Inmunohematologiabasica (2011) (1)
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Dr. Silvio Rosell 24/10/2011
Escuela de Técnicos en Hemoterapia e Inmunohematología UBA
Hospital de Clínicas
INMUNOHEMATOLOGIA. C.- Consideraciones generales. Uso de diferentes
medios: salino, albuminoso, soluciones de baja fuerza iónica (LISS), enzimático, polybrene, polietilenglicol,
antiglobulínico, etc.
Diferentes enfoques de la compatibilidad pretransfusional. Interpretación de los resultados de las técnicas de detección de anticuerpos y pruebas
pretransfusionales.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Aglutinación
• La aglutinación es la agregación, mediada por anticuerpos, de las partículas que expresan antígenos de superficie.
• Tiene dos etapas
1. Sensibilización
2. Formación de puentes entre las células sensibilizadas.
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Hemólisis
• La hemólisis es la destrucción de los glóbulos rojos, con liberación de la hemoglobina intracelular
• La hemólisis no ocurre si los antígenos interactúan con los anticuerpos en sueros sin complemento o plasma con anticoagulante
• La hemólisis constituye un resultado positivo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Uniones químicas en la aglutinación
• Uniones polares • Puentes de hidrogeno entre grupos hidrofílicos
• Suelen asociarse a antígenos hidrocarbonados
• Uniones hidrófobas • En general involucran a antígenos proteicos
• Uniones o fuerzas de Van der Waals – London
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Factores a tener en cuenta
• El grado de ionización de las moléculas
– Depende fundamentalmente del pH del medio
• Constante de equilibrio (afinidad de los anticuerpos)
– Deriva de las tasas relativas de asociación y disociación
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Factores que afectan la aglutinación (primera fase)
• Temperatura • Los antígenos hidrocarbonados suelen relacionarse
con anticuerpos reactivos en frío y los proteicos con anticuerpos reactivos en caliente
• PH • En la mayoría de las pruebas de rutina debe
emplearse un pH de alrededor de 7
• La solución salina almacenada tiene un pH de 5-6
• Es mejor usar solución salina amortiguada
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Factores que afectan la aglutinación (primera fase)
• Tiempo de incubación – En los sistemas salinos que utilizan suero
antiglobulínico para demostrar la fijación, la incubación a 37ºC durante 30-60 minutos permite detectar la mayoría de los anticuerpos significativos
• Relación Ag / Ac – Lo habitual es usar dos gotas de suero por cada gota
de suspensión de glóbulos rojos al 2-5%
– Muy rara vez, el exceso de anticuerpos puede inhibir la aglutinación y provocar un fenómeno de prozona
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Factores que afectan la aglutinación (primera fase)
• Potencia iónica • Cuando se utiliza solución salina de baja fuerza
iónica (LISS) el tiempo de incubación a 37ºC se reduce a 10-15 minutos
• El uso de LISS abrevia la incubación en la detección de anticuerpos de rutina
• Prolongarla podría deteriorar la sensibilidad de la prueba
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Segundo estadío de la aglutinación
La distancia entre los eritrocitos en un medio iónico
es proporcional al potencial Z
El agua de hidratación es la propiedad física más importante
que mantiene la distancia entre los glóbulos rojos suspendidos
en solución salina
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Proporciones
La inhibición de la aglutinación por exceso de
anticuerpos es sumamente infrecuente
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Para visualizar la reacción Ag/Ac:
• La centrifugación promueve el acercamiento físico de las células
• La prueba antiglobulínica indirecta emplea suero antiglobulínico
• Otros métodos actúan: – reduciendo la carga negativa de las moléculas
superficiales
– disminuyendo la capa de hidratación que rodea a las células
– introduciendo macro moléculas con carga positiva que las agregan
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Métodos Potenciadores
• Albúmina Humana
• LISS (Low ionic saline solution)
• PEG (Polietilenglicol)
• POLYBRENE (BHDM)
• Técnicas con enzimas proteolíticas
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
ALBUMINA (Sol de albúmina bovina al 30%, 22%, 6%, 3%)
• Disminuye el potencial Z, favoreciendo la 2º fase de la aglutinación.
