Instituto Politécnico Nacionaltesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/4414/1/... · 2018-05-28 ·...

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

POSGRADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS

EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO Y LA

ADICIÓN DE SALES DE CALCIO Y/O MAGNESIO

EN LA PRODUCCIÒN DE NARINGINASA POR MEDIO DE

Aspergillus niger

TESIS

Que para obtener el grado de

Maestra en Ciencias de los Alimentos

P R E S E N T A

Q. A. RAQUEL GONZÁLEZ VÁZQUEZ

MÉXICO, D.F. 2009

Instituto Politécnico Nacional

El trabajo experimental se realizó en el laboratorio de Tecnología de

alimentos y en el laboratorio de enzimología del departamento de

Graduados en alimentos de la Escuela. Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.

Fue dirigido por la Dra. Yadira Rivera Espinoza y por la M. en C.

Teresa Cruz y Victoria, con el financiamiento de los proyectos SIP

20070396 y 20080285 ambos titulados: “Producción de naringinasa

mediante la fermentación de diferentes fuentes de carbono por medio

de hongos filamentosos”.

Agradezco a CONACyT, institución que me apoyó económicamente.

Siendo becaria de enero 2006 a diciembre 2008, con número de

registro 217266/206844.

Agradezco al programa de formación de investigadores PIFI del IPN

ya que me apoyó económicamente. Siendo becaria en los periodos

correspondientes a partir de enero 2006 y hasta diciembre 2008.

INDICE GENERAL

Resumen………………………………………………………………………… 1

Abstrac…………………………………………………………………………... 2

Introducción…………………………………………………………………….. 3-5

II Antecedentes……………………………………………………………….... 6 –27

II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos................ 6

II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos.............. 6-7

II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.............................. 8

II. 2.Métodos fisicoquímicos del sabor amargo en los jugos de frutas

cítricas..........................................................................................................

8-9

II. 3. Método enzimático para la eliminación del amargor............................ 10-11

II. 4. Producción de naringinasa.................................................................. 12

II. 4.1. Características del género Aspergillus............................................. 12-13

II. 5. Factores que influyen en la producción de naringinasa...................... 13-14

II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa................................................... 14-15

II. 7. Actividad enzimática y constantes de Km y Vmáx reportadas para la

naringinasa..................................................................................................

15-16

II. 8. Métodos para determinar la actividad enzimática de la naringinasa... 17-18

II. 8.1 Modelos gráficos para la determinación de la actividad enzimática.. 18-19

II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten.......................................................... 19-20

II 8.1.1.1 Determinación de las contantes de Michaelis–Menten................ 20-22

II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk........................................................... 23

II 8.1.2.1Determinación de las contantes de Lineweaber-Burk................... 23-24

II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen............................................................. 24-25

II 8.1.3.1. Determinación de contantes de Eadie-Hofsteen......................... 25-26

II 8.1.4. Modelo de Agustinson.................................................................... 26-27

II 8.1.5 Modelo de Wilkinson........................................................................ 27-28

Justificación............................................................................................... 29

Objetivos..................................................................................................... 30

III. Materiales y métodos........................................................................... 31-45

III.1 Desarrollo experimental........................................................................ 31

III.2 Materias primas.................................................................................... 32

III.3 Material de laboratorio y reactivos........................................................ 32

III.4 Equipo................................................................................................. 32

III.5 Métodos................................................................................................ 33-39

III.5.1 Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa

de la cepa Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en

capa fina......................................................................................................

33-34

III.5.1.1 Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia

por capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de

naranja en cromatografía en capa fina........................................................

34-36

III.5.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

inclinado.......................................................................................................

36

III.5.3 Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria........ 36-37

III.5.4 Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de

A. niger utilizando como base un caldo nutritivo.........................................

37-39

III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

carbono........................................................................................................

39

III.6 Métodos analíticos................................................................................ 40-45

III.6.1 Determinación de proteína en el medio de cultivo............................. 40

III.6.1.1 Preparación del reactivo de Bradford............................................ 40

III.6.1.2 Patrón de albúmina sérica bobina (ASB)........................................ 40-41

III.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa

comercial de Penicillium decumbens...........................................................

41

III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de

Penicillium decumbens en la hidrólisis de naringina...................................

42

III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la

naringina por la naringinasa de Penicillium decumbens..............................

42-43

III.6.2.3 Curva tipo de naringina................................................................... 43

III.6.2.4 Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la

naringinasa de P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-

Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson..........

43-44

III.6.3 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por

A. niger en muestras de la fermentación de cada formulación....................

44

III.6.4 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por

A. niger del caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el

estudio anterior............................................................................................

44-45

III.6.5 Análisis estadístico para determinar la confiabilidad de los

resultados obtenidos por medio del programa estadístico MINITAB13.......

45

IV. Resultados y discusión....................................................................... 46-84

IV.1 Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.....

46-57

IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra

de naringina pura en cromatografía en capa fina........................................

46-49

IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la

naringina presente en el jugo de naranja en cromatografía en capa fina....

49-51

IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina

pura y la naringina presente en las naranjas en cromatografía en capa

fina...............................................................................................................

51-52

IV.1.4 Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa

producida por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en

naranjas.......................................................................................................

52-57

IV.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo

inclinado.......................................................................................................

58

IV.3 Fermentaciones.................................................................................... 60-61

IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de

carbono........................................................................................................

60

IV.4 Determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de

Bradford.......................................................................................................

62-68

IV.5 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en

muestras de cada fermentación...................................................................

69

IV.6 Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado.... 76-84

V. Conclusiones......................................................................................... 85-86

VI. Bibliografía............................................................................................ 87-97

Anexos........................................................................................................ 98-111

Anexo 1. Curva tipo de proteína obtenida por el método de Bradford........ 98

Anexo 2. Estudio y determinación de la actividad enzimática de la

naringinasa comercial de Penicillium decumbens.......................................

99-102

Anexo 3. Curva tipo de naringina................................................................ 103-104

Anexo 4. Curva tipo de glucosa.................................................................. 105

Anexo 5. Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la

naringinasa de P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-

Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson..........

106-111

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de

una muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina...................

35

Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor

de elución de la naringina presente en el jugo de naranja..........................

35

Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor

de elución de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de

naranja en una misma placa cromatográfica...............................................

36

Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo

empleado en cada fermentación..................................................................

37

Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada

fermentación y al cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales

de calcio y magnesio...................................................................................

38

Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del

microorganismo y producción de naringinasa por A. niger..........................

39

Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación

de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford....................

41

Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) en

cromatografía en capa fina..........................................................................

46

Cuadro 9. Máximos de producción de proteína en la producción de

naringinasa por medio de A. niger...............................................................

65

Cuadro 10. Comparativo de los máximos de producción de proteína

significativos (p≤0.05) en la producción de naringinasa mediante

diferentes fuentes de carbono por medio de A. niger..................................

67

Cuadro 11. Máximos encontrados de actividad enzimática en la

producción de naringinasa por medio de A. niger (No diferencia

significativa).................................................................................................

73

Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática

significativos (p≤0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes

fuentes de carbono por medio de A. niger...................................................

74

Cuadro 13. Actividad enzimática de la naringinasa producida por

diferentes microorganismos y determinada mediantes diferentes

sustratos......................................................................................................

78

Cuadro 14. Parámetros calculados para las curvas de Michaelis-

Menten, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa

de A.niger ATCC1015..................................................................................

81

Cuadro 15. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-

Menten, Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la

naringinasa de A. niger ATCC1015.............................................................

81

Cuadro 16. Constantes de Vmáx y Km para la naringinasa producida por

diferentes microorganismos.........................................................................

82

Cuadro 1A. Efecto de la concentración en la velocidad de hidrólisis de la

naringinasa de P. decumbens.....................................................................

99

Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina

por la naringinasa e P. decumbens..............................................................

101

Cuadro 3A. Curva tipo de naringina............................................................ 103

Cuadro 4A. Parámetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-

Hofsteen y Agustinson para la naringinasa de P. decumbens....................

106

Cuadro 5A. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-

Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para

la naringinasa de P. decumbens..................................................................

107

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Hidrólisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina

por la enzima naringinasa conteniendo actividad de α.-L-ramnosidasa y

β-D-glucosidasa...........................................................................................

11

Figura 2. Aspergillus niger. Conidióforo...................................................... 13

Figura 3. Aspergillus terreus. Conidióforo................................................... 13

Figura 4. Reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), (color amarillo)

por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico

(color rojo ladrillo)........................................................................................

18

Figura 5. Representación gráfica de la velocidad de reacción y

constantes de Vmáx y Km de Michaelis-Menten............................................

21

Figura 6. Representación gráfica de la doble recíproca de la velocidad

de reacción y constantes de Vmáx y Km para Lineweaberburk..................

24


constantes de Vmáx y Km de Eadie-Hofsteen............................................

25


constantes de Vmáx y Km de Agustinson.......................................................

27

Figura 9. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa,

proteína y determinación de la actividad enzimática de naringinasa

producida por A. niger ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de

carbono........................................................................................................

31

Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en

capa fina utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0)........................

47


capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62)...................

47


capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54).....

47


capa fina utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66).....

48


capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65)....

49

Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por

capilaridad en cromatografía en capa fina utilizando como disolvente

metanol 100% (Rf=0.645)............................................................................

50

Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por


metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67).................................................................

50

Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por


metanol: acetona 90:10 (Rf=0)....................................................................

50

Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por


metanol: acetona 80:20 (Rf=0.8).................................................................

51

Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona

80:20 (Rf=1).................................................................................................

52

Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100%

(Rf=0.86)......................................................................................................

52

Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona

80:20 (triplicado)..........................................................................................

53

Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger, metanol:

acetona 80:20 (triplicado)............................................................................

53


80:20 (triplicado)..........................................................................................

54



54


80:20 (triplicado)..........................................................................................

55



55


80:20 (triplicado)..........................................................................................

56



56


80:20 (triplicado)..........................................................................................

57



57

Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del

CINVESTAV.................................................................................................

58

Figura 32. Agar Saboraud........................................................................... 59

Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.. 59

Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.............................................................................................................

59

Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con

adición de CacO3 (▲) y melaza con adición de MgCO3 (■).........................

61

Figura 36. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la

fuente de carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger

ATCC1015. Tiempo de la fermentación en días(C).....................................

63

Figura 37. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones:

fuente de carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para

naringina, melaza y ramnosa y (C) la relación sales-días para

naringina......................................................................................................

64

Figura 38. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos

de glucosa producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las

diferentes fuentes de carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y

días..............................................................................................................

69

Figura 39. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones

fuente de carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-

días..............................................................................................................

72

Figura 40. (A)Curva de Michaelis –Menten para Naringinasa donde Y=

6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para

Naringinasa; (C) Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de

Eadie-Hofsteen para la naringinasa de A. niger ATCC1015.......................

80

Figura 1A. Curva tipo de proteína............................................................... 98

Figura 2A. Efecto de la concentración de la naringinasa de P.

decumbens en la hidrólisis de la naringina..................................................

100

Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina

por la naringinasa de P. decumbens...........................................................

102

Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921.......... 104

Figura 5A. Curva tipo de Azúcares reductores obtenida por el método

del ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS)............................................................

105

Figura 6A. Curva de Michaelis–Menten para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................

108

Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................

109

Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................

110

Figura 9A. Curva de Agustinson para naringinasa de Penicillium

decumbens..................................................................................................

111

________________________________________________________ RESUMEN

1

RESUMEN

El presente trabajo aporta información del efecto de la naringina, melaza o

ramnosa, como fuentes de carbono, y las sales de Ca2+ y/o Mg2+ en la producción

de naringinasa por medio de Aspegillus niger ATCC1015, el cual es un

microorganismo productor de ácido cítrico y no produce toxinas.

Primero se evaluó por cromatografía en capa fina la capacidad productora de

naringinasa por la cepa empleada, lo cual permitió conocer que el microorganismo

empleado tuviera presuntivamente la capacidad de producir naringinasa. Para

conocer el efecto de las diferentes fuentes de carbono de interés, se empleó un

caldo nutritivo base, adicionado con naringina, ramnosa o melaza, y/o sales de

calcio y magnesio. Las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas

condiciones de temperatura y agitación. Cada 24 horas durante los siete días de la

fermentación se cuantificó el peso del micelio, la producción de proteína y la

actividad enzimática de la naringinasa producida, además se determinó mediante

diferentes modelos gráficos las contantes de Vmáx y Km para la naringinasa que

mostró mayor actividad enzimática. Las constates de Vmáx y Km de la naringinasa

obtenida fueron comparadas contra las de la naringinasa comercial de Penicillium

decumbens, la cual también se determinó en este trabajo. A partir de las

investigaciones realizadas en la presente investigación se encontró que la melaza

y la adición de carbonato de calcio favorecieron significativamente el crecimiento

del microorganismo, pero no la producción de proteína y la actividad enzimática.

También se encontró que para favorecer la producción proteica se debe emplear

como fuente de carbono a la naringina y se debe adicionar la mezcla de las sales

de calcio y magnesio. Por otra parte, la fuente de carbono que permitió obtener

una mayor actividad enzimática fue la ramnosa sin adición de sales. Finalmente,

se encontró que la naringinasa producida bajo las condiciones de este trabajo

presenta la misma actividad específica que la naringinasa comercial, lo cual la

convierte en una enzima que puede competir con la enzima que se encuentra en

el mercado.

________________________________________________________________ ABSTRAC

2

ABSTRAC

The current document provides information to the effect of Naringin, Melase or

Rhamnose, as carbon sources, and salts as Ca2+ and Mg2+ in the production of

Naringinase through Aspegillus niger ATCC1015, which is a microorganism

producer of citric acid and produces no toxins.

First was assessed by thin layer chromatography, production capacity of

Naringinase by the strain used, this allowed knowing that the microorganism used

was allegedly capable of producing Naringinase. To study the effect of different

carbon sources of interest, was used a nutrient broth base, added whit

Naringinase, Rhamnose or Melase and/or calcium and magenisium salts.

Fermentations were carried out under the same conditions of temperature and

agitation. Every 24 hours during the seven days of fermentation the mycelium

weight was quantified, protein production and enzyme activity of produced

Naringinase, also was determined by different graphic models the constants of

Vmax and Km for Naringinase that showed higher enzyme activity. Constants

Vmax and Km from Naringinase obtained were compared against the commercial

Naringinase of Penicillium decumbens, wich is also found in this document. Based

on research conducted in this document found that Melase and the addition of

calcium carbonate, significantly favored the growth of microorganism, but not the

production of protein and enzyme activity. Was also found that to promote the

production of protein must be used as a carbon source the Naringin and addition of

Calcium and Magnesium salts mixture. Furthermore, the carbon source that

yielded a higher enzyme activity was the Rhamnose no added salts. Finally we

found that the Naringinase produced under the terms of this study, shows the

same specific activity that commercial Naringinase, which makes an enzyme that

can compete whit the commercial enzyme.

___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN

3

I. INTRODUCCIÓN

La implementación de enzimas, con aplicación en la industria de los alimentos, ha

aumentado en años recientes. Un ejemplo de esto son las glucanasas, utilizadas

en la panificación, la extracción y clarificación de jugos (Villena y Gutiérrez, 2003)

o las enzimas quimosina y pepsina, que forman el cuajo para la fabricación de

quesos, solo por mencionar algunas (Montes y Magaña, 2002; Manzanares y col,

1997).

La aplicación de enzimas en los alimentos presenta una serie de ventajas de

índole económica o tecnológica. La gran especificidad de acción que tienen las

enzimas hace que no se produzcan reacciones laterales imprevistas. Además, las

enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado

su misión, quedando entonces asimiladas el resto de las proteínas presentes en el

alimento (Montes y Magaña, 2002).

