente
el α-Cariofileno y Cariofileno. Los ácidos grasos de mayor abundancia fueron el
ácido decanoico, dodecanoico y octadecanoico.
2.6 Aspectos generales del género Ipomoea (Convolvulaceæ)
Mundialmente el género Ipomoea está representado por 600-700 especies,
de las cuales 250 están localizadas en México. Estas plantas tienen usos muy
variados, se usan como cercas vivas en los campos de cultivo y como sustrato en
la producción de hongos, asimismo representan un mercado importante como
productos ornamentales, son melíferas y también tienen diversas aplicaciones en
la medicina tradicional (Rzedowski y Rzedowski, 1985; Murguía, 1995; Austin y
Huaman, 1996; Jenett-Siems et al., 1998).
Algunas especies del género Ipomoea son endémicas de México y se les
encuentra de forma restringida en algunos ecosistemas. Tal es el caso de los
“Cazahuates” (Ipomoea arborescens, I. intrapilosa, e I. murucoides) (Rzedowski y
Rzedowski, 1985; Rzedowski, 1991). Tienen importancia económica por sus usos
alimentarios (I. batatas), ornamentales (I. carnea, I. alba, I. tricolor), medicinales (I.
16
purga, I. orizabensis), actividad citotóxica (I. tricolor, I. purga) y dentro de los
rituales religiosos de algunas comunidades por su actividad psicotrópica (Turbina
corymbosa e I. tricolor) (Murguía, 1995; Pereda y Moustapha, 2003).
Recientemente se reportó que I. carnea es una especie con potencial de
fitorremediación, por ejemplo para la remoción de Cadmio (Ghosh y Singh, 2004).
.
2.7 Actividad biológica del género Ipomoea
Las glicoresinas producidas por diferentes especies del género Ipomoea
tienen actividad como aleloquímicos contra varias especies vegetales
competidoras, por lo que se han utilizado como herbicidas. Algunas especies
herbáceas son usadas para cubrir cultivos debido a su gran capacidad de
propagación y la emisión de compuestos sumamente efectivos en impedir el
establecimiento de otras semillas de malezas dentro de un cultivo (Pereda y
Moustapha, 2003).
En algunos agroecosistemas mexicanos el efecto alelopático se ha usado
para eliminar semillas no deseadas en cultivos de maíz y de caña de azúcar
(Pereda y Moustapha, 2003).
Una característica importante de algunas especies de Ipomoea es su
actividad insecticida. Por ejemplo, el extracto de hojas de plantas intactas de I.
batatas, fue tóxico para las hormigas Atta sexdens y efecto fungicida en los
hongos que estas hormigas cultivan como una fuente de proteínas (Hebling et al.,
2000); sin embargo, no se conocen los compuestos responsables de la actividad
tóxica.
Steward y Keeler (1988) analizaron los patrones de defensa de
antiherbivoría en el género Ipomoea y mencionan que de manera general las
especies agrupadas en esta categoría taxonómica presentan tres tipos de
defensa: 1) la presencia de compuestos de tipo indol alcaloides, 2) nectarios de
defensa, 3) hojas pubescentes y 4) estructura leñosa. En el caso de los alcaloides
se presentan con una considerable variación de estructuras y cantidad de
compuestos individuales,
17
Por otra parte, los extractos crudos obtenidos con hexano, cloroformo y
metanol de corteza, hojas, flores y semillas de cinco especies arbóreas del género
Ipomoea (I. murucoides, I. intrapilosa, I. cuernavacensis, I. carnea e I.
arborescens) tienen actividad insecticida contra plagas de importancia agrícola en
México. Entre éstas se encuentran el gusano cogollero del maíz (Spodoptera
frugiperda) y las especies de mosquita blanca Bemisia tabaci y Trialeurodes
vaporariorum, así como efecto antialimentario sobre Epilachna varivestis (Toledo,
2001; Gómez, 2001). Otros ejemplos son I. cairica Linn., cuyos aceites esenciales
se evaluaron entre 5 y 200 ppm sobre Culex tritaeniorhynchus, Aedes aegypti,
Anopheles stephensi y Culex quinquefaciatus, y se encontró que son altamente
tóxicos a las larvas (Thomas et al., 2004).
Al realizar estudios de citotoxicidad con los extractos obtenidos con
diclorometano y metanol de I. tricolor e I. purga contra 4 líneas celulares de cáncer
humano (nasofaríngeo, pulmón, seno y colon) se obtuvieron buenos niveles de
inhibición (Pereda y Moustapha, 2003). En el caso de la especie I. stans, los
extractos acuosos, etanólicos y clorofórmicos del rizoma son utilizados para el
tratamiento de la histeria y la epilepsia en Corea. Así mismo se ha validado su
actividad anticonvulsiva en bioensayos con ratas (Navarro-Ruiz et al., 1996); a
algunas glicoresinas se les atribuye acción purgante (Pereda y Moustapha, 2003).
2.8 Actividad tóxica de callos de Ipomoea
También se ha evaluado la actividad tóxica de extractos hexánicos,
clorofórmicos y metanólicos de callos de I. murucoides e I. intrapilosa sobre larvas
neonatas de Spodoptera frugiperda. Los callos se obtuvieron en medio MS
adicionado con ANA, AIA y 2, 4-D en diferentes concentraciones y utilizando
varios tipos de explante (hipocótilo, pecíolo, hojas cotiledonares y raíz). Los
resultados mostraron que los extractos hexánicos de callos obtenidos con ANA
18.09 µM provenientes de raiz y peciolo de I. intrapilosa así como los metanólicos
de callos generados con 2,4-D (200 ppm) provenientes de raíz de I. murucoides de
60 días de edad fueron los de mayor actividad al producir una mortalidad del 100 y
50 % respectivamente (Pichardo, 2004; Vázquez, 2002; Vera, 2005).
18
De igual manera en el caso de los extractos hexánicos y metanólicos de
callos obtenidos con los reguladores ANA, AIA y 2,4-D, se produjo una
considerable pérdida de peso en las larvas sobrevivientes después de 7 días de
tratamiento. Por otra parte, en bioensayos de toxicidad con insectos adultos de
Trialeurodes vaporariorum (Homoptera:Aleyrodidae) se encontró que el extracto
clorofórmico de callos obtenidos con AIA (13.57 µM) fue el que presentó una
mayor mortalidad (García, 2002; Pichardo, 2004; Vera, 2005).
