Informe Estudio Masificacion Clonal de Genotipos...

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1 ESTUDIO DE MASIFICACIÓN CLONAL DE GENOTIPOS FORESTALES SELECTOS GENERADOS EN PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE INFOR. INFOR – MINAGRI 2011

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ESTUDIO DE MASIFICACIÓN CLONAL DE GENOTIPOS FORESTALES

SELECTOS GENERADOS EN PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE INFOR.

INFOR – MINAGRI 2011

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ESTUDIO DE MASIFICACIÓN CLONAL DE GENOTIPOS FORESTALES

SELECTOS GENERADOS EN PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE INFOR.

Oriana Ortiz N. y Laura Koch Z.1

1 Investigadoras Instituto Forestal, Sede Bio Bio, Casilla 109 C, Concepción Chile. [email protected]. [email protected].

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Proyecto: Estudio de masificación clonal de genotipos forestales selectos generados en

programas de mejoramiento genético. Código: 2101622082

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RESUMEN

Los esquemas de propagación clonal utilizados en forma integrada con programas de mejoramiento genético, hacen posible amplificar las ganancias genéticas al propagar masivamente el mejor material generado en el programa. El estudio, tuvo como objetivo rejuvenecer genotipos forestales adultos, de alto valor genético y productivo, a través de la regeneración de árboles adultos selectos vía organogénesis somática, como un paso previo para posibilitar su masificación clonal mediante técnicas de enraizamiento de estacas. Se obtuvieron vitroplantas en el clon A-33 de E. globulus, las cuales posteriormente serán utilizadas como plantas madres y vitroplantas del clon N° 7 de Lenga. También, se logró el rejuvenecimiento del clon híbrido 9251-4, el cual se encuentra en una etapa de multiplicación para la generación de brotes que serán utilizados para el enraizamiento de vitroplantas. Además, se logró establecer en condiciones in vitro 3 clones selectos de E. nitens y 4 clones selectos de Lenga, los cuales se encuentran en proceso de estabilización, mientras ocurre el rejuvenecimiento de los tejidos, .

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1. INTRODUCCIÓN

El extenso ciclo de vida de los árboles, determina que un programa clásico de mejoramiento genético requiera de mucho tiempo para ser desarrollado, en este contexto la propagación vegetativa se convierte en una herramienta muy útil para el mejorador, pues permite capturar y transferir rápidamente las ganancias genéticas, obtenidas en cualquier etapa de los programas a las plantaciones comerciales (Kleinschmit et al., 1993; Mac Rae y Cotteril, 1997). Además, esta habilidad para capturar las ganancias genéticas (aditivas y no aditivas), permite la multiplicación a gran escala de plantas que exhiben combinaciones específicas de genes o plantas híbridas, las cuales es prácticamente imposible de reproducir mediante semillas (Potts et al., 1992). Por esta razón, es posible obtener altas ganancias en aquellas características deseables, que por su baja heredabilidad, no se traspasan eficientemente a la descendencia por vía sexual, como normalmente lo son el crecimiento, peso seco, contenido de celulosa y otros caracteres de interés forestal (Gutiérrez, 2005).

Durante las últimas décadas, las tecnologías de propagación vegetativa han experimentado un intenso desarrollo, haciendo realidad la silvicultura clonal en especies de importancia comercial como pinos y eucaliptos, además de numerosos híbridos (Bettinger et al., 2009; Assis, 2011). No obstante, aún persisten barreras biológicas que inciden sobre los procesos de clonación, la más seria se relaciona con la maduración de los tejidos vegetales en árboles adultos y su propagación vegetativa, la cual es muy difícil para algunas especies y prácticamente imposible en otras (Rodríguez et al., 2005). Otra limitante que restringe la aplicación operacional de la propagación clonal, es el mayor costo de las plantas clonadas en relación a las producidas mediante semillas, por efecto de la mayor manipulación e infraestructura requerida por las técnicas de propagación vegetativa.

En el caso de las especies forestales, el enraizamiento de estacas es la técnica más

utilizada a nivel mundial, para la producción masiva de plantas clonadas; la facilidad de implementación y el menor costo en relación a otros sistemas de propagación vegetativa, explican la amplia preferencia por esta técnica (Gutiérrez et al., 1994; Gutiérrez, 1998); sin embargo el sistema requiere del uso de plantas donadoras de propágulos que presenten un estatus juvenil.