La naringinasa es una enzima que está siendo utilizada en la industria de los

alimentos con una aplicación importante en el proceso de desamargor en los jugos

de uva y otras frutas cítricas. La naringinasa es un complejo enzimático que

presenta actividad α-L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y β-D- glucosidasa

(EC.3.2.1.21) capaz de hidrolizar a la naringina, el cual es el mayor y principal

componente del amargor en jugos de uva y varias frutas cítricas (Thomas y col,

1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col, 1978). La naringina es

abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas maduras. Su

presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de los jugos de

frutas. La hidrólisis de la naringina produce naringenina la cual es insípida, lo cual

ayuda a la mejor aceptación de los jugos por la disminución de su amargor (Yusof

y col, 1990).

___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN

4

La información sobre la α-L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y su

producción ha sido asociada con plantas (Hall, 1938; Thomas y col, 1958, Ting,

1958; Kaji y Ichimi, 1973), gastrópodos marinos (Kurosawa y col, 1973), y

microorganismos (Manzanares y col, 199, Young y col, 1989; Shanmugam y

Yadav, 1995). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en

naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de

Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa

extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un

hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de

alimentos (Gallego y col, 1996).

Existe poca información disponible en cuanto a la producción de la naringinasa y

mucha información está guardada como secreto industrial o está patentada (Ito y

Takiguchi, 1970; Fukumoto y Okada, 1973; Wulbrandt y col, 1995). Algunos

reportes científicos ofrecen una información muy ambigua acerca de las

condiciones de producción de la naringinasa. Se ha reportado que la producción

de naringinasa mediante hongos filamentosos esta favorecida por los iones

metálicos como Ca2+ y Mg2+. Sin embargo, se ha encontrado que dichos iones no

son indispensables (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001). También se ha

reportado que la enzima es reprimida por la presencia de glucosa (Bram y

Salomons, 1965) lactato, citrato, sacarosa, fructosa y almidón (Munish y Uttam,

2000). Por otra parte se ha encontrado que la producción de la enzima disminuye

abajo de pH 4 y es estimulada en presencia de los sustratos naringina, ramnosa,

melaza (Munish y col, 2005; Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam,

2000).

La naringinasa de origen microbiano que existen actualmente en el mercado

presenta una eficacia muy deficiente de la hidrólisis de la naringina, por lo que es

necesario llevar a cabo estudios para conocer las condiciones de producción y

encontrar una enzima naringinasa que presente una mejor capacidad de hidrólisis.

___________________________________________________________ INTRODUCCIÓN

5

Por ello en este estudio se utilizarán diferentes fuentes de carbono y iones

metálicos para conocer su efecto en la producción de la enzima naringinasa y en

su capacidad de hidrólisis. Asimismo, se llevará a cabo una comparación de la

actividad de la naringinasa producida por Aspergillus niger (ATCC 1015), la cual

es una cepa principalmente productora de ácido cítrico, y la naringinasa comercial

pura (producida por Penicillum decumbens) para conocer si la enzima producida

por A. niger presenta mayor capacidad de hidrólisis que la enzima comercial.

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

6

II. ANTECEDENTES

II. 1. Enzimas alimentarias producidas por hongos filamentosos.

La aplicación de enzimas provenientes de especies de hongos filamentosos es

una constante en el desarrollo de alimentos. Muchos de ellos degradan polímeros

vegetales, que son los constituyentes de la pared celular (celulosa y hemicelulosa)

y tienen múltiples aplicaciones industriales como la mejora del filtrado de zumos, el

aumento de características organolépticas de ciertas bebidas alcohólicas o la

extracción de compuestos de interés nutricional desde residuos agroalimentarios

como es el caso de residuos de pescados para la obtención de proteasas,

coagulasas y peptonas de uso microbiológico (Fernandez, 2004). En condiciones

naturales la síntesis de estas enzimas se produce como respuesta a la presencia

de pequeñas cantidades de sustancias inductoras que generalmente son

monosacáridos producidos por la degradación de los polímeros asimilables. Estos

azúcares entran dentro de la célula fúngica a través de transportadores, pero si en

el medio hay otros azúcares monoméricos con alto valor nutricional (por ejemplo

glucosa) el microorganismo consume antes esta fuente de carbono que ejerce una

represión de la síntesis de las enzimas extracelulares (Lehninger, 1990).

II.1.1. Enzimas constitutivas e inducidas de los microorganismos.

Algunas enzimas pueden necesitarse en la misma cantidad durante todas las

condiciones de crecimiento y se denominan constitutivas. Las enzimas

constitutivas son generalmente enzimas celulares clave requeridas para el

crecimiento bajo todas las condiciones nutricionales y, por tanto, se sintetizan

continuamente en la célula en crecimiento. Por otra parte, las enzimas inducibles

son aquellas que se sintetizan solo cuando el sustrato que requiere se encuentra

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

7

presente en el medio de cultivo como única fuente de carbono y dicha sustancia

se conoce como inductor (Madigan y col, 2004).

Para movilizar los recursos de las fuentes complejas y que los microorganismos

puedan tener acceso a energía y nutrientes, estos producen enzimas que son

inducidas de acuerdo con los sustratos que estén presentes. Por ejemplo, la

adición de celulosa estimula la actividad de celulasa en suelos húmedos. (Shackle

y col, 2000) Lo que significa que la producción enzimática puede ser una

respuesta inducible a la presencia de sustratos complejos. Las enzimas

producidas bajo estas condiciones actúan catalizando la descomposición de los

sustratos complejos en compuestos asimilables. Sin embargo, los

microorganismos solo pueden producir estas enzimas a expensas del crecimiento

y metabolismo si la disponibilidad de nutrientes fácilmente asimilables es escasa

(Asmar y col., 1994; Sinsabaugh y Moorhead, 1994; Chróst, 1991; Pelletier y

Sygush, 1990; Koch, 1985; Harder y Dijkhuizen, 1983).

Sin embargo, aunque existen teorías razonables para explicar la producción

enzimática, la relación entre la producción enzimática y la adquisición de

nutrientes no han sido resueltas (Steven y Vitousek, 2005). Basada en la teoría

económica de los microorganismos (Koch, 1985), la producción enzimática puede

ser inducida sólo cuando esta permita aumentar el grado de adquisición de

recursos disponibles en el medio de crecimiento. Pero este efecto puede ser débil,

si: los sustratos nos están disponibles, los microorganismos no regularan

fuertemente la producción enzimática, o los costos enzimáticos son muy bajos

para permitir una continua producción. Es importante remarcar que la relación

entre la concentración enzimática y la degradación del sustrato es pobremente

comprendida para muchos compuestos de carbono. (Steven y Vitousek, 2005).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

8

II. 1.2. Enzimas extracelulares de los microorganismos.

Cada organismo produce una gran variedad de enzimas, muchas de las cuales

sólo se sintetizan en pequeñas cantidades y están implicadas en procesos

celulares. No obstante, algunas enzimas se producen en cantidades mucho más

grandes por algunos organismos y, en vez de quedarse en el interior de la célula,

se excretan al medio de cultivo. Las enzimas extracelulares son capaces de digerir

polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente,

los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se

utilizan como nutrientes para el crecimiento (Madigan y col, 2004). De acuerdo con

Steven y Vitousek, (2005), las enzimas extracelulares son el principal medio por el

cual microorganismos como los del suelo pueden tener acceso a energía y

nutrientes, a través de degradar compuestos orgánicos complejos en moléculas

pequeñas que pueden ser asimilables (Asmar y col, 1994; Sinsabaugh y

Moorhead, 1994).

II. 2.Métodos fisicoquímicos del sabor amargo en los jugos de frutas cítricas.

La naringina (4’,5,7’-trihidroxi-flavonona 7-ramnoglucosido), flavonoide de los

cítricos, es el mayor y principal componente del amargor en jugos de uva y varias

frutas cítricas (Thomas y col, 1958; Griffith, 1969; Dunlap y col, 1962; Ono y col,

1978). Es abundante en frutas inmaduras y su concentración decrece en frutas

maduras. Su presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de

los jugos de frutas. La concentración de naringina puede ser reducido por el

proceso tecnológico conocido como adsorción del amargor (Griffith, 1969; Jonson

y Chandler, 1988) ya sea por tratamientos químicos o físicos (Kimball, 1987;

Pritchet, 1957; Kimball, 1991; Puri, 1984; Shaw y Wilson, 1983; Wagner y col,

1991). Sin embargo, estas tecnologías tienen las siguientes limitaciones (Munish y

Uttam, 2000):

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

9

(1) EL jugo debe ser previamente desgrasado, desencerado, despulpado y luego

remezclado con el jugo al que se le eliminó el amargor y clarificado.

(2) Las columnas de adsorción empleadas son regeneradas usualmente con

solución alcalina diluida y esto puede afectar las propiedades organolépticas y

finalmente la calidad del jugo.

(3) Los tratamientos empleados pueden alterar la composición del jugo a través de

reacciones químicas o remoción de nutrientes, sabor, color, etc.

(4) Los tratamientos no son específicos, son intrínsecamente ineficientes, y ellos

introducen en cada etapa variaciones por no monitorizar los cambios.

(5) Los métodos de extracción y terminado afectan el rendimiento, calidad, y

características de los jugos de cítricos producidos.

Otro método aplicado en la eliminación del sabor amargo en los jugos es la

hidrólisis acida de la naringina. Sin embargo, este método produce no solo

ramnosa, glucosa y naringenina sino también aglicones (terpenol, terpeno-diol, 2-

fenil etanol o bencilalcohol) los cuales también confieren un sabor amargo (Gunata

y col, 1985), por lo tanto, no es un proceso comercialmente viable. Similarmente

bajo condiciones selectas de pH y temperatura, el carbón activado puede remover

completamente la naringina de una solución; sin embargo, de manera simultánea

se remueven algunos de los componentes deseables del sabor (Munish y Uttam,

2000).

Coghlan, en el 1997, describió un proceso cromatográfico de flujo radial para la

eliminación del amargor de los jugos de frutas. En comparación con la

cromatografía convencional, el sistema de flujo radial es más rápido y operable a

baja presión (Chisti, 1999). No obstante, el uso de una resina cromatográfica es un

proceso patentado (Coghlan, 1997).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

10

II. 3. Método enzimático para la eliminación del amargor.

La reducción del amargor como resultado de un proceso enzimático, controla la

calidad y mejora el valor comercial del jugo de uva y el de toronja como resultado

del mantenimiento de las propiedades saludables e incrementa la aceptación por

el consumidor (Gallego y col, 2001) y precisamente el uso de enzimas para este

proceso está incrementándose rápidamente ya que disminuye la contaminación

durante el proceso (Magindag, 1989).

El componente amargo en los jugos puede ser eliminado por la naringinasa

[obteniendo ambas actividades α-L-ramnosidasa (EC.3.2.1.40) y β-D-glucosidasa

(EC.3.2.1.21)] que hidroliza a la naringina (Yusof y col, 1990) en la insípida

naringenina (C15H12O5), (4’,5,7'-trihidrxiflavonona) (Vila Real y col, 2006).

La naringinasa puede hidrolizar a la naringina por su actividad de α-L-ramnosidasa

y β-glucosidasa en dos pasos. En primer lugar, el sustrato naringina es hidrolizado

por la ramnosidasa para producir prunina. En segundo lugar la prunina es

convertida al flavonoide naringenina por medio de la β-glucosidasa (Figura 1)

(Chandler y Nicol, 1975; Habelt y Pittner, 1983).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

11

Figura 1. Hidrólisis de la naringina en prunina, ramnosa y naringenina por la

enzima naringinasa conteniendo actividad de α-L-ramnosidasa y β-D-glucosidasa.

(Vila Real y col, 2006)

El proceso de eliminación del amargor vía enzimática de los jugos de frutas es

limitado debido a los siguientes factores

(1) El uso de enzimas es caro para los procesos en que se emplea un alto

volumen de jugo.

(2) La limonina actúa sinergistamente con la naringina incrementando el amargor,

y el contenido de limonina no es eliminado por la naringinasa.

(3) La disponibilidad de la tecnología de resinas de intercambio iónico neutral para

el proceso de eliminación del amargor y desacidificación en jugos de uva; y

(4) La poca eficiencia de las preparaciones de naringinasa para llevar a cabo la

hidrólisis completa de la naringina (Munishy Uttam, 2000).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

12

II. 4. Producción de naringinasa.

La información sobre la α-L-ramnosidasa de la naringinasa es limitada y está

relacionada con las semillas de Fagopyrum esculentum (Bourbouze y col, 1976),

las semillas de apio (Hall, 1938), las hojas de las uvas (Hall, 1938, Thomas y col,

1958, Ting, 1958), el hígado del gastrópodo marino Turbo cornutus (Kurosawa y

col, 1973), la planta patógena Corticium rolfssi (Kaji y Ichimi, 1973), el hongo

Aspergillus niger ( Manzanares y col, 1997) y Penicillium decubens ( Young y col,

1989), Cochiobolus miyabeanus (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizotonia solana (Ito y

Takiguchi, 1970), Phanopsis citri (Ito y Takiguchi, 1970), Rhizopus nigricans

(Shanmugam y Yadav, 1995) y la preparación comercial de “Naringinasa” (Roitner

y col, 1984b). Por razones de viabilidad, solo los procesos basados en

naringinasas microbianas son viables (Munish y Uttam, 2000). Tal es el caso de

Aspergillus niger quien es considerado como el mejor productor de naringinasa

extracelular (Kishi, 1955) y Aspergillus terreus quien es bien conocido como un

hongo productor eficiente de enzimas extracelulares de interés para la industria de

alimentos (Gallego y col, 1996). Por lo que se ha propuesto que el proceso de

eliminación del amargor puede ser más rentable si la producción industrial de la

naringinasa es a través del uso de microorganismos (Munish y Uttam, 2000). De

tal manera que

II. 4.1. Características del género Aspergillus.

El género Aspergillus fue descrito por primera vez por P. A. Micheli (1729)

(Madigan y col, 2004), que lo denominó con este nombre por su parecido con un

"aspergillum" (instrumento religioso utilizado para dispersar el agua bendita).

Las especies del género Aspergillus se encuentran ampliamente distribuidas en la

naturaleza pudiéndose aislar de una gran variedad de substratos. Gracias a la

facilidad de dispersión de sus conidios y a su pequeño tamaño, éstos pueden

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

13

permanecer en suspensión en el ambiente durante un largo periodo, por lo que el

hombre se encuentra expuesto constantemente a su inhalación.

El Aspergillus es un hongo filamentoso del grupo Deuteromycetes u Hongos

imperfectos, su aspecto microscópico es típico y se caracteriza por unas

estructuras esporíferas o reproductoras llamadas cabezas conidiales (Fig.2 y 3).

Estas cabezas están compuestas por una vesícula rodeada por una corona de

fiálides en forma de botella, en cuyo extremo se forman cadenetas de esporas.

Se conocen unas 900 especies del género Aspergillus. Rapper y Fennell los

clasifican en 18 grupos, basándose en su aspecto macroscópico y en las

características morfológicas de los conidióforos y fiálides.

Figura 2. Aspergillus niger. Figura 3. Aspergillus terreus.

Conidióforo. (Abarca, 2000) Conidióforo. (Abarca 2000)

II. 5. Factores que influyen en la producción de naringinasa.

En cuanto a la producción de la naringinasa tanto para A. niger, A. terreus y otras

especies de este género los iones metálicos como Ca2+, Mg2+ favorecen la

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

14

producción de dicha enzima, sin embargo, no son indispensables, (Munish y col,

2005; Gallego y col, 2001) también dicha enzima es reprimida por la presencia de

glucosa (Bram y Salomons, 1965), lactato, citrato, sacarosa , fructosa y almidón

(Munish y Uttam, 2000) así como también por Cd2+, Cu2+, Co2+, Fe2+,Hg2+, Mn2+,

Ni2+ tomando en cuenta que además Mn2+ y Fe2 inhiben el crecimiento del hongo.