Posteriormente Vázquez (2002) evaluó la actividad insecticida de callos
generados a partir de raíz y pecíolo de I. intrapilosa cultivados en medio MS
adicionado con el regulador ANA 18.09 µM y macerados en hexano; este autor
observó un porcentaje alto de mortalidad en larvas de primer estadio de S.
frugiperda usando 200 µg/cm2.
2.9 Ipomoea intrapilosa Rose
I. intrapilosa Rose, es una especie endémica del Altiplano Mexicano,
ampliamente distribuida en las zonas cálidas del Estado de Morelos. Se
caracteriza por ser una especie arbórea de hasta 8 metros de altura; esta planta
produce un látex blanco que contiene alcaloides ergólicos (Rzedowski y
Rzedowski, 1985; McDonald, 1991). Se utiliza en la medicina tradicional para el
tratamiento de padecimientos reumáticos (infusiones de flor, hoja, corteza y tallo);
para dolor de oídos y molares, contra la tos, para contrarrestar la picadura de
alacrán (corteza hervida) y algunos problemas gastrointestinales; asimismo se le
atribuyen efectos psicotrópicos (Chao y Der Marderosian, 1973; Argueta et al.,
1994; Osuna, 1994; Perusquia et al., 1995).
2.10 Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera:Noctuidae), plaga de interés agrícola.
Uno de los insectos plaga más importantes durante todo el ciclo de
desarrollo del maíz, elemento básico en la nutrición del mexicano, es el llamado
comúnmente “gusano cogollero del maíz” Spodoptera frugiperda Smith
(Lepidoptera:Noctuidae); aunque ataca principalmente cultivos de maíz también es
19
una plaga importante para los cultivos de alfalfa, frijol, papa, diferentes especies
de pastos, sorgo, soya, algodón, cacahuate y tomate de cáscara (Morón y Terrón,
1988).
Esta especie se encuentra distribuida a nivel mundial en las regiones
tropicales y subtropicales; bajo condiciones favorables una población puede llegar
a tener hasta 12 generaciones por año y cada hembra poner en promedio 1000
huevos, por lo que las pérdidas en un cultivo pueden ser severas (Morón y Terrón,
1988; Davidson y Lyon, 1996). Adicionalmente por el mal manejo con insecticidas
químicos al que han estado expuestas las poblaciones silvestres, este organismo
ha desarrollado resistencia a diversos insecticidas químicos sintéticos.
Aunado a la importancia agrícola de esta plaga, cabe mencionar que esta
especie de insecto ha sido seleccionada para realizar bioensayos en diversos
trabajos, debido a que se adapta adecuadamente a la cría en laboratorio y, dada
la facilidad de su manejo, representa un buen modelo de estudio para evaluar la
actividad de compuestos.
20
3. JUSTIFICACIÓN
La obtención de productos naturales de interés a partir de plantas intactas,
tiene la desventaja de requerir grandes cantidades de material vegetal, lo que
pone en riesgo la permanencia de la especie vegetal en su hábitat natural; así
como una calidad variable del producto obtenido y la falta de disponibilidad del
material vegetal en cualquier época del año.
El cultivo de tejidos, permite el resguardo del germoplasma de especies en
peligro de extinción, amén de ser una alternativa biotecnológica para la producción
de sustancias con actividad biológica o de interés económico (Wink, 1999; Sudha
y Ravishankar, 2002).
I. intrapilosa es una planta endémica restringida al altiplano mexicano y,
aunque no está en peligro de extinción, algunas de sus poblaciones se han visto
disminuidas por la constante pérdida de sus áreas naturales a causa de la
urbanización, principalmente. Asimismo, es una especie poco estudiada y los
compuestos bioactivos que contiene en diferentes estructuras, pueden ser de gran
interés farmacológico en la medicina tradicional (actividad antiespasmódica,
purgativa y antibacterial).
De igual manera, esta planta tiene una especial importancia desde el punto
de vista agrícola dado que ha mostrado tener actividad insecticida sobre varias
especies plaga de interés para la agricultura mexicana (Toledo, 2001).
La obtención y utilización de metabolitos con actividad tóxica sobre
insectos, a partir del cultivo in vitro de I. intrapilosa, puede ser una alternativa
importante del manejo integrado de plagas, tales como S. frugiperda. Además,
desde el punto de vista ecológico, productos naturales de este tipo pueden ser
más “amigables” con el ambiente por ser biodegradables y no ser tóxicos para los
usuarios de productos agrícolas y para los consumidores.
Sin embargo, es necesario ensayar diferentes condiciones de cultivo in vitro
para la obtención de los metabolitos con actividad tóxica, extraerlos de las células
21
con diversos disolventes y mediante bioensayos, evaluar la actividad insecticida
de cada extracto.
22
4. HIPÓTESIS
Condiciones particulares de cultivo (combinaciones hormonales e
iluminación [luz-oscuridad constante]), ocasionan que los cultivos callogénicos de
I. Intrapilosa desarrollen características morfológicas que afectan la actividad
biológica insecticida.
5. OBJETIVO GENERAL
Analizar el desarrollo de características morfológicas de cultivos
callogénicos de I. Intrapilosa y el efecto que manifiesten en la actividad biológica
insecticida
5.1 OBJETIVOS PARTICULARES
5.1.1- Crecer callos de I. intrapilosa usando dos condiciones hormonales y
en presencia y ausencia de luz.
5.1.2.- Evaluar la actividad insecticida de los extractos hexánicos,
clorofórmicos y metanólicos de los cultivos callogénicos de I. Intrapilosa en larvas
neonatas de S. frugiperda.
5.1.3.- Establecer si existe alguna relación entre la morfología de callos y la
actividad bioinsecticida.
23
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Materiales
6.1.1 Recolección y preparación del material biológico vegetal.
Las semillas de Ipomea intrapilosa fueron colectadas de árboles maduros
del municipio de Xochitepec, Morelos, en una zona de selva baja caducifolia,
alrededor de marzo-abril de 2002. En el laboratorio las semillas fueron sometidas
a limpieza (para eliminar el exceso de polvo) y eliminación del abundante vilano
(“pelos” que recubren la semilla). Con objeto de eliminar insectos parásitos, las
semillas limpias se conservaron a 4º C hasta su uso. Antes de ser sembradas, las
semillas necesarias para la experimentación fueron seleccionadas, revisando que
estuviesen completas, sin parásitos y sin defectos visibles. Muestras de 200
semillas fueron escarificadas (raspadas) manualmente con lija de agua (No 220), a
fin de adelgazar la testa y favorecer la hidratación del embrión.
