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1 INFORME TECNICO DEL PROYECTO 20070538 Diversidad genética de las bacterias endofiticas y simbioticas de los nódulos de las leguminosas Conzattia, frijol y colorín Responsable: Dr. Entao Wang Hu, Departamento de Microbiología, ENCBIPN RESUMEN Por este proyecto, se realizaron el aislamiento y la caracterización de los rizobios de frijol y de colorín. Se confirmaron que 1) los rizobios principales de colorín fue Bradyrhizobium, similar a B. japonicum, en suelos ácidos y neutros en México; 2) los rizobios de frijol son diferentes en suelo ácido y neutro y las variedades de frijol no hubo efecto tan fuerte como el pH de suelo sobre la población de rizobio; 3) los rizobios de frijol en un suelo ácido mexicano fueron Rhizobium leguminosarum y R. giardinii, los cuales solo reportaron en Europa anteriormente. Estos resultados forman la base para más investigaciones y indicaron la necesitad de uso inoculantes de rizobio para diferentes suelos. El trabajo sobre las bacterias endofiticas de Conzattia no se podría realizar porque el alumno correspondiente a esto estudio se dio de baja del programa sin terminar su tesis.
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INFORME TECNICO DEL PROYECTO 20070538
Diversidad genética de las bacterias endofiticas y simbioticas de los nódulos de las
leguminosas Conzattia, frijol y colorín
Responsable: Dr. Entao Wang Hu, Departamento de Microbiología, ENCBIPN
RESUMEN
Por este proyecto, se realizaron el aislamiento y la caracterización de los rizobios de frijol y
de colorín. Se confirmaron que 1) los rizobios principales de colorín fue Bradyrhizobium,
similar a B. japonicum, en suelos ácidos y neutros en México; 2) los rizobios de frijol son
diferentes en suelo ácido y neutro y las variedades de frijol no hubo efecto tan fuerte como
el pH de suelo sobre la población de rizobio; 3) los rizobios de frijol en un suelo ácido
mexicano fueron Rhizobium leguminosarum y R. giardinii, los cuales solo reportaron en
Europa anteriormente. Estos resultados forman la base para más investigaciones y indicaron
la necesitad de uso inoculantes de rizobio para diferentes suelos. El trabajo sobre las
bacterias endofiticas de Conzattia no se podría realizar porque el alumno correspondiente a
esto estudio se dio de baja del programa sin terminar su tesis.
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INFORME TECNICO DEL PROYECTO 20070538
RESPONSABLE: Dr. ENTAO WANG HU
Departamento de Microbiología, ENCBIPN
1. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza, todas plantas forman asociaciones con los microorganismos,
incluyendo las bacterias. Entre las formas de relación bacteriaplanta se encuentra la
formación de nódulos o agallas, los cuales son estructuras que pueden formarse en raíces,
corona, tallos u hojas de la planta. Una de sus funciones es la fijación de nitrógeno como lo
que se encuentra en los nódulos de leguminosas. En éstos, se han aislado diversas clases de
bacterias simbióticas y endofíticas. Las bacterias simbióticas de las leguminosas tienen
genes de nodulación y de fijación de nitrógeno, y pueden inducir la formación de nódulos.
Las bacterias endofíticas son aquellas que viven sin causar daño en el interior de células y/o
tejidos de plantas superiores. Las poblaciones de bacterias simbióticas y endofíticas se
afectan por condiciones del hábitat de las plantas.
Es muy importante el estudio de los microorganismos endofíticos tanto para
comprender su relación con las plantas como para explorar los biorecursos nuevos con
potencial de diferentes usos, así como selección de inoculo de microorganismos que pueden
mejorar el crecimiento de la planta o producción de antibióticos nuevos. En México se
encuentran muchas leguminosas nativas, las cuales son importantes económicamente o
ecológicamente. En el presente proyecto, se investigarán la diversidad de las bacterias
endofíticas o simbióticas de tres leguminosas: el árbol Conzattia multiflora, el árbol colorín
(Erythrina mexicana), y el fríjol (Phaseolus vulgaris L.).
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El fríjol es originado de México y forma nódulos radicales con varias bacterias de
los géneros de Bradyrhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium (Mnasri et al. 2007) en
distintas zonas (Han et al. 2005). Las cepas de Bradyrhizobium y de R. tropici se
encontraron en suelos ácidos en China y en otros países. En México, hay muchas zonas
donde tienen suelos ácidos, pero los rizobios de fríjol cultivado en suelos ácidos de México
no han sido investigados. En nuestro laboratorio, han sido aisladas 100 cepas de rhizobia de
fríjol en suelo con pH 4.5. Por las características coloniales y fenotípicas, estas cepas son
diferentes a R. etli, el rhizobio más común de fríjol en México.
