Manipulacin.

Manipulacin y manejo de ratones (Mus musculus), observacin de estructuras internas, macrfagos alveolares, intraperitoneales, mdula sea y esplenocitos estimulados con tioglicolato.

Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.Departamento de Ciencias de la VidaCarrera de Ingeniera en BiotecnologaInmunologa

Gabriela Sevillano06 de marzo de 2015

RESUMENLa presente prctica se llev a cabo usando ratones (Mus musculus) un animal fcil de manipular y muy utilizado para experimentos de laboratorio. Para esto se necesita conocer los reglamentos necesarios para una manipulacin correcta, la forma de administracin peritoneal e intradrmica, adems de los mtodos de necropsia para obtener macrfagos y esplenocitos. Los macrfagos son clulas mononucleadas que se caracterizan por su capacidad de fagocitar y degradar material particulado, los esplenocitos son clulas que se encuentran en el bazo, y constituyen la primera lnea de defensa contra agentes extraos y controlan procesos degenerativos eliminando clulas anormales e inhibiendo su divisin dentro del organismo. El presente trabajo tiene como objetivo manipular ratones machos de 6 semanas, para obtener macrfagos de lquido peritoneal, alveolar y de la mdula sea, adems de esplenocitos del bazo para su posterior observacin en microscopio invertido y conteo celular empleando cmaras de Neubaer, respectivamente. Los resultados obtenidos demostraron la presencia de macrfagos al estimular al ratn con tioglicolato, y de esplenocitos, de los cuales se realiz un conteo mediante cmara de Neubauer, teniendo un total de 2,25x106 macrfagos/ml en la mdula sea, 3,08x106 macrfagos/ml en el lquido peritoneal y 8,75x105 esplenocitos/ml del bazo Palabras clave: Macrfagos, esplenocitos, Mus musculus.

ABSTRACTThis practice was carried out using mice (Mus musculus) easy to handle and very animals used for laboratory experiments. For this we need to know the regulations necessary for the proper handling, how to peritoneal and intradermal administration, besides autopsy methods for macrophages and splenocytes. Macrophages are mononuclear cells that are characterized by their ability to phagocytose and degrade particulate material, splenocytes are cells found in the spleen, and are the first line of defense against foreign organisms and eliminating control degenerative processes and inhibiting abnormal cell division within the organism. This paper aims to manipulate male mice of 6 weeks, for peritoneal macrophages, alveolar fluid and bone marrow, spleen plus splenocytes for further observation inverted microscope and cell counting using cameras Neubaer, respectively. The results obtained showed the presence of macrophages by stimulating the mouse thioglycolate, and splenocytes, of which a count was performed using a Neubauer chamber, having a total of 2,25x106 macrophages / ml in the bone marrow, macrophages 3,08x106 / ml in peritoneal fluid and 8,75x105 splenocytes / ml spleen.

Keywords: macrophages, splenocytes, Mus musculus.