6.1.2 Reactivos.
Los reactivos utilizados para la elaboración del medio MS, así como los
reguladores de crecimiento vegetal fueron marca Sigma Co (St Louis, USA). Los
fijadores utilizados en el procesamiento de las muestras para histología fueron
marca Electrón Microscopy Sciences (Washington, USA) y Merck (Darmstadt,
Alemania), el medio de parafina para embeber las muestras fue marca Paraplast,
Oxford (St Louis, USA) y la resina de montaje para las preparaciones fue de Merck
(Darmstadt, Alemania).
6.1.3 Medios de cultivo.
El medio empleado para el cultivo de callos fue el medio Murashigue y
Skoog (MS) al 50 % para la germinación de semillas y al 100% adicionado con las
diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal (ANA y cinetina)
para la inducción a callogénesis; los medios fueron gelificados con Fitagel (3.8 g/l).
El proceso de esterilización se llevó a cabo en una esterilizadora marca TOMY
SS-325E a 121 ºC durante 20 minutos.
24
6.1.4 Insecto
Los insectos utilizados para la realización de los bioensayos se obtuvieron
del laboratorio de Control Biológico del Centro de Investigación en Biotecnología
de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, donde se mantiene el cultivo
constante de la especie de insecto plaga Spodoptera frugiperda.
6.2 Iniciación del cultivo de callos
6.2.1 Desinfección de semillas.
Las semillas escarificadas se lavaron en una solución jabonosa ligera y
enjuagadas varias veces con agua corriente a fin de eliminar restos de jabón.
Inmediatamente, en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar,
Labconco modelo 36100 00), las semillas lavadas se desinfectaron
sumergiéndolas por tiempos definidos en soluciones desinfectantes como sigue
(soluciones porcentuales v/v): etanol 96 %, 5 min; etanol 70 %, 5 min, hipoclorito
de sodio comercial (Cloralex 6 %) 5 %, 5 min; 10 %, 10 min; 15 %, 5 min.
Finalmente las semillas desinfectadas fueron lavadas 5 veces, 5 min cada vez,
con agua destilada estéril. Desinfección y lavados fueron realizados siempre en
agitación constante (Gómez 2001; Pichardo 2004).
6.2.2 Germinación de semillas y obtención de plántulas.
Usando pinzas estériles, las semillas desinfectadas fueron colocadas en
frascos de vidrio de 6 cm de diámetro y 9.5 cm de altura (cinco semillas por
frasco) conteniendo 50 ml de medio MS al 50% (apéndice 1). Para inducir la
germinación, los frascos con las semillas se mantuvieron en el cuarto de cultivo de
luz constante (18 µmol m-2 s-1) a 25°C ± 1º C. Bajo estas condiciones, las semillas
de I. intrapilosa comenzaron a germinar después de 5 días de cultivo (Gómez,
2001; Vázquez, 2002; Gómez, 2003, Pichardo, 2004; Vera, 2005).
6.2.3 Inducción de callogénesis.
De plántulas de cinco días de edad y bajo condiciones de esterilidad, se
cortaron segmentos de hipocótilo de 1cm de longitud aproximadamente,
colocándose cinco segmentos en cada frasco con 30 ml de medio sólido MS al
25
100 % de nutrimentos, adicionado con las dos combinaciones de reguladores de
crecimiento sugeridas por Gómez (2001): ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y ANA
18.09 µM.
Para la obtención de callos verdes se sembraron 30 frascos con ANA 13.57
µM + cinetina 1.1µM y 30 frascos con ANA 18.09 µM, los frascos se mantuvieron
bajo condiciones de luz constante (18 µmol m-2 s-1) a 25° C; de igual manera para
la obtención de callos albinos se sembraron 30 frascos con ANA 13.57 µM +
cinetina 1.1µM y 30 frascos con ANA 18.09 µM pero a diferencia de los callos
verdes, éstos se mantuvieron en condiciones de oscuridad constante a una
temperatura de 25° C. Todos los frascos con los explantes (luz y oscuridad) se
mantuvieron por espacio de 45 días antes de cosechar los callos, realizando
resiembras cada 15 días en medio fresco MS con el respectivo tratamiento de
fitoreguladores.
6.2.4 Obtención de extractos
Se siguió la metodología propuesta por Gómez (2001) para la obtención de
los extractos de cada tratamiento. Al cabo de los 45 días los callos se sacaron de
los frascos de cultivo e inmediatamente se congelaron con nitrógeno líquido a –70
°C, y se almacenaron en bolsas plásticas por separado y a continuación se
liofilizaron a 200 mbar de vacío (equipo Heto modelo maxidry Iyo) con el objeto de
extraer todo el contenido de humedad del tejido. Una vez que fueron
deshidratadas las muestras se registró el peso seco de cada una y se procedió a
moler los callos con ayuda de un mortero de porcelana; finalmente el polvo
obtenido de cada muestra se dividió en tres partes iguales, las cuales fueron
colocadas en matraces de vidrio (por triplicado) para su maceración.
Para la obtención de los extractos vegetales, al contenido de cada uno de
los tres matraces de cada tratamiento (luz, oscuridad y combinaciones de
fitorreguladores) se les adicionaron tres disolventes seleccionados con base en su
polaridad: hexano, cloroformo y metanol (en este orden) en una proporción de
1:10 (p/v). A continuación, la maceración en cada disolvente se dejó reposar por
26
espacio de 48 horas en condiciones de oscuridad y a temperatura ambiente
(Vázquez, 2002). Una vez que el disolvente extrajo la mayoría de los compuestos
solubles en él, los macerados fueron homogenizados mediante vibraciones
ultrasónicas (Fisher Scientific FS20) durante 60 min.
Para recuperar el disolvente con los solutos disueltos de cada muestra, los
macerados se filtraron a vacío en un embudo Buchner de porcelana con una base
de papel filtro (Whatman No. 5). De este procedimiento se recuperaron por
separado, el disolvente y la biomasa de callos pulverizados. La biomasa
recuperada y secada al ambiente fue retornada a un matraz limpio para adicionar
el siguiente disolvente. La operación fue repetida una vez más con un tercer
disolvente.
El disolvente recuperado para cada muestra, se concentró por evaporación
(Evaporador rotatorio Büchi modelo B-177) a presión reducida y una temperatura
de 60 °C; el agua de enfriamiento en el condensador tenía una temperatura entre
3 y 10 ºC. La presión utilizada fue de 335 mbar para el hexano, 474 mbar para el
cloroformo y 337 mbar para el metanol. Finalmente, los extractos se guardaron en
frascos color ámbar hasta su utilización en los bioensayos.