Además de los rizobios en los nódulos de las leguminosas, también se encentraron
bacterias endofíticas. Una de las bacterias endofíticas más estudiadas de los nódulos de
leguminosas es Agrobacterium. Estas cepas se pueden inhibir específicamente la formación
de nódulo por R. gallicum en frijol (Mrabet et al. 2006), pero no se demostró efecto sobre
nodulación y crecimiento de Melilotus (Wang et al. 2006). Otros tipos de bacterias
endofiticas de los nódulos, incluyendo Bacillus, Pantoea, Serratia, Burkholderia y
Acinetobacter, han sido reportadas (Li et al. 2008), las cuales tienen las capacidades de fijar
nitrógeno, producir IAA y disolver fósforo. En el mismo estudio, también se observó que
hubo transferencia lateral del gen de fijación de nitrógeno de simbionte Bradyrhizobium al
endofito Bacillus.
Conzattia multiflora, una leguminosa arbórea de Ceasalpinioideae, es nativa de
México. En el campo, encontramos que esta planta forma “nódulos” en su tronco y solo
algunas enterobacterias se aislaron de estos nódulos (Wang et al. 2006). Sin embargo, estas
bacterias no causan la formación de nodulos. Debido a que este nódulo es un tipo nuevo en
las leguminosas, es interesante investigar si en ellos existen bacterias fijadoras de nitrógeno
y bacterias de nodulación por métodos moleculares.
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El árbol colorín (Erythrina americana) es un árbol de la subfamilia Papiloionoideae
de leguminosa nativa en México. En condiciones normales, suele desarrollarse mejor a
altitudes de 1000 a 2100 m.s.n.m, en bosques caducifolios, matorral subtropical, selva alta
perennifolia y regiones de vegetación secundaria. (Lozoya, op cit). En México, el colorín se
usa como árboles de ornato en las calles porque sus flores son muy bonitas. Una
investigación anterior indica que el colorín produce erythroidina, una sustancia con
importancia química y farmacológica (Folkers y Major 1937). Hasta la fecha, no se
encuentra información sobre la nodulación de colorín y sobre sus rizobios. Actualmente ya
se ha reportado que Sinorhizobium fredii puede formar nódulos en dos especies de
Erythrina: E. variegata y E. vespertilio, bajo condiciones de laboratorio; y que tres cepas
de Erythrina costarricenses se han identificadas como Bradyrhizobium por sus secuencias
del gen 16S rRNA.
En este proyecto, se estudió la diversidad de los aislados de fríjol y colorín por los
métodos similares al trabajo sobre los rhizobia de colorín, mientras se estudió la diversidad
de las bacterias en Conzattia multiflora. El objetivo general es conocer los rhizobia
asociados con la Erithryna americana Mill y con frijol en suelo acido y neutro, e investigar
la existencia de bacterias simbióticas en nódulos de Conzattia multiflora. Otro objetivo es
la realización de tesis para los alumnos mediante estos trabajos.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Aislamiento de los rizobios asociados a colorín
2.1.1 Muestro. Se muestrearon suelos rizosféricos y semillas de colorín en la ciudad de
Cuernavaca del Estado de Morelos y en el área metropolitana de la ciudad de México.
También se colectaron nódulos radicales de plántulas de colorín (10 individuas en cada
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zona). Los suelos se guardaron en bolsas negras de plástico a refrigeración (4°C). Las
plántulas que presenten nódulos se mantuvieron en bolsa con suelo para ser utilizados el
mismo o segundo día posterior a su recolección.
2.1.2 Extracción de rizobios en las muestras de suelo por nodulación. Las semillas de
colorín se lijaron en papel de arena (para romper su corteza) y se desinfectaron en una
solución al 10% de hipoclorito de sodio bajo condiciones asépticas (Vincent 1970).
Después, las semillas se germinaron en la oscuridad a 28ºC en papel de filtro mojado con
agua estéril en vasos previamente esterilizados. Las semillas germinadas se sembraron en
vasos de plástico limpios que contendrán vermiculita mojada en la solución nutritiva (se
aumenta nitrógeno) para plantas (Vincent 1970), y se inocularon con 1 gramo de la muestra
de suelo. Las plantas se incubaron en invernadero bajo la luz de sol a temperatura ambiente.
