inm
6
Técnica de producción Ac monoclonales El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente, cuatro meses . Para ello, se inyecta en ratones el antígeno, aún cuando no esté puro. Luego de un período de espera que permite un aumento de los linfocitos B específicos, se sacrifica el ratón y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con células mielomatosas (células de un tumor de linfocitos), agregando además polietilenglicol, un agente que facilita la fusión. Con esto se consigue que algunas células mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra así una célula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la célula mielomatosa. No todas las células logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el contrario, un escaso número de ellas (sólo una cada 2 x 105 de las células del bazo). De allí que sea necesario eliminar todas aquellas células que no se fusionen (linfocitos y células mielomatosas). Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas divisiones, mueren. El problema más complicado es eliminar las células del mieloma, que si continúan multiplicándose. Las células mielomatosas que se utilizan para la fusión han sido genéticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para la síntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosil trarferasa. Cuando estas células mielomatosas mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas también mueren. Sin embargo, si se logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al poco tiempo, en el cultivo sólo quedan las células fusionadas (hibridomas). Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce el anticuerpo específico que se desea. Muchas técnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas específicos, siendo la más usada aquella que utiliza un radioinmunoanálisis. Para ello, se fija el antígeno específico en el fondo de pocillos de plástico. Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el líquido del cultivo donde están creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos en que las colonias secretan el anticuerpo específico éste va a reaccionar con el antígeno que se ha fijado al plástico, los demás se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo (marcado con un radioisótopo) que reacciona solamente con la molécula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo anticuerpo específico contra los anticuerpos monoclonales). Después de un tiempo de incubación apropiada, nuevamente se lavan los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qué pocillo está la radioactividad .La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una población proveniente de una sola célula (clon). Para ello, las células se diluyen hasta lograr que una célula quede en un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta célula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De allí en adelante estas células se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre (figura 2). Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratón donde se multiplican y desarrollan como un cáncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este método es útil para el trabajo de laboratorio, pero no es práctico ni económico para la producción comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el método llamado Encapel, que consiste en capsular los hibridomas, en pequeñas esferas . Primero se colocan los hibridomas en una solución biocompatible de alginatos (sustancia derivada
description
no
Transcript of inm
Tcnica de produccin Ac monoclonales
El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente, cuatro meses . Para ello, se inyecta en ratones el antgeno, an cuando no est puro. Luego de un perodo de espera que permite un aumento de los linfocitos B especficos, se sacrifica el ratn y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con clulas mielomatosas (clulas de un tumor de linfocitos), agregando adems polietilenglicol, un agente que facilita la fusin. Con esto se consigue que algunas clulas mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra as una clula que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la capacidad de multiplicarse indefinidamente de la clula mielomatosa. No todas las clulas logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el contrario, un escaso nmero de ellas (slo una cada 2 x 105 de las clulas del bazo). De all que sea necesario eliminar todas aquellas clulas que no se fusionen (linfocitos y clulas mielomatosas).
Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas divisiones, mueren. El problema ms complicado es eliminar las clulas del mieloma, que si continan multiplicndose. Las clulas mielomatosas que se utilizan para la fusin han sido genticamente alteradas, de modo que les falta una enzima vital para la sntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosil trarferasa. Cuando estas clulas mielomatosas mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas tambin mueren. Sin embargo, si se logran fusionar con linfocitos normales, sobreviven, porque los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al poco tiempo, en el cultivo slo quedan las clulas fusionadas (hibridomas).
Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce el anticuerpo especfico que se desea. Muchas tcnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas especficos, siendo la ms usada aquella que utiliza un radioinmunoanlisis. Para ello, se fija el antgeno especfico en el fondo de pocillos de plstico. Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el lquido del cultivo donde estn creciendo las colonias de hibridomas. En aquellos casos en que las colonias secretan el anticuerpo especfico ste va a reaccionar con el antgeno que se ha fijado al plstico, los dems se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo (marcado con un radioistopo) que reacciona solamente con la molcula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo anticuerpo especfico contra los anticuerpos monoclonales). Despus de un tiempo de incubacin apropiada, nuevamente se lavan los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qu pocillo est la radioactividad .La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una poblacin proveniente de una sola clula (clon). Para ello, las clulas se diluyen hasta lograr que una clula quede en un micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta clula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo monoclanal. De all en adelante estas clulas se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre (figura 2).
Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratn donde se multiplican y desarrollan como un cncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este mtodo es til para el trabajo de laboratorio, pero no es prctico ni econmico para la produccin comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha buscado otra forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el mtodo llamado Encapel, que consiste en capsular los hibridomas, en pequeas esferas . Primero se colocan los hibridomas en una solucin biocompatible de alginatos (sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se encapsulan con una membrana de polmeros de almidn. La porosidad de la membrana de la cpsula permite que los gases y nutrientes fluyan al interior y que los productos de desechos, salgan de ella. Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en su interior, las cpsulas se rompen y se recolecta la protena .---------otro texto encontrado------Para produciranticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B delbazode un animal que ha sido expuesto al antgeno. Estas clulas B son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con clulas tumorales demieloma mltiple(un tipo de cncer) que pueden crecer indefinidamente encultivo celular. Esta fusin hace a lasmembranas celularesms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas, llamadashibridomaspueden multiplicarse rpida e indefinidamente (ya que son clulas tumorales despus de todo) y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales producen slo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de unirse a un antgeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamadoELISA, y para seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva.El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es complejo. Primero se disgrega el bazo del ratn inmunizado, donde se acumulan los linfocitos B que tienen una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con clulas de mieloma deficientes en enzimas implicados en la sntesis del nuevo ADN como latimidina quinasa(TK) o lahipoxantina guanina fosforibosil transferasa(HGPRT). Los productos de la fusin celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de hipoxantina, aminopterina y timidina) donde las clulas mielmicas son eliminadas. Solamente pueden crecer en el medio de cultivo HAT las clulas que son producto de la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma. Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin contienen un nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas clulas pierden la capacidad de secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin para evitar el crecimiento de clulas no productoras que al sermetablicamentems eficientes acabaran por dominar el cultivo.
Tiselius y Kabat
En 1939 tiselius y kabat realizaron estudios electroforticos con antisuero de conejo especfico para OVA. Ellos encontraron que la electroforesis del suero de conejos inmunizados resultaron protenas del suero en 4 familias dominantes con diferente movilidad. La fraccin de la albumina era la mas rpida en migrar (mas negativa) seguida por la alpha, beta,y gamma globulinas. Tiselius y kabat continuaron inmunizando a los conejos con la OVA de gallina para conseguir una fuerte respuesta de anticuerpos.Cuando ellos pusieron en electroforesis el suero inmunizado, ellos observaron un gran incremento en la fraccin de gamma-globulina y concluyeron que los anticuerpos eran gammaglobulinas.----otro-----selius y Kabat sometieron a electroforesis el suero de conejos inmunizados con albmina de huevo y demostraron que la actividad de anticuerpo se encontraba en el tercer pico del desplazamiento electrofortico de las protenas, tambin conocido como pico gamma, por lo que muy pronto se llam gammaglobulinas a los anticuerposUsos gammaglobulinaLa gammaglobulina tiene varios usos, en especial en enfermedades infecciosas para las que no hay tratamiento especfico, como la rabia, la hepatitis, el ttano, y en las deficiencias de inmunidad, La enfermedad de Kawasaki existen gammaglobulinas polivalentes que se usa para elevar las defensas de personas que estn expuestas a algn contagio o en las que tienen bajas sus propias defensas. La enfermedad de Kawasaki es una vasculitis sistmica aguda; qu significavasculitis: que las paredes de los vasos sanguneos se han inflamado y qu significasistmica, que se produce en ms de una localizacin. YAguda; que el tiempo de inicio y fin de la enfermedad es de corta duracin.La gammaglobulina constituye la base del tratamiento, ya que es capaz de disminuir el riesgo de aparicin de las alteraciones coronarias en una gran proporcin de pacientes.
ventajasdejerne detectarpequeosnmerosdeclulasproductorasde anticuerpo, entre poblacionesde grantamao.