1. INTRODUCCINLos modelos experimentales son herramientas biolgicas que en los ltimos aos facilitan el conocimiento de los procesos naturales y patolgicos. En las primeras fases de experimentacin se implementa el uso de animales de laboratorio, los cuales son utilizados como instrumentos de investigacin cientfica (Prez, 2007).Un animal de laboratorio es aquel que es engendrado y producido bajo condiciones controladas, mantenido su entorno controlado como la alimentacin, ambiente, antecedentes microbiolgicos y genticos conocidos y existe una comprobacin sistemtica de estos antecedentes (Instituto Nacional de Salud, 2008).Los animales deben ser manejados adecuadamente para poder realizar diferentes mtodos como los siguientes: administracin de substancias las cuales pueden ser por varias vas como subcutnea, intravenosa, intradrmica, intraperitonial, intramuscular, entre otras (Fuente, 2010).La eleccin de la va depende del objetivo de la investigacin que se va a realizar y el uso de sustancias de administracin deben ser apropiadas para la va elegida puesto que estos incluyen solubilidad, viscosidad, pH, pureza y estabilidad las cuales pueden afectar al ratn por lo que antes de inyectar la sustancia debe conocerse lo que esta tiene; la absorcin de la misma depende de estas caractersticas incluidas la vas de administracin (Mortn, 2001). 1.1.MACRFAGOSLos macrfagos son clulas mononucleadas que se caracterizan por su capacidad de fagocitar y degradar material particulado, presentan caractersticas como: son clulas fusiformes o estrelladas, que poseen una gran plasticidad de 30-40 micras de dimetro, tienen un ncleo arrionado, tienen cromatina laxa, su citoplasma es acidfilo, emiten pseudpodos, sus orgnulos estn desarrollados o no segn la actividad de la clula, tienen acmulos de glucgeno y vacuolas lipdicas en el citoplasma, sintetizan y liberan interleuquina-1 (IL-1), factor de necrosis tumoral (TNF), factor de crecimiento de fibroblastos(FGF), interleuquina-6, factor pirgeno, peroxidasas, lisozima, hidrolasas (Universidad Catlica de Chile, 2013).Los macrfagos alveolares (MA) son las clulas presentadoras de antgenos ms abundantes en las vas areas y espacios alveolares, donde juegan un rol importante en la regulacin del sistema inmune y en cuadros de inflamacin. El macrfago tiene su origen en las clulas germinales pluripotenciales (CGp-GM) de la mdula sea (Lambrecht, 2006).Tienen funciones como: fagocitar clulas envejecidas, muertas o inactivas, presentar mecanismos de defensa del organismo en la invasin bacteriana, por ello se presentan en las inflamaciones de tipo crnico (Universidad de Valencia, S/A).En cuanto a la obtencin de la poblacin celular peritoneal rica en macrfagos se puede mencionar que es imposible obtener una poblacin peritoneal compuesta solo por macrfagos, pero se puede conseguir poblaciones altamente enriquecidas en estas clulas. Una de las tcnicas empleadas con este fin es la adherencia de estas clulas al plstico o vidrio, este procedimiento permite la separacin de las clulas de una suspensin celular en adherentes (ricas en macrfagos) y no adherentes (ricas en linfocitos) (Universidad Catlica de Chile, 2013).El procedimiento llevado a cabo siguiendo el mtodo antes descrito consiste en suspender las clulas peritoneales en medio RPMI 1640 compuesto por 25mM de HEPES buffer, L- glutamina y bicarbonato de sodio (Villanueva, 2002).1.3 ESPLENOCITOSLos esplenocitos son clulas mononucleares fagocitarias presentes en el seno del bazo, que identifican agentes extraos que ingresan al organismo y los destruyen por lo que los estas clulas constituyen una de las lneas de defensa del organismo contra infecciones (Roitt et al, 2008).Para la obtencin de esplenocitos es necesario sacrificar los ratones mediante dislocacin cervical, seguida de la extraccin del bazo, est se debe realizar con cuidado y bajo condiciones de esterilidad, para maximizar los niveles de bioseguridad, la extraccin se realiza empleando cabina de flujo laminar. El rgano es depositado en una caja de Petri con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%. La perfusin de los bazos se realiza con jeringa y en condiciones de esterilidad hasta obtener ms del 90% del contenido celular. Los esplenocitos mononucleares se separaran con gradiente de densidad (Sikora&Smedley, 2000).Por lo cual el presente estudio pretende realizar la obtencin de macrfagos y esplenocitos a partir de fluidos peritoneales, alveolares y de la mdula sea, adems del bazo respectivamente, mediante la utilizacin de diversas tcnicas de ratones in vivo.2. METODOLOGA2.1 Material Biolgico

Se obtuvieron 5 ratones machos de 6 semanas de edad, de la tienda Okypet ubicada en el Barrio San Vicente, Quito Ecuador. Se las mantuvo majo condiciones controladas de alimentacin, su dieta constaba de zanahoria, gelatina sin sabor y agua. 2.2. Manejo y manipulacin de los ratonesPara el manejo de los ratones se realiz una sujecin con una mano, se sac al ratn del vaso de precipitacin tomndolo de la cola y se lo apoy en una rejilla, se estir la cola hacia atrs, posteriormente se agarr un pliegue de la piel en la parte trasera del cuello con los dedos pulgar e ndice. Luego se gir la mano hacia adelante colocndose al ratn con su lado ventral hacia arriba y finalmente se sujet la cola. La cabeza y el cuerpo se colocaron en una posicin recta y cmoda de espaldas apoyada en la palma de la mano. (Imagen 1).