Por otra parte la producción de la enzima disminuye abajo de pH 4 y es estimulada

en presencia de los sustratos naringina, ramnosa, melaza (Munish y col, 2005;

Gallego y col, 2001) y licor de maíz (Munish y Uttam, 2000). Es importante resaltar

que la producción de la naringinasa es dependiente del inductor. También se ha

reportado que la adición continua de pequeñas cantidades de naringina en un

cultivo por lote alimentado en un fermentador podría estimular una mayor

producción de la naringinasa que cuando se adiciona una alta cantidad de sustrato

al inicio de la fermentación (cultivo por lotes) (Bram y Salomons, 1965; Gallego y

col, 2001).

II. 6. Otras aplicaciones de la naringinasa.

La naringinasa ha sido empleada para la eliminación de cristales de hesperidín de

los jugos de naranja (Tereda y col, 1995), es utilizada en los procesos de jugo de

uva y naranja para el mejoramiento de lavado de la pulpa, incremento de la

recuperación y el rendimiento de aceites esenciales, para el proceso de

clarificación (Grassin y Fauquembergue, 1996), el mejoramiento del aroma del

vino (Caldini y col, 1994) y para preparaciones enzimáticas de productos

hidrolizados de glucósidos naturales (Roitnel y col, 1984b; Ellenrieder y col, 1998)

de importancia biotecnológica como: preparación de prunita (4’-5,7’–

trihidroxiflavonona-7-glucosido) flavonoide utilizado como agente endulzante para

diabéticos (Roitner y col, 1984ª), y preparación de naringenina (Vila Real y col,

2006). Recientemente, el interés en la enzima α-L-ramnosidasa ha sido enfocado

principalmente en su acción dirigida hacia los terpenilglicosidos para el desarrollo

del aroma en los jugos de uva y bebidas derivadas (Williams y col, 1982).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

15

Por otra parte, la naringinasa también tiene aplicaciones en la industria

farmacéutica como son: la preparación del antibiótico Cloropolysporin C (Sankyo,

1988), aplicación en transformaciones esteroidales (Munish y Uttam, 2000), en el

estudio de la estructura de plantas y polisacáridos de bacterias (Michon, 1987),

preparación de ramnosa como intermediario en síntesis orgánicas, utilizado como

farmacéutico y agente protector de plantas (Daniela y col, 1990) y preparación de

prunina, flavonoide con actividad antiinflamatoria (Roitner y col, 1984b).

II. 7. Actividad enzimática y constantes de Km y Vmáx reportadas para la

naringinasa.

Es importante tomar en cuenta que el grado de actividad de α-L-ramnosidasa y β-

D-glucosidasa varia con la concentración de proteína y el pH (Munish y Uttam,

2000). Además, cada microorganismo puede producir diferentes formas activas de

una enzima y estas se producen en diferente cantidad dependiendo de la fuente

de carbono.

La actividad que presenta la α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger

producida utilizando naringina como fuente de carbono, encontrada por

Manzanares y col, (1997) es de 0.059 μmol de ramnosa/min y presenta una Vmáx=

20.6 U/mg y una Km= 2.9 mM. Esta actividad es dependiente del pH en el intervalo

de 3 a 5 y presenta su máximo de actividad a un pH=4.5 a 30°C en regulador

MacIIvaine, utilizando como sustrato p-nitrofenol. Mutter y col, (1994) determinaron

una Vmáx= 13.0 U/mg para la α-L-ramnosidasa de A. aculeatus; Por otro lado

cuando Munish y col en el 2005, utilizaron ramnosa como fuente de carbono y

reportaron una actividad de 0.399 μIU/ml (IU=cantidad de enzima necesaria para

liberar 1μmol naringina/min, utilizando regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4,

T=30°C) para la naringinasa de A. niger MTCC 1344. Cuando se utilizó licor de

maíz y extracto de malta Bram y Solomons, (1965) encontraron una actividad de

94 U/ml y de 90U/ml para las naringinasas de de la cepa NRRL 72-4 (U=cantidad

de enzima necesaria para hidrolizar 1μmol naringina/min, utilizando regulador de

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

16

citratos sin molaridad especifica, pH=4, T=45°C). Por su parte, Caldini y col,

(1994) determinaron una Km= 2.32 mM y Kurosawa y col, (1973) determinaron una

Km= 2.65 mM para la α-L- ramnosidasa de A. niger utilizando p-nitrofenol, el cual

es un sustrato inespecífico.

Elinbaum y col, (2002) reportaron una actividad de 1.7 U/ml de solución nutritiva

(U=cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min, en regulador

de ácido. succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, T= 30°C, para la α-L-

ramnosidasa de A. terreus, producida utilizando bagazo de caña de azúcar como

fuente de carbono. Por otro lado Gallego y col, (2001) encontraron una actividad

de 91U/mg proteína para la misma enzima producida por A. terreus (U= cantidad

de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min), determinada en

regulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, T=50°C, utilizando ramnosa como fuente

de carbono y una Vmáx= 84 μmol/mg∙min y una Km= 0.17 mM (Michaelis)

En otras especies como Penicillium. decumbens se ha informado una actividad

para la naringinasa de 0.465U/g sólido determinada utilizando regulador de

acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, T=40°C; dicha naringinasa fue obtenida por

fermentación solida y presenta una Km= 1.22 mM y Vmáx= 0.45 μmol/min

(Lineweaberburk) (Gülten y col, 2006). Por su parte, Romero y col, (1985)

determinaron una Km= 1.52 mM y una Vmáx= 10.7 U /mg para la α-L-ramnosidasa

de Penicillium sp. Ting (1979) informó que la naringina presente en jugo de toronja

puede ser hidrolizada a partir de una preparación comercial de pectinasas,

mediante la cual se hidroliza la naringina en naringenina in vitro, cuando esta se

emplea en una concentración del 0.02% en regulador de citratos 0.005 mM a pH 4

y se somete a un tiempo de hidrólisis de 2hrs a 50°C, utilizando como patrón una

solución de naringina (Eastman Kodak ) en concentración de 50 mg/ 100ml y

obteniendo un 68% de hidrólisis; la hidrólisis fue determinada por el método de

Davis (1947).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

17

II. 8. Métodos para determinar la actividad enzimática de la naringinasa.

Para la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa hay pocos

procedimientos disponibles. Estos procedimientos están basados en la

determinación de flavonoides por medio de espectrofotometría de acuerdo al

método de Davis (1947) mediante el uso de dietilen glicol (Munish y Uttam, 2000).

La naringina reacciona con el reactivo para producir un color amarillo el cual es

medido a una longitud de onda de 420 nm. También se puede realizar esta

determinación mediante HPLC (Horuichi y col, 1985). El método de HPLC

determina la actividad de la enzima mediante la medida de los cambios en la

concentración de α-ramnosa. Romero y col, (1985) usaron p-nitrofenil-L-

ramnopiranosido para medir la actividad de la L-ramnosidasa de la naringinasa,

siguiendo colorimétricamente la aparición de p-nitrofenol (Munish y Uttam, 2000).

El ensayo de Davis es un método colorimétrico en el que se emplea dietilen glicol

alcalino para la determinación de ramnoglicosidos de naringina y otros

flavonoides que pueden estar presentes particularmente en la toronja y otras frutas

cítricas. A pesar de que el método de Davis no es especifico para la naringina, es

un método practico y rápido que es particularmente aplicado para la determinación

de naringina en jugo y en el flavedo de la toronja, para determinar la distribución

de falvononas en varios tejidos de frutas cítricas, para determinar la recuperación

de naringina pura adicionada a varias mezclas, para el seguimiento de la hidrólisis

de la naringina y para la determinación de la hesperidina en otras frutas cítricas.

La desventaja del método de Davis consiste en que si se encuentran compuestos

como el citral, furfural, geraniol y ácido ascórbico producen color cuando se

combinan con el dietilen glicol alcalino y muchas de las sustancias provenientes

de plantas dan colores amarillos cuando se mezclan con un álcali, lo cual ocasiona

interferencias (Davis, 1947).

Chaplin y Kennedy, (1968) informaron que, se puede utilizar un ensayo indirecto

para la determinación de la actividad de cualquier enzima que como producto de la

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

18

hidrolisis de su sustrato genere algún azúcar reductor como por ejemplo la glucosa

o la fructosa. Dicho ensayo indirecto consiste en una determinación

espectrofotométrica, tras la conversión del azúcar reductor producido en un

derivado coloreado, mediante el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el

cual se basa en la reducción del DNS (color amarillo) por la glucosa u otro azúcar

reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (color rojo ladrillo) (Figura 4), cuya

presencia puede detectarse por lectura de la absorbancia en la zona de 540-570

nm. La velocidad de la reacción se determina analizando la cantidad de azúcares

reductores formados por unidad de tiempo y la actividad enzimática se expresa

como actividad específica.

OH

OH

NNO

O

O

OH

OH

NH2

NO

O

CHO

OH

OH

OH

OH

CH2OH

O

O

O

OH

OH

OH

OH

CH2OH

COOH

+ +

ácido D-glucónicoácido 3-5-dinitrosalicílico (amarillo)

D-glucosa ácido 3-amino-5-nitrosalicílico

(rojo)

Figura 4. Reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), (color amarillo) por la

glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (color rojo ladrillo)

(Chaplin y Kennedy, 1968).

II. 8.1 Modelos gráficos para la determinación de la actividad enzimática.

Existen diferentes modelos gráficos para determinar la actividad enzimática como

son el modelo de Michael-Menten, el modelo de la doble reciproca de Lineweaber-

Burk, el modelo de Eadie-Hofsteen, el modelo de Agustinson y el modelo

estadístico de Wilkinson; estos modelos permiten seguir el curso de los

mecanismos catalíticos de las enzimas a través de determinaciones cinéticas de

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

19

las reacciones catalizadas enzimáticamente, que se expresan mediante dichos

modelos gráficos (Madigan y col, 2004).

II. 8.1.1 Modelo de Michaelis-Menten.

Leonor Michaelis y Maude Menten desarrollaron en 1913 una teoría general

acerca de la acción y cinética de las enzimas. Esta teoría, que es fundamental

para el análisis cuantitativo de todos los aspectos de la cinética de las enzimas y

de la inhibición, se ha desarrollado plenamente para el caso de una reacción en la

que sólo hay un sustrato. Dicha teoría es aplicable cuando la concentración del

sustrato es mayor que la concentración de la enzima, y cuando las condiciones

son de estado estacionario, o sea que la concentración del complejo enzima-

sustrato es constante (Voet y Voet, 2006; Madigan y col, 2004; Lehninger, 1990).

La teoría de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer

lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES (Reacción 1); a

continuación este último se escinde en una segunda etapa para formar una

enzima libre y un producto P (Reacción 2) (Madigan y col, 2004):

K+1

E+S ES (1)

K-1

K+2

ES E+P (2)

K-2

http://es.wikipedia.org/wiki/Sustrato_(bioqu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Estado_estacionario_(qu%C3%ADmica)&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

20

Las Reacciones 1 y 2 son reversibles; las constantes de velocidad para las

reacciones directa e inversa poseen un subíndice positivo y otro negativo,

respectivamente (Lehninger, 1990).

II 8.1.1.1 Determinación de las contantes de Michaelis–Menten.

Michaelis-Menten dedujeron la ecuación de la velocidad para una reacción de un

solo sustrato catalizada enzimáticamente (Ecuación 1); esta ecuación expresa la

relación matemática entre la velocidad inicial de una reacción catalizada por una

enzima (V0), la concentración del sustrato [S] y ciertas características de la

enzima. A demás esta ecuación relaciona la velocidad inicial, la velocidad máxima

(Vmáx) y la concentración inicial del sustrato a través de la constante de Michaelis-

Menten (Km) que expresa la afinidad de la enzima por el sustrato. En el término

Vmáx se encuentra contenida la concentración de la enzima (Lehninger, 1990).

V0= Vmáx [S]

Km + [S]

Ecuación 1.Ecuación de Michaelis-Menten de la velocidad de reacción

(Lehninger, 1990).

De la ecuación de Michaelis-Menten se deriva una relación numérica importante

en el caso especial en que la velocidad inicial de la reacción sea exactamente la

mitad de la velocidad máxima y a partir de la cual se puede calcular la velocidad

máxima de la reacción (Ecuación 2) (Figura 5).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

21

V0 = ½ Vmáx

Ecuación 2. Relación numérica entre la velocidad de reacción y la velocidad

máxima, derivada de la ecuación de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).

Figura 5. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de Vmáx

y Km de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).

A concentraciones de sustrato muy bajas la velocidad inicial (V0) es casi

proporcional a la concentración del sustrato [S]. A concentraciones de sustrato

muy elevadas la velocidad de la reacción se aproxima asintóticamente a la Vmáx

(Lehninger, 1990).

Al sustituir la ecuación 2 en la ecuación 1 y dividir por Vmáx se obtiene la Ecuación

3, mediante la cual se puede calcular la constante de Michaelis-Menten Km. Por

tanto, la contante de Michnaelis-Menten Km es igual a la concentración de sustrato

en la que la velocidad inicial de la reacción es la mitad de la velocidad máxima

(Figura 2).

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

22

Km= [S]

Ecuación 3.Ecuación de la constante de Michaelis-Menten (Lehninger, 1990).

Las dimensiones de Km para una reacción de un solo sustrato son moles por litro y

la constante es independiente de la concentración de la enzima. Puede obtenerse

con facilidad una aproximación al valor de Km a partir de una serie de

experimentos en los que la velocidad inicial de la reacción se mide a diferentes

concentraciones iniciales de sustrato con una concentración de enzima constante.

El valor aproximado de Km se obtiene gráficamente al representar la velocidad

inicial frente a la concentración inicial del sustrato (Figura 5); se obtiene una

hipérbola rectangular. La Km expresa la afinidad del complejo enzima-sustrato

(ES). Valores bajos indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y

raramente se disocia. Por tanto se obtendrá una Km según el sustrato específico

en que actúe cada enzima y las condiciones de reacción en que se realice las

mediciones (Lehninger, 1990).

La gráfica de velocidad de Michaelis-Menten mostrada anteriormente (Figura 5) no

es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va

curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada

de los métodos, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla,

podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmáx en las

gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus

esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten,

dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-

Hofstee.

http://es.wikipedia.org/wiki/Regresi%C3%B3n_no_lineal

http://es.wikipedia.org/wiki/Diagrama_de_Lineweaver-Burke

http://es.wikipedia.org/wiki/Diagrama_de_Eadie-Hofstee

http://es.wikipedia.org/wiki/Diagrama_de_Eadie-Hofstee

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

23

II 8.1.2. Modelo de Lineweaber-Burk.

La ecuación de Michaelis-Menten (Ecuación 1) puede transformarse

algebraicamente en otras formas que son más útiles para la expresión de los

datos experimentales. Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles

recíprocos de ambos miembros de la ecuación de Michaelis- Menten (Ecuación 4)

1 = Km + [S]

V0 Vmáx [S]

Ecuación 4.Ecuación de la doble reciproca de la ecuación de Michaelis-Menten

de la velocidad de reacción (Lehninger, 1990).

Redondeando y reduciendo la Ecuación 4 se obtiene la ecuación de Lineweaver-

Burk (Ecuación 5).

1 = Km 1_ + 1 _

V0 Vmáx [S] Vmáx

Ecuación 5.Ecuación de Lineweaver-Burk de la velocidad de reacción

(Lehninger, 1990).

II 8.1.2.1Determinación de las contantes de Lineweaber-Burk.

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar la Km y Vmáx; el

punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmáx, y el

de abscisas es el valor de -1/Km (Figura 6). Tal representación doble-recíproca

tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más exacta del valor de

Vmáx ya que la representación sencilla de V0 frente a [S] en la curva de Michaelis-

http://es.wikipedia.org/wiki/Eje_de_ordenadas

http://es.wikipedia.org/wiki/Eje_de_abscisas

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

24

Menten sólo se obtiene su valor aproximado puesto que es un valor límite a una

concentración del sustrato infinita.