Para el cálculo del rendimiento y concentración de extracto se procedió de
la siguiente manera: se registro el peso de un cubreobjeto (manipulado con
pinzas) en el que se colocaron 15 µl de extracto; posteriormente estos
cubreobjetos se introdujeron a una estufa (80° C) durante una hora; transcurrido
ese tiempo los portaobjetos se sacaron de la estufa y se dejaron a que adquirieran
la temperatura ambiente, pesándose nuevamente. Una vez que llegaron a peso
constante se registro el peso y por diferencia de peso entre cada cubreobjetos
sólo y el cubreobjetos con extracto se calculó la cantidad de solutos totales.
Finalmente, tomando en cuenta la cantidad de biomasa (peso seco) que se dejó
macerar en cada tratamiento, los mililitros de extracto obtenidos y la cantidad de
solutos totales obtenidos por diferencia de peso, se calculó el rendimiento de
extracción para cada tratamiento (Pichardo, 2004; Vera, 2005).
27
6.3 Bioensayos para determinar toxicidad.
Para la realización de los bioensayos se utilizaron placas para ensayos de
ELISA del tipo Cells Wells de 24 pozos (2 cm2 de superficie por pozo) que
contenían una dieta merídica sólida utilizada para la cría del insecto (apéndice 2)
para evaluar cada extracto se utilizaron dos placas.
En cada pozo se aplicaron 35 µl de la solución de cada extracto preparada
con el disolvente respectivo, excepto el extracto metanólico el cual se disolvió
utilizando una solución de surfactante INEX-A (1µl de surfactante en 1889 µl de
agua destilada); posteriormente las placas se dejaron secar a temperatura
ambiente. La concentración de los extractos ensayada fue de acuerdo a los
criterios usados por Gómez (2001), Vázquez (2002), Pichardo (2004) y Vera
(2005), estableciéndose un máximo de 200 µg/cm2 de superficie como un límite no
tolerable para larvas neonatas (esta concentración representó un exceso para una
mezcla cruda de un extracto vegetal compuesto por una mezcla diversa de
componentes químicos. La sobrevivencia por arriba de esta concentración fue
indicativo de no toxicidad, mientras que en el caso contrario un producto podría
considerarse como potencial.
Una vez seco el extracto y con ayuda de un pincel fino, se colocó una larva
de primer estadio de S. frugiperda en cada uno de los pozos, cada placa se cubrió
con una película de papel plástico (kleen pack) con el fin de que las larvas no
escaparan, sobre el papel se hizo una pequeña perforación con un alfiler para
evitar que las larvas se asfixiaran, se utilizaron 48 larvas para cada tratamiento,
con 2 repeticiones. Las larvas se mantuvieron a 27ª C ± 1 ºC por 7 días,
después de los cuales se contaron las larvas muertas de cada tratamiento. El
control negativo utilizado en todos los casos fue agua con surfactante (Lina, 1996;
Gómez, 2001; Vázquez, 2002; Pichardo, 2004; Vera, 2005). A los datos de
mortalidad obtenidos de forma porcentual se les realizó una transformación
arcoseno y una prueba de anova (Zar, 1999).
28
6.4 Morfología de tejidos
Con el fin de comparar la morfología y la estructura interna de los callos se
tomaron muestras de tejidos de los diferentes tratamientos (luz, oscuridad y
concentraciones de reguladores de crecimiento) los cuales fueron fijados con
para-glutaraldehido, deshidratados e Incluidos en paraplast. Posteriormente se
hicieron los cortes en un microtomo marca Leica (modelo RM2125RT), la tinción
de los tejidos se hizo con azul de toluidina al 0.05 % (Gómez, 2003; Vera 2004;
Cortés, 2004). Finalmente se montaron con Entellan para observarse al
microscopio (marca Nikon, modelo Eclipse E 400)
29
7. RESULTADOS Y DISCUSION
7.1 Inducción a formación de callo
A partir de los explantes de hipocótilo de I. intrapilosa sembrados como se
detalla en la sección de métodos, se desarrollaron callos con diferente coloración.
En todos los casos, de forma general entre los 3 a 5 días de cultivo, se inició el
hinchamiento de los explantes y la formación de callo dio principio alrededor de la
cuarta semana, siendo a partir de los extremos del corte donde se generó callo
incipiente. Finalmente, después de 5 semanas se observó la formación total de
callo en los explantes. Este resultado es comparable con lo obtenido por Gómez
(2003), Pichardo (2004) y Vera (2005) quienes expusieron explantes de hipocotilo
de I. murucoides a diferentes auxinas a la concentración de 13.57 µM, en estos
trabajos a la séptima semana se pudo observar la desdiferenciación completa del
explante y la completa formación de callo. En términos generales, hemos podido
observar una respuesta positiva de varias especies arbóreas de Ipomoea para
responder positiva y rápidamente al cultivo in vitro.
En el caso de los tratamientos de luz en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y
ANA 18.09 µM, se desarrollaron callos compactos de color verde claro y pequeñas
porciones de color verde oscuro. En 3 explantes cultivados en ANA 18.09 µM y 7
de los cultivados en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM se llegaron a desarrollar
raíces adventicias delgadas de color verde (cuadro 2).
Al comparar estos datos con lo obtenido por Gómez (2003) y Vera (2005)
utilizando explantes de hipocotilo de I. murucoides crecidos en ANA 13.57 µM bajo
las mismas condiciones de iluminación y con fotoperiodo, se presentaron
diferencias en la coloración de los callos ya que en esos trabajos, se observó la
generación de callos de color crema y albinos de consistencia friable, mientras que
a la concentración de 4.52 µM obtuvieron callos verdes compactos con raíces
adventicias. Pichardo (2004) reportó que al utilizar las mismas condiciones
igualmente con I. murucoides, obtuvo callos verdes compactos que en algunos
casos presentaron rizogénesis.
30
En el caso de los callos obtenidos con los tratamientos ANA 13.57 µM +
cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM crecidos en oscuridad, se desarrollaron callos de
consistencia friable y con coloración blanquecina; en 27 explantes crecidos con
ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y 5 crecidos en ANA 18.09 µM también hubo
formación de raíces adventicias delgadas y largas, de color blanquecino (cuadro
2).