El Instituto Forestal, a través del Grupo de Investigación de Mejoramiento Genético y

Biotecnología, actualmente desarrolla programas de mejora en varias de las especies forestales de interés económico para el país y en los cuales se han generado genotipos forestales de gran valor productivo, que requieren ser rejuvenecidos para su aprovechamiento, en esquemas de propagación clonal basados en el enraizamiento de estacas. De esta manera, el material genético puede ser transferido a terceros, mediante la realización de proyectos de I+D o bien mediante convenios directos con los interesados en utilizar este material.

En base, a una evaluación de las necesidades del sector productivo, el valor genético que

representan los distintos clones que componen las poblaciones de mejora y las estrategias implementadas para las especies que actualmente cuentan con programas de mejoramiento en desarrollo, se identificó como material genético prioritario para ser sometidos a procesos de rejuvenecimiento a 2 clones de E. globulus denominados de alta productividad, el clon híbrido 9251-4 (E. globulus x E tereticornis), 3 clones de E. nitens y 5 clones de Lenga, Se utilizó como técnica de rejuvenecimiento la regeneración de plantas vía organogénesis somática, debido fundamentalmente a que es una técnica no destructiva del árbol original (genotipo selecto), la calidad de las plantas producidas y la posibilidad de mantención del estado juvenil mediante la preservación de germoplasma en condiciones in vitro.

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2. Objetivo.

Rejuvenecer genotipos forestales de alto valor genético y productivo, a través de la regeneración de árboles adultos selectos vía organogénesis somática, como un paso previo para posibilitar la masificación clonal de los genotipos selectos que considera este estudio.

3. Antecedentes generales y revisión de bibliografía. Organogénesis somática.

Es ampliamente aceptado que las hormonas vegetales cumplen un rol fundamental en los procesos de maduración y su reversión. Se ha determinado, que reguladores del crecimiento, como el ácido abscísico, giberelinas y citoquininas, pueden ser utilizados para manipular procesos de revigorización y rejuvenecimiento. Se considera a la citoquinina benciladenina (BA), como una de las moléculas antienvejecimiento más importantes, la cual puede ser aplicada tanto en procedimientos de aplicación externa como en cultivos in vitro para promover revigorización; en éstos últimos induce desarrollo de yemas axilares y, dependiendo de su concentración en los medios de cultivo, puede inducir la formación de yemas adventicias que a menudo demuestran “rejuvenecimiento total” (Rodriguez et al., 2005). Por esta razón, se identifica a las técnicas de micropropagación, particularmente la organogénesis somática, como una de las vías más eficaces para la reversión y mantención de la juvenilidad fisiológica en árboles adultos (McComb y Bennet, 1986; Franclet et al., 1987).

La organogénesis somática, implica la diferenciación monopolar de un órgano para dar

origen a una planta bajo condiciones estériles de laboratorio. Usualmente, la diferenciación monopolar ocurre al colocar un explante (segmento nodal o apical y meristemas) en un medio nutritivo enriquecido con sustancias hormonales (citoquininas/auxinas). Los cultivos son mantenidos durante todo el proceso de multiplicación en ambientes controlados con iluminación artificial, fotoperíodo y temperatura. Cuando los brotes alcanzan un tamaño adecuado, se colocan en un medio con auxinas para inducir enraizamiento y posteriormente se realiza la aclimatación de las vitroplantas, a condiciones ex vitro. El proceso es influenciado por el genotipo, estado fisiológico del explante, edad y condiciones in vitro de luz, temperatura y constitución del medio nutritivo, en especial de las concentraciones hormonales (Ahuja, 1983).

La organogénesis somática es una alternativa muy útil cuando no se obtienen buenos

resultados mediante enraizamiento de estacas, se requiere aumentar la tasa de multiplicación, y en el caso de árboles adultos para revertir y mantener su juvenilidad fisiológica (McComb y Bennet, 1986). También, es adecuada para la conservación en un estado juvenil de genotipos forestales, mediante la utilización de técnicas de crecimiento retardado in vitro.

El principal inconveniente de la técnica, es el extenso período de tiempo requerido para

lograr la activación de los tejidos, ya que es necesario al menos un año de subcultivos sucesivos, para que se produzca rejuvenecimiento en tejidos maduros. Adicionalmente, factores relacionados con la contaminación endógena y características fisiológicas inherentes al clon, limitan la eficacia de esta técnica (Le Roux y Van Staden, 1991).