Figura 6. Representación gráfica de la doble recíproca de la velocidad de reacción

y constantes de Vmáx y Km para Lineweaberburk (Lehninger, 1990).

El diagrama de Lineweaver-Burk (Figura 6) se emplea como herramienta gráfica

para calcular los parámetros cinéticos de una enzima, a demás puede

proporcionar también información valiosa acerca de la inhibición enzimática.

II 8.1.3. Modelo de Eadie-Hofsteen.

Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene

multiplicando ambos miembros de la ecuación de lineweaber-Burk (Ecuación 5)

por Vmáx y reordenándola se obtiene la ecuación de Eadie-Hofsteen.

http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

25

V0 = -Km V0 + Vmáx

[S]

Ecuación 6.Ecuación de Eadie-Hofsteen de la velocidad de reacción

(Lehninger, 1990).

II 8.1.3.1. Determinación de contantes de Eadie-Hofsteen.

La representación de V0 frente a V0/ [S] se conoce como la representación de

Eadie-Hofsteen (Figura 7). Donde V0 representa la velocidad de la reacción, Km es

la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentración del sustrato y Vmáx, es el

máximo de la velocidad de la reacción.

Figura 7. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de

Vmáx y Km de Eadie-Hofsteen (Lehninger, 1990).

El diagrama Eadie-Hofstee permite visualizar rápidamente los parámetros

cinéticos importantes como Km y Vmáx a la vez que está menos afectada por el

margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el

mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato

http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_de_Michaelis-Menten

http://es.wikipedia.org/wiki/Diagrama_de_Lineweaver-Burke

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

26

o de la velocidad de reacción. Una de las consecuencias de la aproximación de

Eadie-Hofstee es que tanto la variable en la ordenada como en la abscisa no son

independientes, sino que dependen de la velocidad de la reacción. De éste modo,

cualquier error experimental se encuentra presente en ambos ejes (Lehninger,

1990).

II 8.1.4. Modelo de Agustinson.

La representación de [S]/V0 frente a [S] (Figura 8) se conoce como la

representación de Agustinson (Figura 6). Donde V0 representa la velocidad de la

reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, [S] es la concentración del

sustrato y Vmáx, es el máximo de la velocidad de la reacción. La ecuación 7

muestra la expresión matemática empleada en este modelo para la determinación

de las constantes cinéticas de Vmáx y Km.

[S] = 1 [S] + Km

V Vmáx Vmáx

Ecuación 7.Ecuación de Agustinson de la velocidad de reacción

(Lehninger, 1990).

http://es.wikipedia.org/wiki/Ordenada

http://es.wikipedia.org/wiki/Abscisa

http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_de_Michaelis-Menten

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

27

Figura 8. Representación gráfica de la velocidad de reacción y constantes de Vmáx

y Km de Agustinson (Lehninger, 1990).

II 8.1.5 Modelo de Wilkinson.

La estimación de los parámetros cinéticos Vmáx y Km por el método de Michaelis-

Menten y por otros métodos como el de la doble reciproca de Lineweaver-Burk no

emplean cálculos estadísticos. Los métodos gráficos frecuentemente no proveen

ninguna medida de precisión de la determinación, lo que es necesario para una

evaluación adecuada de los resultados en relación a consideraciones teórica o

para la comparación de los resultados obtenidos bajo diferentes condiciones

experimentales.

El modelo de Wilkinson, a diferencia de los otros modelos, emplea herramientas

estadísticas para la estimación de los parámetros cinéticos de Vmáx y Km. El

principal propósito de este modelo es suministrar estimaciones más exactas y

precisas de la Vmáx y la Km mediante cálculos matemáticos y haciendo uso de las

_________________________________________________________ ANTECEDENTES

28

herramientas estadísticas como la desviación estándar y del error estándar

(Wilkinson, 1960).

____________________________________________________________ JUSTIFICACIÓN

29

JUSTIFICACIÓN

El uso de naringinasa para la disminución del amargor de los jugos de frutas

cítricas es un proceso que ofrece numerosas ventajas, comparado con los

métodos fisicoquímicos que antiguamente se empleaban; y este proceso es más

rentable si se utiliza naringinasa de origen microbiano, especialmente de hongos

filamentosos del genero Aspergillus. Es un nicho que necesita ser explorado ya

que no existe suficiente información sobre los detalles en el proceso de obtención

de esta enzima. Mucha de la información está patentada o existe como secreto

industrial.

Además, es menester decir que las enzimas de origen microbiano que existen

actualmente en el mercado presentan una eficacia muy deficiente de la hidrólisis

de la naringina, por lo que es necesario hacer más estudios con hongos del

género Aspergillus con la finalidad de evaluar la capacidad de producción de

naringinasa por la cepa empleada, comparar la producción de naringinasa

utilizando diferentes fuentes de carbono y factores que se ha informado que en

ciertas cepas favorecen su producción, comparar la actividad de la naringinasa

producida contra la actividad de una naringinasa comercial y contribuir en la

generación del conocimiento que conlleve al mejoramiento del desarrollo

tecnológico.

________________________________________________________________ OJETIVOS

30

OBJETIVOS

Objetivo general

Estudiar el efecto de diferentes fuentes de carbono y las sales de calcio y

magnesio en la producción de naringinasa por medio de Aspergillus niger ATCC

1015.

Objetivos particulares:

Evaluar mediante una prueba presuntiva si la cepa de Aspergillus niger

empleada tiene la capacidad de producir naringinasa.

Estudiar el efecto de la fuente de carbono (ramnosa, naringina y melaza en

la producción de naringinasa por Aspergillus niger

Determinar el efecto de sales de CaCO3 y MgCO3 en el crecimiento del

microorganismo, la producción de naringinasa y la producción de proteína

durante la fermentación.

Cuantificar la actividad enzimática de la naringinasa sobre la hidrólisis de la

narigina in vitro mediante la determinación de los productos de la hidrólisis

de esta por el método del DNS.

___________________________________________________ MATERIALES Y MÉTODOS

31

III. MATERIALES Y MÉTODOS III.1 Desarrollo experimental.

Figura 9. Diagrama de proceso para la producción de naringinasa, proteína y

determinación de la actividad enzimática de naringinasa producida por A. niger

ATCC1015 utilizando diferentes fuentes de carbono.

Preparación del inóculo

Fermentación Crecimiento del microorganismo en diferentes sustratos

Ramnosa Naringina Melaza

Identificación de la enzima

id

Proteína

id

Método Bradford

id

Determinación de la Vmáx, Km

id

Prueba preliminar de la capacidad productora de naringinasa por la cepa

CaCO3 y/o MgCO3

Actividad

enzimática

id

Aspergillus niger ATCC 1015


32

III.2 Materias primas.

1. Naringinasa de Penicillium decumbens (Sigma)

2. Naringina (Sigma)

3. Ramnosa (BDDIFCO)

4. Melaza (Ingenio San Miguelito, Córdoba, Ver.)

5. Glucosa (Sigma)

6. Medio de cultivo Agar Saboraud (BDDIFCO)

7. Extracto de malta (BDDIFCO)

Microorganismo

Aspergillus niger ATCC 1015 obtenido de Colección Nacional de Cepas

Microbianas y Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios

Avanzados (CINVESTAV) y mantenidas a 5ºC en agar papa dextrosa. Este

microorganismo esta reportado como productor de ácido cítrico y antígenos

(CDBB: 177).

III.3 Material de laboratorio y reactivos. Ácido ortofosfórico (Baker), acido 3,5-dns (Baker), agujas de jeringa (plastipack),

agua destilada-desionizada, agar maltosa de sabouraud (BDDIFCO), albúmina

sérica bobina (bsa), azul de comassie-g (Baker), cajas petri, cloroformo.

III.4 Equipo. Balanza analítica (Ohaus, Explorer® Po), baño metabólico (Shaker, G25), baño

maría (BM), centrifuga ALC4239R, espectrofotómetro visible-UV (Termo

Spectronic, Genesys 20), fotocolorímetro (Klett- Summerson), horno (American),

autoclave, parrilla de calentamiento (Termolyne, HP-A1915B), vortex (Daigger,

Vortex Genie 2).


33

III.5 Métodos.

III.5.1 Evaluación preliminar de la capacidad productora de naringinasa de la cepa

Aspergillus niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.

Para conocer si la cepa empleada tenía la capacidad de producir naringinasa, se

utilizaron muestras de jugo de dos lotes de naranjas verdes, un lote sin inocular y

otro inoculado por picadura con Aspergillus niger ATCC 1015, con la finalidad de

evaluar la presencia de naringina en el jugo y la hidrolisis de esta por medio de la

enzima producida por el microorganismo inoculado.

Las muestras de jugo de cada lote fueron tomadas cada 24h y en el caso del lote

de naranjas inoculadas las muestras fueron tomadas del punto de inoculación

debido a que el microorganismo no alcanza a colonizar toda la naranja en 24h. El

lote sin inocular sirvió como control para determinar que, la hidrólisis de la

naringina no fuera efecto de la maduración de la naranja.

Para dar seguimiento a la presencia o ausencia de naringina se utilizó la técnica

de cromatografía en capa fina, para lo cual se cortaron placas cromatográficas de

5 x 2 cm de largo y ancho respectivamente, a las que, se les aplicó una gota de la

muestra problema (naringina pura o jugo de naranja) a una distancia de 0.5 cm del

inicio de la placa cromatográfica (punto de aplicación). Cada placa cromatográfica

con la muestra previamente aplicada, se introdujo en una cámara de vidrio que

contenía 2 mL de disolvente aproximadamente. La muestra aplicada en la placa

ascendió por capilaridad utilizando diferentes disolventes.

Después de que la muestra ascendió por capilaridad y el disolvente recorrió una

distancia de hasta 0.5 cm antes del final de la placa cromatográfica, se sacó la

placa de la cámara de vidrio y se dejó evaporar al ambiente el disolvente que ésta

había absorbido.


34

Para observar la distancia recorrida por las muestras a lo largo de la placa, se

utilizó una lámpara de luz ultravioleta de longitud corta (253 nm) y una de longitud

larga (350 nm), las manchas observadas fueron marcadas con lápiz.

Posteriormente se le aplicó con ayuda de un algodón y unas pinzas sulfato sérico

amoniacal que sirvió como revelador cuando se sometió la placa con el sulfato

sérico amoniacal a calentamiento mediante de una parrilla por 1 min

aproximadamente. El experimento se realizó por triplicado.

III.5.1.1 Determinación del mejor disolvente que permite la ascendencia por

capilaridad de la naringina pura y la naringina presente en el jugo de naranja en

cromatografía en capa fina.

En primer lugar se empleó una muestra de naringina pura (N) que se empleó

como patrón de comparación en una concentración de 50 mg/1000ml, para poder

hacer los experimentos que permitieran conocer si la cepa empleada tenía

capacidad de producir naringinasa. Por ello se evaluaron las mezclas de

disolventes presentes el Cuadro 1.

La elección del disolvente que permitió la mejor elución de la naringina en

cromatografía en capa fina se realizó en base a los Rf (factor de elución de un

compuesto en una placa cromatográfica) calculados para cada placa

cromatográfica, es decir para cada muestra de naringina eluída utilizando

diferentes disolventes.

El Rf expresa la posición de un compuesto sobre la placa cromatográfica como

una fracción decimal; el máximo Rf es 1 y a mayor Rf mejor factor de elución. El Rf

fue calculado dividiendo la distancia que recorrió la muestra en la placa

cromatográfica entre la distancia que recorrió el disolvente.


35

Cuadro 1. Disolventes utilizados para determinar el factor de elución de una

muestra de naringina pura en cromatografía en capa fina.

Disolvente / Concentración %

hexano / 100

acetato / 100

hexano: acetato de etilo / 80:20

acetato de etilo: hexano / 80:20

metanol: acetato de etilo / 80:20

metanol / 100.

acetona / 100

metanol: acetona / 95:5



Además se utilizaron diferentes disolvente o mezcla de disolventes para conocer

la elución de la naringina presente en el jugo de naranja (n) en una placa

cromatográfica las cuales se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución

de la naringina presente en el jugo de naranja.


metanol / 100

acetona / 100





36

Se buscó el mejor sistema de elución tanto para la naringina pura (N) como para la

naringina presente en el jugo de naranja (n). Para ello se evaluaron las mezclas de

disolventes presentes en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Disolventes y proporción utilizados para determinar el factor de elución

de la naringina pura y de la naringina presente en el jugo de naranja en una misma

placa cromatográfica.

III.5.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.

La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del Cinvestav) se

adquirió en tubos de ensaye en agar papa dextrosa, por lo que fue resembrada

para obtener una cantidad suficiente para que pudiera emplearse en las

fermentaciones a realizar (Díaz y col, 1998).

III.5.3 Preparación del inóculo de A. niger por medio de turbidimetria.

Para la obtención del inóculo a emplear en cada fermentación se preparó para

cada ensayo y en el momento del inicio de la fermentación una solución que

contenía 900 x 106 esporas/ mL por medio de turbidimetria utilizando una escala


metanol / 100



37

de MacFarland previamente preparada como se muestra en el Cuadro 4 (Díaz y

col, 1998).

Cuadro 4. Escala Macfarland empleada para calcular el inoculo empleado en cada

fermentación.

El renglón sombreado indica la cantidad de inóculo empleado.

III.5.4 Fermentaciones para la producción de naringinasa por medio de A. niger

utilizando como base un caldo nutritivo.

Se utilizó Aspergillus niger ATCC 1015 en una concentración 900 x 106

esporas/mL. Se preparó un caldo nutritivo con la composición que se observa en

el Cuadro 5 (Munish y col, 2005; Bram y Solomons, 1965).

Clave del tubo BaCl 1%

mL

H2SO4 1%

mL

No. aproximado de

microorganismos x

106/mL

1 0.1 9.9 300

2 0.2 9.8 600

3 0.3 9.7 900

4 0.4 9.6 1200

5 0.5 9.5 1500

6 0.6 9.4 1800

7 0.7 9.3 2100

8 0.8 9.2 2400

9 0.9 9.1 2700

10 1.0 9.0 3000


38

Cuadro 5. Composición del caldo nutritivo empleado en cada fermentación y al

cual se le adicionó la fuente de carbono y/o las sales de calcio y magnesio.

Las muestras que se prepararon con caldo nutritivo para conocer el efecto de la

fuente de carbono y de las sales CaCO3 y MgCO3 se muestran en el Cuadro 6.

Cada fermentación se realizó por duplicado en matraces de 1L los cuales fueron

incubados por un periodo de 8 días a 30°C, con agitación de 54 ciclos por min.

Caldo nutritivo

sustancia proporción

NaNO3 2.0 g/l

KH2PO4 1.0 g/l

KCl 0.5 g/l

MgSO4·7H2O 0.5 g/l

FeCl3 0.1 g/l

Extracto de malta 1% p/v


39

Cuadro 6. Caldos nutritivos evaluados en el crecimiento del microorganismo y

producción de naringinasa por A. niger.

III.5.6 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.

Se tomó una alícuota de 20 mL cada día que duró la fermentación, esta fue filtrada

en papel filtro de poro de 1mm y se secó a 80ºC por 10 min aproximadamente, así

se cuantificó el peso del micelio por diferencia (Bucio Villalobos y col, 2007).

Fuente de

carbono

Proporción

fuente de

carbono %

CaCO3

proporción

0.01 mM

MgCO3

proporción

0.01mM

naringina 0.5 --- ---

naringina 0.5 0.01 ---

naringina 0.5 --- 0.01

naringina 0.5 0.01 0.01

melaza 0.5 --- ---

melaza 0.5 0.01 ---

melaza 0.5 --- 0.01

melaza 0.5 0.01 0.01

ramnosa 0.5 --- ---

ramnosa 0.5 0.01 ---

ramnosa 0.5 --- 0.01

ramnosa 0.5 0.01 0.01


40

III.6 MÉTODOS ANALÍTICOS.