Después de 6 semanas de crecimiento, las plantas se recolectaron y los nódulos radicales se
recogieron para el aislamiento de rhizobia.
2.1.3 Aislamiento y purificación de rhizobia en los nódulos. Los nódulos obtenidos en
campo o en laboratorio se lavaron usando agua destilada para quitar el exceso de suelo.
Después de la desinfección (Vincent 1970), cada nódulo se molió en un micro tubo con 50
µl de agua estéril bajo la condición aséptica. Una gota de la extracción del nódulo se
sembró en una caja de Petri con medio de cultivo YMA por la técnica de estría cruzada. Las
cajas se incubaron a 28ºC de 3 a 14 días hasta observar la formación de colonias
bacterianas. Se transfirió cada tipo de colonia a una caja nueva con el mismo medio de
cultivo por la técnica de estría cruzada y se incubaron las cajas como se mencionó
anteriormente. Mientras se anotaron las características de cada tipo de las colonias como su
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tamaño, textura, borde, luz transmitida, color, etc. Se repitió la técnica de estría cruzada
hasta que todas colonias en la misma caja tuvieron formas y características idénticas. Se
realizó la tinción de Gram en cada aislado para confirmar que es puro (todas las células
tuvieron el mismo tamaño en su ancho). Una copia de cada aislado puro se guardó a –20ºC
en 20% de glicerol estéril y otra copia se mantuvo en un tubo con medio YMA en
refrigeración a 4°C para usarla en los siguientes análisis.
2.2 Aislamiento de rizobios de frijol
2.2.1 Muestreo de variedades y suelos rizosféricos de frijol. Con base en su morfología,
las variedades del frijol se dividieron en 6 tipos (Figura 1). Para investigar el efecto de pH y
cultivares de frijol sobre la población de rizobios, se tomó un suelo de pH casi neutro (7.38)
del estado de Zacatecas y seis cultivares de frijol: Flor de durazno (FD), Negro perla (NP),
Bayomex (BM) correspondiente a tipo I, y Flor de mayo M38 (FM), Negro 8025 (N8),
Mayo INIFAP (BI) correspondiente a tipo III.
Fig. 1. Tipos de frijol varíeles por su morfología (Citada de WWW. fao.org)
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2.2.2 Extracción y aislamiento de rizobios en las muestras de suelo. Estos análisis se
realizaron mediante los métodos anteriormente mencionados en aislamiento de rizobios de
colorín.
2.3 Caracterización de los rhizobia por métodos de biología molecular. Se realizan para
unos aislados que tienen diferentes características el análisis de RFLP (polimorfismo en el
tamaño de los fragmentos de restricción) del gen 16S rDNA amplificado por PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa). Para hacer este análisis, se extrajo el DNA total de
cada aislado, se amplificó el gen 16S rRNA usando los iniciadores fD1 y rD1, se digirieron
los productos de PCR con las endonucleasas de restricción (HaeIII, HinfI, AluI y Sau3AI),
se separaron los fragmentos de la restricción en gel de agarosa, después se visualizaron las
bandas de DNA por la tinción de bromuro de etidio (Wang et al. 1998). Los aislados se
agruparon en base a los patrones de RFLP representativos. De cada grupo de RFLP de los
aislados se usó un aislado representativo para un análisis de secuencia del gen 16S rRNA
(Wang et al. 1998). Las secuencias obtenidas se compararon con otras relacionadas en una
base de datos y se construyó un árbol filogenético usando un programa de computadora
(Clustal W) para determinar la identidad de los aislados.
2.4 Amplificación y secuenciación del gen nodC. El gen nodC es esencial para la
formación de nódulos por los rizobios y su filogenia es una ruta para estimar la evolución
de los rizobios. En este trabajo se amplificó este gen del DNA extraído de las cepas o de
nódulos usando los iniciadores de NodCfor540 (5′TGA TYG AYA TGG ART AYT GGC
T3′) y NodCrev1160 (5′CGY GAC ARC CAR TCG CTR TTG3′), y el protocolo de PCR
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reportado por Sarita et al. (2005). Los productos de PCR se secuenciaron directamente de la
misma forma que se mencionó en el análisis del gen 16S rRNA.
2.5 Caracterización de suelo. Las muestras de suelo se analizaron sobre su pH, humedad y
contenido de materiales orgánicos y nutrientes, por métodos recomendados. Para
determinar la humedad y el pH del suelo se usaron los métodos de Lemos et al. (2002).