Uno de los aspectos más difíciles de abordar, en la organogénesis de árboles adultos, es la

introducción de material aséptico, a condiciones in vitro. En general, la desinfección de brotes colectados directamente en terreno es difícil, debido a la gran cantidad de contaminación tanto

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exógena como endógena presente en este material (De Fossard et al., 1977). Según, Le Roux y Van Staden (1991) es virtualmente imposible esterilizar este material sin dañar severamente el tejido de los explantes iniciales. La edad del material es un factor importante que condiciona el establecimiento de cultivos asépticos (Grewal et al., 1980), idealmente éste debiera tener muchas de las cualidades encontradas en brotes juveniles, por esta razón es común emplear técnicas de pre-tratamiento del material adulto, con el fin de obtener explantes iniciales adecuados para el cultivo in vitro. Se han establecido cultivos asépticos de árboles adultos, a partir de rebrotes de tocón (Furze y Cresswell, 1985), brotes de injertos (Franclet y Boulay, 1982; Durand-Cresswell et al., 1982; Goncalves, 1980), brotes epicórmicos (Oller et al. 2004, Ikemori, 1987), brotes de estacas enraizadas y brotes de ramas pretratadas, en especies caducifolias (Sabja et al., 2005; Ortiz et al., 2006). Antecedentes genotipos seleccionados

La selección del material, fue realizada por el equipo técnico de Mejoramiento Genético de INFOR, tomando en cuenta las necesidades actuales del sector productivo, el valor genético que representan los distintos clones que componen las poblaciones de mejora y las estrategias implementadas para las especies que actualmente cuentan con Programas de Mejoramiento en desarrollo. Se seleccionaron tres especies y un híbrido, con sus correspondientes clones, los cuales se describen a continuación.

· Clones de alto rendimiento A33 y A32 de Eucalyptus globulus.

Como producto de la investigación en mejoramiento genético que ha desarrollado INFOR en Eucalyptus globulus desde el año 1989 (principal especie que sustenta la industria de la celulosa de fibra corta en Chile), se ha evaluado a los clones A33 y A32 con el mejor ranking genético en volumen de todos los ensayos de progenies establecidos en la zona centro sur (ambos de procedencia Jeeralang, North Victoria, Australia). La procedencia geográfica de estos clones es la de mayor tolerancia a sequía y heladas ya que corresponde a una hibridación intraespecífica natural entre E. globulus y E. bicostata. Por esta razón este material genético es altamente demandado por las compañías forestales en Chile y Uruguay para la producción de celulosa Kraft en zonas con déficit hídrico, considerando también el escenario de cambio climático inminente de las próximas décadas.

· Híbrido 9251-4

El Instituto Forestal, desarrolló e inscribió una nueva variedad genética ante el SAG (Ley 19.342 de 1994), que corresponde al clon híbrido 9251-4 de E. globulus x E tereticornis. Las experiencias previas de macropropagación por estacas de este material genético han presentado dificultades en cuanto a su enraizamiento operacional debido a problemas de juvenilidad de los tejidos, por lo cual se requiere investigar el protocolo de propagación in vitro.

Se asume, por las especies que originaron la cruza y el pedigree de los padres, que este híbrido sería una opción comercial interesante para las miles de hectáreas improductivas del secano de la Región de Maule, ya que presentaría ventajas en su supervivencia y crecimiento respecto de especies forestales alternativas como E. globulus y E. camaldulensis.

El híbrido es una combinatoria artificial entre una especie de rápido crecimiento:

Eucalyptus globulus con una especie tolerante a la sequía: Eucalyptus tereticornis. El híbrido fue generado por polinización controlada en el huerto semillero clonal Anilehue (Angol, Chile). La madre es el clon 7011 de Eucalyptus globulus con ranking genético conocido y el padre corresponde a un polen mix de ocho individuos de la procedencia Devils Marsh (Australia) de

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Eucalyptus tereticornis. En la Figura 1, se presenta las estructuras de reproductivas que diferencian a E. globulus del híbrido 9251-4.

E. globulus en ántesis Yemas florales híbrido Yemas florales E. tereticornis

Figura 1. Estructuras reproductivas de E. glubulus y del híbrido 9251-4

E. tereticornis ha sido ampliamente cultivado en muchos países para su uso como

bionergía, madera de construcción por la hermosa veta de su madera, como materia prima para la elaboración de tableros de partículas y producción de pulpa y como híbrido con E. camaldulensis para remediar suelos ácidos y salinos. En Australia la madera ha sido usada en un amplio rango de fines productivos como postes, estacas, madera para la minería, ingeniería pesada y tableros de partículas.

