IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Córdoba, Argentina, 14 a 16 de Noviembre de 2012

Infusión de Stevia rebaudiana Bertoni: sólidos totales, esteviolglicósidos endulzantes y actividad

antioxidante

Celaya L.S.1, Cabana R. del C.

1, Viturro C.I.

1, Molina A.C.

1, Kolb Koslobsky N.

2

1: Laboratorio PRONOA - FI, Universidad Nacional de Jujuy, S. S. de Jujuy, Jujuy, Argentina.

2: Laboratorio Central, FCEQyN, Universidad Nacional de Misiones, Posadas, Argentina.

lilianacelaya@hotmail.com

Resumen: Stevia rebaudiana Bertoni es una hierba perene originaria del Paraguay, reconocida por los principios

endulzantes contenidos principalmente en las hojas, esteviolglicósidos. El objetivo del presente trabajo fue

caracterizar infusiones de S. rebaudiana variedad mejorada a través de la determinación de sólidos totales,

glicósidos endulzantes, poder edulcorante relativo a sacarosa y actividad antioxidante. El contenido de

Esteviósido, Rebaudiósido A, Rebaudiósido C del material de partida (% b.s.) fue: 3,544; 11,809; 1,313

respectivamente. El contenido de sólidos totales de las infusiones es 0,542 g/100 mL. El poder endulzante en

relación a la sacarosa equivale a 32 g de azúcar/g de hoja. El IC50 determinado a los 5 minutos es 0,0342 g/100

mL y difiere significativamente del determinado a 30 minutos: 0,0296 g/100 mL. Se estima que para preparar

una infusión de 200 mL endulzada con S. rebaudiana de la variedad estudiada, sólo se requieren 0,200 g – 0,400

g de hojas molidas, con un poder endulzante equivalente a una o dos cucharaditas de azúcar y un IC72 - IC96,

respectivamente. La infusión de stevia, además de su capacidad endulzante se presenta como una fuente

accesible de antioxidantes naturales beneficiosos para la salud.

Palabras clave: infusión, stevia, sólidos totales, esteviolglicósidos, antioxidantes

Abstract: Stevia rebaudiana Bertoni is a perennial herb native to Paraguay, recognized by the sweetener

principles contained primarily on leaves, steviol-glycosides. The aim of this study was to characterize S.

rebaudiana improved variety infusions through the determination of total solids, sweeteners glycosides, relative

sweetness to sucrose and antioxidant activity. The content of Stevioside, Rebaudioside A, Rebaudioside C

starting material (% db) is: 3.544, 11.809, 1.313 respectively. The total solid content of the tea is 0.542 g/100

mL. The power sweetener in relation to sucrose is equivalent to 32 g of sugar / g leaf. The IC50 determined at 5

minutes is 0.0342 g/100 mL and differs significantly from the value determined at 30 minutes: 0.0296 g/100 mL.

It is estimated that to prepare 200 mL infusion sweetened with the studied variety of S. rebaudiana, only 0.200 g

- 0.400 g of ground leaves are required, with a sweetening power equivalent to one or two teaspoons of sugar

and IC72 - IC96, respectively. The infusion of stevia besides its sweetener capacity appears as an accessible

source of health beneficial natural antioxidants.

Keywords: infusion, stevia, total solids, steviol-glycosides, antioxidants

INTRODUCCIÓN

Stevia rebaudiana Bertoni es una especie vegetal del género Stevia, hierba perenne originaria del Paraguay,

reconocida por los principios endulzantes contenidos principalmente en las hojas, esteviolglicósidos (Geuns

2003). Ha sido utilizada durante siglos por mestizos y aborígenes del Paraguay para endulzar infusiones o

contrarrestar el sabor amargo de diversas preparaciones medicinales (Chattopadhya 2007, Midmore y Rank

2002, Brandle 1998).

Edulcorantes sólidos purificados y extractos acuosos sin purificar o parcialmente purificados tienen uso como

endulzantes y proporcionan sabor dulce en pequeñas cantidades (Chabot y Beaulieu 2012, Abou-Arab et al

2010, Singh y Verma 2009). En el año 2007, el Comité Mixto JECFA aprobó los esteviolglicósidos como

aditivos (JECFA/68 2007) y en 2011, se modificó la Legislación Argentina adoptando la denominación de

esteviol glicósidos para los fitoquímicos obtenidos de la stevia o estevia (CAA 2011). Actualmente, el CAA

aprueba el uso de las hojas adicionadas al té o hierbas para infusiones como medio para proporcionar dulzor

(CAA 2012).