Dado que hubo formación de raíces adventicias en algunos de los explantes
sometidos a luz y oscuridad, se puede inferir que el proceso de rizogénesis en
células competentes no depende exclusivamente de las condiciones de luz para
esta especie. En este sentido Mukherjee et al. (2001), al estudiar las
características histológicas, morfológicas y bioquímicas de callos embriogénicos y
no embriogénicos generados por el efecto de diferentes combinaciones
hormonales (auxinas/citocininas) en I. batatas, observaron que los callos
embriogénicos y no embriogénicos eran morfológicamente diferentes y aunque no
mostraban variación en la coloración antes del evento embriogénico, la respuesta
de crecimiento de los callos varió tanto por el genotipo como por la composición
hormonal del medio.
7.2 Producción de biomasa
La producción de biomasa total en peso seco obtenida por los callos de los
diferentes tratamientos se cuantificó después de liofilizar las muestras. En todos
los casos hubo diferencias, siendo mayor la producción de biomasa (28.2 g) en el
tratamiento de luz ANA 13.57 + cinetina 1.1µM, seguido con 17.8 g en ANA 18.09
µM en oscuridad, ANA 13.57 + cinetina 1.1µM oscuridad con 13.0 g y finalmente
ANA 18.09 µM luz con 7.2 g como se muestra en la figura 1.
En este sentido, la respuesta de esta especie en presencia de citocininas
coincide con lo expuesto en la literatura, ya que al ser un regulador de crecimiento
que promueve la división celular, hay una mayor acumulación de biomasa, la cual
se ve afectada de manera diferente por la presencia o ausencia de luz (Rost et
al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).
31
Cuadro 2. Respuesta a callogénesis de explantes de hipocótilo de I. intrapilosa
cultivados in vitro en condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante durante
45 días.
Calloalgunespon
ANCalloporciofriable
Caamesp
32
ANA 18.09 µM Luz constante s de color verde claro con amarillo enas regiones, de aspecto friablejoso y algunas porciones compactas
ANA 13.57 + cin 1.1 µM luz constante Callos de color verde claro conporciones color verde oscuro, de aspectocompacto aunque con pequeñasregiones friables
A 18.09 µM oscuridad constante s de color blanquecino con algunasnes color amarillo claro, de aspecto
ANA 13.57 + cin 1.1 µM oscuridad constante
llos de color blanquecino con porcionesarillo cremoso, de aspecto friableonjoso
LuzANA 18.09
A 13.57 cin1.105
1015
20
25
0
ramosg(gramos)
ANANA13.57 µM + cin. 1.1µM ANA 18.09 µM
c
Figura 1. Peso seco obtenido en reguladores de crecimiento ANA 13.5condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y os
En este caso no es posible
diferente al efecto combinado de
auxina/citocinina) o a la concentrac
expuestos a la combinación auxina-c
la condición de luz y oscuridad cons
auxina, donde la concentración de
menor cantidad de biomasa práct
oscuridad constante. A este respec
de los callos estuvo influenciado t
crecimiento como por la condición de
En el estudio antes referido d
incremento en el peso seco de cal
consecuencia de la alta actividad me
estrés. En el caso del tratamiento A
una condición de estrés que favorec
tratamientos de auxina-citocinina s
suponer que la presencia de citocin
incremento en masa por aumento
33
obsOsc
3 Peso seco
150 callos por tratamiento, cultivados con los 7 µM + cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM en curidad constante (datos únicos).
observar si los callos responden de manera
los reguladores de crecimiento (auxina,
ión de estos, ya que en el caso de los callos
itocinina, la producción de biomasa es alta en
tante, a diferencia de los tratamientos sólo con
ANA es mayor (18.09 µM), ya que se obtuvo
icamente en las dos condiciones de luz y
to se puede decir que el efecto de crecimiento
anto por la combinación de reguladores de
luz.
e Mukherjee et al. (2001) se menciona que el
los embriogénicos estudiados puede ser una
tabólica inducida por condiciones distintas de
NA 18.09 µM, parece ser que la oscuridad es
ió el crecimiento celular. Sin embargo, en los
e observa un efecto inverso, lo que hace
ina generó un estado metabólico en el cual el
en el número de células fue menor que el
incremento en tamaño dado por una división celular más lenta pero con
incremento en volumen celular, lo que explicaría acumular una mayor cantidad de
biomasa
7.3 Rendimiento de extractos
Al cuantificar la cantidad de sólidos totales presentes en los 4 tratamientos
con los disolventes evaluados, se observó que el extracto metanólico de los callos
cultivados en ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM oscuridad y ANA 18.09 µM en luz y
oscuridad, tuvieron el mayor rendimiento respecto a los demás disolventes. Al
comparar los extractos por condición luz/oscuridad, entre ambos tratamientos
hormonales, se observa una diferencia significativa entre los extractos metanólicos
de ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM (t0.05,2=-17.15, p<0.05) y los extractos hexánicos
de ANA 18.09 µM (t0.05,2=-13.1891, p<0.05).
La comparación por regulador de crecimiento en condición de luz, muestra
diferencia significativa entre los tratamientos hexánicos (t0.05,2=6.63, p<0.05),
clorofórmicos (t0.05,2=6.11, p<0.05) y metanólicos (t0.05,2=-9.9563, p<0.05). En
condición de oscuridad, se observa diferencia significativa entre los extractos
hexánicos (t0.05,2=-6.94, p<0.05) y clorofórmicos (t0.05,2=4.87, p<0.05) de ambas
combinaciones de reguladores, pero no hay diferencia en el caso del extracto
metanólico (cuadro 3).
De lo anterior se concluye que, la oscuridad estimula un incremento de
sólidos totales presentes en los extractos metanólicos de ANA 13.57µM + cinetina
1.1µM y hexánico ANA 18.09, µM y que de manera general, los cultivos en ANA
13.57µM + cinetina 1.1µM tanto en luz como en oscuridad, tienen una mayor
acumulación de solutos.
A este respecto llama la atención que el tratamiento ANA 13.57 + cinetina
1.1 µM crecido en oscuridad, aunque tuvo una menor producción de biomasa, la
presencia de sólidos totales fue mayor que en la condición de luz del mismo
tratamiento, lo que podría sugerir que una parte importante del metabolismo, en
34
vez de dirigirse a preparar a las células a dividirse y crecer, se canalizó a la
síntesis alternativa de compuestos para compensar la ausencia de enzimas
metabólicamente importantes probablemente ausentes como respuesta a la falta
de luz, ya que la expresión genética de varias enzimas, como la charcona sintasa,
y la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa, cuyas secuencias promotoras están
reguladas por luz (Gerats, et al., 1999).