El híbrido entre E. globulus como madre y E. tereticornis como padre fue obtenido con el sistema de cruzamiento One Stop Pollination (polinización en una sola etapa) que consiste en emascular la flor de Eucalyptus en ántesis, inducir la receptividad del estigma con un corte con tijeras quirúrgicas del estigma, polinizar y aislar la flor con Tygon (plástico inocuo) ajustado al diámetro del estilo de cada clon.

El híbrido seleccionado presenta un fenotipo intermedio entre ambas especies parentales, con mayor semejanza al padre E. tereticornis ya que presenta hojas alternas, brotes axilares prominentes, coloración rojiza de brotes y tallo, hoja coriácea. El híbrido desarrollado tiene la característica de ser único en Chile y eventualmente en el mundo ya que la investigación desarrollada2 permitió revertir la incompatibilidad unilateral de E. globulus a través de tratamientos del estilo de la flor y estadios de madurez y receptividad del estigma.

Este aspecto es fundamental porque generalmente el híbrido tiene efectos maternales en la capacidad de enraizamiento, propiedades de la madera, etc., La mayoría de los híbridos en desarrollo por la empresa forestales son recíprocos a E. globulus (E. camaldulensis x E. globulus, E. nitens x E. globulus, E. gunnii x E. globulus, etc.).

El híbrido manifiesta en los rametos existentes en invernadero mayor crecimiento que E. globulus (Figura 2), debido eventualmente a efectos de la heterosis de la cruza artificial entre ambos progenitores. Esta característica además de la mayor tolerancia a la sequía que E. globulus, plantean una opción comercial muy importante para el secano de las regiones de Valparaíso hasta el Bío-Bio y la necesidad de desarrollar investigación para la propagación vegetativa del híbrido y su trazabilidad con miras a una explotación comercial en el futuro si los resultados de la investigación así lo confirman.

2 Proyecto INNOVA Genotipos tolerantes a la sequía de interés comercial. INFOR/EMPRESAS FORESTALES (2003-2005)

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Figura 2. Rametos del híbrido 9251-4 en diferentes edades de vivero e invernadero.

· Clones N10, N20 y N27 de la especie Eucalyptus nitens.

El mejoramiento genético de esta especie, ha contemplado desde la segunda mitad de los años 80, el establecimiento de ensayos de procedencias y progenies que abarcaron gran parte de la distribución natural de la especie en Australia. En una segunda fase se establecieron nuevos ensayos, considerando a los orígenes genéticos que en las primeras pruebas exhibieron el mejor desempeño en el país. En el caso específico de E. nitens se establecieron entre la VII y XI regiones 10 ensayos de progenie.

A partir de estos ensayos, Prado (1988) concluyó que las mejores procedencias para E. nitens corresponden a Macalister, Toorongo y Rubicon. Sin embargo, en ensayos instalados en la zona costera de la VIII Región, los mejores resultados fueron obtenidos con procedencias de Nueva Gales del Sur.

Dentro del programa, se incluyó el establecimiento de poblaciones con un grado de selección cada vez más elevado, para obtener una población de producción depurada. En el caso de E. nitens, se consideró que la introducción de dos colecciones de procedencias, que abarcan toda su distribución natural, pueden asegurar en gran medida la variabilidad y posibilidad de altos niveles de selección.

Actualmente, existen 38 árboles plus de E. nitens seleccionados de acuerdo a sus características fenotípicas de volumen y forma en los ensayos de procedencias y progenies (poblaciones bases). Los clones fueron injertados y se mantienen en un banco de germoplasma, establecido en el predio Antiquina del Instituto Forestal. De este material se seleccionaron para este estudio, los tres mejores clones de acuerdo al ranking genético.

· Clones N° 7, 1, 39, 67 y 140 de Lenga (Nothofagus pumilio)

Lenga (Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.) Krasser) es la especie de más amplio rango de distribución en la Patagonia, abarcando una amplitud de aproximadamente 2.000 km de norte a sur. Si bien el límite norte de distribución de la especie corresponde a la provincia de Talca, el 85 % de la superficie ocupada por el tipo forestal se distribuye en la XI y XII región (CONAF et al., 1999).

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El tipo forestal lenga constituye uno de los recursos forestales más importante de las regiones australes del país y la especie nativa más exportada hoy en día, debido a la belleza y características de su madera. En el pasado, fue severamente afectada por intensos procesos de quemas con el fin de disponer de terrenos para la agricultura y la ganadería. Se suma a lo anterior, la utilización de la práctica silvícola de extracción selectiva de los mejores árboles como método de cosecha del bosque, lo cual altera negativamente la calidad de la regeneración que conformará el futuro bosque.