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Al realizar la extracción por infusión se obtiene una mezcla conteniendo los principios valiosos y materiales

vegetales característicos (JECFA/69 2008): polisacáridos solubles, proteínas y pectinas, pigmentos, taninos y

otros compuestos fenólicos, partículas coloidales entre otras impurezas (Chabot y Beaulieu 2012, Goto 2004,

Pasquel et al 1999, Kutowy et al 1999).

El poder endulzante reportado para los extractos de las hojas ha sido de 200 en relación a la sacarosa (Abou-

Arab et al 2010); los endulzantes purificados y formulaciones comerciales poseen poder endulzante variable

dependiendo de la proporción de Esteviósido, Rebaudósido A, Rebaudósido C y otros esteviolglicósidos o

edulcorantes (Bakal 2011, Nabors 2001). En cuanto al estudio de infusiones, Singh y Verma (2009)

determinaron una proporción de 0,298 g de hojas por tasa, al optimizar sensorialmente una formulación de

mezclas para infusión con hierbas aromáticas y stevia. La composición (esteviolglicósidos) es quien determina

las características endulzantes de los extractos de las hojas (Shevchenko et al 2011, Nabors 2001).

Numerosas investigaciones realizadas sugieren que junto a la dulzura, los glicósidos de ent-kaureno pueden

ofrecer beneficios terapéuticos (Chatsudthipong y Muanprasat 2009): efectos anti-hiperglucémicos, anti-

hipertensivos, anti-inflamatorios, anti-tumorales, anti-diarrea, diurético y acciones inmunomoduladoras; en

particular, los efectos sobre el nivel de glucosa en plasma y la presión arterial sólo se observan cuando estos

parámetros son más altos que la media normal.

Existen diversos estudios de caracterización de fitoquímicos y evaluaciones de actividades biológicas de

diferentes extractos o fracciones de extractos de Stevia rebaudiana (Deetae et al 2012, Muanda et al 2011, Abou-

Arab y Abu-Salem 2010, Abou-Arab et al 2010, Kaushik et al. 2010, Savita et al 2004, entre otros).

En variedades de la planta distintas a la del presente trabajo, se cuantificaron polifenoles y flavonoides con

actividad antioxidante (Deetae et al 2012, Abou-Arab y Abu-Salem 2010, Kim et al 2012, Shukla et al 2009,

Tadhani et al 2007). Abou-Arab et al (2010) determinaron un contenido de carotenoides totales: 7,67 mg / 100 g

b.s. y Abou-Arab y Abu-Salem (2010) por su parte, reportaron el siguiente contenido de fenoles totales: 24,01

mg / 100 g b.s. y flavonoides: 19,93 mg / 100 g b.s..

Kaushik et al. (2010) informaron que en diferentes extractos del material vegetal existe un alto grado de

correlación entre el contenido de polifenoles totales determinado por Folin-Ciocalteau y su actividad

antioxidante medida por el método del radical DPPH• (r = 0,954; p-valor ≤ 0,05). Al estudiar distintas

variedades, Tavarini et al. (2010) determinaron que el contenido de polifenoles y la actividad antioxidante

guardan relación directa con el contenido de Rebaudiósido A de la planta, siendo el genotipo en última instancia

quien determina la capacidad antioxidante de los extractos de la misma.

El objetivo del presente trabajo fue caracterizar infusiones de Stevia rebaudiana Bert. variedad mejorada a través

de la determinación de sólidos totales, esteviolglicósidos endulzantes, poder edulcorante relativo a sacarosa y

actividad antioxidante.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal El material vegetal empleado se obtuvo de una plantación experimental de Stevia rebaudiana Bert. variedad

mejorada (Departamento Capital, Misiones, Argentina). La cosecha se realizó a inicios de la floración, de

acuerdo a Kolb et al. (2012). El lote fue secado en estufa (60 °C), se separaron palos e inflorescencias y se

molió. Para caracterizar las hojas, se determinó el contenido de esteviolglicósidos por HPLC (columna amino y

detector UV) según Kolb et al. (2001) y la humedad por secado en estufa de vacío (102 °C) hasta peso constante.