Cuadro 3. Cuantificación de los sólidos totales (mg) de los extractos obtenidos a partir de callos de I. intrapilosa cultivados en medio MS adicionado con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM bajo condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante.
Tratamiento Disolvente Luz constante (mg) Oscuridad constante (mg) (X ± E.S.)
Hexano 10.30 ± 1.85 a A 10.13 ± 0.33 a A
Cloroformo 9.36 ± 0.91 a A 7.0 ± 1.17 a A
ANA 13.57+ cin 1.1µM
Metanol 29.86 ± 1.96 a A 537 ± 40.09 a B
Hexano 1.86 ± 0.11 b A 14.06 ± 1.41 b B
Cloroformo 3.36 ± 0.47 b A 4.23 ± 0.57 b A
ANA 18.09 µM
Metanol 333.1 ± 41.77 b A 444.43 ± 15.60 a A
*La comparación por disolvente entre regulador de crecimiento se marca con letras minúsculas iguales (no diferencia) o diferentes (diferencia significativa). *La comparación por disolvente entre luz y oscuridad se marca con letras mayúsculas iguales (no diferencia) o diferentes (diferencia significativa).
Wang y Lincoln (2004) mencionaron que de manera general aunque la
composición relativa de mezclas de compuestos está bajo un riguroso control
genético, la concentración relativa de estos es fuertemente afectada por factores
ambientales; en este trabajo los autores estudiaron la contribución del genotipo y
de los factores físicos en la producción de compuestos de defensa en hojas de
Myrica cerifera en diferentes hábitats, observando que la concentración de
compuestos en las plantas expuestas a la luz solar es mayor que en las plantas
expuestas a la sombra y que dichos compuestos probablemente funcionan como
disuasivos al ataque de herbívoros. En el sentido antes expuesto, es posible que
este efecto se deba a que las plantas crecidas bajo sombra están en desventaja
35
energética y deben decidir si la energía y nutrientes disponibles se canaliza a la
síntesis de compuestos o de biomasa.
Del mismo modo, se ha visto que en plantas intactas, la exposición a la luz
y otros factores metabólicos pueden afectar la asimilación de nitrógeno y por tanto
la síntesis de compuestos nitrogenados, como alcaloides. La asparagina y la
glutamina son los aminoácidos más abundantes en el xilema y floema y funcionan
como compuestos clave en la asimilación de nitrógeno inorgánico y transporte de
compuestos nitrogenados, la expresión de las enzimas responsables de su
biosíntesis son altamente sensibles a la luz (Oliveira et al., 2001).
7.4 Pruebas de toxicidad
Para evaluar biológicamente los extractos obtenidos por la maceración de
los callos cultivados en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1 µM y ANA 18.09 µM en
condiciones de luz y oscuridad constante, se realizaron ensayos de mortalidad
sobre larvas de primer estadio del insecto plaga S. frugiperda.
Todos los extractos obtenidos de los tratamientos fueron tóxico; el mayor
porcentaje de mortalidad ocurrió con los extractos hexánicos y clorofórmicos de
ambos tratamientos hormonales, tanto en luz como en oscuridad (figura 2 y 3). El
menor efecto fue registrado con los extractos metanólicos. Estadísticamente, las
concentraciones hormonales usadas no fueron diferentes de manera significativa
en lo que a mortalidad se refiere (F0.05,1=0, p>0.05). Lo mismo ocurrió cuando se
analizaron los datos derivados de las condiciones de iluminación (F0.05,1=3.001,
p>0.05). Sin embargo, la diferencia entre los extractos preparados con los
diferentes disolventes si fue significativa (F0.05,2=24.608, p<0.05).
Estos datos de mortalidad sobre larvas de S. frugiperda concuerdan con
lo reportado por Vázquez (2002) quien evaluó los extractos hexánicos,
clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa generados a partir de
hipocotilo, raíz y pecíolo en ANA 18.09 µM en condiciones de luz constante. Este
autor reportó que con una concentración de 20 µg cm-2 de los extractos
36
clorofórmicos obtuvo el 80 % de mortalidad y con 200 µg cm-2 obtuvo el 100 % de
mortalidad para los extractos hexánicos y clorofórmicos.
Hex
ano
Clo
rofo
rmo
Met
anol
Agua
0
20
40
60
80
100
Porcentaje mortalidad
Disolvente extracto
ntrol
obs
Co
Luz
Control Luz Osc
Figura 2. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa cultivados 45 días en medio MS adicionado con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante. (n=48 para cada tratamiento, p>0.05).
Hex
ano
Clo
rofo
rmo
Met
anol
Agua
02040
60
80
100
Porcentaje mortalidad
Disolvente extracto
Control
Luz
obs
Control Luz Osc
Figura 3. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa cultivados 45 días en medio MS adicionado con ANA 18.09 µM en luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante (n=48 para cada tratamiento, p>0.05).
37
Por otra parte Pichardo (2004) obtuvo de manera similar una mayor
mortalidad en S. frugiperda con los extractos clorofórmicos; sin embargo, al
comparar la mortalidad obtenida utilizando ANA, AIA y 2,4-D para generar los
callos, los valores más elevados los obtuvo al utilizar 2,4-D como fuente de auxina.
Estos valores concuerdan con lo que observó Vera (2005) al evaluar la
actividad insecticida de I. murucoides. Este autor realizó ensayos en larvas de S.
frugiperda y Epilachna varivestis, utilizando los extractos metanólicos,
clorofórmicos y hexánicos provenientes de callos de 30, 60 y 90 días obtenidos a
partir de hipocotilo y cotiledón, crecidos en medio MS adicionado con dos
concentraciones de 2,4-D, AIA y ANA; bajo condiciones de fotoperiodo de 16
horas luz y 8 de oscuridad. Aunque el mayor porcentaje de mortalidad en el
trabajo de Vera (2005) se obtuvo con los extractos metanólicos y clorofórmicos
provenientes de los callos de 60 días cultivados con 2,4-D, la mortalidad sólo fue
significativa con el tipo y la concentración del extracto; observándose que el efecto
del regulador de crecimiento, las dos concentraciones ensayadas y el tipo de
explante, no tuvieron un efecto significativo en la mortalidad. De manera similar,
con los callos de 90 días la mortalidad en las larvas fue significativa en función del
tipo y concentración del extracto, así como con la concentración del regulador de
crecimiento; sin embargo no hubo un efecto importante por el tipo de regulador de
crecimiento.
