InmunohematobasicaII (2011) (1)

24/10/2011 Dr. Silvio Rosell

Escuela de Técnicos en Hemoterapia

e Inmunohematología UBA

Hospital de Clínicas

Procedimientos serológicos seleccionados.

Uso de agentes reductores. Sustancias solubles de grupos sanguíneos. Adsorción. Elución: diferentes técnicas. Titulación. Disociación de IgG por cloroquina. Micrométodos. Automatización. Uso de

anticuerpos monoclonales.


Empleo de reactivos sulfhidrilo

Ditiotreitol (DTT)

2-Mercaptoetanol (2-ME)

2-Aminoetilisotiouronio (AET)

Mecanismo de acción • Clivan los puentes disulfuro que unen las

subunidades monoméricas de los pentámeros de IgM (19S en 7S)

• Los puentes intercatenarios de las IgG monoméricas son bastante resistentes al clivaje


Reactivos sulfhidrilo

Usos

Determinación de la clase de inmunoglobulina de los Acs

Identificación de las especificidades en mezclas de Acs, IgM e IgG (desenmascarar)

Determinación del monto relativo de IgG e IgM en una especificidad dada

Disociación de aglutinatos eritrocitarios por IgM (crioglobulinas)


Reactivos sulfhidrilo

Usos

Destrucción de antígenos eritrocitarios seleccionados para investigación de Acs

(Kell, Dombrock, Cartwright, Gerbich y LW)

Combinación con enzimas proteolíticas, para disociar los Acs IgG de GR (ZZAP)

DTT + Papaína activada con cisteína

La cisteína forma puentes disulfuro que contribuyen al plegamiento de las proteínas


Empleo de reactivos sulfhidrilo para

distinguir los anticuerpos IgM e IgG

Principios

El tratamiento de los Acs IgM, anula las actividades aglutinante y fijadora de complemento

La visualización de la actividad de los Acs antes y después del tratamiento con sulfhidrilos es útil para determinar la clase de inmunoglobulina

El tratamiento con sulfhidrilos también se emplea para abolir la actividad de los anticuerpos IgM y permitir la detección de IgG coexistentes


Ditiotreitol (DTT) 0,01 M

Preparación • Diluir 0,154 g de DTT en 100 ml de PBS a pH 7,3

Conservación • 2 a 6 ºC

Los reactivos sulfhidrilos en baja concentración debilitarían los Ag del sistema Kell

Pudiera observarse gelificación de la muestra Causas • Preparación incorrecta del DTT o concentración

superior a 0,01 M. • Incubación de suero y DTT prolongada

Las muestras gelificadas no pueden estudiarse


Pruebas de inhibición de la

hemaglutinación

Algunos antígenos de grupo sanguíneo están presentes en formas solubles en saliva, orina y plasma

Estas sustancias pueden utilizarse para inhibir la reactividad de los anticuerpos correspondientes

La inhibición también permite neutralizar anticuerpos que enmascaran la presencia de otros no neutralizables


Adsorción

Para los procedimientos de adsorción no existe un procedimiento único ideal

Para incrementar la captación de

anticuerpos puede aumentarse la proporción de antígenos utilizando un

volumen celular mayor

La temperatura de incubación debe ser la de reactividad óptima de los

anticuerpos


Adsorción

Las pruebas de adsorción requieren un volumen importante de GR

Los eritrocitos testigos de los paneles comerciales resultan insuficientes

• las fuentes mas convenientes pueden ser unidades donadas o muestras de sangre del personal de los fenotipos deseados


Elución

Las técnicas de elución liberan las moléculas

de Acs de los GR sensibilizados

Los Acs fijados pueden liberarse:

• por modificación de la termodinámica de las reacciones Ag-Ac

• neutralización o reversión de las fuerzas de atracción que mantienen unidos a los complejos

• alteración de la concordancia estructural entre los Ag y los puntos de fijación en las moléculas de Acs


Elución

Usos

Las técnicas de elución pueden servir para:

• Investigar una PAD positiva

• Concentrar y purificar Acs, detectar Ag de expresión débil e identificar especificidades múltiples (junto a adsorción)

• Preparar GR sin Acs para fenotipificación o estudios de adsorción autólogos.