Infusiones

Las infusiones se prepararon por adición de 2 g de hojas molidas a 200 mL de agua destilada a temperatura de

ebullición; siendo 5 min el tiempo de extracción. Luego se enfrió y se filtró. Las infusiones obtenidas se

conservaron en recipientes color caramelo en heladera (4 °C) hasta su procesamiento analítico. Se trabajó con

dos réplicas (ensayo 1 y ensayo 2).

Glicósidos endulzantes y sólidos totales

El contenido de glicósidos de las infusiones se determinó por HPLC; los sólidos totales por secado (102 °C)

completado en estufa de vacío hasta peso constante.

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Se estimó el poder edulcorante, tomando el valor de 200 para la suma (Esteviósido + Rebaudiósido A +

Rebaudiósido C) en relación a la sacarosa, según Abou-Arab et al (2010), y expresando los resultados por cada

100 mL de infusión preparada o bien por cada 1 g de hojas molidas.

Actividad antioxidante

La actividad antioxidante se determinó en una placa de 96 pocillos, con un microplate reader EPOCH BioTeK;

utilizando solución metanólica del radical estable DPPH en 8 diluciones de la infusión de 0,1 g/100 mL a 0,01

g/100 mL y soluciones de Trolox a distintas concentraciones como referencia. Se evaluó el porcentaje de

inhibición (% I) por la disminución de la absorbancia del DPPH a 515 nm en la mezcla de reacción de 200 µL

del DPPH y 25 µl de cada dilución, durante 30 min y calculando el IC50 (concentración de la muestra que inhibe

el 50% de los radicales DPPH) a los 5 y 30 min de acuerdo a Oliveira et al. (2009). De cada ensayo (ensayo 1 y

ensayo 2) se hicieron tres replicaciones, por triplicado cada una.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Glicósidos endulzantes y sólidos totales

El contenido de Esteviósido, Rebaudiósido A, Rebaudiósido C del material vegetal empleado, se presentan en la

Tabla 1, el contenido de sólidos totales y de glicósidos endulzantes de las infusiones en la Tabla 2 y los

porcentajes extraídos en las infusiones (por componente), en la Tabla 3.

Tabla 1. Composición de las hojas

Componente Contenido en las hojas a (% b.s.)

Esteviósido 3,544 ± 0,235

Rebaudiósido A 11,809 ± 0,115

Rebaudiósido C 1,313 ± 0,011

Glicósidos totales caracterizados 16,665 ± 0,361

Humedad 7,745 ± 0,617

(a) Valor Medio ± Desviación estándar (n=4 )

Tabla 2. Caracterización de la infusión (g/100 mL)

Componente Ensayo 1 a Ensayo 2

a

Esteviósido 0,034 ± 0,002 0,033 ± 0,001

Rebaudiósido A 0,113 ± 0,004 0,115 ± 0,001

Rebaudiósido C 0,012 ± 0,000 0,013 ± 0,001

Glicósidos totales caracterizados 0,159 ± 0,007 0,161 ± 0,001

Sólidos totales 0,537 ± 0,012 0,547 ± 0,013

(a) Valor Medio ± Desviación estándar (media por ensayo, por triplicado)

Tabla 3. Porcentajes extraídos en las infusiones (por componente)

Componente Ensayo 1 a Ensayo 2

a

Esteviósido 91,373 ± 5,830 97,720 ± 2,084

Rebaudiósido A 95,033 ± 3,479 98,033 ± 0,132

Rebaudiósido C 89,393 ± 3,479 97,957 ± 2,607

Glicósidos totales caracterizados 94,013 ± 3,976 98,130 ± 0,802

Sólidos totales b 58,448 ± 1,257 58,976 ± 1,357

(a) Valor Medio ± Desviación estándar (media por ensayo, por triplicado)

(b) Sólidos extraídos de las hojas (% b.s.)

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El contenido de sólidos totales de las infusiones fue de 0,542 ± 0,012 g/100 mL, recuperándose el 58,71 ± 1,21

% (b.s.) de los sólidos de las hojas.