• En concentraciones de 30% o >favorece la aparición de rouleaux
• En la PCI no aumenta la sensibilidad de la prueba
• Por falta de ventajas objetivas está en desuso
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Enzimas Proteolíticas
• Bromelina, ficina, papaína y tripsina – (Las más usadas)
• Desnaturalizan ciertos antígenos eritrocitarios, en especial M, N, S, Fya y Fyb, XG
• Disminuyen la carga superficial de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las cadenas polisacáridas
• El tratamiento enzimático lleva a la formación de espículas en los GR y aumenta así el número potencial de puntos de contacto
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Moléculas con carga positiva Bromuro de Hexadimetrina, Sulfato de Protamina,
Polilisina B.
• Ante estos polímeros los GR normales exhiben agregación espontánea, que puede dispersarse con sales neutras como el citrato de sodio
• El BHDM es un polícatión de amonio cuaternario que neutraliza las cargas negativas de los GR.
• Favorecen la aglutinación por Ig G
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
POLYBRENE
• El Polybrene se añade a los GR incubados con anticuerpos a baja potencia iónica y bajo pH
• Si se adiciona citrato de sodio, se restablece la carga del GR
• Si el aglutinado se disocia – prueba negativa
• Si el aglutinado persiste – prueba positiva (aglutinación irreversible a los GR
sensibilizados con Acs)
• Tiene sensibilidad disminuida en la detección de anticuerpos del sistema Kell
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Polietilenglicol (PEG)
• El PEG es un polímero lineal hidrosoluble que se usa como aditivo para incrementar la captación de anticuerpos
• Su acción principal es eliminar el agua intercelular favoreciendo el acercamiento de los GR
• No debe centrifugarse el PEG con el suero y GR
– Se lavan las células con solución salina y luego se efectúa la prueba antiglobulínica
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Polietilenglicol (PEG)
–El reactivo AGH de elección en las pruebas con PEG suele ser el anti-IgG
• evita las reacciones falsas positivas con algunos agentes poliespecíficos
–Precipitados podrían interpretarse como reacciones positivas
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Solución salina de baja fuerza iónica
(LISS) • Potencia mucho la captación eritrocitaria de
anticuerpos en la fase I de la aglutinación
– La cantidad de iones +/- del LISS (0,03 M) es menor al de la SF (0.17M)
• En la actualidad la mayoría de los profesionales usa aditivos LISS
• Contiene macromoléculas además de sales iónicas y amortiguadores
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Solución salina de baja fuerza iónica (LISS)
• Puede aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ags y Acs
• El aumento del volumen de suero acrecienta la potencia iónica del sistema LISS – aditivo
• Se deben respetar estrictamente las instrucciones del fabricante
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
LISS
• Ventajas:
– Aumenta la sensibilidad de la PCI para detectar Acs clínicamente significativos
– Detecta Acs en baja concentración y los de baja afinidad que pueden perderse con los lavados
– Reduce el tiempo de incubación
• Desventajas:
– Debe ser sometido a estricto control de osmolaridad para evitar la fijación inespecífica de C
– Los GR suspendidos el LISS deben ser procesados dentro de las 24 hs
– Menor sensibilidad para anti-K. (1º fase de aglutinación)
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Otros Métodos para detectar reacciones Ag-Ac
• Adherencia eritrocitaria en fase sólida (Microplacas)
• Aglutinación en columna, pruebas en gel y separación por afinidad
• Inmunofluorescencia
• Pruebas Inmunoabsorbentes ligadas a las enzimas (ELISA)
• Inmovilización de Antígenos Eritrocitarios con Anticuerpos Monoclonales Específicos (IAEAM)
• Radioinmunoensayo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Gel, microcolumnas • Las reacciones se producen en
microcolumnas que contienen mezclas de cuentas de vidrio o gel, amortiguadores y a veces reactivos
• Se establecen barreras de densidad permiten separar el suero problema de los eritrocitos
• Una de sus ventajas es que se evita el lavado con solución salina