Figura 1. Manejo y manipulacin del ratn (Llamuca, 2015)2.3. InmunizacinLa inmunizacin se realiz a los 0 das, se realiz una simulacin de inmunizacin con 0,2 mL de PBS 1X administrados a los ratones por va intraperitoneal. Despus de 10 minutos se realiz la inmunizacin inoculando 0,2 mL de medio tioglicolato por va intraperitoneal como se observa en la imagen 2.

Figura 2. Administracin de tioglicolato por va intraperitonial. (Llamuca, 2015)2.4. Obtencin y cultivo de los macrfagos en lquido peritonealCinco das luego de la inmunizacin, se sacrificaron 2 ratones por dislocacin cervical, se realiz cortes en la piel para exponer el rea del peritoneo y se us medio 10 ml de RPMI para llenar toda la cavidad peritoneal y realizar un lavado, despus se recuper el medio lquido con la misma jeringuilla obtenindose aproximadamente 8ml, ver imagen 3, luego se verti el medio con los macrfagos en una caja Petri y se llev la incubacin en CO2 al 5%, y 37C durante 4 horas, posteriormente se observ los resultados en el microscopio invertido.A parte de la recuperacin de los macrfagos se retir los rganos principales del ratn entre ellos cerebro, intestino, corazn, pulmones y bazo y se midi el tamao de estos.

Figura 3. Lavado de la cavidad peritoneal con medio RPMI para obtencin de macrfagos. (Llamuca, 2015)2.5. Obtencin de macrfagos de la mdula sea Se realiz el corte del fmur y el peron del ratn, obtenindose el hueso libre de tejido muscular, a continuacin se cortaron las cabezas, y se colocaron en tubos eppendorf de 2ml, y se llev a centrifuga a 1000 rpm por 10 min, una vez obtenido esto se retir en sobrenadante y el pellet se mezcl 1ml de RPM1, se prepar la disolucin con BLUE-TRIPAN 10l de muestra-90l del reactivo. S coloc en la cmara de Neubauer, y se observ al microcopio ptico. 2.6. Obtencin de macrfagos alveolaresSe procedi a realizar una microciruga traqueal, siguiendo las consideraciones indicadas, estas son la fijacin del ratn la superficie, y el corte en la zona del cuello, se identific la trquea, y se inyect 1ml de RPMI, despus se recuper el medio lquido con la misma jeringuilla, a continuacin luego se verti el medio con los macrfagos en una caja Petri y se observ los resultados en el microscopio invertido.

Figura 4. Administracin de tioglicolato por va traqueal. (Llamuca, 2015)2.7. Obtencin de esplenocitosPara la obtencin de esplenocitos se sacrific 2 ratones por dislocacin cervical, se recuper el bazo y se lo tritur mecnicamente con el pistn de una jeringa, hasta obtener pedazos pequeos. Para purificar lo esplenocitos se utiliz una gasa para filtrar el lquido como se observa en la imagen 4. Posteriormente se centrifug el preparado por 8 minutos a 1200 rpm y se suspendi el pellet en 5mL de medio RPMI, debido a que existe contaminacin por glbulos rojos se aadi el buffer lisis y se realiz aspiracin sucesivas por 1 min, se volvi a centrifugar por 10 minutos y el pellet se resuspendi en medio RPMI, se prepar la disolucin con BLUE-TRIPAN 10l de muestra-90l del reactivo. S coloc en la cmara de Neubauer, y se observ al microcopio ptico.Para determinar la cantidad de esplenocitos se aplic la siguiente frmula:

Para hacer una estimacin real se multiplic, por el factor de dilucin 1 en 10, y un volumen inicial de 0,1.

Figura 5. Trituracin del bazo con el pistn de la jeringa. (Torres, 2014)

3. RESULTADOS

Tabla. 1. Resultado de datos individuales de supervivencia (%) vs. Tiempo. Supervivencia de ratones (%) vs. Tiempo.

Tiempo (das)No. Ratones vivosPorcentaje de ratones vivos (%)

05100

5360

7360

1200

Tabla. 2. Resultado de datos individuales de peso (%) vs. Tiempo.