III.6.1 Determinación de proteína en el medio de cultivo.

Para la determinación de la proteína en el medio de cultivo se utilizó el método de

Bradford, el cual es un método rápido y sensible para la cuantificación de micro

cantidades de proteína utilizando el principio de formación de color por unión a la

proteína (Bradford, 1976; Kirk y col, 2004).

El método de Bradford involucra la unión no covalente de la proteína al reactivo

Azul brillante de Coomasie G-250 ya que este interacciona con los grupos básicos

y aromáticos de las proteínas. Este colorante absorbe a una longitud de onda de

365 sin embargo la unión de la proteína al colorante causa un cambio en el

máximo de absorción del colorante de 365 a 595nm absorbancia a la que se

realiza la determinación (Bradford, 1976).

III.6.1.1 Preparación del reactivo de Bradford.

Se disuelven 100 mg de azul de Comassie en 50 mL de etanol al 96 %, después

se añaden 100 mL de ácido fosfórico 85 %.Se diluye con 1000 mL de H2O

destilada y se deja reposar 24 h en oscuridad, se filtra dos veces con papel filtro y

se conserva en una botella oscura.

III.6.1.2 Patrón de albúmina sérica bobina (ASB).

Se realiza una curva de ASB de acuerdo con el Cuadro 7. Agitando perfectamente

y después de incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Cada ensayo se lee

a 595 nm usando como blanco el tubo 6 de la serie y se determinan por triplicado.

Esta curva solo es estable por 30 min y se deberá agitar perfectamente antes de

leer. Para determinar el contenido de la proteína en cuestión se realiza el mismo


41

procedimiento sustituyendo la ASB por la proteína problema e interpolando los

resultados obtenidos para la proteína problema en la curva estándar. Durante la

determinación se desarrolla una coloración azulada que se incrementa conforme

se incrementa la concentración de proteínas.

Cuadro 7. Curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de

proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.

Tubo Solución Proteína (ASB,

250 μg/mL)

Agua destilada

(mL)

Reactivo de Bradford

(mL)

1 0.1 2.9 3

2 0.2 2.8 3

3 0.3 2.7 3

4 0.4 2.6 3

5 0.5 2.5 3

6 0.0 3 3

La curva tipo de albumina sérica bovina, para la determinación de proteína en el

medio de cultivo por el método de Bradford.se reporta en el Anexo número 1 del

presente trabajo y presentó una ecuación de la recta de Y=5.78x + 0.1408;

R2=0.9579.

III.6.2 Determinación de la actividad enzimática de la naringinasa comercial de

Penicillium decumbens.

Para llevar a cabo la determinación de la naringinasa producida por el

microorganismo empleado fue importante conocer el comportamiento de esta in

vitro por tanto se realizaron las siguientes determinaciones utilizando naringinasa

de Penicillium decumbens (Sigma).


42

III.6.2.1 Estudio del efecto de la concentración de naringinasa de Penicillium

decumbens en la hidrólisis de naringina.

Se preparó una solución de naringina 0.005 mM en regulador de citratos 0.05 M

pH 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 mL a cada tubo de ensayo, además de

diferentes soluciones de naringinasa de concentración final de 10, 30, 50, 75, 100,

125 y 150 μg/mL; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución

concentrada de 1500 μg/ mL, siendo siempre la alícuota que se adicionó al

sustrato de 0.1 mL. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2 mL.

Cada ensayo se incubo durante 15 minutos, tiempo en el cual se llevaría a cabo la

hidrólisis de naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto

final y esta es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida

por dicha hidrólisis. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detiene con la

adición de 4 mL de DNS y se calienta durante 5 minutos a ebullición para revelar

cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos a 540nm con filtro verde. (Ting,

1958; Olson y col, 1979; Olson y Gray, 1981; Chaplin y Kennedy, 1986). Los

resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2 apartado 2a.1 del presente

trabajo.

III.6.2.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina

por la naringinasa de Penicillium decumbens.

Del estudio anterior se seleccionó una concentración de naringinasa a la cual se

observara claramente la hidrólisis de la naringina la cual fue 50 μg/ mL, dicha

concentración se mantuvo constante durante todo el experimento donde se

evaluaron diferentes tiempos de hidrolisis los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60

minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9 mL de naringina 0.005M y 0.1 mL

de naringinasa. Terminado el tiempo de reacción, la reacción se detuvo con la

adición de 4 mL de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo,

los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. (Ting,


43


resultados de este estudio se reporta en el Anexo 2, apartado 2a.2 del presente

trabajo.

III.6.2.3 Curva tipo de naringina.

Para el montaje de la curva tipo de naringina una vez conocidos tanto la

concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ mL) y el tiempo de hidrólisis más

adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de

naringinasa en concentración de 50 μg/ mL en regulador de citratos 0.005 mM pH

4.5 de la cual se adición 0.5mL, la concentración de naringina empleada fue de

0.005M y se emplearon los siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1,

1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 mL para alcanzar un volumen final de cada ensayo de 2.5 mL. El

tiempo de incubación fue de 10 minutos, posteriormente la reacción fue detenida

agregando 4 mL de DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5

minutos, una vez fríos se llevo a cabo la lectura a 450nm con filtro verde. (Ting,


resultados de este estudio se reporta en el Anexo 3, Figura 4A del presente

trabajo.

III.6.2.4 Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la naringinasa de

P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,

Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.

En base a los resultados de obtenidos de la curva de naringinasa y haciendo una

curva patrón de glucosa (Anexo 4, Figura 5A) se calcularon las concentraciones

reales en μg/ ml que representa cada volumen empleado en la curva tipo de

naringina 0.005M. Dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de

Michaelis- Mentes (Anexo 5, Figura 6A), Lineweaber-Burk (Anexo 5, Figura 7A),


44

Eadie-Hofsteen (Anexo 5, Figura 8A) y Agustinson (Anexo 5, Figura 9A), y se

determino la Vmáx y Km para cada uno, a demás se determinaron dichas

constantes por el método estadístico de Wilkinson (1960) (Anexo 5, Cuadro 5A).

La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde una U = cantidad de enzima

para liberar 1μmol de glucosa/ min.

III.6.3 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger

en muestras de la fermentación de cada formulación.

Para llevar a cabo la determinación de la actividad enzimática de la naringinasa

producida por el microorganismo empleado. Se tomó 0.5 mL de cada muestra de

la fermentación de cada formulación, se le adicionó 1.5 mL de una solución de

naringina (Sigma) 5.26 mM en regulador de citratos 0.05M pH 6, como sustrato, y

se incubó a 35°C por 24 h, la reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido

3,5-dinitrosalicilico y con ebullición en baño María durante 5 minutos,

posteriormente se leyó a 450 nm en un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los

ensayos se realizaron por triplicado. Como blanco se utilizó 1.5 mL de una

solución de naringina 5.26mM. Para el tratamiento de los resultados se utilizó una

curva tipo de glucosa con una ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889;

R2=0.987, reportada en el Anexo 4, Figura 5A del presente trabajo.

III.6.4 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa producida por A. niger

del caldo nutritivo que presentó mayor actividad enzimática en el estudio anterior.

A partir de los resultados obtenidos en el estudio anterior se seleccionó el caldo

nutritivo seleccionado que presentó mayor actividad enzimática.

El caldo nutritivo elegido, fue tratado para concentrar la proteína y separarla del

medio de cultivo por lo que se le adicionó 65 g de sulfato de amonio por cada 100


45

mL de medio de cultivo para precipitar la proteína en baño de hielo logrando una

saturación de 99% de acuerdo con Dawson (1968). La solución fue centrifugada a

17100 rpm (107442.46875277 radianes /min) 4°C por 30 min; el pellet fue re-

suspendido en 15 mL de regulador de citratos 0.05M pH 6 y se le determinó el

contenido proteico por medio del método de Bradford.

Para la determinación de la actividad enzimática del concentrado proteico obtenido

se emplearon 1.5 mL de una solución de naringina de diferente molaridad (0.02,

0.008, 0.00526, 0.0026, 0.0013, 0.001, 0.0006 M) en regulador de citratos 0.05 M

pH 6 a la que se le adicionaron 0.5 mL del concentrado proteico y se incubaron a

35°C por 24 h en baño María, una vez transcurrido el tiempo de incubación la

reacción fue detenida adicionando 4 mL de ácido 3,5-dinitrosalicilico y con

ebullición en baño María durante 5 minutos, posteriormente la lectura se realizó en

un fotocolorímetro con filtro verde. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Para el tratamiento de los resultados se utilizó una curva tipo de glucosa con una

ecuación de la curva de Y=0.6456x -2.2889; R2=0.987, reportada en el Anexo 4,

Figura 5A del presente trabajo. Los resultados obtenidos permitieron calcular los

gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaer-Burk, Eadie-Hoffsten y Agustinson. A

demás se determinó la Vmáx y Km para cada uno. El valor de Vmáx y Km para

Wilkinson se calculó de acuerdo al modelo estadístico de Wilkinson (1960).

III.6.5 Análisis estadístico para determinar la confiabilidad de los resultados

obtenidos por medio del programa estadístico MINITAB13.

Los resultados de peso del micelio, proteína y actividad enzimática fueron

analizados estadísticamente por medio del programa MINITAB13, a través de un

análisis de varianza (ANOVA) con un p ≤ 0.05 utilizando un diseño factorial

general completo de 3x4x5 (fuente de carbono, sales y días) con tres repeticiones.

_________________________________________________ RESULTADOS Y DISCUCIÓN

46

IV. RESULTADOS Y DISCUCIÓN

IV.1 Evaluación de la capacidad productora de naringinasa de la cepa Aspergillus

niger ATCC 1015 por medio de cromatografía en capa fina.

IV.1.1 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de una muestra de

naringina pura en cromatografía en capa fina.

En la Figura 10 se observa que la acetona 100% no permitió la muestra de

naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografía en capa fina por lo que

este disolvente fue descartado para ser empleado en los siguientes experimentos.

El disolvente metanol 100% (Rf=0.62) (Figura 11) y las mezclas de disolventes

metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54) (Figura 9), metanol: acetona 90:10 (Rf=0.66)

(Figura 12) y metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65) (Figura 13) permitieron que la

muestra de naringina pura ascendiera por capilaridad en cromatografía en capa

fina. La mezclas de disolventes hexano 100% (Rf=0), hexano: acetato de etilo

80:20 (Rf=0), acetato de etilo: hexano 80:20 (Rf=0), metanol: acetato de etilo

80:20 (Rf=0) y acetona 100% (Rf=0) no permitieron la ascendencia por capilaridad

de la muestra de naringina. Los resultados se muestran en la Cuadro 8.

Cuadro 8. Disolventes para eluir la naringina pura (50 mg/1000ml) en cromatografía en capa fina.

Disolvente / proporción %

Ascendencia por capilaridad

Rf

metanol 100 sí 0.62

metanol: acetona / 95:5 sí 0.54



hexano / 100 no 0

hexano: acetato de etilo / 80:20 no 0

acetato de etilo: hexano / 80:20 no 0

metanol: acetato de etilo / 80:20 no 0

acetona / 100 no 0


47

Figura 10. Naringina pura ascendida por capilaridad en cromatografia en capa fina

utilizando como disolvente acetona 100%.(Rf=0).


utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.62).


utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5 (Rf= 0.54).


48


utilizando como disolvente metanol:acetona 90:10 (Rf=0.66).


utilizando como disolvente metanol: acetona 80:20 (Rf=0.65).

El valor de Rf nos permitió inferir que el mejor sistema que permitía que la muestra

de naringina pura ascendiera por capilaridad y se observará como una mancha

definida en una cromatoplaca podía ser la mezcla de metanol: acetona 90: 10

(Figura 13) por presentar el mayor Rf, seguido de metanol: acetona 80:20 (Figura

14), metanol 100% (Figura 11) y en último caso el metanol: acetona 95:5 (Figura

12). La elección del disolvente o sistema de disolventes dependió del resultado

obtenido en la siguiente etapa experimental ya que se pretendió encontrar un

disolvente o mezcla de disolventes que permitiera la ascendencia por capilaridad


49

tanto de la naringina pura como de la naringina presente en jugo de naranja ya

que esta última podía verse afectada en su polaridad debido a la acidez del medio

en el que se encontraba.

Debido a que no se observó ascendencia por capilaridad en cromatografía en

capa fina de la naringina pura con el disolvente hexano 100% ( disolvente no

polar; índice de polaridad Ip= 0) inferimos que la naringina es un flavonoide polar,

sin embargo, este flavonoide asciende por capilaridad en cromatografía en capa

fina muy poco con un disolvente de polaridad intermedia como la acetona 100%

(Ip= 5.4) (Figura 10), pero por otra parte con metanol 100% disolvente de alta

polaridad (Ip= 6.6) (Figura11) asciende por capilaridad de tal manera que permite

obtener un RF muy cercano a la unidad, por tanto podemos decir que la naringina

es un flavonoide de alta polaridad.

IV.1.2 Disolventes utilizados para la ascendencia por capilaridad de la naringina

presente en el jugo de naranja en cromatografía en capa fina.

Las mezclas evaluadas en esta etapa fueron: metanol 100% (Rf=0.645)

(Figura15), metanol: acetona 95:5 (Rf=1.67) (Figura 16), metanol: acetona 90:10

(Rf=0) (Figura 17) y metanol: acetona 80:20 (Rf= 0.8) (Figura 18), de acuerdo con

el Rf el mejor sistema apto para la ascendencia por capilaridad en cromatografía

en capa fina de la naringina presente en la naranja es metanol: acetona 90:10, sin

embargo, al observar la placa cromatográfica no se observa una mancha definida

por tanto este sistema de disolventes fue descartado, eligiendo como mejores

sistemas aptos para la ascendencia por capilaridad de la naringina presente en la

naranja al metanol: acetona 80:20 ( Figura 18) seguido del metanol 100% (Figura

15).


50

Figura15. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol 100% (Rf=0.645).

Figura 16. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en

cromatografía en capa fina utilizando como disolvente metanol: acetona 95:5

(Rf=1.67).

Figura17. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en


(Rf=0).


51

Figura 18. Naringina presente en el jugo de naranja ascendida por capilaridad en


(Rf=0.8).

Finalmente este experimento nos permitió saber que la polaridad de la naringina

presente en la naranja puede estar afectada por la presencia de otros

componentes o por las condiciones en las que se encuentra en la naranja.

IV.1.3 Disolventes para la ascendencia por capilaridad de la naringina pura y la

naringina presente en las naranjas en cromatografía en capa fina.

Se encontró que la naringina pura (N) y la naringina presente en la naranja (n),

ascendieron por capilaridad en metanol 100% (Figura 20) alcanzando un Rf= 0.86,

pero su ascendencia por capilaridad mejoró con metanol: acetona en 80:20

(Figura 19) presentando un Rf= 1 el cual fue calculado con respecto a la muestra

de referencia lo que nos sugiere que el mejor sistema para permitir la ascendencia

por capilaridad en cromatografía en capa fina de las muestras de naringina pura y

naringina de la naranja es el de metanol: acetona en 80:20. Por tanto para la

siguiente etapa experimental se trabajo con este sistema de disolventes.


52

Figura 19. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol: acetona 80:20 (Rf=1).

(N= naringina; n= naringina de naranja).

Figura 20. Naringina (N) y naringina de naranja (n) metanol 100% (Rf=0.86). (N=

naringina; n= naringina de naranja).

IV.1.4 Evaluación de la degradación de la naringina por la naringinasa producida

por Aspergillus niger ATCC 1015 una vez inoculado en naranjas.

