Universidad de Costa Rica

Escuela de Química

Laboratorio de Química Orgánica I QU-0213

I Ciclo Lectivo 2012

Cromatografía de tiza, capa fina y de columna

Esteban José Mejías Vargas B14047

Ana Laura

Tipo de Reporte: II

Profesor: Godofredo Solano

Asistente: Jorge Chaves

Introducción

La cromatografía es una técnica de separación que se basa una fase estacionaria y

una móvil (Harris, 2003). Con el fin de que los diversos componentes de una mezcla se

separen a través de la fase móvil, la cromatografía logra la separación de diversos

compuestos en diferentes estados de agregación, ya sea sólido-líquido, gaseoso-gaseoso

entre otros. La cromatografía es de suma importancia debido a su gran uso tanto en la

industria como en el campo de la salud y la biología, por lo que se busca con esta práctica

enseñar algunos tipos de cromatografía (como la de capa fina y columna).

En la práctica se lograron separar los pigmentos de extracto de espinaca y tomate,

además de comprobar la afinidad de algunos analgésicos en diferentes disolventes para la

cromatografía de capa fina, además de la cromatografía de tiza. El objetivo principal de la

práctica fue la separación e identificación de los principales compuestos de una mezcla

mediante la cromatografía.

Resultados

Cuadro I. Rf obtenido para cada sustancia diluida en 95% acetato de etilo – 5% ácido

acético. Prueba Incógnita 1 y 2. (Grupo Ana Laura).

Muestra Distancia (cm) Rf

Incógnita 1 3,5 1,2069

Incógnita 2 3,0 1,0344

Cafeína 3,3 1,1379

Aspirina 3,2 1,1034

Acetaminofén 2,0 0,6896

Ibuprofeno 2,1 0,7241

La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 2,9cm.

Cuadro II. Rf obtenido para cada sustancia diluida en 95% formato de etilo – 5% ácido

fórmico. Prueba Incógnita 1 y 2. (Grupo Ana Laura).

Muestra Distancia (cm) Rf

Incógnita 1 3,2 1,0667

Incógnita 2 3,7 1,2333

Cafeína 4,0 1,3333

Aspirina 3,7 1,2333

Acetaminofén 2,2 0,7333

Ibuprofeno ----- -----

La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,0cm.

Cuadro III. Rf obtenido para cada sustancia diluida en 95% acetato de etilo – 5% ácido

acético. Prueba Incógnita 1 y 2. (Grupo Esteban).

Muestra Distancia (cm) Rf

Incógnita 1 2,30 0,5897

Incógnita 2 3,90 1,0000

Cafeína 3,10 0,7949

Aspirina 3,30 0,8462

Acetaminofén 3,60 0,9231

Ibuprofeno 3,80 0,9744

La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,9cm

Cuadro II. Rf obtenido para cada sustancia diluida en 95% formato de etilo – 5% ácido

fórmico. Prueba Incógnita 1 y 2. (Grupo Esteban)

Muestra Distancia (cm) Rf

Incógnita 1 3,05 0,7820

Incógnita 2 3,80 0,9744

Cafeína 3,10 0,7949

Aspirina 3,80 0,9744

Acetaminofén 4,00 1,0256

Ibuprofeno 4,00 1,0256

La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,9cm

Cálculo Rf: d1

dd

=R f ,

donde d1 es la distancia de arrastre del compuesto y dd es la distancia entre la línea trazada

inferior y el frente de disolvente:

3,5 cm2,9 cm

=1,2069

Cuadro V. Resultados de cromatografía de tiza. Grupo Ana.

Disolventes Estructura Observaciones

Agua

No se da un arrastre notorio

de la tinta

Acetona

La tinta se desplaza más, sin

embargo no es tan

perceptible

Etanol

Se da un eficiente

desplazamiento de la tinta a

través de la tiza

Figura 1. Fotografía de la cromatografía de columna para el extracto de espinacas.

Cuadro VI. Cromatografía de tiza para cuatro marcadores de colores. (Grupo de Esteban)

Disolvente dd

(±0,5cm)

Color del marcador Distancia recorrida

(±0,5cm)

Rf

(1)

Agua 6,00

Azul 0,20 0,03

Verde 3,80 0,63

Rojo 5,00 0,83

Anaranjado 0,50 0,08

Acetona 6,20

Azul 5,60 0,90

Verde 5,50 0,89

Rojo 0,90 0,15

Anaranjado 5,30 0,86

Etanol 6,30

Azul 5,10 0,81

Verde 5,00 0,79

Rojo 4,30 0,68

Anaranjado 5,00 0,79

Discusión

Se procede a realizar la prueba de cromatografía de capa fina. La cromatografía de capa

fina consiste en la separación de los componentes de una mezcla a través de la migración

diferencial sobra cada capa fina de absorbente, retenida sobre una superficie plana

