INFORME TÉCNICO FINAL

PROYECTO SIP 20060739

“Estudio de las propiedades físicas de los desoxirribonucleótidos en ambiente alcalino – tercera etapa”

Responsable: Dr. Reynaldo C. Pless Elling

30 de enero del 2006

Con respecto a las metas enunciadas en el Proyecto 120060739, los resultados logrados fueron los siguientes: Meta: Titulación básica de d-AAGAA, d-AAAAGAAAA, y d-AAAAAGAAAAA a 25°C, en presencia de NaCl al 0.03 M: Estas titulaciones arrojaron los siguientes resultados: pKa = 10.17; pKa = 10.97; pKa = 10.94, respectivamente, para el pentámero, para el nonámero y para el undecámero, demostrando el efecto de la longitud del oligonucleótido sobre la acidez de la base guanina incorporada en la posición central, lo que reprresenta una manifestación del efecto de campo causado por las cargas negativas residentes en los grupos fosfato internucleotídicos a lo largo de la cadena. Como ejemplo del tipo de datos que se obtuvieron en estos experimentos, mostramos a seguir la curva experimental de la titulación del pentadesoxirribonucleótido, d-AAGAA:

0.985

0.99

0.995

1

1.005

1.01

1.015

1.02

5 6 7 8 9 10 11 12 13

pH estandardizado

A25

5*/A

260

Comportamiento del pentámero d-AAGAA en solución acuosa 25°C, titulando con HCl Estos resultados forman parte de la tesis de Maestría del Ing. José Martínez Reyes titulada “Determinación de las constantes de ionización de las bases heterocíclicas contenidas en el ADN en ambiente alcalino”, actualmente en proceso de revisión por parte de los sinodales. Meta: Titulación básica de los oligómeros d-AAAAIAAAA y d-CCCUCCC, monitoreada por UV: Meta: Experimentos de variación continua entre los oligómeros d-AAAAIAAAA y d-TTTTCTTTT, y entre los oligómeros d-CCCUCCC y d-GGGAGGG: Meta: Titulación básica de las dobles hélices d-AAAAIAAAA:d-TTTTCTTTT y d-CCCUCCC:d-GGGAGGG, monitoreando por UV:

Estos experimentos no se pudieron llevar a cabo, debido a que los proveedores de los oligonucleótidos no estuvieron en condiciones de sintetizar oligonucleótidos con este tipo de bases especiales. Se retomarán tan pronto estos materiales sean asequibles.

Meta: Redacción de la tesis de Maestría de José Martínez Reyes: Esta tesis está concluida, y se encuentra ahora en el proceso de revisión por parte de los sinodales.

Meta: Redacción de la tesis de Maestría de María del Rosario Morales García: Esta tesis está concluida, y se encuentra ahora en el proceso de revisión por parte de los sinodales. Meta: Redacción de la tesis de Maestría de Ma. Guadalupe Arredondo Vázquez: Esta tesis está en proceso de escritura. Estudiantes PIFI: Las estudiantes de Posgrado de Tecnología Avanzada del CICATA-IPN Querétaro, Ma. Guadalupe Arredondo Vázquez y María Elena Galván Granados, fueron estudiantes PIFI en este proyecto a lo largo del año 2006. Se adjuntan las constancias correspondientes. Meta: Presentación de resultados en un congreso nacional: Se hicieron las siguientes presentaciones sobre resultados obtenidos en este proyecto, en el II Congreso Nacional Estudiantil de Investigación, celebrado del 11 al 13 de octubre del 2006 en Querétaro:

José Martínez Reyes: Ponencia “Determinación de las constantes de ionización de las bases heterocíclicas del ADN en ambiente alcalino”

María del Rosario Jovita Morales García: Ponencia “Estudio espectrofotométrico de la protonación de estructuras moleculares formadas por las bases citosina, adenina y guanina”

Ma. Guadalupe Arredondo Vázquez: Afiche “Desarrollo de nuevos métodos para la secuenciación de oligodesoxirribonucleótidos “

María Elena Galván Granados, Eva González Jasso y Reynaldo C. Pless: Afiche “Estudio comparativo de la entrada del agua y del ión de calcio al grano de maíz”