Pequeñas muestras de jugo de las naranjas utilizadas en el experimento (n) se

compararon en una placa cromatográfica contra una muestra de naringina pura

(N) tanto de las naranjas inoculadas por picadura con Aspergillus niger ATCC

1015 como las no inoculadas (controles). Después de revelar las placas se

N

N n

n


53

confirmó la presencia de la naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 21)

y de igual manera se confirmo la presencia de la naringina en el lote de naranjas

acabadas de inocular (Figura 22).

Figura 21. Cromatoplacas de naranjas sin inocular, metanol: acetona 80:20

(triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).

Figura 22. Cromatoplacas de naranjas inoculadas con A. niger, metanol: acetona

80:20 (triplicado). (N= naringina; n= naringina de naranja).

A las 24 horas del experimento se observó que todavia estaba presente la

naringina en el lote de naranjas sin inocular (Figura 23). En el lote de naranjas

N N

N n n

n

N N

N n

n n


54

inoculadas se observó que una naranja no presentó naringina en el punto de

inoculación (Figura 24).





A las 48 y 72 horas se observó la presencia de naringina en las naranjas no

inoculadas(Figura 25) junto con la presencia de otros compuestos, lo que podría

n n n N

N N

N n n

N N


55

sugerir el inicio de la degradación de la naringina presente en la naranja

probablemente por efecto de la maduración. En las naranjas inoculadas (Figura

26) se observó el mismo comportamiento presentado a las 24 horas solo que

ahora había presencia de otros compuestos que solo se observaron en una

longitud de onda larga al UV.





N n

n

N

N

N N N

n

n

n


56

Después de 96 hrs de haber iniciado el experimento se observó la presencia de

naringina en las naranjas no inoculadas (Figura 27) junto con la presencia de otros

compuestos que absorven en longiutud de onda larga al UV y en el lote de

naranjas inoculadas (Figura 28) con A. niger no se observó la presencia de

naringina.





n n n N N N

N N N

n n


57

A 120 hrs los controles (Figura 29) mostraron la presencia de naringina junto con

la presencia de otros compuestos que solo absorven en longitud de onda larga en

el UV. En las muestras de las naranjas inyetadas (Figura 30) con el hongo no se

observa la presencia de naringina probablemente debido a una hidrólisis inducida

por el microorganismo inoculado.





N n N n n N

N N

N


58

IV.2 Recuperación de la cepa de A. niger a partir de un cultivo en tubo inclinado.

La cepa Aspergillus niger ATCC 1015 (obtenida del cepario del CINVESTAV;

Figura 31) fue resembrada en agar Sabouraud (Figura 32) el cual fue preparado,

esterilizado y vaciado previamente en cajas petri, las cuales fueron resembradas

por picadura lo cual se muestra en la Figura 33. Dichas cajas se mantuvieron a

temperatura ambiente y cubiertas con papel aluminio por una semana para

obtener un óptimo crecimiento del microorganismo el cual se muestra en la Figura

34. El hongo comenzó a crecer desde el primer día y alcanzo su óptimo a los 7

días de haberse sembrado. Este procedimiento se realizó mensualmente a

manera de conservar la cepa.

Figura 31. Cepa Aspergillus niger ATCC 1015 obtenida del cepario del

CINVESTAV.


59

Figura 32. Agar Saboraud.

Figura 33. Resiembra del microorganismo Aspergillus niger ATCC 1015.

Figura 34. Crecimiento optimo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.


60

IV.3 Fermentaciones.

El caldo nutritivo, como fue descrito en materiales y métodos, fue adicionado con

diferentes fuentes de carbono (0.5% p/v) y con sales de calcio y magnesio al 1 M y

0.1mM. Sin embargo, en estas muestras no se observó el crecimiento del hongo

(peso del micelio).

IV.3.1 Crecimiento del microorganismo utilizando diferentes fuentes de carbono.

Se observó crecimiento del microorganismo cuando se empleó como fuente de

carbono naringina, ramnosa o melaza (0.5% p/v) en el caldo nutritivo. Cuando se

adición las sales de calcio y/o magnesio en concentración de 0.01mM se observó

crecimiento del microorganismo al contrario de cuando se utilizó una

concentración de 1 y 0.1mM. Por ello se empleó en todos los caldos nutritivos que

se trabajaron en este estudio una concentración de 0.01 mM para las sales.

Es importante resaltar que cuando no se adicionó sal alguna al medio de cultivo,

no se encontró diferencia significativa para las tres diferentes fuentes de carbono

empleadas. Lo cual concuerda con Bramn y Solomons (1965) que sugieren que no

es necesaria la adición de factores de crecimiento para Aspergillus niger NRRL

72-4 en la producción de naringinasa. Sin embargo, la presencia de CaCO3 y

MgCO3 individualmente favoreció significativamente (p≤0.05) el crecimiento de

A. niger solo cuando se utilizó melaza como fuente de carbono, siendo el máximo

de crecimiento 0.905 g/mL y 0.775 g/mL para CaCO3 y MgCO3 respectivamente

(Figura 35). Bramn y Solomons (1965) sugieren que el CaCO3 tiene un efecto

positivo en el crecimiento del hongo durante la producción de la naringinasa

debido a que cuando se realiza dicha producción en matraces agitados, y no en

fermentadores, en donde se pueden controlan todos los factores, se forma una

atmosfera limitada en oxigeno que afecta el crecimiento del hongo y esta limitación

puede modificarse a través de la adición de CaCO3. Esto podría aplicarse también


61

para el MgCO3, ya que lo que aporta el carbonato de calcio es oxigeno para

contrarrestar la deficiencia de este en el medio, sin embargo, para magnesio no

está comprobado. No obstante la adición de la mezcla de ambas sales no mostró

diferencia significativa para alguna fuente de carbono empleada.

Figura 35. Crecimiento del micelio de A. niger ATCC1015 en melaza con adición

de CacO3 (▲) y melaza con adición de MgCO3 (■).

0.905

0.775

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Pe

so

del m

ice

lio

en

bas

e s

ec

a g

/ml

Días

M 0.5%, Ca 0.01mM

M 0.5%, Mg 0.01mM


62

IV.4 Determinación de proteína en el medio de cultivo por el método de Bradford.

La determinación de la proteína durante el crecimiento del microorganismo (no

toda la proteína producida es enzima naringinasa) se realizó por triplicado para

todas las muestras tomadas cada 24 horas durante el transcurso de la

fermentación y se utilizó como blanco la fuente de proteína inicial (1% p/v).

Para la producción de proteína se encontró que existe diferencia significativa

(p≤0.05) dependiendo de la fuente de carbono que se utilice, siendo la naringina la

fuente de carbono que favorece más la producción proteica, lo cual se observa en

la Figura 36, Curva A.

También se encontró diferencia significativa en la producción de proteína

dependiendo de la presencia o ausencia de sales de Ca2+ y/o Mg2+. En la Figura

36, Curva B se observa que la adición de las sales favorece positivamente la

producción de proteína, teniendo un mayor efecto positivo el MgCO3 que el

CaCO3, sin embargo, se observa que el efecto positivo se incrementa cuando se

adiciona la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ y cuando se utiliza naringina como

fuente de carbono (Figura 37, Curva A). Probablemente el efecto de la mezcla de

las sales es mayor porque al adicionarlas juntas suman su efecto actuando

sinergistamente sobre la producción proteica.


63

Figura 36. Curvas de comportamiento de la proteína en relación a la fuente de

carbono (A) y sales de Ca2+ y/o Mg2+ (B), por Aspergillus niger ATCC1015.

Tiempo de la fermentación en días(C). N= naringina; R= ramnosa; M=melaza; 0=

sin sales; Ca= CaCO3; Mg=MgCO3; m= mezcla de sales. La línea punteada

representa la media de los datos.


64

Figura 37. Curvas de producción de proteína mostrando las relaciones: fuente de

carbono-sales (A) y fuente de carbono-días (B), para naringina, melaza y ramnosa

y (C) la relación sales-días para naringina. N= naringina; R= ramnosa; M=melaza;

0= sin sales; Ca= CaCO3; Mg= MgCO3; m= mezcla de sales.

Al analizar individualmente las diferentes formulaciones en función de la fuente de

carbono utilizada se encontró para el caso de naringina que existe diferencia

significativa (p≤0.05) en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o Mg2+.

Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para naringina sin adición

de sales de 6192 µg / mL; para naringina + Ca2+ de 11849 µg / mL; para naringina

+ Mg2+ de 15154 µg / mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ de 32553 µg / mL. A

partir de dichos máximos de producción de proteína se observa que la adición de

la mezcla de las sales incrementa significativamente la producción de proteína en


65

comparación cuando no se adicionan sales o cuando se adicionan Ca2+ o Mg2+

individualmente.

Cuadro 9.Máximos de producción de proteína en la producción de naringinasa por

medio de A. niger.

Sin embargo, no existe diferencia significativa en la producción de proteína al

adicionar Ca2+ y Mg2+ de manera independiente. Es posible que la adición de la

mezcla de las sales tenga un efecto sinergista positivo en la producción de

proteína cuando se utiliza naringina como fuente de carbono.

Ensayo

Producción de

proteína (µg / mL)

naringina sin sales

naringina +Ca2+ y Mg2+

naringina + Ca2+

naringina + Mg2+

6192

32553

11849

15154

melaza sin sales

melaza +Ca2+ y Mg2+

melaza + Ca2+

melaza + Mg2+

2339

5033

4987

7368

ramnosa sin sales

ramnosa+Ca2+ y Mg2+

ramnosa + Ca2+

ramnosa + Mg2+

2006

3139

2845

19445


66

Cuando se utilizó melaza como fuente de carbono se encontró diferencia

significativa en la producción de proteína en ausencia y presencia de las sales de

Ca2+ y/o Mg2+. Siendo el máximo de producción de proteína (Cuadro 9) para

melaza sin adición de sales de 2339 µg /mL; para melaza + Ca2+ de 4987 µg / mL;

para melaza + Mg2+ de 7368 µg / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ de 5033 µg /

mL. Es importante mencionar que, a pesar de que la producción de proteína al

adicionar Mg2+ al caldo nutritivo es mayor, esta no es significativamente diferente

en relación a la proteína producida cuando no se hizo adición de sales o cuando

se adicionó solo Ca2+, sin embargo, sí es significativamente mayor en relación a la

producida cuando se adicionó la mezcla de sales.

Finalmente cuando se utilizó ramnosa como fuente de carbono también se

encontró diferencia significativa en ausencia y presencia de las sales de Ca2+ y/o

Mg2+ en la producción de proteína (Cuadro 9). Siendo el máximo de producción de

proteína para ramnosa sin adición de sales de 2006 µg /mL; para ramnosa + Ca2+

de 3139 µg / mL; para ramnosa + Mg2+ de 2845 µg / mL y para ramnosa + Ca2+ y

Mg2+ de 19445 µg / mL. A partir de los máximos obtenidos se observa que la

adición de la mezcla de sales de Ca2+ y Mg2+ al caldo nutritivo permite una mayor

producción de proteína con respecto a cuando no se adicionaron dichas sales, es

decir, la adición de la mezcla de sales tiene un efecto positivo en la producción de

proteína. Por otra parte la adición de Ca2+ al caldo nutritivo favoreció de igual

manera la producción de proteína en relación a cuando no se adicionó, pero esta

producción no fue significativamente diferente a la obtenida cuando se adicionó

Mg2+ o cuando se adicionó la mezcla de Ca2+ y Mg2+. Cabe señalar que la adición

de Mg2+ no tuvo un efecto significativo en la producción de proteína en relación a

los otros caldos nutritivos.

Al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono (naringina, melaza y

ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no adicionar sales

existe diferencia significativa en la producción de proteína entre la proteína

(Cuadro 10) producida al adicionar naringina y al adicionar ramnosa (2006 µg/mL)


67

como fuente de carbono, siendo mayor la producción de proteína cuando se utiliza

naringina (6192 µg/mL), sin embargo, no existe diferencia significativa entre las

dos fuentes de carbono mencionadas anteriormente con respecto a melaza

cuando se utiliza como fuente de carbono.

Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes

en la producción de proteína, fueron en los que se utilizó naringina y melaza como

fuente de carbono (Cuadro 10), siendo mayor la producción de proteína para el

caso de naringina (11849 µg/mL) en relación con la melaza (4987 µg/mL). El caldo

nutritivo en el que se empleo ramnosa como fuente de carbono no mostró ser

significativamente diferente a los anteriormente mencionados.

Cuadro 10. Comparativo de los máximos de producción de proteína significativos

(p≤0.05) en la producción de naringinasa mediante diferentes fuentes de carbono

por medio de A. niger.

Ensayo

Producción de

proteína (µg / mL)

naringina sin sales

ramnosa sin sales

6192

2006

naringina + Ca2+

melaza + Ca2+

11849

4987

naringina + Mg2+

ramnosa + Mg2+

15154

2845

naringina + Mg2+

melaza + Mg2+

15154

7368

naringina + Ca2+ y Mg2+

melaza + Ca2+ y Mg2+

32553

5033

naringina + Ca2+ y Mg2+

ramnosa + Ca2+ y Mg2+

32553

19445


68

En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ se encontró diferencia

significativa en la producción de proteína (Cuadro 10), entre el que se utilizo como

fuente de carbono la naringina (15154 µg/mL) y en el que se utilizo ramnosa (2845

µg/mL), también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína

entre naringina y melaza (7368 µg/mL). Sin embargo, la producción de proteína

entre melaza y ramnosa no fue significativamente diferente.

En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,

también se encontró diferencia significativa en la producción de proteína (Cuadro

10), entre naringina (32553 µg/mL) y melaza (5033 µg/mL) utilizada como fuente

de carbono, de igual manera entre naringina y ramnosa (19445 µg/mL).

Por otra parte el tiempo (días) mostró tener efecto en la producción de proteína

dependiendo de la fuente de carbono que se empleo, lo cual se observa en la

Figura 37B donde claramente se aprecia que los ensayos realizados con naringina

como fuente de carbono presentan mayor producción de proteína ya que a pesar

de que presenta variaciones a lo largo de la fermentación, siempre se mantiene

por arriba de la producción de proteína producida con melaza y con ramnosa. Por

otra parte la Figura 37C, muestra la producción de proteína a lo largo del tiempo

de fermentación utilizando naringina como fuente de carbono en relación a la

ausencia y/o presencia de las sales de Ca2+ y Mg2+ donde se observa que es con

la mezcla donde se ve favorecida significativamente la producción de proteína a

pesar de la variación de esta a lo largo de los días debido al metabolismo del

hongo.


69

IV.5 Estudio de la actividad enzimática de la naringinasa de A. niger en muestras

de cada fermentación.

La determinación de la actividad enzimática se realizó durante el crecimiento del

hongo en el caldo nutritivo en diferentes condiciones por triplicado a lo largo de 7

días de fermentación. Se utilizó como blanco una solución de naringina 5.26M pH

6 en buffer de citratos.

En la Figura 38A se observa el efecto de las tres diferentes fuentes de carbono en

la actividad enzimática. A través del análisis estadístico se encontró que existe

diferencia significativa entre ellas (p≤0.05) siendo la ramnosa la fuente de carbono

que favorece más la producción de naringinasa. Por otra parte en la figura 38B se

observa que la adición de sales no influye significativamente en la actividad

enzimática de esta enzima.

Figura 38. Curvas de Actividad enzimática expresada en microgramos de glucosa

producida después de 24hrs de hidrolisis, en relación a las diferentes fuentes de

carbono 0.5%, sales de Ca2+ y/o Mg2+ 0.01mM y días. La línea punteada


70

representa la media de los datos. N= naringina; R= ramnosa M=melaza; 0= sin

sales; m= mezcla de sales.