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Micrométodos, Microplacas
• Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados
• Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados
• En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva
• Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Hacemos un breve intervalo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Prueba antiglobulínica, principios
• Todas las moléculas de anticuerpo son globulinas
• Los dos puntos Fab de la molécula de AGH forman un puente entre células adyacentes recubiertas con anticuerpos y provocan aglutinación visible
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
AGH poliespecífico
• La mezcla poliespecífica podría reaccionar con las cadenas livianas kappa y lambda presentes en todas las clases de inmunoglobulinas
• Muy pocas veces se reconoce a los anticuerpos por su capacidad de fijación de complemento
• La actividad anti-C3d es importante para la PAD
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Reactivos AGH monoespecíficos
Anti-IgG, anti-C3b, anti-C3d • Anti-IgG
– Carecen de actividad anti- complementaria
• Pueden ser o no específicos para cadenas pesadas
• Pueden ser o no Monoclonales
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Detección de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)
• Objetivos:
– Detectar la mayor cantidad posible de anticuerpos significativos
– Detectar la menor cantidad posible de anticuerpos no significativos
– Completar los procedimientos en un lapso razonable
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Muestras
• Se puede utilizar suero o plasma
• El plasma no es adecuado para apreciar la activación del complemento
• Los GR de donantes múltiples se emplean en la evaluación de muestras de donantes pero no de receptores
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Detección de anticuerpos antieritrocitarios inesperados. (DAI)
• La pesquisa de anticuerpos inesperados
requiere:
– GR reactivos de donante único
– Métodos que identifiquen a los Acs significativos
– Que incluyan una prueba antiglobulínica precedida de incubación a 37ºC
• La magnitud de la aglutinación o el grado de hemólisis debe registrarse de inmediato
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Pruebas de compatibilidad • Si se identifican o identificaron anticuerpos
relevantes el paciente debe recibir sangre sin los antígenos correspondientes aunque los GR portadores de esos antígenos sean compatibles in vitro
• La evaluación pretransfusional no requiere control autólogo ni PAD
• La técnica de compatibilidad más simple es la centrifugación inmediata
• Detecta la incompatibilidad ABO y pueden detectarse anticuerpos anti-M, anti-N y anti-P1
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Compatibilidad informatizada
Fundamento:
• Si la pesquisa y los antecedentes no revelan anticuerpos significativos, es factible omitir la prueba cruzada en fase antiglobulínica y sólo confirmar la compatibilidad ABO
• Su mayor dificultad radica en la validación de la metodología a utilizar
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Tipificación y detección (Type and Screen)
• La metodología de tipificación y detección consiste en determinar el tipo ABO y Rh y la presencia de anticuerpos imprevistos en una muestra de sangre del paciente y luego guardarla para una eventual prueba cruzada
• Su indiscutible ventaja es de tipo logístico
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Selección de unidades para transfusión
• Después de identificar los anticuerpos es preciso definir su significado clínico
• El grado de relevancia clínica podría variar aún en el caso de anticuerpos de igual especificidad
• Los anticuerpos reactivos a 37ºC y/o en la PAI, podrían ser relevantes y los reactivos a temperatura ambiente o menor, no
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Excepciones a los resultados de las pruebas de rutina
• Anti-Ch, anti-Rg y muchos de los Knops y
Cost, ejercen efectos clínicos mínimos o nulos a pesar de la PAI positiva
• Los anti-Vel, anti-P y anti-Tja podrían reaccionar sólo a bajas temperaturas y aún así causar destrucción celular in vivo
24/10/2011 Dr. Silvio Rosell
Gracias por su atención