Para la determinación de compuestos orgánicos volátiles se colocó en un crisol a peso
constante una muestra de 10 gramos de suelo seco en una mufla a 500 °C durante 2 horas,
posterior a esto se colocó el crisol en un desecador y se pesó, la operación fue repetida
tantas veces hasta obtener el crisol con suelo a peso constante, por último se sacó la
diferencia entre el peso inicial del suelo seco y después de que se ha calcinado. Para
conocer la cantidad de nutrientes se pretende enviar la muestra de suelo a un laboratorio
especializado.
2.7 Análisis de los datos de rizobios. Los datos obtenidos de cada análisis se combinaron
para conocer las relaciones entre factores ambientales y las características rhizobianas, así
como para evaluar la diversidad de los rhizobia asociados con colorín presentes en cada
ecosistema analizado, aunque no es posible comparar dichas poblaciones debido a que las
condiciones ambientales de cada sitio estudiado son diferentes, lo anterior nos servirá como
parámetro para conocer en qué condiciones se logra la interacción simbiótica entre
Rhizobium y planta de una manera más efectiva.
2.8 Analisis de las bacterias endofiticas de los nódulos de Conzattia multiflora.
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2.8.1 Extracción de DNA metagenómico de los nódulos. En este trabajo, se
coleccionaron los nódulos del tronco de C. multiflora. Los nódulos se desinfectaron como
reportado en Wang et al. (2006) y se fraccionó la corteza del nódulo para macerarla en
solución reguladora a 10 min. Después de precipitar durante 10 min, el sobrenatante fue
transferido a tubos para centrifugar. Los precipitados se juntaron en un solo tubo para tener
0.5 g de biomasa (mezcla de bacterias y tejidos vegetales) la cual se usó a extraer DNA
metagenómico mediante el método de Zhou et al. (1995).
2.8.2 PCRamplicación y clonación de los genes 16S rRNA. Los genes de 16S rRNA se
amplificaron con métodos de Wang et al. (2006). Los amplificados se clonaron utilizando
los plásmidos pJET1/blunt de 3128 pb y pTZ57R/T de 2886 pb como vectores para
transformar la cepa DH5α de E. coli (químicamente competente) empleando los kits de
clonación de Fermentas de acuerdo a las indicaciones del fabricante, las clonas obtenidas se
inocularon en el medio de Luria Bertani con 100 µg/mL de Amplicilina y se realizó la
extracción de plásmidos por el método de lisis alcalina según el procedimiento reportado en
el Manual de Clonación Molecular de (Sambrook y Russell, 2001.)
2.8.3 Caracterización de las clonas por análisis de polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción
Una vez que se haya realizado la extracción de los plásmidos estos se digieren con enzimas
de restricción como a continuación se describe:
• 10 µL de muestra (4.4 ng)
• 2 µL de regulador de enzimas de restricción 10 x
• 0.5 µL de enzima (5 U/µL)
• 7.5 µL de agua miliQ
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Se utilizan las enzimas MspI, HindI, HhaI, y XbaI, pues son de corte frecuente ya que
cortan fragmentos de 4 pb y ofrecen buenos resultados para este trabajo, se corren en gel
de agarosa al 3% a 100 V durante 90 min para verificar los patrones de RFLP. Los
patrones se agruparon usando el coeficiente de similitud Sj (Sj=2c/(a+b) (donde c es
numero de bandas que ocurrieron en ambas clonas; a y b son números totales en clona a y
clona b), y por el método de UPGMA (Sneath y Sokal, 1973).
3. RESULTADOS
3.1 Estudio de los rizobios de colorín.
3.1.1 Muestreo y caracterización de los suelos. Para la caracterización del suelo, se
determinaron la textura, pH, porcentaje de humedad y porcentaje de materia orgánica a
través de métodos estandarizados. Los resultados obtenidos para el análisis del suelo se
presentan en Tabla 1.