La producción enzimática obtenida en el presente trabajo puede explicarse a

través de la teoría económica de los microorganismos (Koch, 1985) que establece

que la producción de una enzima inducida, solo es favorecida cuando la

producción de esta permite al microorganismo obtener más nutrientes para su

crecimiento y multiplicación. Además este efecto puede incrementar si no existen

sustratos fácilmente asimilables, los microorganismos no regularan fuertemente la

producción enzimática de las enzimas constitutivas, o los costos enzimáticos son

suficientemente bajos para permitir una continua producción, y de acuerdo con

Stevens y col, (2005), las enzimas extracelulares como en este caso la

naringinasa son el principal medio por el cual los microorganismos degradan

compuestos orgánicos complejos en moléculas pequeñas que pueden ser

asimilables.

Por otra parte en la Figura 38C se observa que la producción de naringinasa varía

de acuerdo con el metabolismo del hongo durante los días que duró la

fermentación, siendo esta mayor el primer día después del inicio de la

fermentación y claramente se observa una disminución de esta los últimos días de

la fermentación, quizá debido a una represión por catabolito (glucosa) (Munish y

col 2005, Bram y Solomons, 1965).También el comportamiento ascendente y

descendente de la actividad enzimática a lo largo del tiempo de fermentación

puede explicarse a través de lo citado por Chróst (1991) que establece que una

vez que la concentración de productos incrementa lo suficiente, la síntesis

enzimática se ve reprimida y la producción regresa a un nivel basal.


71

Comparando la actividad enzimática que se observa a través de los días (Figura

38C) con la variación de la proteína presente en el medio de cultivo con respecto

al tiempo (Figura 36C) se observa que la cantidad la actividad enzimática no es

proporcional a la producción de proteína ya que la actividad enzimática mayor se

observa en el primer día después del inicio de la fermentación (Figura 39B)

después de lo cual desciende y es hasta el sexto día cuando vuelve a subir pero

no alcanza el máximo alcanzado el primer día, lo que es contrario para la

producción de proteína donde se observa (Figura 36B) que esta aumenta y

disminuye repetitivamente, es decir no muestra la misma tendencia que en el caso

de la actividad enzimática . De acuerdo con Koch, 1985; Pelletier y Sygush, 1990;

Chróst, 1991; Sinsabaugh y Moorhead, 1994, debido a la producción de nitrógeno

y energía, los microorganismos solo deben producir enzimas a expensas del

crecimiento y metabolismo, es decir; cuando la disponibilidad de nutrientes es

escasa, la producción de enzimas aumenta, ya que de esta manera los

microorganismos pueden movilizar los nutrimentos de las fuentes complejas

(Harder y Dijkhuizen, 1983).

En este trabajo no se cuantificó la cantidad de enzima producida sino la actividad

enzimática de la enzima producida, en este sentido, la actividad enzimática de la

naringinasa producida no, fue proporcional a la producción de proteína.

Por otra parte también se encontró que las relaciones de Fuente de carbono-Sales

(Figura 39A), Fuente de Carbono- Días (Figura 39B), Sales-Días (Figura 39C),

tienen un efecto significativo en la actividad enzimática determinada.


72

Figura 39. Curvas de actividad enzimática mostrando las relaciones fuente de

carbono-sales, fuente de carbono-días y sales-días. N= naringina; R= ramnosa

M=melaza; 0= sin sales; m= mezcla de sales. La línea punteada representa la

media de los datos.

Al analizar los diferentes caldos nutritivos en los que se empleó naringina como

fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en

cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo

de actividad enzimática encontrado para naringina sin sales fue de 2605 μg de

glucosa/mL; para naringina + Ca2+ fue de 5536 μg de glucosa / mL; para naringina

+ Mg2+ fue de 3122 μg de glucosa/mL y para naringina + Ca2+ y Mg2+ fue de 3122

μg de glucosa/mL. Las unidades de actividad enzimática son expresadas en este


73

trabajo en microgramos de glucosa debido a que a partir del método utilizado se

cuantifica la cantidad de glucosa producida por la hidrólisis de la naringinasa

presente en el medio de cultivo sobre una muestra de naringina pura de

concentración conocida.

Cuadro 11.Máximos encontrados de actividad enzimática en la producción de

naringinasa por medio de A. niger (No diferencia significativa).

En el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo melaza como

fuente de carbono se encontró que no existe diferencia significativa entre ellos en

cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin embargo, el máximo

de actividad enzimática encontrado para melaza sin sales fue de 2605 μg de

glucosa / mL; para melaza + Ca2+ fue de 2743 μg de glucosa / mL; para melaza +

Ensayo

Actividad

enzimática (U/µg)

Naringina sin sales

Naringina +Ca2+ y Mg2+

Naringina + Ca2+

Naringina + Mg2+

2605

3122

5536

3122

Melaza sin sales

Melaza +Ca2+ y Mg2+

Melaza + Ca2+

Melaza + Mg2+

2605

2432

2743

3225

Ramnosa sin sales

Ramnosa+Ca2+ y Mg2+

Ramnosa + Ca2+

Ramnosa + Mg2+

6139

4932

1638

2777


74

Mg2+ fue de 3225 μg de glucosa / mL y para melaza + Ca2+ y Mg2+ fue de 2432 μg

de glucosa/mL.

Finalmente, para el caso de los diferentes caldos nutritivos en los que se empleo

ramnosa como fuente de carbono tampoco se encontró diferencia significativa

entre ellos en cuanto a la actividad enzimática determinada (Cuadro 11), sin

embargo, el máximo de actividad enzimática encontrado para ramnosa sin sales

fue de 6139 μg de glucosa / mL; para ramnosa + Ca2+ fue de 1638 μg de glucosa /

mL; para ramnosa + Mg2+ fue de 2777 μg de glucosa / mL y para ramnosa + Ca2+

y Mg2+ fue de 4932 μg de glucosa / mL.

Por otra parte, al hacer una comparación entre las tres fuentes de carbono

(naringina, melaza y ramnosa) bajo las mismas condiciones, se encontró que al no

adicionar sales sí existe diferencia significativa entre en la actividad enzimática

determinada en el caldo nutritivo adicionado con naringina y el adicionado con

ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para naringina de

2605 µg de glucosa /mL y de 6139 µg de glucosa /mL para ramnosa (Cuadro 12).

Cuadro 12. Comparativo de los máximos de actividad enzimática significativos

(p≤0.05) de la naringinasa producida utilizando diferentes fuentes de carbono por

medio de A. niger.

Ensayo

Actividad

enzimática (U/µg)

Naringina sin sales

Ramnosa sin sales

2605

6139

Melaza sin sales

Ramnosa sin sales

2605

6139

Naringina + Ca2+

Melaza + Ca2+

5536

2743


75

También se encontró diferencia significativa entre la actividad enzimática

determinada en el caldo nutritivo adicionado con melaza y el adicionado con

ramnosa, encontrándose un máximo de actividad enzimática para melaza de 2605

µg de glucosa /mL, lo que claramente significa que el caldo de cultivo en el que se

emplea ramnosa como fuente de carbono permite obtener una mayor actividad

enzimática comparada con la de las otras dos fuentes de carbono (Cuadro 12).

Cabe señalar que no se encontró diferencia significativa entre la actividad

enzimática de la naringinasa determinada en el caldo nutritivo adicionado con

Naringina y el adicionado con melaza.

Los caldos adicionados con Ca2+ que mostraron ser significativamente diferentes

en la actividad enzimática fueron en los que se utilizó naringina y melaza como

fuente de carbono (Cuadro 12), siendo mayor la producción de proteína para el

caso de Naringina (5536 µg de glucosa /mL) en relación con la melaza para la que

se encontró una actividad enzimática de 2743 µg de glucosa /mL. El caldo de

nutritivo en el que se empleo Ramnosa como fuente de carbono no mostró ser

significativamente diferente a los anteriormente mencionados.

En el caso de los caldos a los que se les adiciono Mg2+ no se encontró diferencia

significativa en la actividad enzimática, entre el alguna de las fuentes de carbono

empeladas en este trabajo.

En el caso de los caldos adicionados con la mezcla de las sales de Ca2+ y Mg2+,

tampoco se encontró diferencia significativa en la actividad enzimática

determinada entre los caldos de cultivo adicionados con las diferentes fuentes de

carbono.

De acuerdo a los resultados anteriores se seleccionó el caldo nutritivo que

presentó mayor actividad enzimática. De tal manera que la elección se realizó ente

la actividad enzimática para los caldos nutritivos en los que no se adicionó sales y

cuando se adicionó Ca2+, para las fermentaciones llevadas a cabo sin adición de


76

sales, el caldo nutritivo adicionado con ramnosa fue quién mostro mayor actividad

enzimática (6139 µg de glucosa /mL) y para las llevadas a cabo con adición de

Ca2+ la actividad enzimática mayor encontrada fue cuando se utilizó Naringina

(5536 µg de glucosa /mL) como fuente de carbono. Por lo que la fracción de

ramnosa sin sales fue la elegida para realizar la siguiente parte del experimento.

IV.6 Estudio de la actividad enzimática del caldo nutritivo seleccionado.

La fracción seleccionada para la concentración de la proteína y la determinación

de las constantes fue la de la ramnosa sin adición de sales del primer día después

del inicio de la fermentación. El uso de la ramnosa como fuente de carbono

permite obtener una naringinasa con mayor actividad comparada con la producida

utilizando como fuente de carbono naringina o melaza. Quizá este

comportamiento pude explicarse por lo sugerido por Munish y colaboradores en el

2005, quienes señalan que los medios utilizados para producir naringinasa por A.

niger, adicionados con ramnosa, producen elevadas cantidades de enzima quizá

ya que estos medios tienen un bajo contenido de carbohidratos. Sin embargo,

Elinbaum y col. 2002 sugieren que en el caso de una fermentación sólida la

naringina es mejor inductor que la ramnosa para la producción de la naringinasa

utilizando A. terreus, además también sugieren que una fermentación solida

provee mejores resultados para la producción de naringinasa que una

fermentación liquida.

Haciendo una comparación de la producción proteica a lo largo del tiempo de

fermentación en relación a la actividad enzimática se observa que no son

proporcionales y por tanto una mayor producción proteica no conlleva a una mayor

actividad enzimática aunque la naturaleza de la enzima sea proteica, ya que una

actividad enzimática elevada puede estar dada tanto por haber alto contenido de

proteína en el medio de cultivo o por que la enzima es altamente activa. También

es importante resaltar que la actividad enzimática puede ser reprimida debido a


77

una inhibición por glucosa (producto de la hidrólisis de la naringina por la

naringinasa) ya que de acuerdo con lo reportado por Munish y colaboradores en el

2005; Gallego y col en el 2001; Bram y Solomons en 1965 y Clarke y Brammer en

1964, la glucosa reprime la producción de naringinasa.

Como se mencionó con anterioridad, el caldo nutritivo donde se encontró mayor

actividad enzimática fue el adicionado con ramnosa como fuentes de carbono y sin

adición de sales durante las primeras 24 horas de la fermentación. Sin embargo,

debido a que se contaba con una pequeña cantidad de muestra se decidió juntar

todas las muestras tomadas cada día durante el periodo de la fermentación y se

procedió a una concentración de proteína. El contenido de proteína determinado

después del proceso de concentración al que se sometió la muestra fue de 66851

μg/mL de proteína.

La determinación de la actividad enzimática de las fracciones de ramnosa (del

conjunto de muestras obtenidas cada día) sin adición de sales se probó sobre la

hidrólisis de naringina y se obtuvo una actividad enzimática de 0.010U/mg

(U=1µmol de glucosa liberada / min) la cual se reporta en el Cuadro 13. Tal vez

este valor tan pequeño encontrado se debe a que al juntar todas las fracciones

disminuyó la actividad enzimática inicial la cual fue de 0.947 U / min.

La actividad encontrada para la naringinasa presente en el concentrado de

proteína es mayor comparada con la informada por Bram y Solomons 1965 para la

naringinasa de A. niger NRRL 72-4 (Cudadro 13, No5) y es menor comparada con

la informada por diferentes autores, los valores se presentes en el Cuadro 13, sin

embargo, es importante resaltar que la mayoría de ellos determinaron la actividad

enzimática utilizando sustratos inespecíficos como el p-nitrofenol o el dietilen glicol

alcalino, que esta actividad fue determinada utilizando diferentes condicione, y que

la producción de la enzima se realizó utilizando diferentes condiciones de

fermentación como en el caso de Gülten y col, 2006 (Cuadro13, No.2).


78

Por otra parte tal vez la producción de naringinasa por el hongo en estudio podría

mejorarse si se hace una adición de la fuente de carbono en diferentes etapas de

la fermentación de acuerdo con lo que sugiere Bram y Solomons (1965), sin

embargo, como ellos mismos establecen la adición continua de la fuente de

carbono a lo largo de la fermentación es un método más difícil y que requiere de

mayor control y de un fermentador.

Cuadro 13. Actividad enzimática de la naringinasa producida por diferentes

microorganismos y determinada mediantes diferentes sustratos.

Sustrato Actividad

narignina (1) 0.010 U/mg

naringina (2) 469 U/mg

p-nitrofenol (3) 91 U/mg

p-nitrofenol (4) 1.7 U/mL

dietilen glicol alcalino (5) 90-94 U/mL

dietilen glicol alcalino (6) 3.99x 10-4 IU/mL

p-nitrofenol (7) 0.059 U

(1) Naringinasa de A. niger ATCC1015 producida en el presente trabajo. Medio de

cultivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono. Regulador de citratos

0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min.

(2) Naringinasa de P. decumbens, Gülten y col, 2006. Fermentación solida.

Regulador de acetato de amonio 0.1M, pH= 4, 40°C, U= 1 µmol de glucosa

liberado/ min.


79

(3) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=

cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

(4) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Elinbaum y col, 2002. Medio de cultivo

adicionado con carbono de bagazo de caña de azúcar. Regulador de ácido.

succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima

necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

(5) Naringinasas de A. niger NRRL 72-4, Bram y Solomons 1965. Regulador de

citratos sin molaridad especifica reportada, pH=4, 45°C. U=cantidad de enzima

necesaria para hidrolizar 1μmol naringina/min. Método de Davis 1947.

(6) Naringinasa de A. niger MTCC 1344, Munish y col en el 2005. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Regulador de acetato de sodio 0.1M, pH= 4, 30°C.

IU=cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol naringina/min. Método de

Davis 1947.

(7) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger. Manzanares y col, 1997. Medio

de cultivo adicionado con naringina. Regulador MacIIvaine, pH=4.5, 30°C.

U= μmol de ramnosa/min.

Para determinar la constante de velocidad (Vmáx) y la constante de Michaelis-

Menten (Km) se utilizaron los modelos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-

Burk, Eadie-Hofsteen y Agustinson y el método gráfico de Wilkinson 1960. La

Figura 40 muestra las curvas para los modelos gráfico.


80

Figura 40. (A)Curva de Michaelis –Menten para Naringinasa donde Y=

6.683x+0.068; R2=0.908; (B) Curva de Lineweaber-Burk para Naringinasa; (C)

Curva de Agustinson para Naringinasa; (D) Curva de Eadie-Hofsteen para la

naringinasa de A. niger ATCC1015.

En el cuadro 14 se muestra los datos calculados para las curvas correspondientes.

Los valores correspondientes a Vmáx y Km para la naringinasa de A. niger a partir

de cada modelo gráfico y el calculado por el método estadístico de Wilkinson se

muestran en el cuadro 15.

y = 0.010x + 6.279R² = 0.868

02468

1012141618

0 500 1000 1500

1/V

1/S

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025

V

S

A B

y = 4.508x + 0.016R² = 0.978

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025

S/V

S

y = -0.002x + 0.176R² = 0.725

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 20 40 60 80

V

V/S

C D


81

Cuadro 14. Parámetros calculados para las curvas de Michaelis- Menten,

lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson para la naringinasa de A.niger

ATCC1015.