Hoy en día, el recurso se encuentra con distintos niveles de degradación, por este motivo se han desarrollado diversos estudios y acciones tendientes a restaurar su potencial productivo y promover su uso sustentable (Arroyo et al., 1995; Bartsch y Rapp, 1995; Cuevas, 2000; Heinemann, et al., 2000; Mascareño, 1987; Premoli, et al.,1997; Rebertus y Veblen, 1993; Rebertus et al.,1997, Rusch, 1992; Schmidt et al., 1997; Veblen et al., 1996). En este contexto, en el año 1998 se inició el programa de mejoramiento genético de Lenga, mediante el proyecto FONDEF: “Establecimiento y Mejoramiento Genético de Lenga en las regiones Australes XI y XII”, ejecutado por el Instituto Forestal, la Corporación Nacional Forestal y empresas forestales. En el cual, se implementaron las primeras estructuras para iniciar un programa de mejoramiento genético, entre las más importantes se encuentra la selección de árboles plus, establecimiento de un huerto semillero clonal e instalación de ensayos de progenies y procedencias (Ipinza et al., 2000).

Posteriormente, en el marco de un proyecto de propagación clonal se llevaron a cabo estudios de micropropagación de la especie, utilizando 160 genotipos seleccionados de un ensayo de progenies y procedencias, establecido el año 2000 en la Reserva Nacional Coyhaique, los que fueron identificados en base a una evaluación genética del crecimiento que exhibían las distintas familias. Del conjunto de clones propagados, los cinco mejor situados en el ranking genético (Clones N° 7, 1, 39, 67 y 140), fueron seleccionados para iniciar la tramitación de su inscripción en el Registro de Variedades Protegidas que lleva el SAG (Ley 19.342 de 1994).

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4. Metodología Material

De acuerdo a la selección de especies y sus correspondientes clones se utilizaron como fuente de explantes iniciales lo indicado en el Cuadro 1, junto al programa de colecta desarrollado.

Cuadro 1. Fuentes de explantes iniciales y programa de colecta, para la micropropagación de genotipos

selectos. Clones y especies Fuente de explantes

iniciales Lugar colecta

muestras Edad

genotipo selecto

Fecha de colecta

Clones de alto rendimiento A33* y A32 de Eucalyptus globulus

Clon A-32: Trozos de ramas para generación brotes epicórmicos, colectados desde injertos establecidos en un Huerto Semillero clonal (HSC)

HSC Agromen, Confluencia VIII

Región

12 años Agosto de 2011

Híbrido 9251-4

Segmentos nodales y apicales.

Plantas en macetas mantenidas en invernadero INIA La Platina, Santiago, Región Metropolitana

7 años Enero de 2011

Clones, N10, N25 y N27 de la especie Eucalyptus nitens

Trozos de ramas para generación de brotes epicórmicos, colectados desde injertos establecidos en un Huerto Semillero clonal (HSC)

HSC Antiquina, VIII región

8 años Agosto de 2011 Octubre de 2011

Clones N° 7, 1, 39, 67 y 140 de Lenga

En el caso de los clones N° 1, 39, 67 y 140, se utilizaron brotes obtenidos desde yemas en latencia, bajo condiciones ambientales controladas. El clon N° 7, es parte de la colección de clones del Banco de Germoplasma in vitro que INFOR mantiene en el Laboratorio de Micropropagación.

Ensayo de progenies y procedencias Reserva Nacional Coyhaique,

XI Región

12 años 5 de septiembre de 2011

* Nota: este clon ya se encontraba en condiciones in vitro en etapa de multiplicación, al momento de iniciar el estudio.

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Método

Para la multiplicación del clon A33 de alta productividad, se utilizó el medio nutritivo compuesto por el medio MS, complementado con 0,1 mg/l de tiamina, 0,1 mg/l de piridoxina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 100 mg/l de m-inositol, 7 g/l de agar, 2% de sacarosa, 1µM BAP y 0,01 µM ANA. Para el enraizamiento, se utilizaron explantes elongados de 2 a 3 cm de longitud, con hojas verdes, expandidas y sin presencia de vitrificación, empleando de enraizamiento sucesivo descrito por González et al., (2001), en el cual los explantes son colocados en un medio con dosis elevadas de auxina (fase de inducción) y luego son traspasados a un medio nutritivo libre de hormonas (fase de expresión) donde se produce la formación y emergencia de raíces adventicias. Las plantas enraizadas fueron traspasadas a cajas de aclimatación y luego fueron colocadas en condiciones de invernadero y trasplantadas a macetas para manejarlas como plantas madres.