Tabla 1. Características de los suelos muestreados
3.1.2 Extracción y aislamiento de los rizobios. De las plantas noduladas que se
recolectaron en el muestreo de campo, así como obtenidas en el laboratorio en condiciones
de invernadero se extrajeron los nódulos radicales (Figura 2) con lo que se consiguió un
total de 227 nódulos, los cuales presentaron un color que varió desde el rosa pálido hasta
púrpura intenso y su tamaño fue de 1 hasta 12 mm de diámetro. Posteriormente se sembró
el extracto de cada nódulo en placas. De estos nódulos, se obtuvieron 227 aislados puros de
Lugar de muestreo Textura del suelo pH % humedad % materia orgánica
Estado de Morelos Arcillo arenoso 4.8 45.0 17.45
Ciudad de México Arcillo arenoso 4.5 22.5 14.95
Estado de México Arcillo arenoso 6.5 31.5 8.72
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los cuales el 82.4 % producen álcali y crecen lentamente, el 12.8% produce ácido,
polisacárido y es de crecimiento rápido (Figura 3), el 4.8% restante no generó ácido ni
álcali y su morfología colonial fue muy diversa entre sí.
Sin nóodulo
Sin nóodulo
Figura 2. Fotos de coloín demostrando el efecto de nodulación sobre crecimiento de la planta (A) y
morfología de nódulos (B) de colorín.
La Figura 2A muestra dos plantas obtenidas en el laboratorio, la primera de ellas no
presenta desarrollo de nódulos y se caracteriza por poseer hojas de color amarillo debido a
la clorosis ocasionada por la falta de nutriente de nitrógeno, mientras que la segunda planta
si desarrolló nódulos y su aspecto es básicamente el de una planta sana. En la Figura 2B se
observa la planta que si tiene nódulos, de los cuales se extraen las bacterias fijadoras de
Nitrógeno.
La Figura 3 presenta la diferencia entre las bacterias que crecen lentamente y producen
álcali (izquierda), y las que crecen rápidamente y producen ácido en medio de cultivo YMA
después de someterlas a incubación durante 5 días a 28 °C.
A B.
Sin nódulo
Con nódulo
A. Colonias que producen
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Figura 2. Colonias demostrando la diferencia entre Bradyrhizobium (A) y rizobios de crecimiento rápido (B)
en medio de cultivo YMA.
De las cepas obtenidas cuyo crecimiento es lento y producen álcali se realizó la selección al
azar de algunas de ellas para extraer su ADN, también se ha observado su morfología
colonial la cual se presenta en la siguiente Tabla 2. Las morfologías demostraron que los
aislados son diversos.
3.1.3. Amplificación del gen nodA. En la Figura 4 se ve el resultado de una PCR de gen
nodA, las cepas que presentan una banda marcada similar a la de la cepa USDA 1002 y SH
22622 indican la presencia de genes simbióticos, y las que no presentan esa banda, es
probable que sean bacterias contaminantes.
La línea 1 mostrada en la PCR, es un testigo que solamente contiene los reactivos y se ha
sometido al mismo tratamiento que el resto de las cepas, se utiliza con la finalidad de
verificar que no existen interferencias en la prueba, las cepas de interés se compararon con
las cepas de referencia, las cuales presentan gen de nodulación, así, las que presenten las
mismas bandas, son seleccionadas para su posterior análisis.
B. Colonias que producen ácido
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Tabla 2. Características morfológicas de los rizobios de colorín
Colonia H93 H74 H27 H46 H92 1017 Neza31 H28 Tamaño 2 1 1 8 1 2 1 1 Color beige amarillo amarillo beige amarillo beige amarillo amarillo Forma circular circular puntiforme circular circular irregular circular circular
Elevación convexa convexa plana plana convexa convexa convexa convexa Superficie lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa Aspecto húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo Borde completo completo completo completo completo completo completo completo Luz
transmitida opaca opaca traslucida opaca opaca opaca opaca opaca
Luz reflejada brillante brillante brillante brillante brillante brillante brillante brillante Consistencia mucoide butirosa butirosa butirosa butirosa butirosa butirosa butirosa Producción de alcalino alcalino alcalino ácido ácido ácido alcalino ácido Incubación (d) 11 8 10 11 9 11 8 9
3.1.4 Caracterización genotípica. Las cepas utilizadas en las pruebas anteriores fueron
obtenidas del Estado de México: A3, B119, B117; Estado de Morelos: H74,213, H1;
Ciudad de México:1017, Neza48. Se observó que todas las cepas presentaron movilidad
en medio PY al 0.75% de agar. Su tiempo de generación varió entre 9 y 48 horas. Estos
datos están dentro del rango reportado para Bradyrhizobium (más de 8 horas). El rango en
Colonia Sur 17 Sur 32 H51 H58 B18 B117 H510
Tamaño (mm) 1 2 1 8 2 1 1 Color amarillo beige amarillo beige beige beige amarillo Forma circular circular circular circular irregular puntiforme puntiforme
Elevación convexa convexa convexa plana convexa convexa plana Superficie lisa lisa lisa lisa lisa lisa lisa Aspecto húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo húmedo Borde completo completo completo completo completo completo completo Luz
transmitida opaca opaca traslucida opaca opaca opaca traslucida
Luz reflejada brillante brillante brillante brillante brillante brillante brillante Consistencia butirosa mucoide butirosa butirosa butirosa butirosa butirosa Producción de: ácido alcalino alcalino ácido ácido ácido alcalino Incubación (d) 9 11 11 11 11 12 10
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el cual crecieron los microorganismos varía de 5 a 9 hrs. La tolerancia a las sales se
presenta en la Tabla 3.