Elución

Si el eluato reacciona con todas las células

• Alta probabilidad de que se deba a autoanticuerpos

Si el paciente no fue transfundido en fecha reciente y no existen Acs séricos inesperados no se requieren estudios serológicos adicionales


Técnicas para elución de anticuerpos

Calor (56ºC) Calor suave (45ºC) Congelación-descongelación Frío-ácido Digitonina-ácido Diclorometano (DCM) Glicina-HCl / EDTA CLOROFORMO XILENO ETER



Calor (56ºC)

Ventajas

Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO

Rápido y fácil

Desventajas

Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo



Congelación-descongelación

Ventajas

Adecuado para EHRN por incompatibilidad ABO

Rápido y fácil

Requiere un volumen celular reducido

Desventajas

Recuperación escasa de otros auto y aloanticuerpos de grupo sanguíneo



Frío-ácido

Ventajas

Rápido y fácil

Sensibilidad comparable a digitonina-ácido

Desventajas

Menos sensible para auto y aloanticuerpos reactivos en caliente



Digitonina-ácido

Ventajas

No peligroso

Recuperación adecuada de la mayoría de los Acs significativos

Kit comercial

Desventajas

El lavado del estroma es lento

Baja sensibilidad sistema Kidd



Diclorometano (DCM)

Ventajas

Adecuado para anti-K

No inflamable

Desventajas

Tóxico

Recuperación escasa de anti-Fyb



Glicina-HCl / EDTA

Ventajas

Apropiado para preparar eluatos y obtener células PAD negativas

No destruye las células tratadas

Sensibilidad comparable a digitonina-ácido

Desventajas

Desnaturaliza los Ag del sistema Kell



CLOROFORMO

Ventajas

Método de acción rápida

Líquido no inflamable

Recuperación de la mayoría de los anticuerpos significativos

Desventajas

Sustancia reconocida como carcinogénica

Altamente tóxico

Efecto narcótico inhalatorio



XILENO

Ventajas

Buena recuperación de la mayoría de los Acs significativos

Desventajas

Carcinogénico

Tóxico

Narcótico

Provoca hemólisis



ETER

Ventajas

Excelente recuperación de la mayoría de los Acs de grupo sanguíneos

Desventajas

Narcótico

Tóxico

Explosivo

Muy inflamable

Poca recuperación de anti-S-s


Titulación

Principios

Es un método semicuantitativo que se emplea para determinar la concentración de Acs en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresión antigénica en distintas muestras de GR


Titulación

Aplicaciones Estimar actividad de Acs en embarazadas

alosensibilizadas Definir la especificidad relativa de los

autoanticuerpos Caracterizar Acs de título alto baja avidez

(TABA) • Ejemplo

Knops y Chido-Rodgers, Csa y JMH

Observar el efecto de los reactivos sulfhidrilo sobre el comportamiento de los Acs (IgG o IgM)

Monitoreo de IgG en embarazadas


Titulación

Interpretación

Observar la mayor dilución que produce aglutinación 1+

El título es la inversa de la dilución

Si se advierte aglutinación en el tubo que contiene el suero mas diluido no se alcanzó el punto final

En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de 3 diluciones

Los títulos solos sin la evaluación adicional de la intensidad de la aglutinación pueden ser engañosos


Titulación

Score • Asignar un valor numérico a la

intensidad de la aglutinación

• La suma correspondiente a todos los tubos representa el score

• El umbral significativo arbitrario para comparar los puntajes es de 10 ó más

Por ser un método semicuantitavo la variabilidad técnica puede desviar los resultados


Titulación Claves Técnicas

• Calidad de las pipetas y su utilización

• Respetar tiempo y temperatura de incubación

• Duración y potencia de centrifugación

• La antigüedad, el fenotipo y la concentración de las células influyen en los resultados

Es casi imposible lograr resultados reproducibles en su totalidad • Las comparaciones son válidas con análisis

simultáneos

Se disminuye la variabilidad con la utilización de mayores volúmenes


Disociación de la IgG de los GR con

PAD positiva

Los GR con PAD positiva no pueden tipificarse con reactivos que requieran una técnica de AGH

En condiciones controladas, el difosfato de cloroquina disocia la IgG de la membrana de los GR sin afectar su integridad.

