Colorantes

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste;

son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren

color. Están formados por un grupo cromóforo, que en la parte de la molécula

responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales, les permite

disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden

añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células

vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después

de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y

adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión

de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a

continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un

mechero; El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización

de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se

desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, que es menos

agresiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido

ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los

microorganismos.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la

apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite

la observación del movimiento de los microorganismos. Después de la fijación, se

añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el

espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de

colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por

iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que

tiñe es el ion cargado positivamente (el cromóforo) y se combinan con los

componentes ácidos de la célula como ADN y ARN, mientras que en los ácidos, el

colorante es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes

básicos de la célula, como el citoplasma; es decir se combinan con los

componentes celulares en función de sus respectivas cargas; por lo tanto, los

factores como fuerza iónica, composición del medio, temperatura y pH afectan las

tinciones.

Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las

células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual

facilita su unión.

Entre los colorantes básicos, más comunes se encuentran la safranina, la

fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.

Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas

positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con

microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el

rojo Congo.

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas

técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la

afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuando la afinidad química entre el

componente celular y el colorante es baja; también se pueden utilizar para

producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los

flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.

Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes

celulares tales como el negro de Sudán, que es liposoluble y permite distinguir los

glóbulos de grasa.

Tipos de tinciones:

Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA BACTERIAS

Tinción Uso Técnicas

Tinciones simples

Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo completo

Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; la rnayoría de los tejidos no se tiñen.

Tinciones diferenciales

Tinción de Gram.

Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se cubre la preparación de bacterias fijadas con cristal violeta y después con una solución de iodo (mordiente). Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Se decolora con acetona al 95%.

Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Dos colorantes; distingue entre las micobacterias (ácido-alcohol resistentes) y el resto de las bacterias

Se tiñen las células con fucsina básica y se calienta a emisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacterias se tiñen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidas de rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con el colorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras se tiñen de azul.

Tinciones selectivas

Tinción de esporas de Wirtz-Cortitlin

Tiñe selectivamente las endosporas

Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de la célula toma el color rosa.

Tinción negativa

Revela la presencia de cápsulas

Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación en fresco del espécimen. Las partículas de colorante no pueden penetrar en la cápsula, que se observa como una región clara alrededor de la célula.

1) Tinciones simples

En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del colorante.

Coloración de azul de metileno

Procedimiento:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor.2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar 3-5 minutos3. Lavar con agua y dejar secar4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Coloración de tinta china o negativa

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana.3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjetos4. Observar con lente de menor y mayor aumento

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Coloración de azul de lactofenol

1. Colocar una gota de colorante sobre la lamina portaobjetos2. Colocar una muestra de cultivo de hongos sobre el colorante3. Cubrir con una lamina cubreobjetos.4. Observar con lente de menor mayor aumento.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

2) Tinciones diferenciales

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias.

a) Tinción de Gram

Método   de identificación de bacterias mediante una tinción específica. Desarrollado por el médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. Esta tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción de Gram y se llaman Gram variables.

Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis. 

La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:

En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana (derivado metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por último se lavan con alcohol etílico, o acetona y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo (en este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante)

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol, ácido, básico o neutro?

El azul de metileno es un colorante básico.La tinta china es un colorante acido.Azul de lactofenol es un colorante básico.

2. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?El azul de metileno es un colorante básico que tiene el núcleo de la célula.