Figura 3. Amplificación de nodA para confirmar la capacidad de nodulación.
Tabla 3. Características fisiológicas de los rizobios de colorin
Cepas
% (w/v) de sales CuSO4 BaCl2 CdCl2 PbSO4 NaCl
0.05
0.10
0.15
0.20
0.05
0.10
0.15
0.20
0.05
0.10
0.15
0.20
0.05
0.10
0.15
0.20
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
A 3 + + + + + B119 + + + + + + + + + + + + + B117 + + + + + + + + + + + + + + H74 + + + + + + + + + 1017 + + + + + + + + 213 + + + + + + + + + + + H1 + + + + + + + + + + + N48 + + + + + + + + + + + Indica crecimiento bacterial en las cajas;
Indica ausencia de crecimiento bacterial en las cajas.
3.1.5. Secuenciación del gen 16S rRNA.
21
617
28
68
26
24
68
64
24”
12
28”
22
28b
29”
Figura 4. Amplificación de nodA para confirmar la capacidad de nodulación.
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La secuencia obtenida de 16S rDNA de la cepa B113 tiene 1411 pb (Figura 5) y 99%
similitud con el mismo gen de Bradyrhizobium japonicum USDA110 (número de registro:
BA000040). La de la cepa N31 tiene 1440 bp y 99% similitud con Bradyrhizobium
japonicum USDA135 (número de registro: AF208511). Estos datos demostraron que la
mayoría de los rizobios de colorín fueron relacionados a B. japonicum.
B113 (1441 bp)
CGGCAGGCTT AACACATGCA AGTCGAGCGG GCGTAGCAAT ACGTCAGCGG CAGACGGGTG AGTAACGCGT GGGAACGTAC
CTTTTGGTTC GGAACAACAC AGGGAAACTT GTGCTAATAC CGGATAAGCC CTTACGGGGA AAGATTTATC GCCGAAAGAT
CGGCCCGCGT CTGATTAGCT AGTTGGTAGG GTAACGGCCT ACCAAGGCGA CGATCAGTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA
GCCACATTGG GACTGAGACA CGGCCCAAAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG GACAATGGGG GCAACCCTGA
TCCAGCCATG CCGCGTGAGT GATGAAGGCC CTAGGGTTGT AAAGCTCTTT TGTGCGGGAA GATAATGACG GTACCGCAAG
AATAAGCCCC GGCTAACTTC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGAAGGGGG CTAGCGTTGC TCGGAATCAC TGGGCGTAAA
GGGTGCGTAG GCGGGTCTTT AAGTCAGGGG TGAAATCCTG GAGCTCAACT CCAGAACTGC CTTTGATACT GAAGATCTTG
AGTTCGGGAG AGGTGAGTGG AACTGCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGCAAG AACACCAGTG GCGAAGGCGG
CTCACTGGCC CGATACTGAC GCTGAGGCAC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA
AACGATGAAT GCCAGCCGTT AGTGGGTTTA CTCACTAGTG GCGCAGCTAA CGCTTTAAGC ATTCCGCCTG GGGAGTACGG
TCGCAAGATT AAAACTCAAA GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAC GCAACGCGCA
GAACCTTACC AGCCCTTGAC ATGTCCAGGA CCGGTCGCAG AGATGTGACC TTCTCTTCGG AGCCTGGAAC ACAGGTGCTG
CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CCCGTCCTTA GTTGCTACCA
TTTAGTTGAG CACTCTAAGG AGACTGCCGG TGATAAGCCG CGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAGTCCTC ATGGCCCTTA
CGGGCTGGGC TACACACGTG CTACAATGGC GGTGACAATG GGATGCTAAG GGGCGACCCT TCGCAAATCT CAAAAAGCCG
TCTCAGTTCG GATTGGGCTC TGCAACTCGA GCCCATGAAG TTGGAATCGC TAGTAATCGT GGATCAGCAC GCCACGGTGA
ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAT GGGAGTTGGT TTTACCTGAA GACGGTGCGC TAACCCGCAA
GGGAGGCAGC CGGCCACGGT AGGGTCAGCG ACTGGGGTGA AGTCGTAACA A
N31 (1440 bp)
CCAACGGCTT AACAGCCTGC TTAGACATGC AAGTCGAGCG GGCGTAGCAA TACGTCAGCG GCAGACGGGT GAGTAACGCG