(Sharapin, 2000). Este tipo de cromatografía tiene aplicaciones similares a las de

cromatografía de líquidos. Se aplica para desarrollar las condiciones para las separaciones

en cromatografía de líquidos en alta resolución. La cromatografía tiene amplio uso en

laboratorios clínicos e industriales (Skoog, James & Crouch, 2008)

En este método de cromatografía hay dos tipos de fases, una móvil, que es el disolvente que

se colca en la cámara; y otra estacionaria que es donde se agregan las muestras. La

separación se logra porque algunas sustancias son más fuertemente retenidas por la fase

estacionaria, mientras que otras se desplazan mejor en la fase móvil (Bolaños, Herrera &

Luts, 2003).

Se toma una placa de cromatografía y se marca con un lápiz la línea base del nivel

de disolventes a 1cm del extremo inferior y luego otra a 1cm del extremo superior, que va a

ser la línea de frente de disolvente. En la línea de abajo se agrega una pequeña muestra de

cada sustancia en el siguiente orden (indicando en la placa):

1. Incógnita 1

2. Incógnita 2

3. Cafeína

4. Aspirina

5. Acetaminofén

6. Ibuprofeno

Luego se coloca la placa en una cámara de desarrollo con 15mL de 95% acetato de etilo –

5% ácido acético. Además, previo a colocar la placa se coloca un papel filtro que va a

generar una atmósfera controlada con el disolvente que se adicionó. Se deja la placa dentro

de la cámara hasta que el disolvente se desplace hasta el frente de disolvente. Luego se pasa

por una luz ultravioleta y por la cámara de yodo. Las láminas de yodo son sensibles a los

compuestos orgánicos que están en la placa y dan productos oscuros. En cuanto a la luz

fluorescente, los componentes de la muestra amortiguan la fluorescencia del material de tal

forma que toda la placa exhibe fluorescencia, excepto los lugares donde se encuentran los

componentes de la muestra (Skoog, James & Crouch, 2008). Se debe indicar dónde está la

máxima altura que llegó a alcanzar la sustancia aplicada al arrastrarse con el disolvente.

Luego se averigua el Rf y se comparan los resultados obtenidos. Esto se repite usando ahora

95% formato de etilo – 5% ácido fórmico.

(a) (b)

Figura 2. (a) Revelado con luz ultravioleta, (b) revelado con cámara de yodo.

Según lo que se aprecia en los cuadros de resultados, la incógnita 1 es cafeína pues

los valores de Rf de estos son los más similares en el disolvente que contiene acetato de

etilo, sin embargo con el formato de etilo la diferencia es mayor. En cuanto a la segunda

incógnita, el valor Rf al que más se acerca en ambos disolventes es al de la aspirina, donde

en uno difiere por 0,069 (en el acetato de etilo grupo Ana), mientras que en el otro

disolvente (el formato de etilo grupo Ana) no presenta ninguna diferencia pues ambos

alcanzan la misma altura. Sin embargo, los valores las incógnitas 1 y 2 en el formato de

etilo del grupo Esteban son más cercanos a sus identidades (aspirina e incógnita 2 son

iguales, mientras que la incógnita 1 y la cafeína presentan los valores más similares). En

cuanto a los valores obtenidos para el acetato de etilo del grupo Esteban, sucede lo mismo

que en los del grupo Ana donde se presentan leves diferencias. Sin embargo con la

incógnita 2 si se da una diferencia mucho mayor que en los otros cuadros.

Con este tipo de cromatografía, aunque posee diversas ventajas como la simplicidad

del equipo, el bajo costo y la rapidez; también se presentan ciertos problemas que conllevan

a errores y a valores muy variados entre sustancias similares como el hecho de que el

disolvente no migre de manera regular, o el tiempo que transcurre entre el revelado y la

lectura de la placa. La presencia de manchas puede deberse a la aplicación de sustancias en

baja concentración que necesitan de la aplicación de un volumen mayor de la solución que

se va a analizar (Sharapin, 2000). Todo esto puede afectar la eficiencia de esta técnica y por

esa razón los valores obtenidos difieren un poco entre sí.

En cuanto al uso de disolventes, deben buscarse aquellos más volátiles para que se

evaporen antes de ingresar las placas a la cámara de yodo y así evitar manchas que generen

incertidumbre sobre donde está la marca de la muestra. Además, se debe tomar en cuenta la

polaridad de este y la acidez o basicidad (Walton & Reyes, 1983).

(a) (b)

Figura 3. Estructuras disolvente A. (a) Acetato de etilo, (b) ácido acético (Wolfram Alpha,

2012).