Se hicieron las siguientes presentaciones en el 1er Congreso Internacional de Nixtamalización, celebrado del 22 al 25 de octubre del 2006 en Querétaro:

Reynaldo Pless Elling: Ponencia “Uso del radioisótopo Ca-45 para delinear la distribución de calcio en el grano de maíz nixtamalizado”

María E. Galván Granados, Eva González Jasso y Reynaldo C. Pless: Afiche “Estudio comparativo de la entrada del agua y del ión de calcio al grano de maíz” ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ En lugar de las metas inconclusas encima enumeradas (que no se pudieron realizar por falta de los oligonucleótidos especiales requeridos), se llevaron a cabo los siguientes trabajos: Estudios térmicos de oligonucleótidos cortos: Estos estudios resultaron necesarios como trabajo de trasfondo para la tesis de José Martínez Reyes. Se ensayaron los oligonucleótidos d-AAAAAAA, d-AAAGAAA, y d-CCCGCCC a diferentes temperaturas, para delinear en qué medida los espectros de absorción UV podían ser afectados por simples efectos térmicos debidos a estibamientos de las bases (sobre todo de adeninas) dentro de una misma hebra sencilla. Se demostraron efectos térmicos importantes, como se aprecia en las siguientes gráficas:

Titulación en ambiente ácido de oligonucleótidos del tipo d-TnCTn: Se determinó por métodos espectrofotométricos el valor de pKa de la base citosina en oligodesoxirribonucleótidos como d-TTCTT, d-TTTCTTT y d-TTTTCTTTT, a diferentes fuerzas iónicas de la solución, con fines de determinar el efecto que tiene la incorporación de la base heterocíclica citosina a un oligonucleótido sobre su basicidad. Similar a los resultados obtenidos en los estudios de desprotonación de guaninas en un entorno oligonucleotídico, aquí también se verificó un corrimiento de los pKas hacia valores mayores cuando la base se incorpora a un oligómero. A seguir se muestra como ejemplo la titulación de un oligonucleótido, que da como resultado para el pKa de la base central citosina el valor de 4.67.

Comportamiento del heptámero d-TTTCTTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, titulando a 25°C con HCl Estudios de secuenciación de oligonucleótidos por cercenamiento químico: Se llevaron a cabo pruebas iniciales para el desarrollo de una metodología para la determinación de la secuencia nucleotídica en oligodesoxirrribonucleótidos mediante aminólisis y subsiguiente análisis por espectrometría de masas en la modalidad de MALDI/TOF. Redacción de un artículo científico internacional: Se redactó el manuscrito “Comparison of different amines for the one-lane sequence determination of 5’-end labelled oligodeoxyribonucleotides by chemical cleavage” (autores: Eva González-Jasso, Guadalupe Arredondo-Vázquez, Pedro Martínez y Reynaldo C. Pless) para su envío a la revista científica Nucleic Acids Research. Se adjunta copia del manuscrito.

Carátula y primera página del manuscrito: “Comparison of different amines for the one-lane sequence determination of 5’-end labelled oligodeoxyribonucleotides by chemical cleavage”, enviado a Nucleic Acids Research

TITLE PAGE

Comparison of different amines for the one-lane sequence determination of 5’-end labelled oligodeoxyribonucleotides by chemical cleavage Eva González-Jasso, Guadalupe Arredondo-Vázquez, Pedro Martínez and Reynaldo C. Pless*

Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada Querétaro, Instituto Politécnico Nacional, Querétaro, Qro. 76040, Mexico ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

* To whom correspondence should be addressed: Tel: (52) 442-2290538, E-mail: rpless@ipn.mx The authors wish it to be known that in their opinion the first two authors should be regarded as joint First Authors.