TGGGAACGTA CCTTTTGGTT CGGAACAACA CAGGGAAACT TGTGCTAATA CCGGATAAGC CCTTACGGGG AAAGATTTAT
CGCCGAAAGA TCGGCCCGCG TCTGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCAGTA GCTGGTCTGA
GAGGATGATC AGCCACATTG GGACTGAGAC ACGGCCCAAA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG
GGCAACCCTG ATCCAGCCAT GCCGCGTGAG TGATGAAGGC CCTAGGGTTG TAAAGCTCTT TTGTGCGGGA AGATAATGAC
16
GGTACCGCAA GAATAAGCCC CGGCTAACTT CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGAAGGGG GCTAGCGTTG CTCGGAATCA
CTGGGCGTAA AGGGTGCGTA GGCGGGTCTT TAAGTCAGGG GTGAAATCCT GGAGCTCAAC TCCAGAACTG CCTTTGATAC
TGAAGATCTT GAGTTCGGGA GAGGTGAGTG GAACTGCGAG TGTAGAGGTG AAATTCGTAG ATATTCGCAA GAACACCAGT
GGCGAAGGCG GCTCACTGGC CCGATACTGA CGCTGAGGCA CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG
TCCACGCCGT AAACGATGAA TGCCAGCCGT TAGTGGGTTT ACTCACTAGT GGCGCAGCTA ACGCTTTAAG CATTCCGCCT
GGGGAGTACG GTCGCAAGAT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA
CGCAACGCGC AGAACCTTAC CAGCCCTTGA CATGTCCAGG ACCGGTCGCA GAGATGTGAC CTTCTCTTCG GAGCCTGGAA
CACAGGTGCT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCCCGTCCTT
AGTTGCTACC ATTTAGTTGA GCACTCTAAG GAGACTGCCG GTGATAAGCC GCGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAGTCCT
CATGGCCCTT ACGGGCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG CGGTGACAAT GGGATGCTAA GGGGTGACCC TTCGCAAATC
TCAAAAAGCC GTCTCAGTTC GGATTGGGCT CTGCAACTCG AGCCCATGAA GTTGGAATCG CTAGTAATCG TGGATCAGCA
CGCCACGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTTGG TTTTACCTGA AGACGGTGCG
CTAACCCGCA AGGGAGGCAG CCGGCCACGG TAGGGTCAGC CAGCTGGGGT TAAGTGTTAA TTTTGCTAAT CTCGCCCTCT
Figura 5. Secuencias del 16S rDNA de los rizobios de colorín
3.2 Caracterización de rizobios de frijol
3.2.1 Filogenia de rizobio aislados del suelo ácido. Anteriormente, los aislados se
agruparon en tres grupos con base en el análisis de las características fenotípicas. En el
presente proyecto, se obtuvieron secuencias de 16S rDNA de 7 cepas representativas de
estos grupos. Por análisis filogenético, se agruparon respectivamente a las especies
Rhizobium leguminosarum, R. giardinii y Agrobacterium tumefaciens (Figura 6). En la
amplificación de nodC, la cepas de A. tumefaciens no presentaron el producto corresponde,
indicado que no fue una bacteria simbiotica igual que los reportes anteriores (). Las
secuencias del nodC de 6 cepas se usaron en la construcción de árbol filogenético (Figura 7)
y las 6 cepas se agruparon en dos grupos los cuales fueron muy similares que el árbol de
16S rDNA.
17
3.2.2 Aislamiento y caracterización de rizobios de suelo neutro. Los resultados de
nodulación de las 6 variedades se presentan en Tabla 3. Estos resultados indicaron que el
número de rizobio que nodulan distintas variedades fueron diferentes. De los nódulos
obtenidos, se aislaron 59 cepas de rizobio. Ya se realizó el análisis de PCRRFLP de 16S
rDNA de 30 cepas. Solo una tenía patrones diferentes a otras (Figura 8). Nos parecen que la
mayoría de estas cepas no son R. leguminosarum y R. giardinii. Estos resultados
demostraron que en suelo de pH neutro, la población de rizobio es diferente a la de suelo
ácido.