(a) (b)

Figura 4. Estructuras disolvente B. (a) Formato de etilo, (b) ácido fórmico. (Wolfram

Alpha, 2012).

Las estructuras demuestran que el formato de etilo – ácido fórmico posee puntos de

ebullición menores debido al metilo menos que posee en comparación con Acetato de etilo

– ácido acético, lo que además, lo vuelve más volátil y por ende mejor disolvente.

Con la cromatografía de columna se basó en la utilización de diversos filtros para la

separación de los diversos pigmentos pertenecientes a la hoja de espinaca y extracto de

tomate. Se utilizó el gel de sílice ya que la filtración por gel produce una serie de poros de

diferentes tamaños, por lo que las moléculas más pequeñas pueden atravesar los diversos

poros y recorrer mucha mayor longitud dentro del tubo que las moléculas más grandes

(Watson, 2005). Para la espinaca se observó (ver Figura 1) que la molécula que realizó el

mayor recorrido es el pigmento amarillo, seguido de diversas tonalidades de verde. Como

describe Oñate (2010) las hojas de espinaca poseen 4 pigmentos básicos, las xantofilas

(pigmento amarillo), carotenos (pigmento naranja) y las clorofila A y B (pigmentos verdes,

la B es más oscura que la A). Por lo que encontramos en el fondo de la columna, el

pigmento amarillo son xantofilas mientras las diversas tonalidades de verde son mezclas

entre las clorofilas A y B, esto último es producto de la distribución uniforme de los poros

del gel. Las xantofilas son moléculas de menor tamaño en comparación con la clorofila (ver

Figuras 6 y 7), por lo que se les facilita atravesar los poros y llegar a la parte más baja de la

columna, cabe destacar que como se observa en la Figura 5 las xantofilas se componen

únicamente de cadenas de carbonos por lo que no poseen polaridad ya que carecen de un

compuesto más electronegativo que atraiga los electrones. Debido que silanol (SiOH),

presente en la superficie de gel de sílice, posee polaridad (Climent, 2004), las xantofilas

como son no polares no poseen interacción con el gel lo que les permite localizarse en la

zona más baja de la columna. Para el caso de las clorofilas se basan en el grupo funcional

que diferencia la clorofila A de la B, la clorofila A posee un metilo en una posición donde

la clorofila B posee un aldehído (Orozco, 2012). Este grupo funcional posee una gran

variante ante la interacción el gel de sílice ya que el aldehído posee polaridad debido al

oxígeno que posee (Bruice, 2007) además de que el hidrógeno forma puentes de hidrógeno

con el oxígeno del silanol, lo que permite mayor interacción con el gel causando que este se

localizara en zonas superiores a la clorofila A (ver Figura 6), a diferencia de la clorofila B,

la A por el metilo no interactúa con el gel debido a que posee un grupo metilo que no

interacciona con el silanol. Debido a la irregularidad de los poros del gel no se da una

distribución exacta entre los pigmentos, sino que se encuentran diferentes capas de colores,

podemos observar en la Figura 1 hay xantofilas tanto en el fondo de la columna como en

una zona superior de la columna.

Figura 5. Estructura de una xantofila (Sigma-Aldrich, 2010).

Figura 6. Estructura de la clorofila A (Sigma-Aldrich, 2010).

Figura 7. Estructura de la clorofila B extraído de espinaca (Sigma-Aldrich, 2010).

Para el caso del tomate, este posee un pigmento característico que es el licopeno que

le otorga la tonalidad rojiza característico de los tomates (Nuez, 2001). Además del

licopeno el tomate posee otros carotenoides en menor cantidad que poseen una tonalidad

diferente. En la Figura 10 (Anexos) observamos como en la parte superior de la columna se

nota la presencia de un pigmento rojizo, el licopeno. Pero a través de la columna se

descomponen otros pigmentos amarillos, otros carotenos (Murray et al., 2004) encontrados

en las células del tomate, que debido a su tamaño si pudieron atravesar los poros del gel

mientras que el licopeno se almaceno en la parte superior de la columna.

Figura 8. Estructura del licopeno, pigmento que otorga color al tomate (Sigma-Aldrich, 2010).

Se realiza la práctica de cromatografía de tiza donde se marca la tiza con un punto

en cada lado con marcadores permanentes. Luego se coloca sobre un disolvente específico

y se espera hasta que la elusión termine. Luego se analiza que tan bueno es el disolvente

según la distancia a la que se desplace la sustancia coloreada del marcador.

La tiza se utiliza como medio poroso, para que realice una función similar a la del papel

filtro, trabajando como fase estacionaria (Villa, 2007). El primer científico en usar la tiza

como fase estacionaria para realizar las pruebas de cromatografía fue Mikhail Tswett, quien

observo cómo se separaban los colores de los diferentes pigmentos al pasarlos por un tubo

con polvo de tiza (Valpuesta, 2008). De hecho, si la tiza fuese muy compacta la prueba de

cromatografía no se puede realizar pues los compuestos muy compactos, como los

productos de cerámica compactos, son impermeables (CEAC, 2007).