Se extrajo el 96,07 ± 3,42 % de los esteviolglicósidos caracterizados; el porcentaje de glicósidos diterpénicos

extraídos es comparable a los valores referidos por Chhaya et al. (2012) para la extracción acuosa de los

edulcorantes a partir de las hojas: 93 %, en otras variedades de stevia (Chhaya et al. 2012).

El poder endulzante en relación a la sacarosa, tomando el valor de 200 para la suma de Esteviósido +

Rebaudiósido A + Rebaudiósido C (Abou-Arab et al. 2010) equivale a 32 g de azúcar/g de hoja. En base a los

resultados, se estima que para preparar una infusión de 200 mL endulzada con stevia, sólo se requieren 0,200 g

– 0,400 g de hojas molidas con un poder endulzante equivalente a una o dos cucharaditas de azúcar.

Los valores calculados son comparables a los informados por Singh y Verma (2009) en cuanto a la relación

hojas/agua para preparar una infusión. Sin embargo, dada la alta proporción de Rebaudiósido A presente en las

hojas y extraído en la infusión, puede esperarse un poder edulcorante superior al estimado, en el caso de la

variedad investigada. Son necesarios estudios posteriores de análisis sensorial para determinar el poder

endulzante de las infusiones de stevia o bien, con stevia, variedad mejorada.

Actividad antioxidante

Los resultados obtenidos (IC50 a los 5 y 30 min) se presentan en la Tabla 4. Las infusiones en las diluciones

investigadas mostraron actividad antioxidante relativamente alta, con % I dentro del rango del 10 - 90 %; la

dependencia de la actividad antirradicalaria respecto al tiempo mostró el mismo comportamiento para todas las

concentraciones evaluadas y crece logarítmicamente con la concentración.

Tabla 4. IC50 de las infusiones y Trolox a los 5 min y 30 min

Tiempo de reacción (min)

g/100 mL

Infusiones a,b

Trolox

5 0,0342 0,0010 0,0055

30 0,0296 0,0002 0,0050

(a) Valor Medio ± Desviación estándar (n = 18)

(b) La concentración se expresa como g sólidos totales/100 mL de infusión.

El IC50 determinado a los 5 min difiere significativamente del determinado a 30 min (p<0,05); a

concentraciones menores a 0,025 g/100 mL la capacidad decolorante no varía significativamente entre los 5 y 30

min de reacción.

Kim et al. (2011) determinaron en extractos acuosos de hojas de S. rebaudiana provistas por Gochang farm

(Chunbuk, Korea) una capacidad capturadora de DPPH de aproximadamente 40%, medida según técnica

equivalente (Brand- Williams et al.1995), para una concentración de 0,1 g/ 100 mL. En nuestra experiencia esa

misma capacidad capturadora (IC 40) se logró con 0,021 g/100mL para un extracto obtenido con sólo 5 min de

extracción frente a las 3 h a 100ºC obtenido por Kim et al.

Preparando una infusión de 200 mL con 0,200 g - 0,400 g de hojas molidas de la variedad estudiada como

endulzante, y suponiendo el mismo porcentaje de extracción se tendría, a los 30 min, IC72 - IC96

respectivamente.

CONCLUSIONES

En las condiciones de ensayo, el contenido de sólidos totales de las infusiones fue 0,542 g/100 mL;

recuperándose el 58,71 % (b.s.) de los sólidos de las hojas. La concentración de glicósidos caracterizados fue de

0,160 g/100 mL siendo el porcentaje de endulzantes extraídos de 96,07 % (esteviolglicósidos caracterizados). Se

estima que para preparar una infusión de 200 mL endulzada con S. rebaudiana de la variedad estudiada, sólo se

requieren 0,200 g – 0,400 g de hojas molidas, con un poder endulzante equivalente a una o dos cucharaditas de

azúcar y un IC72 - IC96, respectivamente. Dada la alta proporción de Rebaudiósido A presente en las hojas y

extraído en la infusión, puede esperarse un poder edulcorante superior al estimado, para la variedad investigada.

IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Córdoba, Argentina, 14 a 16 de Noviembre de 2012

La infusión de stevia, además de su capacidad endulzante se presenta como una fuente accesible de

antioxidantes naturales beneficiosos para la salud.

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AGRADECIMIENTOS

Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por el financiamiento otorgado (PICTO UNJu00150)