Cuadro 15. Parámetros de Vmax y Km para las curvas de Michaelis-Menten,

Lineweaber-Burk, Eadi-Hoffsten, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de A.

niger ATCC1015.

Michaelis-Menten Lineweaber-Burk Agustinson

Eadi-

Hoffsten

[s] mM V μg/min 1/[S] 1/V [S]/V S V/[S] V

1 65.2 1 0.01535 0.0153 1 65.36 65.2

1.3 69.5 0.769 0.014.4 0.0187 1.3 53.47 69.5

2.6 78.1 0.385 0.0128 0.33 2.6 30.04 78.1

5.26 11.3 0.190 0.0089 0.465 5.26 2.148 11.3

8 14.9 0.125 0.0067 0.537 8 1.8625 14.9

20 19.1 0.05 0.0053 1.047 20 0.955 19.1

Curva Vmax ( U/mg min)

Km (mM)

Michaelis-Menten 0.0158 0.0954

Lineweaverburk 13.24 1.6

Eadie-Hoffsten 18.46 7.21

Agustinson 14.64 2.1

Wilkinson* 17.63 3.3


82

En el Cuadro 16 se presentan los valores para la Vmáx y Km determinadas para

A. niger y P. decumbens, así como los valores reportados por diferentes autores

para la naringinasa.

Cuadro 16. Constantes de Vmáx y Km para la naringinasa producida por

diferentes microorganismos.

Sustrato Vmáx Km

narignina (1) 17.63U/mg∙min 3.3mM

naringina (2) 2.92 8.4

naringina (3) 0.45µmol/mg∙min 0.1.22mM

p-nitrofenol (4) 20.6 U/mg 2.9 mM

p-nitrofenol (5) 10.7 U /mg 1.52 mM

p-nitrofenol (6) 84U/mg 0.17mM

(1) Naringinasa de A. niger. Medio de cultivo adicionado con ramnosa como fuente

de carbono. Regulador de citratos 0.05M, pH=6, 35°C, [naringina]=0.00526mM.

U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de Wilkinson).

(2) Naringinasa de P. decumbens (Sigma). Regulador de citratos 0.05M, pH=4.5,

35°C, [naringina]=0.00526mM. U=1µmol de glucosa liberada / min (Método de

Wilkinson).

(3) Naringinasa de Penicillium. Decumbens. Gülten y col, 2006. Fermentación

solida. Regulador de acetato de amonio 0.1 M, pH= 4, 40°C. U= 1 µmol de glucosa

liberado/ min. (Lineweaberburk).

(4) α-ramnosidasa de la naringinasa de A. niger .Manzanares y col, 1997.

Regulador MacIIvaine pH=4.5, 30°C.U= μmol de ramnosa liberados / min


83

(5) α-L-ramnosidasa de Penicillium sp Romero y col, 1985. Regulador de ácido.

succínico /succinato de sodio 50mM, pH=5.5, 30°C. U=cantidad de enzima

necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min.

(6) α-L-ramnosidasa de A. terreus, Gallego y col, 2001. Medio de cultivo

adicionado con ramnosa. Rregulador de succinato 50 mM, pH= 5.5, 50°C. U=

cantidad de enzima necesaria para liberar 1μmol p-nitrofenol/min. (Michaelis)

En este trabajo se encontró que los valores de Vmáx y Km para la naringinasa de

A. niger ATCC1015 (Cuadro16, No.1) coinciden con los encontrados para la

naringinasa de P. decumbens (Cuadro16, No.2), lo que significa que a pesar de

haber una aparente producción proteica baja para la naringinasa producida por A.

niger, las constantes resultaron ser del mismo orden que las encontradas para la

naringinaa de P. decmbens por lo cual los resultados obtenidos son

comparativamente buenos.

El valor de Vmáx reportados por Gallego y colaboradores en el 2001 (Cuadro 16,

No 6) para la α-L-ramnosidasa de A. terreus es menor comparada con el obtenido

en el presente trabajo (Cuadro 16, No. 1) sin embargo, la enzima obtenida

presenta una menor afinidad por el sustrato naringina ya que obtuvo una Km

mayor (Cuadro 16, No.1) quizá porque esta enzima no solo presenta la actividad

de α-L-ramnosidasa sino también la de β-glucosidasa.

Por otra parte el valor informado para la α-L-ramnosidasa de A. niger por

Manzanares y colaboradores en 1997 y el informado por Romero y colaboradores

en 1985 es menores que el encontrado en el presente trabajo mediante el método

de Wilkinson ya que este engloba de manera estadística a todos los demás.

El valor de Vmáx para la α-L-ramnosidasa de A. niger informado por Manzanares y

col. 1997 (Cuadro 16, No.4) es mayor a lo encontrado en el presente trabajo lo


84

que significa que la actividad enzimática de la enzima encontrada es menor

teniendo ambas actividades (α-L-ramnosidasa y β-D-glucosidasa).

Gülten y col. en el 2006 determinaron las constantes de actividad enzimática de la

naringinasa de P. decumbens a través del método de Linewaver-Burk,

encontrando una Km menor a la encontrada, lo que significa que dicha naringinasa

tiene más afinidad por el sustrato que la que tiene la naringinasa producida

(Cuadro 64, No.3).

Sin embargo todos los autores anteriormente mencionados determinaron la las

constantes de Vmáx y Km utilizando un sustrtos inespecíficos como el p-nitrofenol,

obteniendo los valores presentes en el Cuadro 16.

___________________________________________________________ CONCLUSIONES

85

V. CONCLUSIONES

El presente trabajo nos permitió encontrar una cepa capaz de producir una enzima

con las características encontrada en una enzima comercial, por lo que usando

fuentes de carbono económicas se puede encontrar un nicho que a nivel comercial

puede ser más rentable.

La prueba presuntiva en cromatografía en capa fina mostró presuntivamente que

la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 es capaza de producir naringinasa.

Las diferentes fuentes de carbono y la concentración en la que se emplearon

produjeron naringinasa a partir de A. niger ATCC 1015 como respuesta por parte

del microorganismo a la presencia de compuestos orgánicos que pueden ser

asimilables a través de estas enzimas.

Cuando se adicionaron las sales de calcio y magnesio se encontró que un factor

determinante para el crecimiento del microorganismo es la concentración en la

que éstas se adicionan.

La fuente de carbono que favorece más el crecimiento del microorganismo es la

melaza y este crecimiento incrementa cuando se adiciona carbonato de calcio.

La mayor producción proteica se obtuvo cuando se empleó naringina como fuente

de carbono y ésta fue favorecida positivamente al adicionar la mezcla de sales.

La mayor actividad enzimática encontrada fue la de la enzima producida utilizando

el caldo nutritivo adicionado con ramnosa como fuente de carbono sin adición de

sales.

Por lo tanto las condiciones que favorecieron el crecimiento del hongo y la

producción de la proteína no fueron las ideales para favorecer la mayor actividad

enzimática de la naringinasa producida. De acuerdo a lo encontrado las

___________________________________________________________ CONCLUSIONES

86

condiciones más adversas utilizadas en este estudio para el crecimiento del hongo

favorecieron la producción de enzima con mayor capacidad de hidrólisis de la

naringina. Lo que significa que no existe relación alguna entre el crecimiento del

hongo y la actividad enzimática de la enzima producida. A demás tampoco existe

relación alguna entre la producción proteica con respecto una mayor actividad

enzimática ni entre el crecimiento del microorganismo con respecto a la

producción proteica. Sin embargo en este trabajo si existió una relación entre la

actividad enzimática y la adquisición de nutrientes por parte del microorganismo.

Debido a que la naturaleza de A. niger es producir acido cítrico, la tendencia

natural del medio de cultivo tiende a ser acida, quizás controlando estas

condiciones puede mejorarse la producción enzimática y la actividad de esta y

esto puede lograrse haciendo un escalamiento de dicha producción a

fermentadores controlados ya que con una aeración controlada y vigorosa puede

inhibirse la producción de acido cítrico por este hongo y favorezca la producción

de naringina. Además el proceso podría ser optimizado ya que existen

investigaciones que suguieren que la adición de fuentes de carbono en diferentes

etapas podría proveer mejores resultados en cuanto a la actividad enzimática de la

naringinasa que se produce utilizando A. niger.

Finalmente mediante este estudio no es posible esclarecer la relación entre la

concentración enzimática y la degradación del sustrato, enigma que también

permanece poco entendible en la literatura.

_____________________________________________________________ BIBLIOGRAFÍA

87

VI. BIBLIOGRAFÍA

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_________________________________________________________________ ANEXOS

98

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 200 400 600 800 1000 1200

Ab

s (

nm

)

microgramos de proteína /ml

ANEXOS

Anexo 1. Curva tipo de proteína obtenida por el método de Bradford.

Figura 1A. Curva tipo de proteína donde Y=5.78x + 0.1408; R2=0.9579.

_________________________________________________________________ ANEXOS

99

Anexo 2. Estudio y determinación de la actividad enzimática de la naringinasa

comercial de Penicillium decumbens.

2a.1. Estudio del efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens en

la velocidad de hidrólisis de la naringina.

El efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis

de naringina (Figura 2A; Cuadro 1A) se observa como el aumento de la

concentración de enzima adicionada. Esta se refleja en un incremento en la

concentración de azucares reductores en un mismo tiempo, la concentración

elegida en base a este experimento para montar la curva tipo de naringina fue de

50 μg/ml. A demás también se observó que el tiempo de incubación empleado (15

minutos) provee una medida excesiva del grado de hidrólisis.

Cuadro 1A. Efecto de la concentración en la velocidad de hidrólisis de la

naringinasa de P. decumbens.

Concentración μg/ml

UK

10 0

30 22.33

50 111.33

75 140

100 240

125 248.66

150 263.33

200 269

_________________________________________________________________ ANEXOS

100

Figura 2A. Efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens en la

hidrólisis de la naringina.

0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250

UK

microgramos glucosa /mililitro de hidrolizado

_________________________________________________________________ ANEXOS

101

2a.2 Estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por

la naringinasa de Penicillium decumbens.

Del estudio anterior se seleccionó la concentración de naringinasa de 50 μg/ml a

la cual se observó claramente la hidrólisis de la naringina. Esta concentración fue

elegida para determinar el efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la

naringina por la naringinasa de P. decumbens. Dicha concentración se mantuvo

constante durante todo el experimento.

El objetivo de realizar el experimento de efecto del tiempo en la velocidad de

hidrolisis de la naringina fue encontrar un tiempo adecuado al cual se llevara a

cabo la hidrólisis de la naringina de manera que fuera suficiente pero no excesiva,

para evitar subestimar o sobrestimar los resultados. En la curva de efecto del

tiempo en la velocidad de hidrólisis (Figura 3A; Cuadro 2A) se observa que a

mayor tiempo de incubación es mayor el grado de hidrólisis, y que un tiempo

adecuado para montar la curva tipo de naringinasa es de 10 minutos.

Cuadro 2A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la


Tiempo min

UK

5 278.66

10 335.33

20 370.66

30 426.66

40 660

50 926.66

60 1060

_________________________________________________________________ ANEXOS

102

Figura 3A. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis de la naringina por la


0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70

UK

Tiempo en minutos

_________________________________________________________________ ANEXOS

103

Anexo 3. Curva tipo de naringina.

Para el montaje de la curva tipo de naringina, una vez conocidos tanto la

concentración de naringinasa a emplear (50 μg/ml) y el tiempo de hidrólisis más

adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de

naringinasa en concentración de 50 μg/ml en regulador de citratos 0.005 mM pH

4.5. La concentración de la naringina empleada fue de 0.005 M y se utilizaron los

siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 ml.

Transcurrido el tiempo de incubación la reacción fue detenida agregando 4 ml de

DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5 minutos, una vez fríos se

llevo a cabo la lectura a 540 nm en un fotocolorímetro con filtro verde (Figura 4A).

Los resultados se muestran en el Cuadro 3A.

Cuadro 3A. Curva tipo de naringina.

Naringina

0.0005 M

(ml)

UK

promedio

μg de glucosa

producida/ml de

naringina hidrolizada

0.05 83 110.273

0.1 109 155.293

0.2 136 200.462

0.4 155 232.996

0.6 178 272.380

0.8 197 304.332

1 219 344.948

1.2 240 381.155

1.4 260 415.637

1.6 283 455.293

1.7 294 474.258

1.8 305 510.465

1.9 316 512.189

_________________________________________________________________ ANEXOS

104

Figura 4A. Curva tipo de naringina, Y= 129.22+ 80.535, R2= 0.921.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

UK

microgramos de glucosa producida/ml de naringina hidrolizada

_________________________________________________________________ ANEXOS

105

Anexo 4. Curva tipo de glucosa.

Figura 5A. Curva tipo de Azúcares reductores obtenida por el método del ácido

3,5-dinitro salicílico (DNS) donde Y=0.6456x - 2.2889; R2=0.987.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 200 400 600 800 1000 1200

UK

de g

luc

os

a

microgramos de glucosa /ml

_________________________________________________________________ ANEXOS

106

Anexo 5. Determinación de las constantes de Vmáx y Km para la naringinasa de

P. decumbens por los métodos gráficos de Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk,

Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson.

Cuadro 4A. Parámetros Michaelis-Menten, Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen y

Agustinson para la naringinasa de P. decumbens.

Michaelis-Menten Lineweaber-Burk Agustinson Eadie-Hofsteen

[s] mM V μg/min 1/[S] 1/V [S]/V S V V/[S]

1.51 132.2 0.66 0.00358 0.0054 1.5 309 154.5

2 154 0.5 0.00324 0.0065 2 357 142.8

0.5 214.4 0.4 0.0028 0.007 2.5 385 128.33

1 244 0.33 0.0026 0.0078 3 424 121.1

1.5 279.5 0.29 0.00236 0.0083 3.5 465 116.3

2 309 0.25 0.00215 0.0086 4 --

2.5 357 -- -- -- -- --

3 385 -- -- -- -- --

3.5 424 -- -- -- -- --

4 465 -- -- -- -- --

4.5 540 -- -- -- -- --

_________________________________________________________________ ANEXOS

107

Cuadro 5A. Parámetros de Vmáx y Km para las curvas de Michaelis- Menten,

Lineweaber-Burk, Eadie-Hofsteen, Agustinson y Wilkinson para la naringinasa de

P. decumbens.

Curva Vmax Km

Lineweaver-Burk 3.968 2.5

Eadie-Hofsteen 4.379 4.8

Agustinson 4.88 3.7

Wilkinson 2.92 8.4

La Vmáx esta expresada en U/mg proteína donde una U = cantidad de enzima

para liberar 1μmol de glucosa/ min.

_________________________________________________________________ ANEXOS

108

Figura 6A. Curva de Michaelis–Menten para naringinasa de Penicillium

decumbens donde Y= 83.256x+145.42; R2=0.9842.

0

100

200

300

400

500

600

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5

μg

/ m

in

mM

_________________________________________________________________ ANEXOS

109

Figura 7A. Curva de Lineweaber-Burk para naringinasa de Penicillium decumbens

Y= 0.0035x+0.0014; R2=0.9722.

0

0.0005

0.001

0.0015

0.002

0.0025

0.003

0.0035

0.004

0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7

min/μg

mM-1

_________________________________________________________________ ANEXOS

110

Figura 8A. Curva de Eadie-Hofsteen para naringinasa de Penicillium

decumbens.

y = -3.703x + 879.0R² = 0.949

250

300

350

400

450

500

110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160

μg

/min

μg/min•mM

_________________________________________________________________ ANEXOS

111

Figura 9A. Curva de Agustinson para naringinasa de Penicillium decumbens.

y = 0.001x + 0.004R² = 0.978

0.005

0.0055

0.006

0.0065

0.007

0.0075

0.008

0.0085

0.009

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