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Authors’ e-mail addresses:

egonzalezj@ipn.mx; gpearredondo@hotmail.com; pedro.a.martineza@delphi.com; rpless@ipn.mx

ABSTRACT Hot aqueous solutions of a wide variety of aliphatic amines bring about efficient cleavage of 5’-[32P]-labelled oligodeoxyribonucleotides. Electrophoretic resolution of the product mixtures produce radioactivity patterns which can be analyzed in terms of relative band intensities and band separations to deduce the base sequence of the original oligonucleotide. Amines differ in their overall reactivity with respect to the oligonucleotide as well as in their preference for reaction with the various heterocyclic bases. Guanine sites, in particular, vary markedly in their cleavage susceptibility when reacted with the different amines, being more vulnerable to scission when reacted with less basic amines. Guanine cleavage propensity can also be markedly affected by the ionic strength of the aminolysis solution. Both effects are interpreted in terms of variable extents of deprotonation of the guanine sites in the basic medium. Many of the amines produce fragment patterns which are marred by the presence of minor extraneous bands; these are probably due to an incomplete extent of the second β-elimination involved in backbone cleavage. The methodology is applicable to confirmatory sequencing of synthetic oligonucleotides and can also be used to prepare standard ladders for use in footprinting experiments or chemical reactivity studies.

INTRODUCTION While sequencing of long stretches of DNA is routinely performed by techniques derived from the Sanger dideoxy terminator approach (1), sequence determination of oligonucleotides requires a different approach, e.g. sequencing by chemical cleavage. This can be carried out using, in parallel, various base-specific or base-selective reactions, as originally developed as a methodology by Maxam and Gilbert (2,3) and later expanded by various new chemical procedures proposed by several research groups (4,5,6,7,8,9). Alternatively, the chemical cleavage can be effected by a single type of treatment which results in partial DNA cleavage at all bases, but with base-characteristic relative rates, so that the sequence can be deduced from a single electrophoretic lane, by evaluation of the relative intensity of the bands displayed in that lane. This approach was described by Pless and coworkers (10,11,12,13), who used treatment of end-labelled polynucleotides in hot aqueous amine solutions for this purpose, and by Di Mauro and coworkers, who brought about the requisite DNA cleavage primarily with hot concentrated aqueous solutions of formamide (14,15,16,17) or N-methylformamide (18). Despite the high temperatures employed in these chemical cleavage methods, they can be used in conjunction not only with radioisotopic, but also with fluorescent end labels (15,19). We have now examined the action of a large number of different amines when this type of analysis is performed on 5’-end labeled DNA. The interest for these tests is based on the consideration that in the analysis of 5’-end labeled polynucleotides (the more frequent application, compared to the analysis of 3’-end labeled DNA), the production of well defined labeled fragments (in this case, fragments bearing a phosphoric acid monoester group at the 3’ terminus) requires two successive base catalyzed β-eliminations (3), the second of which may occur with some difficulty. Different amines could show differences in their effectiveness in bringing about these successive β-eliminations. Thus, Negri et al. (14) report that, while treatment of 3’-end labeled DNA with aqueous formamide alone already produces a readable electrophoretic pattern, in the case of 5’-labelled DNA this cleavage method produces smeared sequence profiles, due to the appearance of double bands. Also, compared to our earlier report on 3’-labelled DNA (13), we have now examined a larger number of bases. Finally, we have focused the present work on the sequencing of oligonucleotides, as opposed to polynucleotides, as it is primarily for the sequencing of the former that these chemical cleavage methods are of interest. Even though the automated synthesis of oligonucleotides a priori defines their sequence, the use of these materials in a number of critical medical and forensic applications makes it desirable, from a quality-control point of view, to have available a method for rapidly resequencing them in a confirmatory sense. The data presented here show that aminolysis of the end-labelled oligonucleotides serves this purpose. The results also allow us to define the best conditions for future work, directed at sequencing oligonucleotides by mass spectrometric methods. MATERIALS AND METHODS

70% aqueous ethylamine, 98% 1,6-diaminohexane, 99% ethanolamine, 99.5% N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) (all from Aldrich), as well as concentrated aqueous ammonia (Mallinckrodt), were used without any special treatment. Piperidine and ethylenediamine (both from Fisher Scientific Co.), diethylamine (J. T. Baker), and morpholine and pyrrolidine (both from Aldrich) were purified by distillation at atmospheric pressure. DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) (Aldrich) was sublimed under vacuum. Quinuclidine (Aldrich) was recrystallized from ethyl ether. Triethylamine was first distilled from p-toluenesulfonyl chloride and redistilled. NaOH was analytical grade, from Merck.