El alcohol resulta ser mejor eluyente debido a que producen generalmente una disminución

de la hidrofobicidad de la fase estacionaria y de la polaridad de la fase móvil, y en

consecuencia, una disminución en los factores de retención de los compuestos (Morell &

Candela, 1998). Y por esta misma razón el agua no funciona, pues promueve la retención

de la tinta.

(a) (b)

Figura 9. Cromatografía de tiza, (a) disolvente alcohol, (b) disolvente agua.

El problema con la acetona es la velocidad con que este se volatiliza, pues esto impide un

desarrollo normal de la cromatografía, al mover la tinta pero levemente (Mallol, 2008).

Figura 10. Cromatografía de tiza con acetona como disolvente.

Conclusiones:

La aplicación de la cromatografía de capa fina es un buen método para averiguar

una incógnita siempre que se tenga un modelo para comparar los resultados.

Es importante la utilización de un buen disolvente como fase móvil, en este caso fue

el 95% formato de etilo – 5% ácido fórmico, que generaron mejores resultados.

Las tizas empleadas al no ser compactas facilitaron el arrastre de las tintas. Eso sí,

empleando un alcohol como fase móvil.

El sustrato utilizado en la columna, como el gel de silica, puede intervenir la

separación de pigmentos según la polaridad de los mismos.

El tamaño de las moléculas por separar es un factor importante en la cromatografía

de columna por el tamaño de los poros del sustrato utilizado en la columna.

Referencias:

1. Bruice, P. (2007). Química Orgánica (5ta. Edición). México: Pearson Educación.

2. CEAC, (2007). Materiales de Construcción. Ediciones CEAC, Barcelona, España.

Pp.125.

3. Climent, J. (2005). Experimentación en química : química orgánica, ingenieria

química. Valencia: Univerisidad Politécnica de Valencia.

4. Harris, D. (2003). Ánalisis Químico Cuantitativo (6ta edición). Barcelona: Editorial

Reverté.

5. Herrera, C.; Bolaños, N.; Lutz, G. (2003) Química de Alimentos: Manual de

Laboratorio. Editoria Universidad de Costa Rica, 1ª edición, San José, Costa Rica,

Pp4.

6. Mallol, J. (2008). Manual de Radiofarmacia. Ediciones Díaz de Santos, España,

Pp71.

7. Morell, I.; Candela, L. (1998). Plaguicidas: aspectos ambientales, analíticos y

toxicológicos. 3º edición, Universidad de Jaume, España, Pp171.

8. Murray, M., Birdsall, T., Pizzorno, J., & Reilly, P. (2004). La curación del cáncer :

metodos naturales. Barcelona: RobinBook.

9. Nuez, F. (2001). El cultivo del tomate. Barcelona: Editorial Aedos.

10. Oñate, L. (2010). Biología. México: Cengage Learning.

11. Orozco, M. (2012). Los pigmentos fotosinteticos. Recuperado el 13 de junio de

2012, de Universidad Nacional de Colombia:

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/02_04.htm

12. Sharapin, N. (2000). Fundamentos de Tecnología de Productos Fisoterapéuticos.

Área de Ciencia y Tecnología del Convenio Andrés Bello & Red Iberoamericana de

Productos Fito farmacéuticos. Editado por Roberto Pinzón, 1ª edición, Colombia,

año Pp161-164.

13. Sigma-Aldrich. (2011). Sigma-Aldrich. Recuperado el 24 de mayo de 2012, de

Sigma-Aldrich: http://www.sigmaaldrich.com/us-export.html

14. Skoog, D.; James, F.; Crouch, S. (2008) Principios de Análisis Instrumental.

Editorial Cengage Learning S.A., 6º edición, México, Pp848-849.

15. Valpuesta, J. (2008). A la búsqueda del secreto de la vida. Una breve historia de la

biología molecular. Editorial Hélice, España, Pp62.

16. Villa, M. (2007). Manual de prácticas de química general. 2º edición, Universidad

de Medellín, Colombia, Pp98.

17. Walton, H.; Reyes, J. (1983). Análisis Químico e Instrumental Moderno. Editorial

Reverté, edición en español, España, Pp332-333.

18. Watson, J. (2005). Biología molecular del gen. Madrid: Editorial Médica

Panamericana, D.L.

19. Wolfram Alpha. (2012). Wolfram Alpha. Recuperado el 14 de junio de 2012, de

Wolfram Alpha: http://www.wolframalpha.com

Anexos

Figura 10. Cromatografía de columna para el extracto de tomate.