Peso de ratones vs. Tiempo

No. ratnTiempo en dasPeso ratn (g)% disminucin

A015

513,212

B014,6

515,5

713,8

1212,713,01

C013,9

514,3

713,5

1212,510,07

D017

514,415,29

F018,8

516,5

715,3

1213,926,06

PROMEDIO15,29

Tabla. 3. Resultados de las mediciones de cerebro, intestino, bazo, corazn y pulmones.Mediciones de rganos de los ratones

No. RatnEstructuras Tamao (cm)

ACerebro1,2

Intestino34

Bazo1,2

Corazn0,8

Pulmones1,7

DCerebro1

Intestino36

Bazo1,5

Corazn0,9

Pulmones1,2

PROMEDIOCerebro1,1

Intestino35

Bazo1,35

Corazn0,85

Pulmones1,45

Tabla. 4. Resultado del conteo de clulas de macrfagos en dilucin y con trypan blue. RATNClulas/ml

MACROFAGOS

A5,5*10^6Liquido peritoneal

C2,25*10^6Medula

D1,5*10^6Liquido peritoneal

Tabla 4. Conteo de esplenocito por clulas/mlRATNClulas/ml

ESPLENOCITOS

B1*10^6

E7,5*10^5

Grfico 1. Grfico de mortalidad (%) vs. Tiempo.

Grfico 3. Grfico Peso vs Tiempo.

Grfico 3. Nmero de clulas/ml en relacin de macrfagos para los ratones A, C, D.

Grfico 3. Nmero de clulas/ml en relacin de esplenocitos para los ratones B, E.

Figura 5. Observacin de macrfagos mdula sea (Llamuca, 2015). Las clulas ms oscuras representan aquellas que no son viables.

Figura 6. Observacin del conteo de esplenocitos con trypan blue en el microscopio ptico realizada en la cmara de Neubauer (Llamuca, 2015). Las clulas ms oscuras representan aquellas que no son viables.

Figura 7. Observacin de macrfagos alveolares en el microscopio invetido (Torres, 2015).

Figura 8. Observacin de esplenocitos en el microscopio invertido (Guerra&Sevillano, 2015).