En este trabajo parece no haber diferencia en la síntesis de los compuestos
responsables del efecto de la mortalidad ya que esta se observa por igual en los
tratamientos de luz y oscuridad, sin embargo, no es posible saber con estos datos
si la luz afecta la producción en presencia-ausencia o si se presenta un posible
efecto en la proporción de los compuestos tóxicos sintetizados, sin que este
cambio produzca un cambio visible en estos experimentos de mortalidad.
7.5 Morfología de tejidos
Las características estructurales de los explántes después de 45 días de
cultivo fuero como sigue: en el caso de los callos generados con ANA 18.09 µM
38
cultivados en luz constante (Figura 4A) la estructura general interna estuvo
formada por células pequeñas de tipo parenquimático, de forma irregular. En la
zona correspondiente a la parte compacta del callo no se observan espacios
intercelulares, pero en las zonas correspondientes al callo friable se aprecian
espacios celulares dentro del tejido. Así mismo se observaron restos de haces
vasculares (elementos traqueales) del explante original, así como células con
pared secundaria. Al interior de las células parenquimáticas es posible observar la
presencia de inclusiones cercanas a la membrana celular.
En los callos generados con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en luz constante
(Figura 4B) se observó que el tejido estuvo formado por células parenquimáticas
irregulares en forma y tamaño, sin espacios intercelulares en la zona de callo
compacto; sólo se observa una delgada pared primaria.
También se presentaron regiones con células laxas en la zona de callo friable.
Así mismo se observó la presencia de elementos traqueales dispersos de novo
(no preexistentes), algunos unidos pero sin formar haces vasculares, la pared
secundaria con perfecta ornamentación anillada en algunas células y en otras
reticulada (Figura 4B).
En los callos generados con ANA 18.09 µM cultivados en oscuridad constante
(Figura 5A), aunque el tejido se observó ligeramente dañado se pudo apreciar que
estuvo formado por células parenquimáticas. En algunas células se observó
parte de la pared secundaria y también se presentaron secciones de tejido que
mostraban parte del explante original.
Finalmente, en los callos generados con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en
oscuridad constante (Figura 5B) se observó que en el tejido predominaban las
células parenquimáticas alargadas en una zona, pero en otra zona fueron más
redondas con indicios de rediferenciación a través de los elementos traqueales de
novo dispersos en ciertas áreas del tejido.
39
de I
dura
40
ET = Elementos Traqueales
HV = Haz Vascular
IN = Inclusiones
PP = Pared Primaria
PS = Pared Secundaria
Fig
. in
nte
A
ura 4. Aspectos diversos de la estructura de callos generados a partir de hipoc
trapilosa cultivados in vitro en condiciones de luz constante (18 µmol m-2
45 días: (A): ANA, 18.09 µmol y (B) ANA 13.57 µmol + Cin 1.11 µmol.
A
A
B
Bótilo
s-1)
Estas observaciones concuerdan con lo observado por Gómez (2003), ya que en
este trabajo, al hacer el estudio anatómico comparativo de explantes de I.
murucoides expuestos a diferentes auxinas (ANA, AIA y 2,4-D) a la concentración
de 13.57 µM y a luz constante, observó que los explantes mostraron cambios
estructurales a partir del séptimo día. A la segunda semana, aún se observaban
restos del explante original con grandes espacios intercelulares y células
meristemáticas y a partir de la cuarta semana, además, se observaron grupos de
células con inclusiones y revascularización de los cultivos.
Asimismo, Vera (2005) al realizar el análisis comparativo de toxicidad a S.
frugiperda y el aspecto anatómico entre diferentes explantes de I. murucoides
expuestos a diferentes reguladores de crecimiento y fotoperiodo de 16 horas luz a
los 30, 60 y 90 días de cultivo, observó que en el explante de hipocotilo cultivado
en ANA 13.57 µM durante 30 días, el tejido aún conservaba rastros del explante
original ya que al exterior se distinguía la epidermis adaxial unistratificada seguida
de parénquima en empalizada.
Al interior del tejido hubo grupos de células parenquimáticas con espacios
intercelulares en los que se observaron muy pocos cloroplastos; cabe señalar que
el extracto clorofórmico de este tratamiento, fue el que produjo la mayor reducción
de peso en larvas neonatas del insecto plaga mencionado.
En el caso de los callos de 60 días cultivados en ANA 4.52 µM, Vera (2005)
menciona que el tejido estuvo formado por células parenquimáticas con algunas
zonas meristemoides. Al evaluar la actividad insecticida de los extractos
obtenidos de los callos generados entre las diferentes condiciones de explante,
auxina y concentración, el extracto hexánico de este tratamiento, fue el que menor
actividad mostró. Respecto al establecimiento de alguna relación entre la
morfología de callo y la actividad insecticida no se observó algún patrón de
organización del tejido único, por lo que no fue posible establecer alguna relación
morfología-actividad en los tratamientos ensayados.
41
Figura 5. Aspectos diversos de la estructura de callos generados a partir de hipocótilo de I. intrapilosa cultivados in vitro en condiciones de oscuridad constante (18 µmol m-2 s-1) durante 45 días: (A): ANA, 18.09 µmol y (B) ANA 13.57 µmol + Cin 1.11 µmol.
42
8. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos muestran que I. intrapilosa, es una especie vegetal
que puede responder con la misma eficiencia a la formación de callo durante su
cultivo in vitro en condiciones de luz y oscuridad constante, cuando se utiliza
medio MS adicionado con el regulador de crecimiento vegetal ANA 18.09 y ANA
13.57+ cin 1.1 µM.
La producción de los compuestos solubles en metanol durante el cultivo in
vitro de I. intrapilosa en medio MS adicionado con ANA 13.57+ cin 1.1µM se ve
fuertemente incrementado cuando el cultivo se mantiene en condiciones de
oscuridad.
Si bien en un tratamiento es posible observar un haz vascular como
reminiscencia del explante original y en otros formación incipiente de elementos
traqueales, el aspecto general interno de los callos cultivados en condiciones de
luz y oscuridad constante con los tratamientos hormonales ANA 18.09 y ANA
13.57+ cin 1.1 µM, es el de tejido desdiferenciado formado básicamente por
células parenquimáticas.
La producción de biomasa y el aspecto morfológico externo de los callos
generados (verdes/albinos, friables/compactos) se ven afectados por el tipo de
regulador de crecimiento empleado (ANA / ANA-cinetina) y por la condición de luz
y oscuridad constante empleada durante el cultivo in vitro de I. intrapilosa.