En el caso del clon A32 de E. globulus y los tres clones de E. nitens, la introducción de material a condiciones in vitro se realizó utilizando brotes epicórmicos, para ello a inicios de primavera se colectaron trozos de ramas de 2 a 4 cm de diámetro y de aproximadamente 30 cm de longitud, las cuales fueron lavadas en el Laboratorio y luego colocadas en frascos de perlita en una sala climatizada donde se les proporcionó una temperatura de 22º±3 C, humedad relativa del aire sobre el 80% y un fotoperíodo de 16 horas luz. Para la especie E. nitens, la actividad fue reforzada con una nueval colecta de material durante el mes de octubre.

El cultivo de brotes epicórmicos se realizó en frascos individuales, utilizando dos formulaciones del medio MS (Murashige y Skoog, 1962), la primera formulación, consideró la composición de macro y micro nutrientes del medio MS, complementado con 0,1 mg/l de tiamina, 0,1 mg/l de piridoxina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 100 mg/l de m-inositol, 6 g/l de agar y 3% de sacarosa. La segunda, correspondió a la recomendada por Oller et al. (2004), la cual se compone de las sales minerales de medio MS, complementadas con las vitaminas de White (1943).

El material colectado del clon híbrido 9251-4, se seccionó en segmentos nodales y apicales, los cuales fueron desinfectados con los siguientes tratamientos:

· T1: Hipoclorito de sodio (NaOCl ) al 10 %, durante 5 minutos. · T2: Remojo durante tres horas en el fungicida Polyben 50 WP (1 g/l) y luego

aplicación de hipoclorito de sodio (NaOCl ) al 10 %, durante 5 minutos.

La desinfección en ambos tratamientos fue seguida de cuatro enjuagues de 10 minutos cada uno, con agua destilada estéril. Para la fase de establecimiento se utilizó el medio descrito para el clon de E. globulus de alta productividad A 32, en tanto que en la fase de multiplicación se utilizó el medio multiplicación utilizado para el clon A-33.

Para la multiplicación del clon N° 7 de Lenga se utilizó el un medio nutritivo compuesto por las sales minerales del medio BTM (Broad Leaved Tree Medium) suplementado con 250 mg/l de caseína hidrolizada, 20 g/l de sacarosa, 7 g/l de agar, 0,22 mg/l de BAP, 0,002 mg/l de ANA y 20 mg/l de putrescina. Para esta etapa se utilizó el procedimiento conocido como “enraizamiento sucesivo”, donde se utiliza un medio para la fase de inducción de rizogénesis y otro para una fase siguiente de expresión y elongación de raíces. En la fase de inducción se usó el medio BTM, con los macronutrientes reducidos a la mitad suplementado con 15 g/l de sacarosa, 2,5 g/l de Gelrite® y 0,2 mg/l de la auxina AIB. Para la fase de expresión de raíces se utilizó la misma formulación basal del medio anterior, pero sin reguladores de crecimiento, adicionada con 7 g/l de agar y 2 mg/l de pantetonato de calcio. Para el enraizamiento, se seccionaron brotes sanos y vigorosos de al menos 3 cm de tamaño y se colocaron en el medio de inducción donde permanecieron durante 10 días en oscuridad, al cabo de este período fueron traspasados al medio de expresión de raíces y colocados bajo condiciones de fotoperíodo normal (16 horas). Las plantas enraizadas fueron trasplantadas a cajas de aclimatación.

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En los casos de los clones N° 1, 39, 67 y 140 de Lenga, la generación de explantes

iniciales, por razones de carácter fisiológicas, sólo puede ser realizada en la temporada de primavera. Para realizar esta actividad se siguió el protocolo establecido por Ortiz et al. (2006), para ello se colectaron muestras a fines de la temporada invernal (agosto), cuando las yemas aún se encuentran en dormancia. Luego de la recepción e identificación del material, se lavaron las ramas y yemas con detergente líquido (Quix®), se enjuagaron con agua corriente por una vez y luego se remojaron durante 30 minutos en una solución de los productos Captan (0,1% p/v), Polyben (0,1%, p/v) y Python (0,3 % v/v), luego el material fue enjuagado con agua corriente. Para la brotación se utilizó una solución compuesta por agua estéril, suplementada con sacarosa (10 g/l) y ácido cítrico (500 ppm). El material permaneció en una sala bajo las mismas condiciones descritas para el clon A-32 de E. globulus.