Esto permite la fenotipificación completa de los GR recubiertos con autoanticuerpos reactivos en caliente


Cloroquina

Reactivos Necesarios

Solución de difosfato de cloroquina preparada disolviendo 20 g en 100 ml de SF

Ajustar el pH a 5,1 con OH-Na 1 N

Conservación 2 a 6º C

Se necesitan GR de control portadores de una dosis simple de los antígenos a fenotipificar

Se utiliza reactivo anti-IgG monoespecífico


Cloroquina Limitaciones técnicas

No disocia el complemento de la membrana celular

Incubación no > de 2 hs. causa hemólisis y/o pérdida de reactividad antigénica

Los Ag del sistema Rh podrían experimentar cierta desnaturalización.

Pudieran no eliminarse por completo los Acs de los GR sensibilizados

sólo atenuar la intensidad de la PAD

La cloroquina atenúa la expresión de Ag HLA de Clase I eritrocitarios


Micrométodos, Microplacas

Utilizan antígenos o anticuerpos inmovilizados.

Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados

En la prueba indirecta si las células indicadoras se adhieren a las paredes de la cubeta, la reacción es positiva

Si sedimentan no se produjo reacción Ag-Ac


Anticuerpos monoclonales

Una célula B estimulada da origen a una progenie clonal que produce Acs específicos para un epítopo

El sobrenadante del cultivo de un clon de células B contiene Acs de especificidad única.

• Los eventos posteriores a la activación pueden inducir diferencias en el isotipo de las cadenas pesadas

• la especificidad idiotípica codificada en las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas no se modifica.



Hibridomas

La fusión de células plasmáticas normales, productoras de anticuerpos, con células plasmáticas neoplásicas permite obtener líneas celulares con capacidad reproductiva infinita.



Aplicaciones

Los Acs que reaccionan en forma específica e intensa con un solo epítopo, que forma parte de Ag multivalentes, pudieran no reconocer al Ag ante la falta de esa configuración particular



Aplicaciones

Los reactivos usados en los bancos de sangre son mezclas de distintos productos monoclonales que permiten incrementar las variantes fenotípicas que el antisuero puede reconocer

Solos o mezclados suelen reaccionar con mayor intensidad con los Ag de expresión débil que los sueros inmunes

Para individualizar y caracterizar sistemas antigénicos complejos se utilizan baterías de diferentes especificidades monoclonales



Las especificidades antiglobulínicas monoclonales se emplean para reconocer distintas clases de inmunoglobulinas o fracciones del complemento sobre la membrana eritrocitaria

Las mezclas de varios reactivos monoclonales se utilizan para elaborar los reactivos poliespecíficos


Hacemos un breve intervalo


Procedimientos Inmunohematológicos

en paciente con autocontrol o PAD

positiva


Verificar Hemólisis

Macroscópica

BI

Haptoglobina

LDH

Hemoglobina libre en plasma y orina

Si no hay clínica ni laboratorio de hemólisis no se justifican estudios adicionales

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Paciente con autocontrol o PAD

positiva

Siempre comenzar por verificar la

existencia de antecedentes transfusionales recientes

Puede tratarse de:

• Autoanticuerpos reactivos en frío

• Autoanticuerpos reactivos en caliente


Autoanticuerpos reactivos en caliente

La reactividad de la mayoría de los

autoanticuerpos reactivos en caliente aumenta con el uso de PEG y enzimas

Es conveniente realizar la DAI sin los medios potenciadores habituales

Si los resultados son negativos puede emplearse el mismo procedimiento para la prueba de compatibilidad sin necesidad de adsorciones


Transfusiones recientes

Si el autocontrol es positivo en la fase AGH, podría haber células recubiertas con Acs que determinan una PAD positiva con campo mixto

La elución podría ser útil en especial cuando las pruebas séricas no son concluyentes



En el paciente con PAD positiva transfundido en fecha reciente o no, podría ser difícil obtener el fenotipo exacto de los GR

Muchos reactivos monoclonales pueden proporcionar resultados válidos a pesar de la PAD positiva



La elución concentra las pocas moléculas de inmunoglobulina presentes en los GR de la preparación inicial en un volumen reducido

Es excepcional que las células

transfundidas generen un control positivo en otras fases de la prueba, pero puede ocurrir si existen neo o crioaloanticuerpos


Pensemos

Implementación de algoritmos operativos para la utilización racional de los recursos


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Vale disfrutar si el esfuerzo no fue en vano

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