Aunque el aspecto morfológico externo de los callos crecidos en
condiciones de luz y oscuridad constante no presenten una diferencia clara en lo
que a estructura se refiere, la actividad biológica insecticida se mantiene con una
alta probabilidad de contar con productos novedosos que puedan ser originados
bajo las diferentes condiciones de obtención e incubación de callos de I.
intrapilosa.
43
9.0 PERSPECTIVAS
En este trabajo se observó que se mantiene la capacidad de síntesis de los
compuestos con la actividad insecticida de I. intrapilosa. Sin embargo, dado que
no se conoce la naturaleza química de los compuestos, su concentración ni su
proporción con respecto a otros compuestos, es de gran interés conocer la
estructura de estos compuestos, para posteriormente determinar si existe algún
cambio en la síntesis de estos compuestos bajo diferentes condiciones de
reguladores de crecimiento vegetal y de exposición a luz.
También es deseable probar otras combinaciones hormonales, cultivo en
suspensión y elicitadores, con el fin de optimizar la producción de biomasa y de
los compuestos de interés en los cultivos.
Es de interés hacer un seguimiento histológico de los eventos morfogénicos
que se suceden durante el proceso de desdiferenciación y rediferenciación de los
explantes originales y encontrar la posible relación de estructura-capacidad
sintética del tejido.
Hacer evaluaciones de toxicidad con otras especies de insectos plaga que
permitan ampliar el espectro de acción de los compuestos, así como con otras
especies de insectos no plaga para determinar la inocuidad de los compuestos en
especies no blanco.
44
10. LITERATURA CITADA
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11. APÉNDICES.
I.- Soluciones para la preparación de medio Murashigue y Skoog (MS)
► Sol. A, aforar a 500 ml con agua destilada estéril (25 ml/ l de medio).
REACTIVO FÓRMULA QUÍMICA CANTIDAD (g) Nitrato de amonio NH4NO3 33.00 Nitrato de potasio KNO3 38.00 Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 7.40 Sulfato de potasio KH2PO4 3.40
► Sol B, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (5 ml/ l de medio).
Cloruro de calcio CaCl2H2O 8.8
► Sol. C, en 50 ml de agua destilada estéril tibia disolver el sulfato ferroso, por
separado disolver en 50 ml de agua destilada estéril el EDTA, vaciar lentamente la
sol. de EDTA sobre el sulfato ferroso en agitación (2 ml/ l de medio).
Sulfato de ferroso FeSO4 1.39 Sulfato de potasio NaFe2EDTA 1.86
► Sol. D, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (1 ml/ l de medio).
Sulfato manganoso MnSO4H2O 2.23 Sulfato de Zinc ZnSO47H2O 0.86 Ácido bórico H3.BO3 0.62 Ioduro de potasio KI 0.083
► Sol. Vitamínica, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (1 ml/ l de medio).
Ácido nicotínico 0.1 Piridoxina-HCl 0.1 Tiamina 1 Glicina 0.2
► Mio-inositol (1.0 g) aforar a 100 ml de agua destilada estéril (10 ml/ l de medio).
► Sacarosa, 30 g/ l, ajustar pH= 5.7
► Fitagel 3.8 g/ l de medio,
54
II. Dieta para Spodoptera frugiperda
Ingredientes para preparar un litro de dieta:
Ingredientes Cantidad Harina de soya 71.1 g Germen de trigo 31.7 g Sales Wesson 10.6 g Sacarosa 13 g Metil-paraben 1.6 g Ácido sórbico 1.0 g Ácido ascórbico 4.3 g Agar 14 g Sol. Vitamínica 3.5 ml Sol. Ácido acético (25%) 12 ml Sol. Formalina (10%) 4.4 ml Sol. Cloruro de colina (15%) 7.3 ml Agua destilada 1000 ml
Ingredientes para prepara sol. vitamínica, aforar a 35 ml con agua destilada:
Ingredientes Cantidad (g) Pantotenato de calcio 0.42 Niacinamida 2.31 Riboflavina 0.105 Ácido fólico 0.0525 Tiamina 0.0525 Biotina 0.0042 Vitamina B12 (Axofor Plus) 0.875 ml
Licuar los ingredientes secos (excepto el agar, el cual se disuelve en 500 ml
de agua destilada caliente, dejar hervir por espacio de 5 minutos a temperatura
baja) en 500 ml de agua destilada, posteriormente agregar las vitaminas y las
55
demás soluciones, al final vaciar el agar caliente, una vez bien incorporados todos
los ingredientes se puede vaciar en moldes.
III. Fijación de tejidos
► Paraglutaraldehido, aforar a 250 ml con buffer de fosfatos
Sol. paraformaldehido al 1.5 % pH=7.2 37.5 ml
Sol. glutaraldehido al 3% 15.0 ml
Buffer de fosfatos 197.5 ml
Sacarosa 2.0 g
► Buffer de fosfatos, ajustar pH=7.2
Fosfato de sodio dibásico (2.37 g / 200 ml) 72.6 ml
Fosfato de sodio monobásico (1.816 g/ 200 ml) 27.4 ml
► Deshidratación e Inclusión
● Serie de alcoholes
Etanol 30 % 1 hora Etanol 50 % 1 hora Etanol 70 % 1 hora Etanol 80 % 1 hora Etanol 90 % 1 hora Etanol 100 % 1 hora Etanol 100 % 1 hora
● Serie Etanol: Xilol
4:1 24 horas 3:2 24 horas 1:3 24 horas Xilol absoluto 5 minutos
● Serie Xilol: Paraplast
3:1 48 horas en estufa a 60 ªC 2:2 48 horas en estufa a 60 ªC 1:3 48 horas en estufa a 60 ªC Paraplast 15 días en estufa a 60 ªC
● Incluir en Paraplast 100%
56
IV. Tinción con azul de toluidina
Xilol 100 % 10 min Xilol 100 % 10 min Etanol absoluto 5-10 min Etanol 96 % 10 min Etanol 70 % 10 min Etanol 50 % 10 min Etanol 30 % 10 min Etanol 10 % 10 min Teñir con azul de toluidina aprox. 30 seg Enjuagar el exceso de colorante con agua destilada Etanol 10 % meter y sacar rápido Etanol 30 % meter y sacar rápido Etanol 50 % meter y sacar rápido Etanol 70 % meter y sacar rápido Etanol 96 % meter y sacar rápido Etanol 100 % meter y sacar rápido Xilol 100% meter y sacar rápido Montar en Entellan Eng. 2(1):29-48.
57