Para el establecimiento de los cultivos, se seleccionaron brotes que tuvieran un tamaño superior a 1 cm y al menos dos pares de hojas expandidas. Las perulas de los brotes fueron removidas antes de realizar la desinfección de los explantes, la cual fue llevada a cabo en cámara de flujo laminar. Los brotes fueron desinfectados durante 10 minutos con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 10%, a continuación del tratamiento de desinfección, los explantes fueron enjuagados cuatro veces con agua destilada estéril, cada enjuague tuvo una duración de 10 minutos. Los brotes fueron cultivados en el medio L&D (Lainé y David, 1994) suplementado con 30 g/l de sacarosa, 6 g/l de agar, 0,22 mg/l de BAP, 0,002 mg/l de ANA, 80 mg/l de putrescina y 800 mg/l de PVP.

Para todos los clones, los cultivos fueron traspasados a medio fresco cada 21-30 días y el pH de los medios nutritivos fue ajustado en 5,7 ± 0,05, antes de su esterilización en autoclave a 121ºC y 0,1MPa, durante 20 minutos. Los cultivos fueron mantenidos en una cámara de crecimiento a 22±2 ºC, bajo una condición de semisombra, con 16 horas luz de fotoperíodo.

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5. Resultados y discusión

· Clones de alto rendimiento A33 y A32 de Eucalyptus globulus. El clon A 33, se caracterizó por presentar tasas de multiplicación altas estables y buena respuesta a los medios de elongación, en explantes adecuadamente elongados se observaron tasas de enraizamiento sobre 60%. El período de enraizamiento y aclimatación fue realizado en los meses de septiembre a diciembre del 2011 y se logró producir 28 vitroplantas que actualmente están siendo transplantadas a macetas para su manejo como plantas madres, desde donde se extraerán propagulos para desarrollar un sistema de propagación mediante enraizamiento de estacas. En la Figura 3, se muestran los explantes en etapa de multiplicación y vitroplantas en proceso de aclimatación.

Figura 3. Cultivos del clon A 33 de E. globulus en etapa de multiplicación, y vitroplantas en proceso de aclimatación.

En el caso del clon A32 de E. globulus, se obtuvo un número muy bajo de brotes epicórmicos y el material cultivado resultó ser no viable, lo cual indica que este clon presenta una baja respuesta a procesos de regeneración mediante técnicas de propagación vegetativa. Este clon se sitúa en el segundo lugar en el ranking genético después del clon A-33, se evalúa probar nuevos clones del ranking genético, también de alto valor productivo.

· Híbrido 9251-4. En el clon híbrido 9251-4, se cultivó un total de 129 explantes, 56 en el primer tratamiento de desinfección y 73 en el segundo. La contaminación de brotes fue de 42% debido a infección por hongos principalmente, la pérdida de explantes por problemas de necrosis fue de 11% y un 37% de los brotes libres de contaminación no logró activarse en el medio nutritivo. El porcentaje de éxito, evaluado en base a los brotes viables (formación de yemas in vitro) fue de 3% para el tratamiento de desinfección 1 y de 12% para el tratamiento 2, lo cual indica que este último es más efectivo para la introducción de material a condiciones in vitro, del clon híbrido 9251-4. Aún cuando la pérdida de explantes iniciales fue elevada, corresponde a una situación que ocurre normalmente en el género Eucalyptus,lo importante en este caso es la obtención de brotes viables, ya que a partir de uno sólo de ellos es posible iniciar la fase siguiente de multiplicación de brotes.

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La evolución de la multiplicación de brotes mostrada en la Figura 4, indica que durante los primeros siete meses desde la introducción de los explantes a condiciones in vitro, éstos se mantuvieron en una condición de latencia, mientras internamente se producian los procesos de revigorización inducidos por la influencia de la citocinina BAP, durante los subcultivos sucesivos. Finalmente durante los últimos tres meses se observan multipliacación de brotes de manera exponencial, indicando que el rejuvenecimiento ya se ha alcanzado en este material (Figura 5). Una vez que se disponga de suficientes copias, se iniciarán ensayos de enraizamiento in vitro para la producción de vitroplantas y su posterior masificación mediante enraizamiento de estacas.

Figura 4. Evolución de la múltiplicación in vitro de brotes del clon híbrido 9251-4

Figura 5. Aspectos de los explantes del clon híbrido 9251-4 durante su introducción a condiciones in vitro (Izq.) y luego de 12 meses de cultivos (Der.) donde se observa formación de brotes a tasas crecientes de multiplicación, indicando que ya se ha conseguido el rejuvenecimiento de este material.