Tabla 4. Resultado de nodulación de frijol inoculados con suelo de pH neutro
Variedad Dilución de suelo Tipo 10 3 10 4 10 5
NP + + + + I BM + + + + I FD + I FM + + + + III N8 + + + + III BI + + + III
3.3 Estudio de bacterias endofiticas de Conzzatia.
En este estudio, se construyó una biblioteca genética de los genes de 16S rRNA. Pero no
obtuvimos más resultados por que el alumno Rolando Hernádez se dió de baja del
programa sin terminar su tesis.
18
R. leguminosarum PB223 (EF525233)
SH9
SH36
R. leguminosarumWSM2304 (DQ838519)
SH44
R. leguminosarum LMG 14904 (AM181757)
R. leguminosarum USDA 2370(U29386)
R. tropic B CIAT899(U89832)
R. tropic A LMG9517(X67234)
Ag. rhizogenes IFO 13257T (D14501)
R. lusitanum P17(AY738130)
R. etli CFN42(U28916)
R. indigoferae CCBAU71042(AY034027)
R. sullae IS123(Y10170)
R. yanglingense SH22623(CCBAU71623)(A...
R. gallicum R602sp(U86343)
R. mongolense USDA1844(U89817)
R. hainanense I66(CCBAU57015)(U71078)
R. lossense CCBAU7190B(AF364069)
R. galegae ATCC43677(D11343)
R. huautlense S02(AF025852)
SH35
SH42
R. sp. 24.8 (DQ499520)
R. giardinii R4385 (AM181755)
SH26
Ag. vitis NCPPB3554(D14502)
Ag. rubi IFO13261(D14503)
SH5
Ag. tumefaiens IAM13129(D12784)
A. tumefaciens NCPPB 2437 (AB247617)
A. tumefaciens LMG 140 (AM181758)
100
100
100
99
100
62
62
56 67
100
61 57
55 74 96
21
72
69
99
88
0.005 Figura 6. Árbol filogenético del gen 16S rRNA demostró las relaciones de los rizobios de frijol en un suelo acido.
19
Figura 7. Árbol filogenético del gen nodC demostró las relaciones de los rizobios de frijol en un suelo acido.
RFLP HaeIII FD110
Figura 8 Una foto demostró los dos tipos de PCRRFLP del 16S rDNA de los rizobios aislados de suelo
neutral.
R. giardinii H152 (AF217267)
Rhizobium sp. RPA02 (EU123544)
SH42
SH26
SH35
R. gallicum UPRM8043B (AY166849)
S. meliloti 4H41 (DQ333891)
R. etli bv. phaseoli CFN42 (AF217268)
Rhizobium sp. CCBAU 65255 (DQ010038)
R. leguminosarum VF252 (AY664623)
Rhizobium sp. CCBAU 83482 (EF050779)
SH36
SH44
SH9 Bradyrhizobium sp. CCBAU 65066 (EU056343)
100
89
98
100
97
75
99 61
100
29
45
0.05
20
Impacto de los resultados
1. Rizobios de colorín. En esta parte, los resultados por primera vez indicaron claramente
qué esta planta principalmente forma nódulos con las cepas de Bradyrhizobium,
probablemente las de B. japonicum. Estos son la base para más investigaciones a fin de
conocer el efecto de estas bacterias sobre el crecimiento de la planta. Mientras, dos alumnas
realizaron su estudio de tesis de licenciatura. En este proyecto, teníamos problemas con la
preservación de las cepas. A 20˚C en 20% de glicerol, la mayor parte de las cepas de
Bradyrhizobium se murieron. Por eso, necesitamos en un futuro detectar un método eficaz
para preservar este tipo de bacteria.
2. Rizobios de frijol. Anteriormente, solo Rhizobium etli y R. gallicum se aislaron en
México. La identificación de R. leguminosarum y R. giardinii en suelo ácido de México
amplió la diversidad de rizobios asociados a frijol en México, e indicó que en suelo ácido,
tal vez existen rizobios diferentes que en suelo neutro. Estos resultados demostraron que el
pH de suelo puede ser un factor selectivo para las poblaciones de rizobios, y que distintos
inoculantes de rizobio se necesitan en diferentes suelos.
BIBLIOGRAFÍA SELECTIVA (no presenta)