4. DISCUSINLa variacin del porcentaje en peso de cada ratn en los 12 das es evidente, la tendencia de todos los ratones en transcurso de este tiempo fue de disminuir de peso, obtenindose un porcentaje promedio de disminucin de 15% esto se debe al cambio de alimentacin y a los hbitos alimenticios y a la falta de lquidos. Segn Quezada (2008), el alimento para los ratones destinados a la experimentacin, debe ser colocado en cantidad y calidad suficientes para sus necesidades y para conservar su salud; adems, el acceso al alimento debe ser libre y dosificado en base con los requerimientos, minimizando la competencia por el alimento en caso de tener grupos de ratones por jaula. Los ratones sobrevivieron durante el transcurso de la investigacin. Segn Brockmann (2010), los ratones tienen un tipo generacional muy corto, son muy prolficos y se adaptan fcilmente a la vida en los bioterios, mejorando su capacidad de supervivencia, adems de esta manera se pueden controlar las variables ambientales en las experimentaciones. Se observ que los ratones al da 17 presentaron inflamacin del intestino delgado a nivel del leon, adems de heces de color rojizo. Segn Velasco, (2012), la inflamacin causada en el intestino delgado, impide la absorcin de componentes importantes de los alimentos, razn por la cual se produjo la perdida excesiva de peso. El dao a la mucosa del intestino proviene de una reaccin a la ingestin de gluten, que se encuentra en el trigo, la cebada, el centeno, y posiblemente la avena, y en alimentos elaborados con estos ingredientes. Esto adems ocasiona la falta de absorcin de nutrientes debido a un dao en las vellosidades intestinales. Por lo tanto, los animales resultan desnutrida sin importar cunto alimento consuma. Este trastorno es ms comn en los organismos de raza blanca. El fenotipo es un componente esencial para el desarrollo de modelos animales y se determina por la interaccin entre los factores genticos y ambientales, de esta manera el peso corporal y el desarrollo de los rganos en ratones de laboratorio presentan diferencias significativas cuando los animales son producidos en condiciones distintas (Fuentes, 2012). En la Tabla.3., se observa la longitud de los diferentes rganos de los ratones sacrificados para las mediciones. Las longitudes promedio fueron: cerebro 1.1 cm, bazo 1.35 cm, intestino 35 cm, corazn 0.85 cm, y pulmones 1.45 cm. La inoculacin con caldo Tioglicolato estimula un incremento en la poblacin de macrfagos peritoneales, y alveolares permitiendo recolectar mayor cantidad de estas clulas, el medio acta como un estmulo inflamatorio no especifico. Al realizar el conteo de estos se obtuvo 3,08x106 macrfagos/ml en el lquido peritoneal, despus de la incubacin a 4 horas, para la viabilidad celular se evalu por exclusin con azul de Tripano y las clulas se contaron con una cmara de Neubauer utilizando un microscopio ptico. Brockmann (2010) dice que la observacin de macrfagos debe realizarse despus de 4 horas de incubacin y para visualizarlos de mejor manera se puede realizar tincin con guiensa. Al realizar el recuento de macrfagos obtenidos de la mdula sea se obtuvo 2,25x106 macrfagos/ml, segn Lambrecht, (2006), los macrfagos tiene su origen en las clulas germinales pluripotenciales (CGp-GM) de la mdula sea, por esta razn se los pudo visualizar en la cmara de Neubuer. El aislamiento de esplenocitos se lo realiz del bazo del ratn, puesto que este rgano es en donde encontramos gran cantidad de este tipo de clulas, segn Martnez (2008), los esplenocitos totales aislados mediante la misma tcnica de esta prctica, da como resultado 25x106 esplenocitos/ml, cuando se correlacion este parmetro con los resultados obtenidos en la prctica, el promedio de esplenocitos es de 8,75x105 esplenocitos/ml, se observ una gran diferencia con los resultados de Martnez (2008). Se debe tomar en cuenta, que el nmero de esplenocitos por mililitro puede variar o ser ajustado a una densidad celular especfica (Sierra, 2012).5. CONCLUSIONESLos ratones fueron manejados e inoculados de manera correcta, evitando daos tanto al operario como al ratn y el mnimo dolor.La variacin de peso entre los diferentes ratones, se relaciona a la disponibilidad y dosificacin del alimento, adems de factores ambientales y genticos.Las longitudes de los diferentes rganos estn relacionadas directamente al peso y desarrollo del animal, se debe en gran parte, a los factores externos introducidos por el hombre para estudios cientficos.El tioglicolato inoculado produce una inflamacin dentro de la cavidad del peritoneo que estimula y aumenta la cantidad de macrfagos del ratn.El conteo de esplenocitos, presenta un amplio margen de variacin, la media de esplenocitos por mililitro es muy alta en relacin a la referencia de la cantidad extrable con una misma tcnica.Los macrfagos se pueden encontrar tanto en el lquido intraperitoneales, alveolos pulmonares y mdula sea. Encontrndose que existe una mayor cantidad en las encontradas en los alveolos pulmonares. 6. REFERENCIAS Bedell Ma, Jenkins Na, Copeland Ng. Mouse models of human disease. Part I: Techniques and resourcesfor genetic analysis in mice. Genes & Development11: 1-10, 2005.Brockmann Ga, Bevova Mr. Using mouse models to dissect the genetics of obesity. Trends in Genetics 18: 367-376, 2010.Fuente, E., Garca, L., Marn, O., Padrn, R., Rivas, Ma. y Vargas, G. Manual para el manejo de animales con fines de experimentacin y enseanza. 2010. Universidad de Jurez Autnoma de Tabasco. Fuentes, M. Efecto de la edad y el sexo sobre el peso de los rganos en relacin al peso corporal en ratones NMRI/UCLA. Gaceta Cs. Vet. 6(1):4-16. 2012.Martnez S. 2008. Determinacin de la Actividad enzimtica poli-ADP-ribosa polimerasa en clulas del sistema inmune. Departamento de Farmacologa. Universidad de Murcia.Morton, D., Jenning, M., Buckwell, A., Ewbank, R. y Wilson, B. 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