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Núm

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Evolución multiplicación de brotes in vitro, clon híbrido 9251-4

N° Explantes in vitro

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· Clones N10, N20 y N27 de la especie Eucalyptus nitens.

La formación de brotes epicórmicos, fue alta y prolongada en el tiempo en los tres clones selectos de esta especie; sin embargo, y acorde a la tendencia encontrada en Eucalyptus, durante la etapa de establecimiento in vitro se observó una elevada mortalidad de los explantes, por efecto de contaminación y necrosis. Se observó que E. nitens, al igual que E. globulus, es muy sensible al agente desinfectante (NaOCl), por lo que fue necesario utilizarlo en dosis bajas, para evitar la muerte de los brotes debido a la necrosis de los tejidos; pero teniendo como efecto adverso la elevación de la tasa de contaminación. Esta situación, coincide con lo reportado por Boulay (1983) y Yara (1987), éste último señala un 71% de pérdida de explantes, debido a la contaminación, en el cultivo in vitro de brotes epicórmicos de E. grandis. Como ya fue mencionado anteriormente, en esta etapa basta con el establecimiento de sólo un explante viable, para iniciar cultivos in vitro, aunque idealmente debieran establecerse al menos 10 explantes por clon, para aumentar la probabilidad de éxito en el establecimiento de cultivos. En el caso de E. nitens, se cultivaron entre 81-140 explantes, dependiendo del clon, la tasa de contaminación fue en promedio de 64% y la de necrosis alcanzó el 36,4%; a la fecha se cuenta con 3-10 explantes viables por clon, los cuales al igual que en el caso del híbrido 9251-4, se espera que se mantengan en latencia por aproximadamente 7 meses para luego mostrar tasas crecientes de multiplicación. En la Figura 6, se muestran el aspecto de los brotes epicórmicos cultivados y explantes en etapa de estabilización.

Figura 6. Aspecto de los brotes epicórmicos de E. nitens (Izq.) y cultivos in vitro en etapa de estabilización (Der.).

· Clones N° 7, 1, 39, 67 y 140 de Lenga (Nothofagus pumilio)

En el caso del clon 7, se observó un porcentaje de enraizamiento promedio de 63,6 %, variando entre un 40 a 100% entre las repeticiones del ensayo. Esta alta variabilidad es reflejo de las condiciones en que se realizó la multiplicación, ya que los cultivos de este clon se encontraban bajo un sistema de crecimiento retardado in vitro, entonces al retornarlos a una etapa de multiplicación fue dificil obtener cultivos homogéneos, una vez que este inconveniente sea superado es posible aumentar la tasa de enraizamiento sobre 75%, que fue el encontrado en el estudio de Ortiz et al. (2006).

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Para los clones restantes, se recepcionaron entre 15 y 30 ramas de cada uno de ellos, la brotación ocurrió durante la tercera semana del mes de septiembre, se desinfectaron entre 52 y 69 brotes por cada clon (Figura 7), los porcentajes de contaminación fueron altos, debido a que los brotes estaban infectados con larvas. A la fecha, se mantienen en etapa de estabilización alrededor de 2-5 explantes viables por clon, esta etapa pudiera ser mucho más prolongada, que la observada en Eucalyptus, de acuerdo a los datos proporcionados por el estudio de Ortiz et al. (2006).

Figura 7. Brotes de Lenga para cultivo in vitro (Izq.) y brotes en proceso de estabilización (Der.) 6. Conclusión Las actividades de rejuvenecimiento de genotipos selectos realizadas en el Laboratorio de Micropropagación, han permitido obtener vitroplantas del clon A-33 de E. globulus, las cuales se transformarán en plantas madres para su propagación mediante enraizamiento de estacas y vitroplantas del clon N° 7 de Lenga. También, se logró el rejuvenecimiento del clon híbrido 9251-4, el cual se encuentra en una etapa de multiplicación para la formación de brotes que serán utilizados en el enraizamiento y producción de vitroplantas. Además, se logró establecer en condiciones in vitro 3 clones selectos de E. nitens y 4 clones selectos de Lenga, los cuales se encuentran en proceso de estabilización, mientras ocurre el rejuvenecimiento de los tejidos. La maduración de los tejidos de árboles adultos, constituye una seria limitante para alcanzar los beneficios que promete la propagación vegetativa, utilizada como elemento de transferencia de las ganancias genéticas de los programas de mejoramiento forestal.No obstante y haciendo usos de las características biológicas y de regeneración propias de las plantas, en conjunto con técnicas de micropropagación, particularmente la organogénesis somática, es factible técnicamente superar esta limitación

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